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Erhehung der Enantioselektivitt von Mandel-R-HNL durch rationales Design des aktiven Zentrums.

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Angewandte
Chemie
Zuschriften
Das aktive Zentrum von Mandel-Hydroxynitrillyase wurde umgestaltet,
um Enzymvarianten fr die hoch enantioselektive Synthese von (R)-2Hydroxy-4-phenylbutyronitril in industriellem Maßstab zu erzeugen. K.
Gruber, A. Glieder et al. beschreiben die Entwicklung dieser Biokatalysatoren in der Zuschrift auf den folgenden Seiten.
4778
2005 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
DOI: 10.1002/ange.200500435
Angew. Chem. 2005, 117, 4778 – 4782
Angewandte
Chemie
Protein-Engineering
Erhhung der Enantioselektivitt von
Mandel-R-HNL durch rationales Design
des aktiven Zentrums**
Roland Weis, Richard Gaisberger, Wolfgang Skranc,
Karl Gruber* und Anton Glieder*
Die enzymkatalysierte Addition von HCN an Aldehyde oder
Ketone durch Hydroxynitrillyasen (HNLs) ermglicht eine
quantitative und stereoselektive Bildung von C-C-Bindungen. Die daraus resultierenden enantiomerenreinen Cyanhydrine sind Schl$sselbausteine in einer Vielzahl chemischer
Synthesen.[1] In der Natur existieren sowohl R- als auch Sselektive HNLs, und mehrere Gene wurden bereits kloniert
und exprimiert.[1] Beispielsweise wird das rekombinante
Isoenzym 5 der Mandel-HNL (PaHNL5) von Pichia pastoris
in den Kultur$berstand sekretiert. So kann es ohne vorherige
Enzymaufreinigung oder Immobilisierung direkt f$r biokatalytische Umsetzungen in w4ssrigen oder zweiphasigen
Systemen verwendet werden. Stabilit4t in saurer Lsung
(zur Unterdr$ckung der unselektiven nichtenzymatischen
Hintergrundreaktion) sowie eine hohe Enantioselektivit4t
sind weitere Anforderungen f$r die industrielle Anwendung
dieses Enzyms. Obwohl die ausgepr4gte Stabilit4t der rekombinanten PaHNL5 bei niedrigen pH-Werten sogar mit
langsam reagierenden Substraten bereits stereoselektive enzymatische Synthesen in w4ssrigen und zweiphasigen Systemen ermglicht hat,[1, 2] reicht die Enantioselektivit4t in
einigen F4llen noch nicht f$r eine biokatalytische Anwendung in großem Maßstab aus.
Innerhalb der Substratpalette[3] von PaHNL5 sind jene
Substanzen von besonderem Interesse, bei denen die Aldehydfunktion durch eine oder mehrere Methylengruppen von
einer aromatischen Gruppe getrennt ist. Wie beim nat$rlichen Substrat Mandelonitril (Benzaldehydcyanhydrin) d$rfte
der aromatische Ring eine wichtige Rolle bei der Erkennung
und Bindung dieser Substrate spielen.[4] Andererseits redu-
[*] R. Weis, R. Gaisberger, Prof. Dr. K. Gruber, Prof. Dr. A. Glieder
Kompetenzzentrum Angewandte Biokatalyse GmbH
Petersgasse 14, 8010 Graz ((sterreich)
Fax: (+ 43) 316-873-4072
E-mail: karl.gruber@a-b.at
glieder@glieder.com
Dr. W. Skranc
DSM Fine Chemicals Austria Nfg. GmbH & Co KG
R & D Center Linz
St.-Peter-Straße 25, 4021 Linz ((sterreich)
[**] Wir danken DSM, der FFG, dem Land Steiermark, der SFG und der
Stadt Graz f=r finanzielle Unterst=tzung, H. Mandl vom Kompetenzzentrum Angewandte Biokatalyse, I. Wirth und O. Maurer von
DSM f=r ausgezeichnete technische Unterst=tzung, K. Faber, C.
Kratky und W. Kroutil f=r wertvolle Kommentare zum Manuskript
sowie P. Nagl f=r die Illustration.
Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind im WWW unter
http://www.angewandte.de zu finden oder kCnnen beim Autor
angefordert werden.
Angew. Chem. 2005, 117, 4778 –4782
www.angewandte.de
zieren die Distanz zur funktionellen Gruppe wie auch die
flexible Konformation des Alkylbindest$cks den Einfluss des
aromatischen Rings auf die Stereoselektivit4t der Reaktion.
Unter diesen aromatischen Substraten mit r4umlich entfernter reaktiver Gruppe sind 3-Phenylpropionaldehyd (1 a) und
3-Phenylpropenal (2 a, trans-Zimtaldehyd), oder die entsprechenden Cyanhydrine (R)-2-Hydroxy-4-phenylbutyronitril
(1 b) bzw. (R)-2-Hydroxy-4-phenyl-3-butennitril (2 b), aus
kommerzieller Sicht die wichtigsten Repr4sentanten. Diese
Cyanhydrine knnen durch saure Hydrolyse in enantiomerenreine a-Hydroxycarbons4uren umgewandelt werden, die
ihrerseits wichtige Zwischenprodukte f$r die Synthese einer
Klasse von „Angiotensin-Converting-Enzyme“-Inhibitoren
(ACEi) mit dem Bberbegriff „Prile“[5] darstellen. 2 a wurde
h4ufig als besonders schlecht umsetzbares Substrat beschrieben. Alternativ f$hrt die palladiumkatalysierte Hydrierung
des resultierenden Cyanhydrins 2 b ebenso zu (R)-2-Hydroxy4-phenylbutters4ure.[6] 2 b reagiert dar$ber hinaus als vielseitiges Zwischenprodukt unter asymmetrischer Epoxidierung,
Dihydroxylierung oder Addition von Halogenen.[7] Da nur
das R-Enantiomer von 2 b eine Zwischenstufe f$r pharmakologisch aktive „Prile“ darstellt, erfordert die kommerzielle
Produktion einen hohen Enantiomeren$berschuss (ee >
95 %); außerdem sind eine hohe Ausbeute (> 95 %), ein
umweltvertr4glicher Prozess und konomische Reaktionszeiten bei einem niedrigen Enzym/Substrat-Verh4ltnis w$nschenswert. Eine Trennung der beiden Enantiomere gelang
zwar durch Kristallisation von Diastereomeren, allerdings nur
mit 68 % Ausbeute.[8] Alternative Synthesewege (z. B. $ber
die enantioselektive Reduktion von Keto- oder Diketoestern) sind komplizierter oder bentigen teure Ausgangsverbindungen.[5, 9]
Wir haben ein biokatalytisches Verfahren f$r die Synthese
dieser chiralen Bausteine in großem Maßstab untersucht, bei
dem geringe Mengen rekombinanter PaHNL5 (17 mg Enzym
pro mmol Substrat 1 a) verwendet werden (Schema 1). Dieser
Syntheseweg geht von kosteng$nstigen Substraten aus, minimiert die Anzahl der Arbeitsschritte und bietet zus4tzlich die
Mglichkeit einer fraktionierenden Kristallisation nach der
Hydrolyse der Cyanhydrine zur Gewinnung von reinem
Produkt. 1 a wurde mit rekombinanter PaHNL5 innerhalb
von vier Stunden ann4hernd vollst4ndig (93 %) zu 1 b mit
89.4 % ee umgesetzt (Tabelle 1, Eintrag 1). Um den zus4tzlichen Reinigungsschritt einer Kristallisation zur Enantiomerentrennung zu vermeiden, bentigten wir allerdings ein noch
selektiveres Mutein.
Durch gerichtete Evolution konnte die Enantioselektivit4t von vielen (haupts4chlich bakteriellen) Enzymen effizient
beeinflusst werden.[10] Obwohl die Expression von PaHNLIsoenzymen in E. coli mglich ist, konnte PaHNL5 bis jetzt
nur in Pichia pastoris in hoch aktiver Form produziert
werden.[1, 11] P. pastoris ist aber kein verl4ssliches Wirtsystem
f$r die gerichtete Evolution. Dar$ber hinaus verhindert ein
Codon-Dilemma[12] den Zugang zu allen theoretisch mglichen Aminos4ure-Austauschen durch Punktmutationen – vor
allem wenn nur wenige tausend Mutanten untersucht werden
knnen. Aufbauend auf unserem k$rzlich beschriebenen
Design eines Muteins mit hherer katalytischer Aktivit4t
f$r sterisch anspruchsvolle Mandelonitril-Derivate,[1a] verbes 2005 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
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Zuschriften
In berechneten Strukturmodellen der Komplexe
von PaHNL5 mit (R)-1 b und (S)-1 b ist die Phenylgruppe bei beiden Substraten in nahezu identischer
Position gebunden, und auch die mechanistisch wichtigen polaren Wechselwirkungen der Hydroxy- und
Cyangruppen mit His498 und His460 sind konserviert
(Abbildung 1).[4] Deutliche Unterschiede ergaben
sich nur f$r die Wechselwirkungen des Enzyms mit
dem Alkylbindest$ck von 1 b, das im Komplex des SEnantiomers in Richtung von Ala111 und beim REnantiomer in Richtung von Val360 orientiert ist
(Abbildung 1, siehe auch das Video in den Hintergrundinformationen). Diese Pseudo-Spiegelsymmetrie war der Ausgangspunkt f$r die gezielte Modifizierung des aktiven Zentrums von PaHNL5, bei der
das zug4ngliche Volumen f$r das jeweilige Enantiomer eingeschr4nkt oder vergrßert wurde. Nhnliches
wurde schon f$r einige erfolgreich evolvierte Enzyme
beobachtet.[14] Ausgew4hlte Aminos4uren im aktiven
Zentrum wurden unter Beibehaltung des hydrophoben Charakters der Bindestelle gegen Reste unterschiedlicher Grße ausgetauscht. Da Ala111 und
Val360 stark mit der Alkylkette des Substrats wechselwirken, sind sie besonders interessante Stellen f$r
Mutationen. Gleiches gilt f$r Leu331 und Leu343, die
haupts4chlich mit der Phenylgruppe wechselwirken
Schema 1. a) Enantioselektive Synthese von (R)-2-Hydroxy-4-phenylbutyronitril (1 b) und
und einen Teil des Eingangstunnels zum aktiven
(R)-2-Hydroxy-4-phenylbutennitril (2 b) aus 3-Phenylpropionaldehyd (1 a) bzw. 3-PhenylproZentrum bilden. Insgesamt wurden 24 Mutanten in
penal (2 a). So wird (R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersDure produziert, die ein Intermediat der
silico modelliert; davon wurden 12 – und zwar jene
Synthese der „Prile“ ist. b) Einige Beispiele f=r „Prile“.
mit den grßten vorausgesagten Nnderungen der
Enantioselektivit4t – pr4pariert und experimentell
Tabelle 1: Vergleich der Eigenschaften der Muteine und des
analysiert.
In einer ersten Hydrocyanierung von 1 a mit
Ausgangsenzyms PaHNL5 bei der enantioselektiven Hydrocya[a]
kleinen
Mengen
an Mutein zeigte V360I die hchste Seleknierung von 1 a.
tivit4t, wohingegen A111G wie erwartet wenig stereoselektiv
Nr.
Enzym
Umsatz [%]
ee [%]
war (Tabelle 1). F$r exaktere Analysen wurden jeweils 2 g
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
PaHNL5
A111VL331A
A111G
A111VL343A
A111V
L331F
A111GV360M
L343A
L343F
V360M
A111GV360I
L331A
V360I
93
30
40
40
16
80
75
83
95
93
92
94
98
[a] 30 mmol 1 a und 0.5 mg Enzym (17 mg mmol
10 8C, pH 3.4.
89.4
0
15.2
27.6
60.2
63.1
64.7
68.8
74.4
86.7
87.6
88
95.3
1
Substrat), 4 h,
serten wir hier durch einen strukturgest$tzten
Ansatz die Enantioselektivit4t dieser Lyase.
Unseres Wissens ist dies das erste Beispiel f$r
ein erfolgreiches rationales Design von
Lyasen zur Steigerung der Enantioselektivit4t; allerdings haben auch rationale Ans4tze
mit HNL-Varianten aus Manihot esculenta f$r
besseren Substrattransport die Enantioselektivit4t f$r mehrere Substrate erhht.[13]
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2005 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Abbildung 1. Stereobild der Jberlagerung der modellierten Komplexe von PaHNL5 mit
(R)-1 b (blau) und (S)-1 b (rosa). AminosDure-Seitenketten sind hellgrau, der FAD-Cofaktor
gelb, N- und O-Atome sind blau bzw. rot wiedergegeben. Die f=r die Mutagenese selektierten AminosDuren sind rot gekennzeichnet, ihre entsprechenden Van-der-Waals-Volumina sind durch kleine Kugeln abgegrenzt. Das Bild wurde mit dem Programm PyMol erzeugt (http://www.pymol.org).
www.angewandte.de
Angew. Chem. 2005, 117, 4778 –4782
Angewandte
Chemie
(15 mmol) 1 a mit 1 mg der vier selektivsten Muteine umgesetzt (67 mg Enzym pro mmol Substrat, Eintr4ge 10–13). Die
Varianten L331A, V360M und V360I (Tabelle 2, Eintr4ge 3, 4
und 5) setzten dabei das Substrat innerhalb von vier Stunden
mit signifikant erhhter Enantioselektivit4t um. Am Ende
der Umsetzung zeigte das von A111GV360I produzierte 1 b
zwar auch eine etwas erhhte Enantioselektivit4t (91.8 % ee),
die Umsetzung war jedoch langsamer.
Die Umsatzgeschwindigkeiten von 1 a mit jedem einzelnen Mutein wurden bestimmt; dazu wurde die Enzymmenge
jeweils so angepasst, dass die Geschwindigkeit w4hrend der
ersten 20 Minuten in einem ann4hernd linearen Bereich lag.
Die unter diesen Bedingungen erhaltenen spezifischen Aktivit4ten (Tabelle 2) wurden f$r den Vergleich der Muteine bei
der Cyanhydrinsynthese herangezogen, obwohl aus solchen
Zahlenwerten aufgrund der nichtlinearen Kinetik von
PaHNL5-katalysierten Reaktionen in zweiphasigen Systemen nicht direkt kcat-Werte f$r hhere Enzymkonzentrationen abgeleitet werden knnen. Die Einf$hrung von Isoleucin
an der Position 360 verbesserte die Enantioselektivit4t auf
mehr als 96 % ee und beschleunigte die Umwandlung von 1 a
beinahe 6fach. Daher war die Umsetzung binnen weniger
Stunden mit einem niedrigen Enzym/Substrat-Verh4ltnis
abgeschlossen. In einer k$rzlich verffentlichten Studie
wurde vergleichsweise mindestens die 30fache Menge an
Enzym verwendet.[6] Die Mutationen L331A und $berraschenderweise auch A111GV360I zeigten ebenfalls eine
leicht erhhte Katalysegeschwindigkeit. Allerdings sank die
Umsatzgeschwindigkeit von A111GV360I, im Unterschied zu
den anderen Muteinen, mit Fortschreiten der Reaktion.
Alle Muteine mit erhhter Enantioselektivit4t bei der
Synthese von 1 b wurden auch in der Umsetzung von 15 mmol
der starreren Verbindung 2 a zu 2 b untersucht (Tabelle 3).
Zwei der Muteine ergaben f$r 2 a hhere Selektivit4ten, und
wieder lieferte V360I mit ca. 98 % ee das beste Resultat.
Zus4tzlich wandelten alle Mutationen außer V360M das
Substrat 2 a schneller um als das Ausgangsenzym PaHNL5.
Die Kombination aus hherer Steifigkeit von 2 a (verglichen
mit 1 a) und grßerem Platzbedarf des Methioninrests knnte
die geringere Aktivit4t der V360M-Variante erkl4ren. Der
Umsatz mit nur 27 mg PaHNL5-V360I pro mmol 2 a war nach
drei Stunden ann4hernd vollst4ndig, und das Produkt 2 b
wurde $berdies mit ausgezeichnetem Enantiomeren$berschuss erhalten (ca. 98 % ee). Gerrits und Mitarbeiter bentigten dagegen Reaktionszeiten von 168 Stunden f$r 97 %
Ausbeute bei 98 % ee.[15] K$rzlich wurden durch den Einsatz
von „vernetzten Enzymaggregaten“ (cross-linked enzyme
aggregates, CLEAs) aus nativer Mandel-HNL hohe Enantioselektivit4ten bei kurzen Reaktionszeiten erzielt.[16]
Durch strukturgest$tztes rationales Design wurden rekombinante PaHNL5-Varianten f$r die stereoselektive Synthese von aromatischen Cyanhydrinen mit einem Phenylring
in entfernter Position in großem Maßstab in einem w4ssrigen
System entwickelt. Vier der 24 entworfenen und 12 pr4parierten, gut exprimierten ortsspezifischen Mutanten des
Pahnl5-Gens zeigten signifikant erhhte Stereoselektivit4t.
Alle Muteine waren bei niedrigem pH-Wert in den w4ssrigen
Systemen stabil. Besonders gute Ergebnisse lieferte die
Variante PaHNL5-V360I, die den Enantiomeren$berschuss
f$r die Umsetzung von 1 a auch bei sehr niedrigem Enzym/
Substrat-Verh4ltnis auf $ber 96 % erhhte. Dieses Mutein
reduzierte die bentigte Menge an Biokatalysator f$r die
Herstellung von enantiomerenreiner (R)-2-Hydroxy-4-phenylbutters4ure (und ihren Derivaten) um das 10- bis 30fache.
Mit sehr geringen Mengen an PaHNL5-V360I konnte auch
das Cyanhydrin 2 b innerhalb von nur drei Stunden mit ca.
98 % ee produziert werden. Die Reaktionszeit f$r diese
schlecht reagierenden Substrate wurde von 168 auf drei
Stunden herabgesetzt. Interessanterweise zeichneten sich
unsere am Computer enworfenen, selektiveren Muteine
Tabelle 2: Umsatz und EnantioselektivitDt des Ausgangsenzyms PaHNL5 und ausgewDhlter Muteine bei der Hydrocyanierung von 1 a.[a]
Nr.
Enzym
1h
Ums.[b] [%]
1
2
3
4
5
PaHNL5
A111GV360I
L331A
V360M
V360I
72
70
78
78
86
[a] 15 mmol 1 a, 1 mg Enzym (67 mg mmol
1
ee [%]
Reaktionszeit
2h
Ums.[b] [%]
ee [%]
4h
Ums.[b] [%]
ee [%]
TOF[c] [s 1]
89.0
90
90.7
93.6
96.0
87
83
90
93
96
96
94
95
97
98
90.2
91.8
92.9
94.6
96.7
2497 208
3379 208
2865 312
6812 837
14 397 416
90.1
90.6
93.3
94.0
96.6
Substrat), 10 8C, pH 3.4. [b] Umsatz. [c] TOF: Umsatzzahl.
Tabelle 3: Umsatz und EnantioselektivitDt des Ausgangsenzyms PaHNL5 und ausgewDhlter Muteine bei der Hydrocyanierung von 2 a.[a]
Nr.
Enzym
Ums.[b]
ee
Reaktionszeit
2h
Ums.[b]
ee
1
2
3
4
5
PaHNL5
V360M
L331A
A111GV360I
V360I
13
9
19
21
70
95.2
90.3
94.5
95.8
98.0
22
14
29
36
90
1h
96.2
92.7
95.4
96.8
97.9
3h
Ums.[b]
ee
TOF[c] [s 1]
30
18
39
47
97
96.4
92.6
95.7
96.8
97.6
110 19
n.b.[d]
n.b.[d]
149 16
458 32
[a] 15 mmol 2 a, 0.4 mg Enzym (27 mg mmol 1 Substrat), 10 8C, pH 3.4. [b] Umsatz. [c] TOF: Umsatzzahl. [d] n.b.: nicht bestimmt; ee war nicht erhCht.
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2005 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
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Zuschriften
auch durch hhere Aktivit4ten aus. Dies unterscheidet unsere
Ergebnisse vom Design selektiverer Hydrolasen, bei denen
nur die Reaktivit4t mit dem „falschen“ Enantiomer reduziert
wurde.[17] PaHNL5-V360I ist zurzeit der effizienteste Katalysator in der Synthese enantiomerenreiner Bausteine f$r
pharmakologisch aktive „Prile“, was eine industrielle Anwendung in großem Maßstab nahelegt.
Eingegangen am 4. Februar 2005
Online verffentlicht am 6. Juli 2005
.
Stichwrter: ACE-Inhibitoren · Asymmetrische Synthesen ·
Biokatalyse · Hydroxynitrillyase · Protein-Engineering
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2005 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
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Angew. Chem. 2005, 117, 4778 –4782
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