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ENDOR-Untersuchung biologisch relevanter organischer Radikale in inversen Micellen.

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zwei Sorten von Oktaederliicken im Verhaltnis 1 :2. Die
Oktaederlucken, die jeweils nur von einer der vier tert-Butylgruppen pro Tetrahedranmolekiil umgeben sind, schlieBen die Gasmolekule bzw. -atome ein. Die iibrigen Liicken
sind dafiir zu klein. Im Packungsdiagramm (Abb. 1) sind
Die Deformationsdichten wurden jeweils in Schnitten
(Abb. 2) entlang einer Tetraederbindung und durch den
Mittelpunkt der gegenuberliegenden Tetraederbindung berechnet. Schnitte mit Maxima in speziellen Lagen (Spiegelebenen) haben wir owegen der gr6Beren ,Standardabweichung (a@)=0.06 eAP3 gegeniiber 0.04 e A P 3 in allgemeinen Lagen) nicht zur Diskussion herangezogen. Die Dichtemaxima der Tetraederbindungen sind um 0.37 A von der
Bindungsachse nach auI3en verschoben. Dies entspricht einer Biegung dieser Bindungen um 26". Die Tetrahedranbindung ist somit eine der am starksten gebogenen C-CBindungen'''. Theoretische Berechnungenl6l ergeben Biegungen der gleichen GroBenordnung. Ein Kreisbogen iiber
das Dichtem>ximum zwischen zwei Tetrahedran-C-Atomen ist 1.7 A lang, wahrend der Abstand zwischen den
Atomen 1.497 A betragt. Die Dichtemaxima der Bindungen zwischen den Tetrahedran-C-Atomen und den quartaren C-Atomen der fert-Butylgruppen (Abb. 2) liegen exakt
auf den Verbindungslinien zwischen den Atomen. Dies gilt
auch fiir die C,,,,,-C,,,h,,-Bindungen
der rert-Butylgmppen.
Abb. I . Packungsdiagrarnm der Argon-EinschluDkristallevon 1 (Projektion
entlang c); Argonatome durch Kreise markiert.
Eingegangen am IS. Dezember 1986,
verlnderte Fassung am 22. Januar 1987 [Z 20111
die Positionen der Argonatome durch Kreise markiert. Die
Belegung im verwendeten Kristall betrug 26%. Beim Erwarmen der Kristalle in der Mutterlauge iiber 220 K beobachtet man unter dem Mikroskop, daB Gasblasen aus den
Kristallen austreten und aus der Losung herausperlen. Die
Kristalle werden triib: Ohne die stiitzenden Gaseinschliisse
bricht das Gitter zusammen. Auf der Basis der Tieftemperaturdaten konnen die beiden spiegelbildlichen Torsionsfehlordnungslagen der terr-Butylgruppen, die in die von
Argonatomen belegten Liicken ragen, getrennt verfeinert
werden. Der Torsionswinkel zwischen den beiden Fehlordnungslagen betragt 26". Aus den thermischen Parametern
ergibt sich fur die tert-Butylgruppen eine Torsionsschwingung von 9", die sich durch dynamische Schwingung oder
statische Fehlordnung erklaren IaBt. Im Vergleich zur Messung bei 213 KI'l sind die Bindungslangen wegen der Verfeinerung mit Reflexen hoher O r d n ~ n g weitgehend
~~I
frei
von Effekten, die durch die Abweichung der Bindungselektronen von der kugelsymmetrischen Elektronendichteverteilung um die Atome entstehen[*I.
,
iA
,
,
IA
[l] H. Irngartinger, A. Goldmann, R. Jahn, M. Nixdorf, H. Rodewald. G.
Maier, K.-D. Malsch, R. Emrich, Angew. Chem. 96 (1984) 967; Angew.
Chem. In:. Ed. Engl. 23 (1984) 993.
I21 P. Coppens, Angew. Chem. 8 9 (1977) 33; Angew. Chem. Inr. Ed. Engl. 16
(1977) 32.
[3] Kristallographische Daten des Argon-Clathrats von 1 bei 103 K: Kristallzlichtung bei 213 K aus Ethylacetat. geslttigt mit Argon:
CIOHlb 0.086 Ar; a = 15.732(2), c - 13.923(1)A; hexagonale Raumgruppe P63/m; 2 - 6 ; hr=O.94. 10" g/m'; drei unabhlngige Datensltze
mit insgesamt 12 5 15 Intensitaten (Enraf-Nonius-CAW-Diffraktometer,
MoK,-Strahlung, Graphit-Monochromator); sin(B/,L)=0-0.60 k':
I109
beobachtete Reflexe ( I >!u(I))zur Berechnung der Deformationsdichten; sin(B/A)=0.65-1.15 A-': 637 beobachtete Refiexe ( I > 2 . 5 u ( I ) ) for
die Verfeinerung mit Reflexen hoher Ordnung (C anisotrop; Vollmatrix);
R = 0.06. (Die Atomlagen und isotropen thermischen Parameter der HAtome wurden rnit Reflexen niedriger Ordnung (sin (B/A)SO.65 A - l ;
R=0.04) verfeinert.) Bindungsllvgen (T=Tetraeder): CT-CT 1.497, CT1.498, C,..,-Cm.lhyl 1.529 A; Standardabweichungen 0.003, 0.004,
C,
0.006 A. Weitere Einzelheiten zur Kristallstrukturuntenuchung k6nnen
beim Fachinformationszentrum Energie, Physik, Mathematik GmbH, D75 14 Eggenstein-Leopoldshafen 2, unter Angabe der Hinterlegungsnummer CSD-52295, der Autoren und des Zeitschriftenzitats angefordert werden.
[4] J. L. Atwood, J. E. D. Davies, D. D. MacNicol: Inclusion Compounds,
Academic Press, Bristol (England) 1984.
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Chem. In:. Ed. Engl. 21 (1982) 769.
[6] a) T. Loerzer, R. Machinek, W. Liittke, L. H. Franz, K.-D. Malsch, G.
Maier, Angew. Chem. 95 (1983) 914; Angew. Chem. In:. Ed. Engl. 22
(1983) 878; b) K. Kovakvic, Z. B. Maksi6, J. Org. Chem. 39 (1974) 539.
+
ENDOR-Untersuchung biologisch relevanter
organischer Radikale in inversen Micellen**
Von Norbert Bretz. Ingrid Mastalsky, Martin EIsner und
Haw Kurreck*
Das Interesse an inversen Micellen (,,mit dem Wasser innen") nimmt aus mehreren Griinden zu:
a) Enzyme kdnnen iiblicherweise nur in wanrigem Milieu eingesetzt werden, d a sie durch hydrophobe Wechsel1'1 Prof. Dr. H. Kurreck, Dipl.-Biochem. N. Brew,
[**I
Abb. 2. Deformationsdichten von 1 [3]. Schnitte jeweils entlang einer Bindung und senkrechr zur gegenuberliegenden Bindung des Tetraeders. Die in
den Formeln mit Kreisen markierten Atome und Bindungsmittelpunkte liegen in der jeweiligen Schnittebene. Kontur-Interval1 0.05 e . i - 3 .
Angew. Chem. 99 (1987) Nr. 4
1. Mastalsky, DipLChem. M. Elsner
Institut far Organische Chemie der Freien Universitat
TakustraDe 3, D-1000 Berlin 33
Wir danken Herm Dr. B. Kinte fur hilfreiche Diskussionen und Unterstutzung bei den Spektrensimulationen. N.B. dankt H e m Prof. F. Miller, UniversitPt Wageningen, for einen anregenden Forschungsaufenthalt in dessen Laboratorium. Diese Arbeit wurde von der Dcutschen
Forschungsgemeinschaft und dem Fonds der Chemischen lndustrie gefbrdert.
8 VCH Verlogsgesellschoji mbH, D-6940 Weinheim. 1987
0044-8249/87/0404-0357 S 02.50/0
351
wirkungen denaturieren. Gelost im Wasser innerhalb inverser Micellen sind sie jedoch gegeniiber hydrophoben
Losungsmitteln stabilisiert und so als Biokatalysatoren einsetzbar, um schlecht wasserlbsliche Substrate in der nichtwanrigen Phase zu den gewunschten Produkten umzusetzenll.21
b) Proteinfreie, modifizierte Cofaktoren von Enzymen
wie die der Flavoproteine sind wegen unerwiinschter Eigenschaften, die beim intakten nativen Material nicht beobachtet werden, oft keine ,,guten" Modellverbindungen.
Der Einbau der Flavin-Coenzyme in inverse Micellen
konnte moglichenveise diese Eigenschaften, z. B. Aggregatbildung durch Stapelung, Lichtempfindlichkeit oder im Falle der semichinoiden Stufen - Disproportionierung
und Dimerisierung, unterdriicken.
c) Fur die Spektroskopie freier Radikale mit den magnetischen Resonanztechniken EPR (Elektronenspinresonanz) und ENDOR (Elektron-Kern-Doppelresonanz)ist
Wasser wegen seiner hohen dielektrischen Verluste im Mikrowellenbereich besonders ungeeignet. Andererseits sind
gerade wll3rige Pufferlosungen fur die Einstellung physiologischer Bedingungen unabdingbar. Wenn die paramagnetischen Spezies jedoch im Innern inverser Micellen erzeugt werden, sollte ihre Untersuchung in waDrigen Kompartimenten der weiterhin vorwiegend hydrophoben Losung moglich sein.
Die EPR-Spektroskopie Spin-markierter Molekiile (,,reporter group te~hnique"'~?,die Aussagen iiber die Radikalumgebung ermtigli~ht[~',
erbrachte bei inversen Micellen interessante Ergebnisse z. B. iiber die micellare Mikroviskositiit. Allerdings sind Informationen iiber die wichtigen Hyperfeindaten wegen des begrenzten Aufliisungsvermogens der EPR-Spektroskopie nur unzureichend zuganglich. Deutlich besser ist das Auflosungsvermogen der Doppelresonanzmethode ENDOR, die heute bei organischen
Radikalen vie1 angewendet ~ird('-'~.Die erste ENDORUntersuchung in inversen Micellen wurde am Fremyschen
Salz, einem anorganischen Radikal (ON(S03K)2), durchgefiihrt. Dabei wurden das Dodecylammonium-propionat/
Toluol- und das Natrium-l,2-bis(2-ethylhexyloxycarbony1)-1-ethansulfonat (AOT)/Toluol-System venvendet1*l.
Aus der Temperaturabhangigkeit der Signalintensitat des
hochfrequenten ''N-ENDOR-Signals konnte geschlossen
werden, daD das micellare Wasser ein fiir das Radikalsalz
polareres und viskoseres Milieu ist als reines Wasser. AuDerdem ist der EinfluB von Luftsauerstoff auf den ENDOR-Effekt geringer, und auch die bei hoheren Konzentrationen zu beobachtende Aggregation des Fremyschen
Salzes ist unterdriickt. (Dieses Ergebnis ist vergleichbar
mit dem Verhalten von in Micellen eingebauten Porphyrinen, bei denen die sonst ubliche Aggregation ebenfalls
nicht auftritt['- lo].)
Hier berichten wir iiber das erste erfolgreiche ENDORExperiment an in inverse Micellen eingebauten organischen Radikalen mit den Radikalanionen von Lumiflavin,
Riboflavin, FMN (Flavinmononucleotid) und FAD (Flavin-adenindinucleotid) als Beispielen. Flavine treten als
ubiquitare Redox-Cofaktoren in nahezu allen biologischen
Elektronentransportketten auf; die chemischen, biochemischen und biologischen Aspekte des Flavin-Systems werbehandelt. Obwohl durch UV- und EPRden z. B. in [I1.
Untersuchungen in wanrigen Losungen stabile Radikalanionen von Flavinen nachgewiesen werden konnten[I3I,
waren ENDOR-Signale bisher nur von gefrorenen wal3rigen Losungen erhaltlich. Dagegen sind die Radikalanionen der Flavine der ENDOR-Spektroskopie zuganglich,
wenn sie elektrochemisch in nichtwiinrigen Losungsmitteln wie CH2Clz oder Hexamethylphosphorsauretriamid
358
0 VCH Verlagsgesellschaft mbH. 0-6940 Weinheim. 1987
(HMFT) mit Tetra-n-butylammoniumtetrafluoroboratals
Leitsalz eneugt werdedI4*"1. Auch kationische paramagnetische Derivate der Flavin-Modellverbindungen konnten ENDOR-spektroskopisch untersucht werden, allerdings ebenfalls in nichtwahigen Losungsmitteln, z. B. in
Mischungen von Toluol und Trifluoressigslure"61. ENDOR-Untersuchungen an Radikalen von Flavoproteinen
sind bisher nur in gefrorenen waI3rigen Losungen moglich
(vgl. 1'. 161).
Es ist uns gelungen, bemerkenswert stabile Losungen
von Flavin-Radikalanionen in HexadHexanol-Mischungen mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) als Amphiphil zu erzeugen. Abbildung 1 zeigt die 'H- und 'H-
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1
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I
333
v[MHzl-
Abb. I. 'H- und 'H-ENDOR-Spektren der Radikalanionen selektiv deuteriertcr Lumiflavine in inversen Micellen. Die Zuordnung der Signale (unten)
ist eindeutig, da die Signale der selektiv ausgetauschten Protonen im 'HENDOR-Spektrumjeweils fehlen.
W44-8249/87/0404-0358 $ 02.50/0
Angew. Chem. 99 (1987) Nr. 4
[9] J. H. Fuhrhop, M. Baccouche, Justus Liebigs Ann. Chem. 1976. 2058.
[lo] J. H. Fuhrhop, T. Lehmann in G. Blauer, H. Sund (Hrsg.): Opfical Roperties and Sfrucfure of Tetrapyrroles. Walter de Gruyter, Berlin 1985,
S. 19f.
1111 F. MUller, Top. Curr. Chem. 108 (1983) 71.
[I21 D. E. Edmondson, G. Tollin, Top. Curr. Chem. 108 (1983) 109.
[I31 A. Ehrenberg, F. MUller, P. Hemmerich, Eur. J. Biochem. 2 (1967) 286.
1141 Vergleichende ENDOR-Untersuchung der Spindichteverteilung in unterschiedlich protonierten Flavin-Radikalen, die eineneits in Wsungsmitteln wie Toluol/Trifluoressigs8ure, HMPT oder CH2C12,andererseits
in inversen Micellen erzeugt wurden: E. Weilbacher, N. Helle, R. D.
Allendoerfer, H. Kurreck, unverdffentlicht.
[ 15) Auch Dimethylformamid ist in einer friiheren ENDOR-Untersuchung
des Lumiflavin-Radikalanionsals Lasungmittel verwendet worden: L.
E. G. Eriksson, J. S. Hyde, A. Ehrenberg, Biochim. Biophys. A d a 192
(1969) 211.
[16] H. Kurreck. M. Bock, N. Bretz, M. Elsner, H.Kraus, W. Lubitz, F. Miiller, J. Geissler, P. M. H. Kroneck, 1. Am. Chem. Soc. 106 (1984) 737.
117) Die EPR- und ENDOR-Spektren wurden mit einem Bruker-EPR-Spektrometer als Grundgerilt (ER-220-D mit Bruker-Resonator ER 200ENB) und NMR-Zusatzelektronik aufgenommen, vgl. 16.71. Die Mikrowellenleistung betrug 130-160 mW, die Radiofrequenzleistung ca.
250 W (FeldstBrke ca. 0.6 mT im rotierenden Koordinatensystem).
1181 Synthese selektiv deuterierter Lumiflavine: M. Elsner, H. Kurreck, unver0ffentlicht; Uber eine andere Synthese deuterierter Flavine berichten
H. J. Grande, C. G. van Schagen, T. Jarbandhan, F. Miiller, Helu. Chim.
Acta 60 (1977) 348.
1191 F. MOller, P. Hemmerich, A. Ehrenberg, G. Palmer, V. Massey, Eur. J.
Biochem. 14 (1970) 185.
[20] N. Bretz, H. Kurreck, unverdffentlicht.
ENDOR-Spektren~"I der Radikalanionen selektiv deuterierter Lumiflavine[''] in diesen inversen Micellen (ahnliche ENDOR-Spektren wurden fur die Radikalanionen von
Riboflavin, FMN und FAD erhalten). Die Spektren zeigen
ein gutes Signal/Rausch-Verhaltnisund eine gute Aufliisung mit Linienbreiten von etwa 150 kHz. Wir fuhren dies
darauf zuruck, daB Austauschprozesse (,,chemischer Austausch" und ,,Heisenberg-Austausch") weitgehend unterdriickt werden; dies ist unter der Annahme plausibel, daB
eine Micelle maximal ein Radikalanion enthalt. Derartige
Austauschprozesse wiirden den ENDOR-Effekt drastisch
reduzieren['I; es ist wahrscheiniich, daD gerade wegen dieser Effekte bei den in flussigem Wasser erforderlichen hohen Radikalkonzentrationen ENDOR-Signale nicht nachgewiesen werden konnen.
Wahrend Neutralradikale in fliissiger wiiOriger Liisung
nicht in fur ENDOR-Messungen ausreichender Konzentration zu erzeugen sind (um Flavin-Neutralradikale untersuchen zu kiinnen, muB N5 des Isoalloxazinrings alkyliert
werden["]), konnen sie in inversen Micellen angereichert
werden. Offensichtlich dimerisieren oder disproportionieren sie in diesem Milieu nicht. In orientierenden
Versuchen konnten wit das ENDOR-Spektrum des Neutralradikals von Lumiflavin-3-acetat in Hexan mit AOT als
Tensid problemlos aufnehmen[201.Es gelang auch, EPRSpektren invers-micellarer Lasungen von Flavoproteinen
wie den Radikalen von Flavodoxinen und der Glucoseoxidase aufzunehmen. Bisher konnten allerdings von diesen
Liisungen keine ENDOR-Signale erhalten werden.
Enantioselektive Synthese von a-Trialkylsilylketonen
und -aldehyden**
A rbeitsvorschrijit
Von Dieter Enders+ und Braj Bhushan Lohray
Eine 0.3 molare Lasung von CTAB (umkristallisiert aus Ethanol und iiber
Silicagel im Vakuum getrocknet) in HexadHexanol (611 v/v), wo-Wert [2d]
([H,O]/[CTAB]) von 15, wurde hergestellt durch Zugabe des berechneten Volumens an Pufferlasung (typische Zusammensetzung: 25 mM Flavin-Derivat,
75 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und SO mM 2-Amino-2-hydroxymethyl-1.3-propandiol (Tris; pH 10) oder Pyrophosphat (pH 11) oder NaOH
(pH 12)). Die durch krdftiges Schiitteln (ca. 1 min) und durch Beschallung
(2 x 25 s) homogenisierte, phasenstabile Liisung wurde in das EPR/ENDORProbenrchrchen iiberfiihrt, entgast und unter Hochvakuum abgeschmolzen.
Die Probe wurde im EPR-Resonator so lange bestrahlt (Halogenlampe
250 W, 15s-lntervalle, 313 K), bis eine optimale EPR-SignalintensitBt der gebildeten Radikalanionen erreicht war. Fiir die ENDOR-Messungen wurde
das hobenrdhrchen in einen ENDOR-Resonator iiberfiihrt (mit unseren Geraten ist eine in-situ-Erzeugung der Radikale im ENDOR-Resonator nicht
maglich).
Professor Gerhard Quinkert zum 60. Geburtstag gewidmet
Silylenolether BI'l und die isomeren a-Silylketone (0Ketosilane)
lassen sich ineinander iiberfuhrenl3]. Sie
gehiiren zu den Verbindungsklassen der modernen Carbonylchemie, die bei Synthesen am vielseitigsten einsetzbar
sind. Wahrend die 0-silylierten Verbindungen B einfach
durch Silylierung der Ketone zugiinglich sind (Z= 0),mu13
man zur Synthese der C-silylierten Isomere A entsprechende Azaenolate (Z= NR, NNR2)[4"4d'oder andere Verkniipfungsmuster heranziehen (siehe RetrosyntheseSchema l)[k-'l.
Eingegangen am 5. November,
veranderte Fassung am 30. Dezember 1986 [Z 19811
[I] H. H. Weetall, W. P. Vann, Biofechnol. Bioeng. 18 (1976) 105; K. Martinet, A. V. Levashov. N. L. Klyachko. V. 1. Pantin, 1. V. Berezin, Biochim.
Biophys. Acta 657 (1981) 277; F. M. Menger, K. Yamada, J. Am. Chem.
Soc. 101 (1979) 6731; P. LOthi. P. L. Luisi, ibid. 106 (1984) 7285; C. Laane, R. Hilhorst, R. Spruijt, K. Dekker, C. Veeger in R C. Bray, P. C.
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Band der Reihe Methods in Sfereochemicul Analysis), VCH Publishers,
Deerfield Beach, FL, im Druck.
[8] E. C.Janzen, Y. Kotake, G. A. Coulter. U. M. Oehler, Chem. Phys. Lett.
126 (1986) 205.
Angew. Chem. 99 (1987) Nr. 4
?SIR3
R'
A
X
(2
-
NR. NNR2)
Schema I
I*)Prof. Dr. D. Enders, Dr. B. Bhushan Lohray
[**I
lnstitut Wr Organische Chemie der Technischen Hochschule
Professor-Pirlet-StraDe 1, D-5100 Aachen
Diese Arbeit wurde vom Fonds der Chemischen lndustrie und den Firmen BASF AG und Degussa AG gefdrdert. Wir danken H e m Dr. H.
Weffer.Ciba-Geigy, Basel, fur Chlordimethylthexylsilan.
0 VCH Verlagsgesellschaft mbH, 0-6940 Weinheim. 1987
0044-8249/87/0404-0359 $ 02.50/0
359
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