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Erster Nachweis endogener Pyridoxylisochinolin-Alkaloide im Sugerorganismus.

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Erster Nachweis endogener PyridoxylisochinolinAlkaloide im Saugerorganismus**
Von Gerhard Bringmann* und Stephan Schneider
Die Leichtigkeit, mit der sich die Biosynthese der Isochinolin-Alkaloide aus Arylethylaminen und Aldehyden oder
a-Ketosauren in vitro nachvollziehen la13t1'1,fiihrte schon
friih zu der Annahme['l, daf3 derartige Kondensationsre,iktionen auch im Saugerorganismus, z. B. nach Alkoholkonsumf'l, ablaufen konnten. Vor allem der Aldehyd Pyrido.ial
5, zentrales Coenzym des Aminosaure-Stoffwechsek,
konnte mit korpereigenen dinucleophilen Arninen - iibtr
die biochemisch vertrauten intermediaren Schiff-Basen I auch zu Alkaloid-artigen Produkten 2 cyclisieren (Schema
I). Wir berichten hier uber den ersten Nachweis der 111vivo-Entstehung neuartiger, auch im Pflanzenreich unhekannter Alkaloide im Saugerorganismus aus Vitamin B, 3
und L-Dopa 4, die bei einigen Stoffwechsel-Erkrankungen, z. B. beim park ins on is mu^[^] oder bei der Homocystinurie"I', in unphysiologisch hohen Dosen, oft in Grammeiigen, verabreicht werden.
In vorgeschalteten in-vitro-Modellreaktionen konntcn
wir zunachst die Vitamin-B,-abgeleiteten Isochinolin-Atkaloide 8-11 (Schema 2) unter physiologischen Bedingun-
Decarboxyliwung
Transorninierung
-
Rocernislerung
1
2
Schema I.
I-H
3-H.
4.85 (mc)
1.91 (ddd,
J = 17.0, 4.5, 1.9 Hz)
2.13 (ddd,
J - 17.0, 12.0. 5.5 Hz)
2.69 (ddd,
J = 13.1, 5.5, 1.9 Hz)
2.43 (ddd.
J = 13.1, 12.0, 4.5 Hz)
3-H,
4-H,
4-H.
5-H
8-H
6'-H
5'-CH?
CH,
{
penf6](Wasser, pH 6-8,35"C) aus Pyridoxal 5 oder Pyridoxalphosphat 6 und L-Dopa 4 oder Dopamin synthetisieren, wobei 7 als Zwischenstufe wahrscheinlich ist. Nach
Aufklarung ihrer Konstitution und Konfigurati~n'~'
('HNMR-Daten in Tabelle 1) wurde eine auf diese extrem polaren, teilweise mehrfach zwitterionischen Substanzen zugeschnittene Analytik erarbeitet. Auf der Basis Ionenpaarassistierter Umkehrphasen-HPLC (RP 18; 0.01 M H3PO4in
H20+0.3% Natriumdodecylsulfat / 0.01 M H3Po4 in
CH,OH) fanden wir Bedingungen, die eine effiziente chromatographische Trennung und Detektierung im Nanogrammbereich, auch in komplexen biologischen Systemen,
gestatten.
Nach intravenoser Applikation therapeutisch iiblicher
Dosen (20mg/kg) F'yridoxin 3 und L-Dopa 4 an WistarRatten lieR sich allerdings das erwartete Isochinolin 11 im
Blut nicht nachweisen, nicht einmal dann, wenn statt 3 der
kondensationsfilhige Aldehyd Pyridoxal 5 injiziert wurde.
Stattdessen fanden wir in beiden Fallen noch starker polare Metabolite, die chromatographisch (HPLC; siehe
oben) den 0-phosphorylierten Heterocyclen 8 und 10
gleichen.
Zur Sicherung der ldentitat von 8 und 10 und zur ZUsatzlichen Quantifizierung fiihrten wir die Tierversuche
rnit [4,5-'4C]Pyridoxin 3* durch. Zur umgekehrten Isotopenverdunnungsanalyse wurde nach lnkubation (2-6 h)
das aus venosem Blut gewonnene Blutplasma mit inaktivem 8 bzw. 10 und mit inaktivem Edukt 3 versetzt. Nach
Behandlung rnit SprOZ. Trifluoressigsaure wurden die Proteine abzentrifugiert und die uberstehende Losung gefriergetrocknet. Durch praparative HPLC (Bedingungen siehe
oben) und anschliefiende Abtrennung des Ionenpaarreagens erhielt man 8* und lo*, die durch Kristallisation bis
zur konstanten Radioaktivitat gereinigt wurden. Um erste
Hinweise uber die Verteilung dieser neuartigen Metabolite
5.26 fmc)
2.58 (mc)
2.86 (mc)
2.89 (mc)
3.26 (mc)
3.60 (dd,
J = 10.4. 3.9 Hz)
3.67 (dd,
J = 10.9. 4.3 Hz)
-
-
2.98 (dd,
2.95 (dd,
J = 15.6, 4.3 Hz)
2.85 (ddd,
J = 15.6. 10.9, 0.8 Hz)
J = 16.2, 3.9 Hz)
2.90 (ddd.
J = 16.2, 10.4. 0.7 Hz)
}
::trierbar
7.33 (s)
4.15 (dd, J = 12.9, 7.0 Hz)
4.26 (dd, J = 12.9. 7.8 Hz)
1.55 (s)
[*) Priv.-Doz. Dr.
G.Bringmann, Dipl.-Chem. S . Schneider
Organisch-chemisches lnstitut der Universitst
Orleansring 23, D-4400 Minster
l**] Endogene Alkaloide im Menschen, 2. Mitteilung. Diese Arbeit wurck
vom Minister fur Wissenschaft und Foschung des Landes Nordrhei,,.
Westfalen sowie vom Fonds der Chemischen lndustrie (Sachmittel un.1
ein Prornotionsstipendium for S. S.) gefordert. Wir danken Priv.-Do.,.
Dr. K . D. Richer, Zentrale Tierexperimentelle Einrichtung der Univerv .
tatskliniken Minster, fur wenvoile Anregungen und Frau DipLChen,
zsiika riir experimentelleHilfe bei den Tiemesuchen. I. Mittel.
lung: G . Bringmann, Narrrr~issen.~cl~affen
66 (1979) 22.
,,.,,
Angrw. Chem. 98 (1986) Nr. 2
im Korper und ihre mogliche Biotransformation zu erhalten, wurde in jedem Fall auch die Leber analysiert. Die
Ergebnisse der Tierversuche sind in Tabelle 2 zusarnmengefaBt[*]. Zum weiteren Strukturbeweis IieRen sich die Alkaloide 8* und lo* in VitrO mit einer sauren Phosphatase
(E.C. 3.1.3.2) zu den radioaktiven Alkoholen 9* und 11*
dephosphorylieren.
Mit diesem Nachweis von Pyridoxylisochinolin-Alkaloiden im lebenden Saugerorganismus wird die bekannte Palette fein abgestimmter, enzymatisch gesteuerter Reaktio-
0 VCH Verlagsgesellsc-haffmhH. D-6940 Weinheim. 1986
OO44-8249/86/0202-0167
S 02.50/0
167
H
O
W
N'
CH3
4
3
I
-
CHO
I
1
;N
' *'CH,
t
6
1
I
WjHZ
[4] H. Bader: Lefirbucfider Pharmakologie und Toxikologie. Edition Medizin.
Verlag Chemie. Weinheim 1983.
[51 H. Groebe. Dtscfi. Wed. Wocfienscfir. 98 (1973) 1313.
[61 C. Schijpf, H. Bayerle, Justus Liebigs Ann. Cfiem. 513 (1934) 190.
[7] Die Kontiguration des F'yridoxyl-Substituenten an C-l in 10 und I 1 lie0
sich 'H-NMR-spektroskopisch aus der 'J-Kopplung zwischen I-H. und
4-Ha als Bquatorial, damit cis beziiglich der aquatorialen Carboxygruppe
und somit als (IR) ermitteln. Zur massenspektrometrischen Analyse wurden 8 und 10 enzymatisch zu 9 und 11 dephosphoryliert (saure Phosphatase, H20, pH 5). da sie als Phosphorsaureester auch nicht durch
schonende Ionisationstechniken (Felddesorption oder Fast Atom Bombardment) erfaBbar waren. - Uber die Darstellung dieser Kondensationsprodukte wurde bereits berichtet, ihre spektroskopische Charakterisicrung
- war -iedoch unvollst8ndia. wobei vor allem die Konfiauration maalicher epimerer Produkte vemachlbsigt wurde: E. A. Rudd, W. C. Cunningham, J. W. Thanassi, J. Med. Cfiem. 22 (1979) 233; C. B o m Voltattorni, A. Orlacchio, A. Giartosio, F. Conti, C. Turano, Eur. J. Eiocfiern. 53
(1975) 151; T. Kametani, M. Koizumi, K. Okui, Y. Nishii, M. Ono, J.
Med. Cfiem. 15 (1972) 203; J. H. Fellman, E. S. Roth, Biocfiemistry 10
(1971) 408; H. F. Schott, W. G. Clark, J . Biol. Cfiem. 196 (1952) 449.
181 Bei der Bewertung der absoluten Einbauraten (Gesamtradioaktivitet der
isolierten Alkaloide dividiert durch die der markierten Vorstufe 3 x 100)
ist zu beriicksichtigen, daB die dem Kijrper vertrauten Vontufen nach
ihrer Verteilung im lebenden Organismus auch in konkumerende Stoffwechselwege einflieOen und daB danlber hinaus auch die Alkaloide ihrerseits rasch weiter umgewandelt zu werden scheinen.
Der Ferrocenylmethyl(Fem)-Rest als
hochlipophile und chromophore Gruppe zur
Maskierung von PeptidbindungeP
HO
HO
Von Heiner Eckert* und Christoph Seidel
RO
Phosphotose
Schema 2. In-vitro- und in-vivo-Bildung von Pyridoxylisochinolin-Alkdloiden.
nen von Vitamin B6 noch erweitert durch die wahrscheinlich nichtenzymatische Pictet-Spengler-Kondensation zu
heterocyclischen Metaboliten.
Tabelle 2. Ergebnisse der umgekehrten lsotopenverdilnnungsanalysenach
Applikation von Pyridoxin 3* (10 KCi, 20 mg/kg) und L-Dopa 4 (20 mg/kg)
an Ratten.
Isoliertes
Alkaloid
(Probe)
Inkubationszeit [h]
8 (Blut)
8 (Blut)
8 (Leber)
10 (Blut)
10 (Blut)
10 (Leber)
4
6
6
2
4
6
Gesamtradioaktivitat
[nCil
1.9
3.0
0.2
0.7
Absolute
Einbaurate
[%I x 10'
1.9
3.0
0.2
0.7
Alkaloidgehalt
[ng/mL bzw.
ng/g]
0.8
0.8
133
206
28
53
57
<0.007
<0.007
<1
Eingegangen am 2. Oktober,
ergtinzte Fdssung am 11. November 1985 [Z 14811
[I] W. Whaley, T. Govindachari, Org. React. 6 (1951) 151.
[2] P. Holtz, K. Stock, F. Westermann, Nature (London) 203 (1964) 656.
[3] Siehe r B. M. Sandler, S. Carter, K. Hunter, G. Stem, Nature (London)
241 (1973) 439: J. L. Cashaw, K. McMurtrey, H. Brown, V. E. Davis, J.
Cfiromatogr. 99 (1974) 567; M. A. Collins, W.Nijm, G. Borge, G. Teas, C .
Goldfarb, Science206 (1979) 1184. ubersicht: M. A. Collins in A. Brossi:
The Alkaloid.$.Bd. X X I . S . 329, Academic Press, New York 1983.
168
0 VCH VerlagsgesellscfiaftmbH. 0-6940 Weinfieim.1986
Fur eine neue Strategie zur Chemosynthese von Peptiden''], die durch Verwendung stark lipophiler und chromophorer Gruppen gekennzeichnet ist, wurde eine Methode
zur Maskierung von Peptidbindungen entwickelt. Die Behandlung der chemisch reaktiven funktionellen Gruppen
ist durch die konventionellen Schutzgruppentechriikeni2I
weitgehend abgedeckt. Peptidbindungen sind hingegen
_ _ vor
allem ,,physikilisch reaktiv", das heifit, sie haben groaen
EinfluB auf Sekundarstruktur und LGslichkeit eines Peptids. Solche Konformationseffekte erschweren oft die Synthese. Versuche, diese Effekte zu verhinderni3],wurden von
Weygand et al. mit dem 2,4-Dimethoxyben~yl-Rest~~~~
unternommen.
et
erkannten die praparative Niitzlichkeit der IiDoDhilen
und chromoDhoren Ferrocenvlalkvl. .
- Gruppierung in stereospezifischen Reagentien13h1.Von
Ragnarsson et
wurde kurzlich die tert-Butoxycarbonylierung der Peptidbindung in einem Prolyl-glycin-Derivati3'] beschrieben.
Der chromophore (gelbe) Ferrocenylmethyl(Fern)-Re~tl~~
ermoglicht eine wirtschaftlich gunstige, regenerative Maskierung von Peptidbindungen zur Unterdriickung oder
Manipulation von Sekundarstrukturen und zur lipophilen
Solubilisierung von Peptid-Derivaten. Der Fem-Rest kann
durch einfache katalytische reduktive Alkylierung von
Aminosauren oder Aminosaure-estern mit kommerziell erhaltlichem Ferrocencarbaldehyd 1 und Wasserstoff eingefiihrt werden. Als Hydrierkatalysator kommt das hochselektive Palladium(ii)-phthalocyanin[s' in Betracht : Wlhrend 1 nur auBerst langsam reduziert wird, laBt sich das
aus 1 und der Aminosaure bzw. dem Aminosaureester erhaltene Azomethin 2 innerhalb einiger Stunden hydrieren.
Dabei entstehen die Fem-Aminostiuren bzw. deren Ester
racemisierungsfrei und in hohen Ausbeuten (Tabelle l),
[*I Dr. H. Eckert, C. Seidel
["I
Organisch-chemisches lnstitut der Technischen Univenitat Miinchen
LichtenbergstraBe 4. D-8046 Garching
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefardert.
W44-8249/86/0202-0168 $ 02.50/0
Angew. Cfiem. 98 (1986) Nr. 2
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