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G-Proteine und die Regulation der Adenylat-Cyclase (Nobel-Vortrag).

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AUFSATZE
G-Proteine und die Regulation der Adenylat-Cyclase (Nobel-Vortrag)**
Alfred G. Gilman*
Einleitung
Im Fruhjahr 1961 machte mir Earl Sutherland, ein Freund
meines Vaters, den Vorschlag, an einern M.D.-Ph.D.-Ausbildungsprogramm teilzunehmen, was damals pidagogisches
Neuland war. Er hatte es an der Western Reserve University, der
heutigeii Case Western Reserve University, in Ohio konzipiert.
Die Vorstellung, sieben Jahre in Cleveland zu verbringen, reizte
mich wenig und so bedankte ich mich bei ihm und lehnte hoflich
ab. Zum Gluck war Sutherland hartnackig. Im Herbst 1961,
dem Beginn meines letzten Collegejahres, schrieb er wieder und
ich entschlon mich zu einem Besuch. Damals warf ich meinen
ersten Blick auf das cyclische AMP, das Sutherland 1957 entdeckt hatte, wofur ihni 1971 der Nobelpreis verliehen wurde.
Das cyclische AMP, Sutherland und das M.D.-Ph.D.-Programm machten einen vielversprechenden Eindruck. Daher war
ich bei meiner Ankunft im September 1962 sehr enttauscht, als
ich erfuhr, daR Sutherland im Begriff war, an die Vanderbilt
University zu wechseln. Es bot sich jedoch eine gunstige Gelegenheit, rnit Theodore Rall zusammenzuarbeiten, einem jungeTen Mitarbeiter von Sutherland, der bei den bahnbrechenden
Versuchen von 1957 entscheidend beteiligt gewesen war. Ich
begann mit meiner Arbeit in seinem Labor und konnte in den
folgenden 30 Jahren nie mehr den cyclischen Nucleotiden widerstehen, obwohl ich es mehrmals versuchte. Der starkste Versuch
war mein EntschluB, im neu eroffneten Neurobiologielabor von
Marshall Nirenberg als Postdoktorand zu arbeiten. In unserem
ersten Gesprach nach meiner Ankunft in den National Institutes
of Health in Bethesda bat mich Marshall, ein Testsystem fur
cyclisches AMP zu entwickeln. Damit saR ich wieder in der
FalIe, aber ich habe nicht sehr energisch gekampft, um wieder
herauszukommen.
Mit der Entdeckung des cyclischen AMPS (CAMP) und der
Adenylat-Cyclase, eines Enzyms, das durch Hormone reguliert
wird und das das cyclische Nucleotid aus ATP herstellt, legten
Rall und Sutherland den Grundstein fur die Vorstellungen, wie
Signale durch die Membran gelangen und wie die hormonge-
[*I
[**I
Prof. A. G. Gilman
Department of Pharmacology
The University of Texas Southwestern
Medical Center at Dallas
Dallas, TX 75235 (USA)
Telefax: Int. + 214/648-8812
Copyright The Nobel Foundation 1995. Wir danken der Nobel-Stiftung,
Stockholm, fur die Genehmigung zum Druck einer deutschen Fassung des
Vortrags.
Angew Chem. 1995, 107, 1533-1548
steuerte Synthese der intrazellularen sekundaren Botenstoffe
ablauft (Abb. 1). Beide Forscher waren biochemisch ausgebildet worden, Sutherland von Carl Cori und Rall von Albert
Lehninger, und zusammen begannen sie rnit der Erforschung
der Wirkungsweise von Hormonen. Dabei wandten sie die klassische Lehre an, daR aus der Kenntnis der einzelnen Teilschritte
die gesamte Reaktion verstiindlich wird. In den 5Oer Jahren war
uber Hormone nur bekannt, daB sie Regulatorverbindungen
sind und mit intakten Zellen wechselwirken. Sutherland und
Rall entdeckten ein System, in dem eine charakteristische Wirkung von Adrenalin und Glucagon in Homogenaten, die Aktivierung von Phosphorylase, festgestellt werden konnte. Durch
eine gereinigte Fraktion wird dabei zunachst cAMP durch eine
Stimulierung mit Hormonen synthetisiert, das dann Phosphorylase im Cytosol aktiviert1'1. Damit gab es einen ersten, allerdings
noch arbeitsaufwendigen Assay fur die Adenylat-Cyclase, und
Hormonwirkungen konnten durch Zugabe von ATP zu Plasmamembranen untersucht werden.
Die Vorstellung, daB es Rezeptoren fur engogene Regulatoren und fur Wirkstoffe gibt, tauchte um die Jahrhundertwende
mit den pharmakologischen Versuchen von Langley und Ehrlich auf. Als cAMP entdeckt wurde, konnten allerdings vide
Forscher rnit dem damals metaphysisch anmutenden Rezeptor-
-
0 VCH
Abb. 1 . Friihe Darstellung von Sutherlands Konzept der sekundiren Botenstoffe.
Verlag~gesellschufrmbH, 0.69451 Welnherm,1995
OU44-8249/95/1313-15338 lU.OO+.ZS/O
1533
AUFSATZE
A. G. Gilman
begriff nichts anfangen. Der Begriff Rezeptor ist im Index von
The Pharmacological Basis of Therapeutics, dem Standardwerk
der Pharmakologie, in der Ausgabe von 1955 nicht verzeichnet.
Es stand jedoch der folgende Satz dort: ,,Years ago, Langley
named the differentiating substance the ,receptive substance';
this term is still widely employed, but it must be realized that the
,receptor' may not be a morphologically demonstrable structure." Aufgrund der Versuche von Rall und Sutherland wurden
Assays fur Rezeptoren entwickelt und so bewiesen, daR es Rezeptoren wirklich gibt. Ahlquist fiihrte den Begriff der p-adrenergen Rezeptoren ein. Sein Konzept paljte zu den Wirkungen
von Adrenalin und ahnlichen Substanzen auf Adenylat-Cyclase,
und der erste neuentdeckte B-adrenerge Antagonist konnte deren Wirkungen blockieren
Damit begann die biochemische
Rezeptorforschung, und die Frage trat auf, in welcher Beziehung der 8-adrenerge Rezeptor zur Adenylat-Cyclase steht.
Konnte das Enzym der Rezeptor sein? Vielleicht, aber diese
Hypothese setzte die Existenz einer Gruppe von Adenylat-Cyclasen mit ganz bestimmten Stellen fur die Regulation voraus,
da gezeigt werden konnte, dalj die Enzymregulation nicht auf
Adrenalin und Glucagon beschrankt war: Das andrenocorticotrope Hormon (ACTH), das thyreoidstimulierende Hormon
(TSH) , das luteinisierende Hormon (LH), das antidiuretische
Hormon (ADH) sowie andere Stimulatoren und die Inhibierung
der Adenyiat-Cyclase durch cholinerge Agonisten wurden entdecktF3].
Mehr als ein Jahrzehnt nach der Entdeckung der AdenylatCyclase lieferten Martin Rodbell et al. starke, allerdings indirekte Beweise, da13 Kezeptoren und Adenylat-Cyclasen unterschiedliche Molekule sind. Die Adenylat-Cyclase aus Fettzellen
wird durch sehr vide Hormone stimuliert. Wenn es bestimmte
Cyclasen gabe, die jeweils auch als Rezeptor fungieren konnten,
ware die Wirkung auf die maximal wirksamen Hormonkonzentrationen additiv. D a dies nicht der Fall ist, konnte angenommen werden, daI3 unterschiedliche Rezeptoren rnit vielen Adenylat-Cyclasen wechselwirken k o n ~ ~ e n [Dieser
~ ] . Punkt wurde
endgiiltig in den 70er Jahren gekllrt, als Ligandenbindungsassays fur Rezeptoren eingefuhrt wurden. Damit konnten Rezeptoren untersucht werden, ohne auf die Bestimmung ihrer Wirkungen angewiesen zu sein. Adenylat-Cyclasen konnten nun in
Losung gebracht und von den 8-adrenergen Rezeptoren getrennt werden. Damit wurde bewiesen, da13 es sich um unterschiedliche Makromolckiile handelt15*'1.
Die Anfange der G-Protein-Forschung
Damals stand die Frage nach dem Mechanismus der Wechselwirkung oder ,,Kopplung" zwischen Rezeptoren und AdenylatCyclase im Vordergrund. Die einfache Annahme, daI3 ein
Agonist-Rezeptor-Komplex ein allosterischer Regulator des
Enzyms ist, wurde auch von Rodbell bezweifelt, der als erster die
Idee verkiindete, ein Ubertrager konnte zwischen Rezeptor und
Adenylat-Cyclase ~ermitteln[~!
Zwar war diese Hypothese zunachst eher instinktiv aufgestellt worden, und die Lipiddoppelschicht wurde als moglicher Ubertrager diskutiert, doch wurden
bald Ergebnisse erhalten, die zu genaueren Erkenntnissen fuhrten. Rodbell, Birnbaumer und Mitarbeiter machten die iiberraschende Entdeckung, daD fur die Regulation nur ein Ligand, der
Agonist des Rezeptors, nicht ausreichte, um Adenylat-Cyclase
zu aktivieren. Ein Hormon konnte das Enzym nur aktivieren,
wenn auch GTP vorhanden war[']. Dies hatte man mehr als
zehn Jahre iibersehen, da sowohl die Membranpraparationen
als auch das Substrat ATP mit G T P in ausreichend hohen Konzentrationen im FM-Bereich verunreinigt waren. Von dem Zeitpunkt a n war klar, dai3 die Inhibierung der Adenylat-Cyclase
durch Hormone ebenfalls von G T P abhangt['I. Es sei Rodbell
iiberlassen, diese Versuche im Detail zu besdireiben[*l. Anzumerken ist, daI3 es an der Bedeutung dieser Ergebnisse erhebliche Zweifei gab (Abb. 2), da es schwierig war, die Ergebnisse zu
reproduzieren. Die meisten Forscher arbeiteten nicht mit den
ausgezeichneten Menibranpraparationen, die im Labor von
Rodbell verwendet wurden.
Bereits Mitte der 70er Jahre ergaben mehrere Untersuchungen, daI3 GTP fur die Regulation der hormonabhhgigen Aktivitat von Adenylat-Cyclase wichtig ist. Am bedeutungsvollsten
war der Befund von Cassel und Selinger, daR eine hormonstimulierende GTPase rnit der Aktivierung von Adenylat-Cyclase verkniipft zu sein schien. Aus technisch schwierigen kinetischen
Untersuchungen zogen sie die richtige SchluOfolgerung, d a b
GTPase ein hormonvermitteltes Signal beenden kann["]. Die
Versuche von Londos, Schramm und Mitarbeitern stimmten
mit diesen Uberlegungen iiberein. Sie bemerkten, dalj nichthydrolysierbare Analoga von GTP, wie Gpp(NH)p, die Adenylat-Cyclase deutlich und ohne Hormone aktivieren" '1. Mein
erster Postdoktorand, Michael Maguire, entdeckte, daD GTP
' 9
['I
Siehe folgenden Nobel-Voltrag von M. Rodhell
Aljred G. Gilman wurde 1941 in New Haven, C T ( U S A ) ,geboren. Er studierte Biochemie an der
Yale University und promovirrte 1969 in Pharmakologie an der Case Western Reserve University
in Cleveland, OH. Nach einem Postdoktorandenaujenthalt im Laboratory of Biochemical Genetics
an den National Institutes of Health in Bethesda, M D , ging er 1971 an die University of Virginia,
M'O er am Department ofPharmucology als Assistant Projessor (1971- 1973), Associate Prof2ssor
(1973- 1977) und Professor (1977- 1981) tatig war. Seit 1981 ist er Chairman of Pharmacology
an der University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, T X . Gilman entdeckte, charakrtviyierte und reizigte eine Reihe w n Guanin-Nucleoti~d-bindendenRegulatorproteinen (GProteinen). Seine Arbeiten sind die Grundlage unseres heutigen Verstandnisses von unterschiedlichen Signaliihertraguiig.~prozessenauf molekularer Ebene. Gilman cvurde vielfach geehrt
und seine Arheit gewxiirdigt 1994 erliielt er den Nobel-Preisfur Medizin und Phqsiologie.
~
1534
Angew. C l i ~ m1995.
.
107, 1533- 1548
G-Proteine/Nobel-Vortrag
AUFSATZE
A
Abb. 2. Karikatur von Dr. Pierre DeMeytes aus den 70er Jahren. Dab GTP fur die
Ubermittlung voii Transmembransignalen notwendig ist, wurde nicht von allen
Forschern gleich erkannt (mit freundlicher Genehmigung von Dr. DeMeytes).
die Affinitat der Rezeptoren fur Agonisten, aber nicht fur Antagonisten selektiv senkt1'31. Eine Interpretation dieses unerwarteten Befundes gab es nicht, doch war klar, da13 dieses Ergebnis
wesentlich war.
Wahrend dieser Zeit versuchten einige unermudliche Mitarbeiter, die Komponenten des hormonabhangigen Adenylat-Cyclase-Systems in Losung zu bringen und zu reinigen. Dies war
schwierig, denn sobald Detergentien zugefiigt wurden, konnte
keine Hormonabhangigkeit mehr festgestellt werden. Die Adenylat-Cyclase erwies sich zudem als sehr labil. Eva Neer war
wahrscheinlich die erste, die das Enzymsystem von einem biochemischen Gesichtspunkt aus betrachtete und seine hydrodynamischen Eigenschaften unter~uchte['~].
Eine daruber hinaus
gehende konventionelle biochemische Erforschung des Systems
erschien schwierig.
Der Wendepunkt kam fur uns, als Daniel et al. die cytotoxische Wirkung von cAMP auf klonale S49-Lymphomzellen beschrieb[lS1.Bald darauf isolierten Bourne et al. eine Variante
dieser Zellen, cyc-, die keine Adenylat-Cyclase zu enthalten
schien1I6],obwohl laufend eine normale Zahl an j3-adrenergen
Rezeptoren exprimiert wurde['71. Wir konnten eine andere,
noch interessantere Variante der S49-Zellen isolieren: eine entkoppelte (uncoupled, UNC) Mutante. Diese schien zwar alle
normalen Rezeptoren und Adenylat-Cyclase zu enthalten, produzierte aber kein CAMP,wenn sie mit geeigneten Hormonen,
2.B. mit p-adrenergen Agonisten oder Prostaglandinen, stimuliert wurdelLS1.Durch diese Varianten wurde der Zugang zum
Verstandnis der biochemischen Vorgange einfacher, besonders
fur Elliott Ross, einem begabten und gut ausgebildeten Membranbiochemiker, der 1975 in meine Arbeitsgruppe kam. Ross
versuchte, die cyc- -Variante in vitro zu rekonstituieren. Dazu
extrahierte er Adenylat-Cyclase aus Zellen, die keine /3-adrenergen Rezeptoren besaBen, und versuchte dann, sie wieder rnit den
Rezeptoren der cyc--Membranen zu kombinieren (Abb. 3).
Nach mehreren Anlaufen gelang ihm dies: Die cyc--Membranen konnten rekonstituiert werden und wiesen eine
catecholaminabhangige Adenylat-Cyclase-Aktivitat auf" 'I. Dies
war der erste Schritt zur Aufklarung und Rekonstitution des
Systems, der sich schnell bezahlt machen sollte. Die anfanglichen Rekonstitutionsversuche waren aus den erwarteten Grunden nicht erfolgreich gewesen. Wenn die Adenylat-Cyclase in
Angen. Chrm. 1995, 107. 1533-1548
t l minAbb. 3. Versuche. die zur Entdeckung des G,-Proteins fiihrten. A) Versuchsdarstellungen. Links: 1. Elliott Ross exti-ahierte Membranproteine rnit Detergentien uiid
gab sie zu cyc--Membranen. von denen man annahm, daB sie keine Adenylat-Cyclase besitzen. 2. Durch Adrenalin (Epinephrin) wurde die Produktion \ o n cATP
stimuliert, was darauf hindeutete, daB Adenylat-Cyclase in die cyc--Meinbranen
eingefuhrt worden war. Mitte: In einem Kontrollversuch wurde Adenylat-Cyclase
in den Extrakren inaktiviert. Auch unter diesen Bedingungen konnte durch Adrenahzugdbe zu den cyc--Menibranen die Brldung von cAMP stimuliert werden.
Rechts: Diese verbluffenden Ergebnisse fiihrten zur Entdeckung, daB die cyc-Membran zwar Adenylat-Cyclase enthalt, aber eiiie dritte Komponente henotigt,
um das Enzym aktivieren zu konnen: ein auch nach der Inaktivierung der AdenylatCyclase im Extrakt vorhandenes G-Protein. Nach seinem Einbau in die Membran
konnte die dort vorhandene Adenylat-Cyclase cAMP synthetisieren (mil freundlicher Genehmigung aus Lit. [154]). B) Ergebnisse dieser Versuche: Rekonstitution
der durch Hormone regulierten Adenylat-Cyclase durch Mischung von cyc --Menibranen mit Extrakten aus Wildtyp-Membranen, die durch Hitze inaktiviert wurden.
Die Detergentienextrakte aus Wildtyp-Membranen wurden fur die auf der Abszisse
angegebenen Zeit auf 30°C erwlrint, anschliehend abgekiihlt und rnit den cyc-Membranen gemischt. Die Adenylat-Cyclase-Aktivitat, R(AC) [pmol min ' mL- '1,
wurde dann nach Zugabe von GTP, von dein mit Adrenalin verwandten Improtereno1 + GTP, von NaF und von Gpp(NH)p gemessen. Die rnit NaF und Gpp(NH)p
stimulierte Adenylat-Cyclase-Aktivitat der inkubierten Extrakte vor dem Mischen
mit cyc--Membranen ist gestrichelt eingezeichnet (mit freundlicher Genehmigung
aus Lit. [21]).
~
1535
AUFSATZE
den Detergens-Zellextrakten, die wir fur die Rekonstitutionsversuche verwendeten, inaktiviert wurde, konnten wir eine unverminderte hormonabhiingige Adenylat-Cyclase-Aktivitht
feststellen. Die Zugabe eines Detergens-Extraktes ohne
Adenylat-Cyclase-Aktivitht zu cyc--Membranen, die zwar den
Rezeptor enthielten, aber auch keine Adenylat-Cyclase-Aktivitat aufwiesen, fiihrte also wieder zur vollstiindigen Reaktion
(Abb. 3). Behandlungen rnit Proteasen ergaben wenig splter,
daB sowohl der Detergensextrakt als auch die cycC-Membran
Proteine enthalten, die fur eine Adenylat-Cyclase-Aktivitlt notwendig sind, und zwar fur die Grundaktivitat genauso wie fur
die durch Hormone, Fluoride oder Guanin-Nucleotide stimulierte Aktivitat. Heute wissen wir, daB die spezifischen Isoformen der Adenylat-Cyclase, die in den S49-Zellen iiberwiegen,
eine erstaunlich niedrige Grundaktivitat haben. Man brauchte
also zwei Proteine. den Katalysator oder die Adenylat-Cyclase,
die tatslchlich in den cyc--Membranen vorhanden war, und ein
stimulierendes Protein, das in den cycC-Membranen fehlt, aber
die milden Bedingungen zur Inaktivierung der AdenylatCyclase in den fur die Rekonstitution verwendeten Extrakten
uberstanden hat. Wir machten den Vorschlag, da13 der Hormonrezeptor die Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Komponenten reguliert
211. Gleichzeitig gelang Pfeuffer eine teilweise Trennung von Adenylat-Cyclase und einem aktivierenden
Protein durch Affinitatschromatographie an einem GuaninNucleotid-substituierten Harz[221.
Dieses neue Protein wurde bald zum Gegenstand unserer Forschung, da es unbekannter und stabiler als die Adenylat-Cyclase
war. Zusitzliche Versuche von Ross deuteten an, daB das Protein - zunachst G / E spiiter G, genannt -- die Bindungsstelle fur
Guanin-Nucleotide und Fluorid istr2']. Diese Annahmen wurden durch hydrodynamische Untcrsuchungen der Aktivitiit von
Allyn Howlett gestutzt. Sie entdeckte Veranderungen, die durch
Gpp(NH)p und Fluorid hervorgerufen wurden und andeuteten,
daR das Protein nach einer Aktivierung durch diese Liganden in
seine Untereinheiten d i s s o ~ i i e r t [ ~Paul
~ ] . Sternweis und John
Northup gelang es, das G,-Protein zu reinigen. Durch Mutationsversuche entdeckten wir es in den S49-Zellen. D a sich die
Adenylat-Cyclase durch das Protein aktivieren IieB, gab es eine
einfache Nachweismethode. Was wir damals nicht wuRten war,
daR das G,-Protein das am wenigsten verbreitete aller G-Proteine 1st. Trotzdem fuhrten die Beharrlichkeit und die Fahigkeiten
aller Beteiligten ziim Erfolg, und wir konnten zeigen, daR G, ein
homogenes Protein ist, das Guanin-Nucleotide binden kann.
AuBerdem kann es, wenn es mit Gpp(NH)p oder Fluorid aktiviert wird, auch Adenylat-Cyclase aktivieren (Abb. 4)[24,2 5 1 . Es
besitzt eine 35 kDa schwere 8-Untereinheit. Eine dritte, 8 kDa
schwere 7-Untereinheit wurde damals allerdings noch nicht entdeckt.
Weitere Untersuchungen ergaben, daB ein Aquivalent des
Guanin-Nucleotids an die cc-Untereinheit des Oligomers bindet.
Die Aktivierung durch Gpp(NH)p oder Fluorid ist in der Tat
rnit einer Dissoziation in die Untereinheiten verbunden und die
abgetrennte x-Untereinheit, die Gpp(NH)p gebunden hat, ist
notwendig und ausreichend fur die Aktivierung der AdenylatCyclase (Abb. 5)12'. "I. Weitere Versuche zur Aufklarung des
Mechanismus, nach dem das G,-Protein durch Fluorid aktiviert
wird, sorgten fur Uberraschungen. Der Effekt von Fluorid war
deutlich. wenn die Versuche in Glasrohrchen oder mit Kompo1536
A. G . Gilman
Abb. 4. A) Polyacrylamid-Gelelektrophorese von gereiniglen Fraktionen von G,Proteinen. Spur 1: Proteinfraktion aus elner l'ruhen Reinigungsstufe, Spur 2 und 3 :
Auftrngung von 3 bzw. 8 pg gereinigtem Protein; B) Markiei-uiig von gereinigtem
G,-Protein nut Cholera-Toxin und [3'P]NAD. Spur 1 : Mit Coomassie-Blau gefarbtes gereinigtes Protein; Spur 2 und 3: Autoradiogramme des mlt dem Cholera-Toxin
[32P]ADP-ribosyliertenProteins, die nach 16 bzw. 48 h entwickelt wurden. Die
beiden Bandcn bei hoherem Molekulargewicht entsprechen alternativ gespleioten
Formen von G,,-Proteinen. Die Bande be] niedrigerem Molekulargewicht entspricht der [i-Untereinheit (mit freundhcher Genehmigung nus Lit. [24]).
nenten aus dem Adenylat-Cyclase-Assay, z.B. ATP, durchgefuhrt wurden, verschwand aber bei Versuchen ohne ATP in Plastikrohrchen[28,2y1. Paul Sternweis isolierte aus ATP und waarigen Extrakten von Einmalglasrohrchen den Coaktivator. Es
gab Hinweise, daB ein Metall beteiligt ist. Eine Neutronenbeugungsanalyse ergab, daI3 es sich um AI3+ handelt[291.Die Bedeutung und der Wert dieses Ergebnisses wurde zehn Jahre spater offensichtlich.
Damals untersuchten wir, angeregt durch die Arbeiten von
Vaughan13'] und
auch die ADP-Ribosylierung des G,-Proteins durch das Cholera-Toxin, das wir reinigen
konnten. Im Verlauf der Reinigung verlor das Cholera-Toxin
allerdings die Fahigkeit zur ADP-Ribosylierung des (3,-Proteins. Sie konnte durch die Zugdbe eines Proteinfaktors wiederhergestellt ~ e r d e n l ~Der
~ ] Faktor
.
wurde ebenfalls gereinigt und
ADP-ribosylierender Faktor (ARF) genannt. Er ist ein Protein
rnit niedrigem Molekulargewicht, das GTP I ~ i n d e t [3 5~1 .~Heute
*
weiI3 man, d a b A R F ein wichtiger Regulator in der Proteinubert r a g ~ n g [und
~ ~ ein
I Aktivator der Phospholipase D i ~ t [ ~ 'Seine
].
Verbindung mit dem Cholera-Toxin und/oder dem G,-Protein
ist noch ungeklart.
Ende der 70er und Anfang der 80er Jahre charakterisierten
Michio Ui et al. in Japan aus Bordetella pertussis das inselaktivierende Protein (IAP). Wenn Zellen oder Membranen mit diesem Toxin behandelt werden, zeigen sie keine Inhibierung der
Adenylat-Cyclase durch Hormone inehr; in einigen Fallen wurde die hormonelle Stimulierung des Enzyms allerdings durch
IAP g e ~ t e i g e r t ~Gleichzeitig
~~].
wurde entdeckt, daR das Toxin
den Einbau der ADP-Ribosyl-Einheit aus N A D in ein 41 kDa
Angmr. Chrm. 1995. 107. 1533-1548
G-Proteine/Nobel-Vortrag
AUFSATZE
0.04
1
0’03
A,,, 0.02
0.01
0
und den hormonabhangigen Adenylat-Cyclasen hin. Bitensky
hatte eine cyclische GMP-Phosphodiesterase in der Netzhaut
entdeckt, die durch Licht aktiviert werden
Besonders
bemerkenswert waren die Beschreibungen einer lichtaktivierbaren G T P ~ S und
~ [ ~die
~ Tatsache,
]
daD fur die Aktivierung der
Phosphodiesterase ein Guanin-Nucleotid erforderlich ist. Aufgrund dieser Befunde wurde das Protein Transducin isoliert und
G,-Protein genannt[47’48J.
Man erkannte, daB die G7-,GI- und
G,-Proteine eine Gruppe von strukturhomologen, Guanin-Nucleotid-bindenden Proteinen mit verwandten cr-Untereinheiten
und sehr ahnlichen oder identischen P-Untereinheiten sind
(Abb. 6)[491. Aufgrund ihres haufigen Vorkommens wurde die
puntereinheit im Heterotrimer Transducin
IAP-Substrat
Transducin
GF
!
friih erkannt; wegen ihrer schlechten Anfarb- M,[kDa] 35 39 35 41 35 45
barkeit wurde sie aber
erst spater als Bestandteil der G,- und Gi- PLaseBSA Proteine
nachgewiesen[41. sol
Oval Fur eine kurze Zeit
CAzu Beginn der 80er Jahre schien es ruhiger zu
werden. Die G,- und
TI G,-Proteine stimulier-
-A
Fraktionsnummer
-
Abb. 5. Trennung der G,-Protein-Untereinheit durch Gelfiltration. Gereinigtes G,Protein wurde durch Inkubation mit [’5S]GTPyS radioaktiv markiert. Nach der
Entfernung van freien Nucleotiden wurde das Protein durch Hochleistungsgel~ltration untersucht. Das obere Diagranim reigt die Absorption A (280 nm) der eluierten
Proteinfrdktionen. Als Einschub ist die Silberfiirbung einer an Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid durchgefiihrten gelelektrophoretischen Trennung der Hauptfraktionen dargestellt: 1. Spur: 1. Peak, 2. Spur: 2. Peak, 3. Spur: reines Protein.
Das untere Diagramm zeigt die gemessenen Aktivitaten. Die Aktivitat des G,-Proteins, k(GJ [mmolmin-’ mL- ‘1 (o), wurde iiber die Aktivierung der Adenylat-Cyclase bestimmt. Dariiber hinaus wurde die durch die Bindung von [3SS]GTP)San
das G-Protein resultierende Radioaktivitat A(GTPp”SS) [Zahlrate pro mL] ( 0 )
sowie die 35 K-Aktivitit A (35 K) bei 14 min t,,* (A) als Man fur die Aktivitit der
Bq-Untereinheiten gemessen. Die Nucleotid-Bindungsaktivitiit und der Fahigkeit,
Adenylat-Cyclase zu aktivieren, sind demnach ausschlieBlich der gelosten a-Untereinheit, die nach Aktivierung des G,Protems durch GTP/S von der /b-Untereinheit
dissoziiert. zuzuschreiben (mit freundlicher Genehmigung aus Lit. [27]).
~
schweres Membranprotein k a t a l y ~ i e r t [ ~Die
~ J . Ahnlichkeiten
zum Cholera-Toxin waren bemerkenswert. Zwei meiner Postdoktoranden, Toshiaki Katada, ein ehemaliger Student von
Professor Ui, und Gary Bokoch, begannen, mit dem Toxin von
Professor Ui zu arbeiten. Dabei fie1 John Northup auf, daB ihm
bei der Reinigung des G,-Proteins oft eine 41 kDa schwere Verunreinigung untergekommen war. Er besaD sogar noch eingefrorene Proben, die rnit dieser Verunreinigung angereichert waren. Moral: Werfe nie etwas weg! (Siehe auch Abb. 4). Im ersten
Versuch erwies sie sich als ausgezeichnetes Substrat fur die
ADP-Ribosylierung durch IAP, und wir wurden fur unsere aufwendigen Versuche zur Reinigung des G,-Proteins belohnt. Die
Reinigung dieses IAP-Substrat genannten Proteins schritt
schnell ora an[^'^, unter anderem auch durch die Tatsache, daB
es haufiger vorkommt als das G,-Protein. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daI3 das IAP-Substrat ein homologes G-Protein ist, und zwar das G,-Protein, das die Adenylat-Cyclase inhibiert. Dies wurde ein Jahr spater durch eine vollstandige
Charakterisierung des G,-Proteins bewiesenL41-44J. Trotzdem
sind die tatsachlichen Mechanismen (Plural ist beabsichtigt !),
wie Adenylat-Cyclase durch das G,-Protein inhibiert wird, noch
ungeklart.
Wahrend dieser Zeit wies uns Bitensky immer wieder auf
Parallelen zwischen dem Ubertragungsweg beim Sehvorgang
Angew Chem. 1995, 107, 1533-1548
ten bzw’ inhibierten
Guanin-Nucleotid vermitt& die AdenylatCyclase, und mit dem
Transducin wurden die
Ergebnisse beim Seh-
Abb. 6. Elektrophoretische Trennung der gereinigten Untereinheiten van Transducin (G,),
vom IAP-Substrat (G,) und vom G F-Protein
(GJ. Die a-Untereinheiten aller drei G-Proteine haben unterschiedliche Molekularaewichte,
wahrend die der P-Untereinheiten g l k h sind.
Eine Peptidkartierung und eine Andlyse der
Aminosaurezusammensetzung der Unterein‘Organg erklart. In “- heiten ergaben, daB die a-Untereinheiten zwar
sammenarbeit mit Ross
unterschiedlich aber verwandt sind. wdhrend
die b-Untereinheiten sehr Phnlich oder idenkonnten wir cine stitisch sind (mit freundlicher Genehmigung aus
mulierung der AdenyLit. [49]).
PLase = Schweineleber-Esterase,
BSA = Rinderserumalbumin, Oval = OvalbuIat-Cyclase durch Hormin, CA = Carboanhydrase, TI = TrypsinmOne feststellen, indem
inhibitor.
wir drei gereinigte Proteine verwendeten, die zu Phospholid-Vesikeln rekonstituiert
worden waren I 5 I J: den P-adrenergen Rezeptor, das G,-Protein
und die Adenylat-Cyclase. Gab es weitere G-Proteine? Wichtige
Anhaltspunkte sollten bald folgen: Sternweis et al.[521sowie
Neer et
entdeckten das Go-Protein,das iiberraschend haufig im Gehirn vorkommt. Fain et al.[541 sowie Gomperts
et al.[551beobachteten eine hormon- und GTP-abhangige Stimulierung der Inositol-Triphosphate-Synthese.Es wurden Homologien in der Aminosauresequenz zwischen den signaliibertragenden G-Proteinen und den p2Iras-Genprodukten
festgestellt[s6J,und auch das Klonieren b e g a ~ ~ n [’*I.
~’%
Es war
jetzt an der Zeit das Methodenrepertoire zu erweitern und Forscher anderer Disziplinen hinzuzuziehen.
G-Proteine: von Pheromonen bis zu Photonen
An dieser Stelle mochte ich die geschichtlichen Aspekte verlassen und den derzeitigen Stand der Forschung iiber die G-Protein-vermittelte Transmembran-Signaliibertragung beschrei-
1537
AUFSATZE
ben. Es ist besonders in den letzten zehn Jahren klar geworden,
dalj diese relativ grolje Gruppe von heterotrimeren GTP-bindenden und -hydrolysierenden Proteinen eine wichtige
Ubertragerrolle spielt, indem sie zwischen Hunderten von Rezeptoren an der Zelloberflache und Effektorproteinen in der
Plasmamembran vermittelt. Solche Systeme kommen in der Natur hlufig vor. Sie kontrollieren Vorgange, die von der Vermehrung in Hefen bis zur Wahrnehmung beim Menschen reichen.
Die Rezeptoren, die G-Proteine aktivieren, sind dementsprechend unterschiedlich. Es sind Proteine, die mit Hormonen,
Neurotransmittern. Lokalhormonen, Autacoiden, Riech- sowie
Geschmacksstoffen, Pheromonen nnd Photonen wechselwirken. Mehrere Uber~ichtsartikel[’~
-’‘I
zu diesem Gebiet sind
empfehlenswert - auch fur den Zugang zur Originalliteratur.
A. G. Gilman
heiten anscheinend verboten sind und manche a-Untereinheiten
einige By-Dimere bevorzugen, ist die Zahl moglicher Oligomere
immer noch sehr hoch.
Jede a-Untereinheit eines G-Proteins enthalt eine Bindungsstelle rnit hoher Affinitat fur ein Guanin-Nucleotid. Die x-Untereinheit rnit gebundenem GDP ist relativ inaktiv und hat eine
hohe Affinitat zum py-Komplex. Der GDP-aBy-Komplex ist daher das inaktive Oligomer. Der durch den Rezeptor katalysierte
Guanin-Nucleotid-Austausch fuhrt zur Bildung des GTP-aKomplexes, und die damit einhergehenden Konformationsanderungen verursachen die Dissoziation der a- von der /fif-Untereinheit (Abb. 8). Damit werden zwei Regulatoren von strom-
i-
Uberblick iiber die Funktion und die Struktur
von G-Proteinen
Zwar sind G-Proteine Heterotrimere, doch verhalten sie sich
wie dissoziierbare Dimere. Die /I- und y-untereinheiten bilden
fest assoziierte Komplexe, die als Einheit reagieren. G-ProteinOligomere werden anhand ihrer x-Untereinheiten unterschieden. Obwohl eine Reihe von By-Komplexen offensichtlich erfolgreich und unterschiedslos mit vielen a-Untereinheiten
assoziieren kann, ist nicht bekannt, inwieweit dies in vivo auftritt.
Sechzehn unterschiedliche Gene codieren die a-Untereinheiten der G-Proteine in Saugetieren. Es werden etwa 20 Proteine
synthetisiert, einschlienlich der Produkte. die als Folge des alternativen SpleiBens von mRNA gebildet werden. Die allgemein
anerkannte Einteilung der a-Untereinheiten beruht zwar auf
Strukturbeziehungen, doch wird sie (Abb. 7) auch den Funktionen gerecht[661.Es werden vier Gruppen unterschieden: 1) die
kleine G,-Gruppe aus G, und G,,,. die als Aktivatoren von Adenylat-Cyclasen bekannt sind, 2) die grolje und funktionell verschiedenartige G,-Gruppe, deren Mitglieder mit Ausnahme von
G, Substrate des Keuchhustentoxins sind, 3) die Go-Gruppe,
deren Mitglieder Aktivatoren der Isoformen von
Phospholipase Cp sind,
und 4) die erst kiirzlich
bekannt gewordene GI*Gruppe aus Proteinen,
deren Funktionen noch
nicht bestimmt wurden.
Es sind funf Gene bekannt, die P-Untereinheiten codieren, und sechs
Gene, die y-Untereinheiten codieren. Wenn alle
Kombinationen zwischen
a-, B- und y-UntereinheiJGi2
ten erlaubt waren, miinte
l1
o
:
3
b
i
man rnit mindestens 600
Arninosaureubereinstirnrnung / %
G - Protein - Oligomeren
Abh. 7 . Ubereinstimmungen in der Aminorechnen. Auch wenn einisduresequenz von r-Unteremheiten der Gge Kombinationen zwiProteine von Siugetleren (modifiziert, ndch
Lit. [65,661).
schen 8- und y-unterein-
1,
1538
GTP
t
‘Pi
\
J
S
P
Ahb. 8. Die Rolle der G-Proteine in der Ubertragung von Trdnsmembransigndlen.
1) Im Grundzustand liegen G-Proteine als Heterotrimere vor. wobei G D P fest an
die a-Untereinheit gehunden ist. Der Hormonrezeptor R ist frei, und der Effektor E
wird nicht reguliert. 2) Bindet ein Hormon (H) an den Rereptor. wird dieser aktiviert und wechselwirkt rnit dem Heterotrimer. Es findet eine Konformationslnderung statt und G D P dissoziiert von der Guanin-Nucleotid-Bindungsstelle. Unter
normalen zellullren Bedingungen hinsichtlicb der KonLentration an GuaninNucleotiden wird die freie Stelle sofort von GTP besetzt. Ohne GTP hehllt das
Hormon eine hohe Aftinitit zum Rezeptor, und der H-R-G-Komplex ist stabil. 3)
Wenn G T P an die G.-Untereinheit bindet, iindert sich die Konformation, was zwei
Folgen hat. Erstens dissoziiert das G-Protein vom H-R-Komplex und vermindert
dadurch die Affinitat des Hormons zum Rezeptor. so da13 auch dieser Komplex
dissoziiert und der freie Rezeptor ein benachbartes, noch inaktives G-Protein hinden kann. Zweitens vermindert die Bindung von GTP die Affinitlt der G,- fur die
Go;-Untereinheit, und die Untereinheiten trennen sich. 4) Die freie G,-GTP-Untereinheit kann jetzt ihre wichtigste Funktion als Regulator des Effektors erfiillen und
die enzymdtische Umsetzung eines Substrdts S zum Produkt P aktivieren. In einigen
Systemen kann auch die freie G,,-Untereinheit direkt mit Effektoren (E,) wechselwirken und so deren Aktivitlt beeinflussen oder davon unahhiingig auf andere
Effektoren (E,) wirken. 5 ) Die G,-Untereinheit besitzt eine intrinsische CTPase-Aktivitit. Die Zerfdlsgeschwindigkeit der GTPdse bestimmt die Lehenszeit der aktiven
Spezies und damit Dduer der zugehorigen physiologischen Antwort. Durch die
Hydrolyse von GTP dnrch die G,-Untereinheit entsteht GDP. der aktive G,-ElKomplex dissoziiert und wird inaktiviert. Die (3%-GDP-Form besitzt eine hobe
Affinitat zur G,,-GDP-Untereinheit; sie assoziieren und bilden wieder den Ausgangszustand (mit freundlicher Genehmigung aus Lit. [68]).
abwarts gelegenen Effektoren, der GTP-a-Komplex und die ByUntereinheit, freigesetzt. Die a-Untereinheiten sind schwache
Enzyme rnit einer GTPase-Eigenaktivitat. Nach einer fur jede
a-Untereinheit charakteristischen Zeit wird GTP zu GDP hydrolysiert, wonach die Untereinheiten wieder assoziieren, und
der Grundzustand wird somit wiederhergestellt. G-Proteine wirken also als Schalter und als Zeitschaltuhren. Die hohe Affinitat
der a-Untereinheit (und besonders des Oligomers) zu G D P halt
Anxew. Chcm. 1995. 107, 1533-1548
G-Proteine/Nobel-Vortrag
den Schalter in Aus-Stellung ; durch den Nucleotidaustausch
wird die Enzymaktivitat eingeschaltet und durch die Hydrolyse
von GTP mit einer charakteristischen Verzogerung aufgrund
der langsamen Katalyse (im Bereich von Sekunden bis eventuell
sogar Minuten) wieder ausgeschaltet. Diese Zeitschaltuhr ist ein
wichtiger Bestandteil der Signalverstarkung.
Die Untereinheiten von G-Proteinen konnen sowohl physiologisch als auch pathologisch kovalent modifiziert sein. Besonders offensichtlich sind Modifikationen durch kovalente Verknupfungen mit Lipiden. G,-Proteine sind rnit Myristinsaure
verknupft, wobei die C,,-Fettsaure uber eine Amidbindung an
aminoterminale Glycinreste gebunden ist17' - 731. Diese Modifikation ist ein wichtiger Faktor fur die Affinitat der a- zu den
fly-Untereinheiten und der G,-Untereinheiten zur AdenylatC y ~ l a s e 7[5~1 (siehe
~ - unten) . Alle a-Untereinheiten mit Ausnahme der G,,-Untereinheit enthalten einen, einige sogar zwei Palmitinsaurereste. Die C,,-Fettsaure ist uber eine Thioesterbindung an Cysteinreste in der Nahe des N-Termin~s['~]
eingebaut.
Bei Proteinen der G,-Gruppe befindet sich der mit Palmitinsaure verknupfte Cysteinrest direkt neben dem rnit Myristinsaure
verknupften Glycinrest. Wahrend die Verknupfung mit Myristinsaure wahrscheinlich cotranslational ablauft und die Modifikation irreversibel ist, wird Palmitinsaure posttranslational
eingebaut und relativ schnell umgesetzt. Die Umsetzung von
Palmitinsaure ist von besonderem Interesse. Sie wird durch einen Rezeptor reguliert, der offensichtlich die Abspaltung der
Palmitinsaure von der a-Untereinheit k ~ n t r o l l i e r t [781.
~ ~ .Die
Bedeutung dieses Vorgangs wurde noch nicht vollstandig verstanden. Es konnte sich aber um einen Teil eines Prozesses handeln, durch den Transmembransignale abgeschwacht werden.
Die puntereinheiten haben typische CAAX-Boxen an ihren
C-Termini und sind prenyliert. Die y,-Untereinheit, die in der
Netzhaut vorkommt, ist farne~yliert[~'],
die anderen puntereinheiten geranylgeranyliertrso~
'll. Zwar ist die Prenylierung fur
die Bildung von fly-Dimeren rnit hoher Affinitat nicht notwendig, doch ist sie ausschlaggebend fur die Wechselwirkungen zwischen der fir- und der a-Untereinheit sowie einigen Effektoren
(z.B. Adenylat-Cyclasen)[821.Alle Modifikationen durch Lipide
konnten bei der Bindung der G-Protein-Untereinheiten an die
Membran eine wichtige Rolle spielen. Die Mechanismen allerdings, die die Spezifitaten dieser Protein-Membran-Wechselwirkungen festlegen, mussen erst noch entdeckt werden. Wir vermuten, daI3 die G,,-Untereinheit durch eine bis jetzt noch nicht
identifizierte Gruppe kovalent modifiziert ist, denn das natiirliche Protein, das aus Leber oder Gehirn isoliert wird, hat eine
wesentlich hohere Affinitat fur die Adenylat-Cyclase als das
rekombinante G,,-Protein, das in Bakterien synthetisiert
wirdLs3I.
Eine besonders interessante, irreversible Modifikation von
pathologischer Bedeutung ist die ADP-Ribosylierung von
a-Untereinheiten durch bakterielle Toxine. Das Darmtoxin, das
Durchfall hervorruft und von Vibrio cholerae produziert wird,
sowie das hitzelabile Toxin, das von einigen E.-coli-Stammen
synthetisiert wird, sind ADP-Ribosyl-Transferasen rnit einer hohen Spezifitat fur die G,,-Untereinheit. Dabei ist NAD der Lieferant fur die ADP-Ribosyl-Einheit, die auf einen Argininrest
im aktiven Zentrum des Substrates ubertragen wirdcs4].Die sich
daraus ergebende Inhibierung der GTPase-Aktivitat der GsaUntereinheit fuhrt zu einer permanenten Aktivierung der AdeAngeu,. Chem. 1995, 107, 1533-1548
AUFSATZE
nylat-Cyclase durch die G,,-Untereinheit. Aufgrund der Lokalisation der Infektion im Darm ist Durchfall das vorherrschende
Symptom der Krankheit. Ein Toxin (ein inselaktivierendes Protein), das von Bordetella pertussis produziert wird, katalysiert
die ADP-Ribosylierung eines Cysteinrestes am C-Terminus in
a-Untereinheiten von G , - P r ~ t e i n e n [ ~Durch
~ I . diese Reaktion
werden Wechselwirkungen zwischen G-Proteinen und Rezeptoren gestort, so daI3 die beteiligten Prozesse einschliel3lich der, die
eine Inhibierung der Adenylat-Cyclase verursachen, wirkungsvoll inhibiert werden. Nebenbei sei angemerkt, daI3 andere Mikroorganismen davon abweichende Strategien entwickelt haben, um die Konzentrationen an cyclischem AMP in ihren
Wirtszellen zu erhohen. So sind ein Toxin aus Bacillus anthacis
und eines aus Bordetella pertussis selbst Adenylat-Cyclasen, die
durch Calmodulin aktiviert werden und in Saugetierzellen eindringen.
Kurzlich wurden hochaufgeloste Kristallstrukturen von zwei
a-Untereinheiten, G,, und Gial,in unterschiedlichen Ligandenzustanden beschrieben[86-881. Die prinzipielle Bauweise dieser
eng verwandten Proteine ist im wesentlichen identisch (Abb. 9).
Abb. 9. Schematische Darstellung der G,,,-Untereinheiten als Bander und Spiralen. Die Helix-Domane ist gelb, die p2Iras"-ahnliche
Domane griin sowie blau, und
die Linker-1- und -2-Strange sind rot eingezeichnet. GTPyS ist als Kugel-StabModell und das Magnesium-Ion als violette Kngel dargestellt. Elemente der Sekundarstruktur sind gekennzeichnet. Die roten Buchstaben N und C markieren die
Positionen der ersten geordneten Reste am N- und C-Terminus (mit freundlicher
Genehmigung aus Lit. [SZ]).
Jede der beiden Untereinheiten besteht aus zwei sehr unterschiedlichen Domanen: einer p2Iras-ahnlichenaP-Domiine und
einer bei G-Proteinen einmaligen a-Helix-Domane, die diese
flankiert. Sie sind durch zwei Linker-Peptidstrange verbunden.
Obwohl alle direkten Wechselwirkungen zwischen dem Protein
und dem Guanin-Nucleotid durch die p2Iras-ahnlicheDomHne
oder durch das Linker-2-Peptid gebildet werden, befindet sich
das Nucleotid in der Spalte zwischen den beiden Hauptdomanen. Die Konformationsanderungen, die vom Rezeptor vermittelt werden und die fur den Guanin-Nucleotid-Austausch ausreichen, konnte moglicherweise zu einer deutlichen Trennung
der Helix- und der p2Iras-ahnlichen Domane fiihren.
Obwohl mehrere ausgezeichnete Kristallstrukturen von
p2Iras-Proteinenund von p2Iras-Mutantenohne GTPase vorliegen, ist es schwierig, auf den Mechanismus der Hydrolyse von
1539
A. G . Gilman
AUFSATZE
G T P zuruckzuschlieDen. Dies ist hauptslchlich deswegen der
Fall, weil die Proteine ohne Aktivatoren (GTPase-aktivierende
Proteine. GAPS) schlechte Katalysatoren sind. Dasselbe gilt fur
die Gtz- und Gi,,-Untereinheiten mit gebundenem GTPyS.
Glucklicherweise sind die Konformationen dieser Proteine,
wenn sie AIF, gebunden haben, aufschlufireicher. Wie bereits
bemerkt, wurde unerwarteterweise herausgefunden, daR A13
ein notwendiger Cofaktor fur die Aktivierung von G-Proteinen
durch F- ist. Daraus wurde geschlossen, daR AIF, wahrscheinlich an G,-Proteine in der Niihe van G D P gebunden ist und so
die y-Phosphorylgruppe von G T P nachahmt[28*89.901. Die Kristallstruktui-zeigt, daR diese Hypothese fast richtig ist[881.Dabei
scheint GDP-AIF; allerdings eher ein Analogon des Ubergangszustandes zu sein, als nur einfach G T P nachzuahmen. Mit
GDP-AIF; wurde damit die Bedeutung von Aminosaureresten
im aktiven Zentrum demonstriert.
Zwei Aminoslurereste, Arg 178 (Numerierung nach G i Z l )
und Gln 204 spielen bei der Katalyse eine Rolle. Dies ist das
Ergebnis der Isolierung oder Konstruktion von GTPase-freien
Proteinen mit Mutationen an diesen Stellen[" -941. Dabei entspricht Arg 178 dem Arg in der G,,-Untereinheit, das durch das
Cholera-Toxin ADP-ribosyliert worden ist. Gln 204 entspricht
dem fur die Katalyse wichtigen Aminosaurerest Gln 61 in
~21'"'. (Fur Arg 278 gibt es keine homologe Aminosaure in
~21'"'; Arg 178 liegt im Linker-2-Peptid.) Die unterschiedlichen
Positionen dieser beiden Aminosaurereste in GDP-A1F; und
im GTPyS-gebundenen Protein enthullen ihre Funktionen bei
der Katalyse (Abb. 10). Gln 204 scheint das hydrolysierende
Wassermolekul im trigonal-bipyramidalen Ubergangszustand
zu stabilisieren und zu orientieren, wahrend Arg 178 die negative Ladung an den aquatorialen Sauerstoffatomen der Phosphat-Zwischenstufe mit pentakoordiniertem Phosphoratom
stabilisiert. D a dieser Arg-Rest nur in G,-Proteinen vorkommt,
kann seine Gegenwart die hohere hydrolytische Aktivitlt der
G,-Proteine im Vergleich zu der von p2lraS-Proteinenerklaren.
Die Hydrolyse von G T P durch die G,,-Untereinheit wird
von einer Lockerung sowohl des Linker-2-Strangs als auch eines
Segments aus 20 Resten begleitet, das Gln 204 enthiilt. Der Verlust von jeglicher geordneter Konformation in diesen Resten, die
in der Elektronendichtekarte nicht sichtbar sind, fuhrt zu Anderungen in den fur das GDP-gebundene Protein charakteristischen Eigenschaften : zum Verlust der Mg2+-Bindungsstelle, zu
einer etwas herabgesetzten Affinitlt fur das Guanin-Nucleotid,
zu einer erhohten Anfalligkcit fur Proteolyse in dieser Region
und zu einer Loschung der Tryptophan-Fluoreszenz.
Eine uberraschende Konsequenz der Hydrolyse von G T P ist,
dalj sich die N- und C-Termini in einer klar erkennbaren, deutlichen cc-Helix-Domane anordnen. Diese Strukturanderung tritt
nahezu 30 8, vom katalytischen Zentrum entfernt auf, und es ist
schwierig, sie mit einer Folge von intramolekularen Konformationsiinderungen zu erkliren. Noch uberraschender ist die Entdeckung. da13 diesc neue Domiine im Kristall eine auaerordentlich komplementiire und ausgedehnte Packungsgrenzschicht zur
x-Helix-Domane und zum Linker-2-Strang eines Nachbarmolekuls bildet (Abb. 11 ) . Daher konnten Strukturanderungen zwischen der GTP-Bindungsstelle und dem N- sowie dem C.-Terrninus, die einen Teil der mutmafilichen Bindungsoberflache fur
den PyUntereinheiten-Komplex ausmachen, durch intermolekulare Wechselwirkungen weitergegeben ~ e r d e n [ ~ 'Diese
].
Be-
A
+
1540
C
NH
I
0
Ahb 10. A) Schematische Dnrslellung des ilkliven Zciitriinis iin GTPYS-G,,,-Kornplex. Sic zeigt die Positioiien voii Arg 17X und Gln 204. Dicse Aminosiuren liegen
auDerhalb der Reichweite der Warserstoffbr~ckenbindungci~
des Nucleotids. Dai
nucleophile Wassermolekul ist rran\-;ixial bczttglich des 0-Atoms der P-0-P-Brucke
m i t einem O(H,O)-P-Ahstand von 3.85
angeordnct. Die /j,-r,-Schleil'c is1 gi-un,
das 81-r,-Schalterpeptid gelb und der Linker-?-Strang blau eingczeichnet. El) Dcr
GDP-AIF;-Komplex aus derselhen Perspektive. Arg 178 u n d G l n 204 hahcn sich
gedreht. urn mit AIF, zu wechselwirkeii. Das nucleophile
sich i n der Koordinationssphire des Aluminiuin-Ions. C) Modell dcs aktiven Zentrurns de\ G,,,-Proteins im Ubergangszustand der Phosphorylierung. Das Modell
hasicrt auf der Struktur des GDP-AIF, -Koiiiplexes (mit freundlicher Gcnehmigung
a u s Lit. [881).
A
funde sind vermutlich auch fur die Uberlegungen von Rodbell
zur Moglichkeit der G-Protein-Oligomerisierung relevant[961.
G-ProteinelNobel-Vortrag
AUFSATZE
Die Eigenschaften der a-Untereinheiten der G-Proteine
Ahb. 11. Symmetrische GDP-G,,,-Molekiile ordnen sich im kristallinen Zustand
helical an. Im GTP-Komplex sind der C- und der N-Terminus der G,,-Untereinheit
ungeordnet, aher wenn das Nucleosid-Triphosphat hydrolysiert wird, falten sie sich
zu einer eigenstindigen Mikrodomane, die ungefihr 40 Aminosauren umfaRt. Es
wird angenommen, dal3 ein Phosphat-Ion, das mit drei Argininresten des N-terminalen Endes und mit Lys 180 vom Linker-2-Strang wechaelwirkt, als Kristallisationskeim dieser Mikrodomane fungiert. I n Kristallen des GDP-G,,,-Proteins uhernimmt ein Sulfat-Ion diese Funktion. Die Mikrodomane hildet eine ausgedehnte,
komplementare Grenzschicht rnit der a-Helix-Domine und dem Linker-2-Strdng
des Nachharmolekuls. Dadurch wird eine losungsmittelzuganglicheOberflache von
iiher 1800 A 2 hlockiert; Grenzschichten von dieser Grone weisen auch vide Antigen-lminunglobulin-Komplexe auf.
Homogene Proben nahezu aller bekannten a-Untereinheiten
(Tabelle 1) und vieler unterschiedlicher fly-Untereinheiten wurden aus Gewebeproben oder nach ihrer Expression in E. coli
oder in SF9-Zellen isoliert. Die Eigenschaften mehrerer Untereinheiten wurden auch durch In-transfecto-Versuche - eine neuartige biochemische Methode - bestimmt. Jedes System hat Vorund Nachteile. Wahrend den aus E. coli stammenden Proteinen
bestimmte kovalent gebundene Modifikationen fehlen kbnnen,
auch wenn eine Verkniipfung mit Myristinsaure durch Coexpression von N-Myristoyl-Transferase moglich ist, haben diese
Proteine den Vorteil, daD sie eindeutig keine anderen G-ProteinUntereinheiten enthalten. Dies nachzuweisen kann bei G-Proteinen aus anderen Quellen schwierig sein.
Die as- und a,,,-Untereinheiten der G,,-Gruppe aktivieren
durch direkte Wechselwirkungen unterschiedliche AdenylatCyclasen. Alle bekannten Isoformen der membrangebundenen
Adenylat-Cyclase in Saugetieren werden von den G,,-Proteinen
aktiviert. Es werden als Folge des alternativen Spleiljens einer
Vorlaufer-mRNA vier G,,-Polypeptide exprimiert, die sich in
den Resten, die im Exon 3 codiert werden, und einem Serin-Rest
an der SpleiDstelle unterscheiden. Die Funktionen dieser
Varianten konnten bis jetzt noch nicht unterschieden werden[97 991. Die a-Untereinheit des Go,,-Proteins wird iiberwiegend im Neuroepithel des Riechzentrums exprimiert, wo sie
wahrscheinlich Riechrezeptoren und eine hauptsachlich ge~
Tahelle 1. Eigenschaften der a-Unteremheiten von G-Proteinen in Saugetieren.
Gruppe,'
Untereiiiheit
M , [kDa]
40.3
40.5
40.5
40.0
40.1
40.0
40.1
40.5
40.9
100
88
94
73
73
68
6X
67
60
[q
Lipid [c]
Vorkominen
in Gewehen
Reprisentative
Rezeptoren [d]
Effektor
CT
CT
CT
P
P
P '?
iiberall
iiherall
Riechneuroepithel
PAR, Glucagon,
TSH, andere
Riechstoffe
t Aden ylat-Cyclase
T Ca2+-Kanile, J Na+-Kanale.
t Adenylat-Cyclase
PT
PT
PT
PT
PT
CT, PT
CT, PT
CT ('?),PX
M,
M,
M,
M,
M,
M
M
M, P
M,Cho, a,AR,
andere
Met-Enk,
a,AR, andere
Rhodopsm
Opsine
Geschmack (?)
M,Cho (?),
andere (?)
T K'-Kanile (?)
T Phospholipase A,
1Ca*+-Kanale
-
weit verhreitet
iiberdll
weit verbreitet
Gehirn, andere
Gehirn, andere
Netrhautstibchen
Netzhautzipfchen
Geschmacksknospen
Gehirn, Nebennieren,
Blutplattchen
Aminosaureiiher- Toxin [h]
einst. [%I [a]
P
P
P
P
P
'?
Adenylat-Cyclase
(")
1 Adenyldt-Cyclase, andere ( ? I
T cGMP-spezifische Phosphodiesterase
7 cGMP-sperifische Phosphodiesterase
'?
1Adenylat-Cyclase,
andere (?)
G,
%
100
515
42
42
41.5
43
a16
13.5
58
211
EIJ
weit verhreitet
weit verbreitet
Lunge, Niere, Leher
B-Zellen,
Knochenmarkzellen
T-Zellen,
Knochenmarkzellen
88
79
51
M,Cho, a,AR, andere
C5a. IL-8, andere
IL-8, andere (?)
T Phospholipase CB, andere (")
IL-8, andere ( ' I )
GI,
112
%13
44
44
100
61
-
P
P
uherall
iiherall
'?
?
?
?
[a] Vergleich init der in einer Gruppe jeweils zuerst genannten Untereinheit. [b] Dss Cholera- und das Keuchhustentoxin (CT bzw. PT) katalysieren die ADP-Rihosylierung eines Arginin- bzw. Cystein-Restes in der aufgefiihrten a-Untereinheit. [c] Modifikationen durch Verknupfungen mit Palmitinsaure (P) und/oder Myristinsaure (M). [d] BAR = [j-adrenerger Rezeptor, M,Cho = M,-muscarinisch cholinerger Rereptor, 1,AR = a,-adrenerger Rezeptor, Met-Enk = Methionin-Enkephalin,
M,Cho = M,-muscarinisch cholinerger Rezeptor, r , A R = r,-adrenerger Rezeptor. [el a,,sI = kurze, z < ( ~=, lange Spleinvarianten van a,. [fl T = Aktivierung,
1 = Inhibierung.
Angew.
Chem. 1995, 107. 1533 -1548
1541
AUFSATZE
A. G. Gilman
ruchsspezifische Isoforin der Adenylat-Cyclase (Typ 111) verkniipft['nol. Gereinigtes G,,-Protein aktiviert auch Ca2 +-Kanale, die auf Dihydropyridin und Anderungen im Membranpotential reagieren, in Gewebestucken aus Skelett- und Herzmuskeln['O'l, und inhibiert NaC-Kanlleim Herz["*]. Die physiologische Bedeutung dieser beiden Wirkungen 1iBt sich schwer
benrteilen. Das G,-Protein wird von Rezeptoren aktiviert, die
die Adenylat-Cyclase stimulieren; 8-adrenerge Rezeptoren sind
dafur der Prototyp.
Mitgliedern der G,-Gruppe begegnete man zuerst als Transducine in der Netzhaut und dann als Substrate fur das inselaktivierende Protein. Die beiden Isoformen von Transducin werden
selektiv in den Netzhautstibchen und -zipfchen exprimiert[' 03].
Sie werden durch photolysiertes Rhodopsin oder den Opsinen
aktivierl , und jede stimuliert eine Phosphodiesterase, die fur
cyclisches G M P spezifisch ist. So wird die intrazellulare Konzentration an cyclischem G M P bei Lichteinwirkung vermindert.
Ein dem Transducin iihnliches G-Protein, das Gusducin (ap).
wird nur in Geschmacksknospen exprimiert" O4]. Die Verwandtschaft von Gusducin und den Transducinen ist sehr eng. Daher
wurde die Hypothese aufgestellt, daD eine Cyclo-NucleotidPhosphodiesterase der Effektor bei der Antwort auf einige Geschmacksstoffe ist.
Drei eng verwandte Gene codieren die drei G,,-Untereinheiten. Diese Proteine weisen in vitro sehr ihnliche Wirkungen auf,
obwohl sich sowohl ihre zellularen als auch subzelluliiren Verteilungen unterscheiden. Aus mehreren Grunden konnte man lange nicht zeigen, daB diese sc-Untereinheiten Inhibitoren der Adenylat-Cyclasen sind. So brauchte man vergleichsweise hohe
Konzentrationen. die a-Untereinheit muate init Myristinslure
verknupft werden, und man stellte unterschiedliche Wirkungen
auf die Isoformen der hdenylat-Cyclase fest[". lo'] . Zu niichst
hatte man angenommen. dalJ G,,-Proteine K +-Kan%lein Herzmuskelzellen und im Nervengewebe aktivieren[' 06], doch ist dies
derzeit sehr umstritten. G,,-Proteine konnten im Vergleich zu
den By-Untereinheiten hier sogar von untergeordneter Bedeutung ~ein['*'~.Daruber hinaus gibt es Ergebnisse, nach denen
zumindestens einige G,,-Proteine beim Schleusen durch Membranen eine Rolle spielen[' o'
' o]. D'ie Beteiligung dieser
Proteine an solch unterschiedlichen zelluliiren Prozessen ist verwirrend.
Das G,,-Protein unterscheidet sich erheblich von den Gi,Proteinen, inhibiert allerdings auch die Adenylat-Cyclase-Aktivitlt in transfizierten Zellen[' I oder in vitro" "1. Auffallend
ist, daO G,, kein Substrat fur das Keuchhustentoxin ist und
C T P sehr langsam hydrolysiert" 13].
Wie erwahnt, war die Entdeckung des Go-Proteins sehr
aufschluBreich, da es in hoher Konzentration im Gehirn
vorkommt (1 - 2 % aller Membranproteine im Gehirn) und
anscheinend nicht an den bekannten Guanin-Nucleotide
regulierten Systemen beteiligt ist. Das Go,-Protein scheint
nicht nur eine wichtige Rolle als Inhibitor von spannungsabhangigen Ga2 t-Kaniilen["41 7 u spielen. sondern hat unserer
Meinung nach noch andere, bedeutende Aufgaben. Hinweise darauf sind die hohe Konzentration in den Wachstumszapfen im Nervengewebe"
und die offensichtlichen
Wechselwirkungen init GAP-43, eineni Ca2+-bindenden Protein, das ebenfalls in diesen Geweben in hohen Konzentrationen
vorliegt [ I 1 6 ' .
~
1542
Eindeutige Hinweise fur eine Regulation der phosphoinositspezifischen Phospholipase C waren schon lange, bevor die relevanten G-Proteine identifiziert wurden, l ~ e k a n n t [ 'I.~ ~Es
% handelt sich in den meisten Zellen urn einen ProzeD, der nicht durch
das Keuchhustentoxin beeinflufit wird. Die Klonierung von
G,,-Untereinheiten auf Grundlage der Polymerase-Kettenreaktion lieferte Proteine, die als Regulatoren in Frage kamen["".
Fast gleichzeitig wurden G-Proteine mit Regulatoreigenschaften durch bewahrte Rekonstituierungsmethoden entdeckt["*. 1191 und neuartige a-Untereinheiten durch Affinitatsund Austauschchromatographie isoliert['201. Mit diesen drei
Methoden wurden zunachst die Gqx-und dann die Gllc-,G,,,und GI,,,,,-Untereinheiten als Aktivatoren von Isoformen der
Phospholipase C/J' identifiziert. Mit den gereinigten G,,-Proteinen wurde gezeigt, daD sie mit den Phospholipasen an deren
C-Terminus direkt wechselwirken. Interessanterweise verhalten
sich die Phospholipasen CP gegenuber den G,,-Untereinheiten
wie GTPase-aktivierende Proteine[12'1.Ohne den Effektor ist
der k,,,-Wert fur die Hydrolyse von G T P durch diese Proteine
sehr niedrig, mit ihm wird er auf einen uber 50fach hoheren Wert
erhoht. Dies kann am einfachsten damit erkliirt werden. daD
die Phospholipase CP ihre eigene Aktivierung blockieren kann.
Jedoch ergaben kinetische Untersuchungen, daB der Rezeptor,
das G,-Protein und die Phospholipase einen Komplex bilden,
der G T P schnell bindet und hydrolysiert. Dies fuhrt zu
einer erheblichen Aktivierung der Phospholipase C im FlieBgleichgewicht, die mit besonders schnellen Antworten verbunden ist.
Die Bedeutungen der GI,,- und G,,,-Untereinheiten sind
nicht bekannt. Beide sind von ihrer Struktur her mit einem
Protein aus Drosophila concertina verwandt, das eine Rolle in
der Gastrulation zu spielen scheint" 2 2 1 . Eine Transfektion von
NIH-3T3-Zellen mit der cDNA der G,,,-Untereinheit fuhrt zu
einer Transformation der Zellen[' 2 3 , lZ41.
Die Eigenschaften der fly-Untereinheiten der G-Proteine
Erst seit kurzem wird allgemein anerkannt, dal3 die stromabwarts stattfindende Regulation von Effektoren durch die p;~Untereinheiten (Tabelle 2) erfolgt'69. 'I. Zunachst glaubte man,
dab diese Untereinheiten weniger wichtig seien. Die Bindung
von G D P und der By-Untereinheit an die x-Untereinheit ist
positiv kooperativ. Die /fi;-Untereinheit stabilisiert so die inaktive cc-Form, die GDP gebunden hat, indem sie die Dissoziationsgeschwindigkeit des a-Untereinheit-Nucleotid-Komplexeshera b s e t ~ t [ ' ~ ~Die
] . By-Untereinheit fungiert also als ein
Rauschunterdrucker['261.Im Gegensatz dazu weisen die Wechselwirkungeii von G T P uiid der By-Uiitereinheit mit der a-Untereinheit eine negative KooperativitCt auf. Es wurde vorgeschlagen, dal3 die By-Untereinheit die Inaktivierung der
a-Untereinheit beschleunigen und dadurch die stroniabwlrts
stattfindenden Antworten inhibieren konntel' *'I. Die Bedeutung dieser Moglichkeit ist noch ungekllrt, aber als schlieRlich
die Inhibitorwirkungen der Gin-Proteine auf die AdenylatCyclase beobachtet wurden, brauchte man diese Hypothese
nicht mehr. Fur den Austausch von G D P durch GTP an der
a-Untereinheit,' der durch den Rezeptor ausgelost wird, ist die
[(y-Untereinheit als Katalysator erforderlich" 281. Der Rezeptor
AUFSATZE
G-Proteine/Nobel-Vortrag
Tabelle 2. Eigenschaften der p- und der y-Untereinheiten von G-Proteinen
Untereinheit
M , [kDa]
Aminosaureubereinst.
I "/I
Vorkommen
in Geweben
in
Slugetieren.
Effektor/Fnnktion [b]
[a1
~
B
~
~
~
~~
~
Unterstutzung der Phosphorylierung und Desensibilisierung des Reaeptors durch Aeonisten
8,
100
8 5
37.3
37.3
37.2
37.2
38.7
71
8.4
82
7.9
8.5
100
38
36
(34)
25
Bz
83
84
93
*j4
YS
77
(? teilweise)
7.3
1.5
90
83
89
52
35
iiberall
weit verbreitet
weit verbreitet
weit verbreitet
Gehirn
Netzhautstibchen
Gehirn, Nebennieren
Gehirn, Hoden
(Niere, Netzhaut (?))
iiberall
iiberall
fur Wechselwirkungen zwischen G, und Rezeptor benotigt
Inhibitierung der Aktivierung von G,
T oder 1 Adenyldt-Cyclase (isoformspezifische Wirkungen)
T Phospholipdse CB2,I ( ,
7 K+-Kanile
T Phospholipase A,
[a] Vergleich mit der in einer Gruppe jeweils zuerst genannten Untereinheit. [b]
T
=
erkennt also nur das Heterotrimer aus G-Proteinen und die
Assoziation der Untereinheiten ist eine Voraussetzung fur die
Aktivierung.
Der erste deutliche Hinweis auf eine Wechselwirkung zwischen der By-Untereinheit und Effektoren kam von Logothetis
et al.[lo'l, die entdeckten, darj die K+-Kanale in Herzkammermuskelzellen nur durch die by- und nicht durch die G,-Untereinheit aktiviert werden. Uber die Bedeutung dieser Ergebnisse
herrschte Unstimmigkeit, und so wurden die By-Untereinheiten
mehrere Jahre nicht beachtet, obwohl rnit genetischen Methoden bewiesen wurde, darj sie die eigentlichen Mediatoren bei der
stromabwarts gelegenen Signaliibertragung der Pheromonantwort bei keimender Hefe ~ i n d " ' ~In
~ .den letzten Jahren wurden
rnit einfachen biochemischen Assays interessante, direkte Wechselwirkungen zwischen Py-Untereinheiten und Effektoren, wie
Adenylat-Cy~lasen['~~-~~'~
und P h o ~ p h o l i p a s e n [ '1341
~ ~ -festgestellt. Die Ergebnisse waren reproduzierbar, und dieser
Punkt scheint geklart. Die Wirkungen von PpUntereinheiten
auf Adenylat-Cyclasen werden im folgenden Abschnitt behandelt.
Die Frage nach der Spezifitat der unterschiedlichen By-Untereinheiten bleibt kompliziert. Abgesehen von Ergebnissen, nach
denen nichtretinale a-Untereinheiten und Effektoren mit retinalen P,y,-Untereinheiten weniger gut wechselwirken als mit anderen, konnte nur eine geringe Spezifitat der fly-Untereinheiten
gegeniiber vielen a-Untereinheiten und Effektoren festgestellt
werden"'. 3 5 3 361. Diese In-vitro-Ergebnisse sind in Einklang
mit der von Kleuss et al. an intakten Zellen festgestellten SpezifithttS2.1 3 5 - 1 391. In GH,-Zellen werden spannungsabhingige
Ca2+-Kanale von M,-muscarinischen und Somatostatin-Rezeptoren inhibiert. Eine selektive Unterdriickung von jeder der
beiden Spleiharianten des Go,-Proteins rnit Antisense-Oligonucleotiden deutet darauf hin, dal3 die muscarinische Antwort von
der Expression des
und nicht der des Go,,-Proteins und die
Antwort auf Somatostatin selektiv nur vom Go,,-Protein abhangt. Eine ahnliche Unterdriickung von ,6- oder y-Untereinheiten ergab erstaunliche Ergebnisse, die rnit der muscarinischen
Signaliibertragung durch das a,,P,y,-Protein und der durch Somatostatin durch das a,,/l,y,-Protein iibereinstimmen. Die gegenwartig beste Erklarung ist, dalj die Spezifitat durch die ReAngen. Chem. 1995, 107, 1533-1548
Aktivierung.
(?)
1 = Inhibierung.
zeptor-G-Protein-Wechselwirkungen erreicht wird, aber
Beweise dafiir, z.B. durch Rekonstitution der gereinigten Komponenten in vitro, sind noch nicht iiberzeugend.
Adenylat-Cyclasen
Unser Interesse galt immer den Adenylat-Cyclasen, auch
wenn wir uns durch die G-Proteine ablenken lieBen und seit
einiger Zeit nur ein Mitarbeiter rnit Adenylat-Cyclasen arbeitete. 1989 anderte sich dies.
Adenylat-Cyclasen aus Saugetieren werden durch Forskolin
aktiviert, ein Diterpen, das in den Wurzeln von Coleusjitrskofii
gefunden wird. Pfeuffer und Metzger entwickelten eine Forskolin-Affinitltsmatrix, rnit der eine - wenn auch schwierige - Enzymreinigung moglich w ~ r d e [ ' ~Als
~ I .erster reinigte Smigel in
unserem Labor eine calmodulinabhangige Adenylat-Cyclase
aus Rinderhirn durch Pfeuffers MethoderL4'].Krupinski et al.
reinigten spater eine ausreichende Menge an Protein, um die
Aminosauresequenzen zu be~timrnen"~'].Mit der Hilfe von
Randall Reed am John Hopkins Hospital, den wir um Unterstiitzung gebeten hatten, da Adenylat-Cyclase besonders im
Neuroepithel des Riechzentrums im Gehirn vorkommt, erhielten wir cDNAs, die Adenylat-Cyclasen vom Typ I codieren, aus
einer Rinderhirn-Bibliothek. Inzwischen wurden weitere sechs
Klone in voller Lange, die Typen 11-VI und VIII, durch nichtstringente Hybridisierung und PCR-Methoden von mehreren
Arbeitsgruppen isoliert. Alle genannten Proteine konnten exprimiert und ihre Regulatoreigenschaften bestimmt werden[143- 1451
Die membrangebundenen Adenylat-Cyclasen in Saugetierzellen haben eine komplexe Struktur, die an viele Transporter und
Kanale erinnert (Abb. 12). Ihre topographische Verwandtschaft
zum P-Glycoprotein und zum Regulator der Transmembranleitfahigkeit bei der Mukoviszidose ist auffallend, obwohl es keine
Homologien in den Aminosauresequenzen dieser Proteine gibt.
Auf einen kurzen cytoplasmatischen N-Terminus folgen sechs,
vermutlich Transmembran-Domanen M I und eine ungefahr
40 kDa schwere cytoplasmatische Doniane C,. Diese Struktureinheit wird wiederholt: Auf einen zweiten Satz aus sechs Trans1543
AUFSATZE
A. G. Gilman
jeder Domane der K,-Wert fur ATP angehoben werden kann.
Beide Domanen konnen moglicherweise ATP binden und die
Synthese von CAMP katalysieren. Alternativ konnte eine Domane der Hauptkatalysator sein, wahrend die andere eine Regulationsfunktion hat.
Regulation der Adenylat-Cyclasen durch
G-Protein-Untereinheiten
Die sieben bis heute identifizierten Isoformen der AdenylatCyclase werden durch das G,,-Protein und Forskolin aktiviert.
Uberraschenderweise sind dies und die Inhibierung der P-Bindungsstelle durch Adenosin-Analoga die einzigen gemeinsamen
Regulationsmotive. Die Typ-I-Isoform wird auch durch Calmodulin aktiviert, wlhrend sie durch die By-Untereinheit stark inhibiert wird. Dies wurde zunachst auf eine Verdringung von
mem bran-Domanen M, folgt wieder eine grolje cytoplasmatiCalmodulin durch die pj-Untereinheit zuriickgefuhrt, doch
sche Domlne. C,. Obwohl diese Struktur fur ein ,,einfaches"
wurde nach Reinigung der exprimierten Cyclase festgestellt, daR
Enzym einmalig ist, ist ihre Bedeutung nur schwer abzuschatsie direkt mit der pj-Untereinheit w e ~ h s e l w i r k t [ ~
Die
~ ~drei
~.
Zen. Fur mich ist es faszinierend, daD das regulatorische Prinzip
Isoformen der Giz-sowie die beiden Go,-Untereinheiten konnen
der Adenylat-Cyclasen, die Aktivierung durch ein GTP-bindenebenfalls Typ-I-Adenylat-Cyclase inhibieren ; der Effekt ist al~s
auftritt. Obwohl
des Protein, auch in S u c ~ c h r r r o n z ~cerevisiue
lerdings schwacher im Vergleich zu dem der By-Untereinheit mit
diese Art der Regulation von Hefen bis Saugetieren konserviert
Calmodulin als Aktivator des Enzyms und verschwindet fast,
worden ist, haben sich die Proteine, die diese Regulation bewirwenn die Cyclase durch die G,,-Untereinheit aktiviert wird['051.
ken, veriindert. Die Adenylat-Cyclase von Saccharomyces ist ein
Die Adenylat-Cyclase vom Typ 1 ist bis heute die einzige besehr groljes peripheres Membranprotein, das wenig Ahnlichkeit
schriebene Isoform, die durch die By-Untereinheit inhibiert
mit seinem Gegenstiick in Saugetieren hat['461. Das GTP-binwird. Als wir andere Isoformen dardufhin untersuchten, stellten
dende Protein in Hefen, das die Synthese von cAMP stimuliert,
wir iiberraschenderweise fest, daD die Enzymaktivitat der Isoweist Homologien zum p21 '"'-Protein in Saugetieren a ~ f ~ ' ~ ' ] , formen I1 und IV stark durch die By-Untereinheit stimuliert
obwohl Hefen heterotrimere G-Proteine enthalten. Die EvoluwirdLL3
'* 1501. Diese stimulierenden Wirkungen der By-Untertion geht bisweilen sonderbare Wege.
einheit hingen allerdings von einigen Voraussetzungen a b : Jede
Die C,a-und die C2,-Region beide ungefiihr 200 AminosauUntereinheit hat allein nur einen geringen oder keinen EinfluB
ren lang - sind bci den Adenylat-Cyclasen der Siugetiere hochauf die Adenylat-Cyclase-Aktivitat; erst der Komplex stimuliert
konserviert. Diese Verwandtschaft reicht auch bis zu den topoin Gegenwart der G,,-Untereinheit die Enzymaktivitat um das
graphisch lhnlichen Enzymen in Drosophila und Dictyostelium.
fiinf- bis zehnfache. F u r eine Stimulation der Isoformen I1 und
Die beiden Domanen sind aber auch einander sowie den katalyIV mulj die By-Untereinheit im Vergleich zur G,,-Untereinheit in
tischen Domiinen der membrangebundenen und der loslichen
wesentlich hoheren Konzentrdtionen eingesetzt werden. Wir
Guanylat-Cyclasen sehr lhnlich. Diese Verwandtschaften deunehmen daher an, daD wirksame Konzentrdtionen von beiden
ten darauf hin, daB eine oder beide Domlnen der Ort der KataAktivatoren nicht durch Dissoziation des G,-Oligomers erreicht
lyse sind.
werden, sondern daB die fly-Untereinheiten aus den Gi- oder
Wenii diese vermutlich katalytischen Domanen als separate
Go-Oligomeren stammen, die im Gehirn in hohen KonzentratioProteine exprimiert werden, ist keine signifikante Adenylat-Cynen vorkommen. Die Typ-11- und Typ-IV-Adenylat-Cyclasen
clase-Aktivitiit feststellbar. Das ist auch der Fall, wenii die beisind demnach Molekiile, die eine gleichzeitige Aktivierung von
den Hllften des Molekiils jeweils in Sf9-Zellen exprimiert
zwei Regulationswegen durch ein eindeutiges Signal markieren.
werden. Erst die gemeinsame Expression der M,C,- und
Mit den biochemischen Eigenschaften dieser Adenylat-Cyclasen
M,C,-Regionen fuhrt zu einer betrachtliclien Adenylat-Cyclasekonnen Phlnomene, die 1975 von Rall et al. beschrieben wurAktivitiit, die durch G-Protein-Untereinheiten oder im Falle des
den[' 511, ausgezeichnet erklart werden. Sie beobachteten eine
Typ-I-Enzyms durch Calmodulin charakteristisch reguliert werbemerkenswert synergistische Stimulierung der Anreicherung
den kann~'"Ol. Wir nehmen vorlaufig an, dal3 eine Wechselwirvon cAMP in Gehirnschnitten durch Paare von Neurotransmitkung zwischen den C,- und C,-Dom&nen fur die Katalyse nottern. Von diesen weiD man heute, daD sie an Stoffwechselwegen
wendig ist. Dies stimmt mit den Tatsachen iiberein, dalj beide
beteiligt sind, die durch G,- und G,-Proteine reguliert werden.
Untereinheiten der heterodimeren, loslichen Guanylat-CyclaNimmt man an, daD die Typ-11-Adenylat-Cyclase durch die Bysen, deren Untereinheiten zu C , , und C,, homologe Sequenzen
Untereinheit aktiviert wird, die wahrscheinlich aus dem G,-Proe n t h a l t e ~ i [ ' ~ *fur
] , die Katalyse benotigt werden und daD
tein stammt, ware es problematisch, wenn die G,,-Untereinheit
die membrangebundenen Guanin-Cyclasen Homooligomere
das Enzym inhibieren wurde; dies ist gliicklicherweise nicht der
~ i n d " ~ Es
~ ' .ist auch interessant, daB durch Punktmutationen
Fall.
sowohl in der Citt-als auch in der C,,-Domlne die Aktivitat der
Eine deutliche Inhibierung von Adenylat-Cyclasen durch die
Adenylat-Cyclase stark beeintrlchtigt und durch Mutationen in
Cia-Untereinheit konnte erstmals bei den Isoformen V und VI
Ahh. 12. Angenoinrnenc Topograplne von membrangehundenen Adenylat-Cyclasen. Die Zylinder stellcn die membrand~,rchspannenden Regionen dar. die fettgedriickteii Linien kennzeichnen Regionen mit hoher Aminosiureubereinstimmung
bei alien Adenylat-Cyclaseii, N : ammotel-minaie Domine; M , , M,: memhrandurchsparinende Regimcn: C,,, C,,,. C2". C,,,: g o n e intrazellulire cytoplasmatische Domiinen (mi[ freundiicher Genchinigung aus Lit. [145]).
~
1544
Angeii. CIivm 1995. 107. 1533-1548
1
G-Proteine/Nobel-Vortrag
Wachstumsfakiren
'qik
4
1 1
0
eLc.
r
AUFSATZE
Stimulierung
c3+
lnhibierung
T
AC I
AC II
AC V,Vr
r
7
festgestellt ~ e r d e n [ ' lo5].
~ ' Dabei hangt die Inhibierung von der
Verknupfung dieser a-Untereinheiten mit Myristinsaure ab und
erfordert hohe Proteinkonzentrationen im Bereich von nM bis
p ~ die
, unserer Meinung nach noch verniinftig erscheinen. Die
Typ-V- und Typ-VI-Adenylat-Cyclasen werden auf dem, wie
man annahm, Standardweg - Aktivierung durch G,,-Untereinheiten und Inhibierung durch G,-Untereinheiten - reguliert.
Aber auch diese Isoformen waren fur Uberraschungen gut: Sie
werden durch CaZ in geringer Konzentration (pM-Bereich) inhibiert.
Offensichtlich gibt es drei Arten der Regulation von Adenylat-Cyclasen in Saugetieren (Abb. 13). Alle Isoformen werden
durch die G,,-Untereinheit aktiviert, woran zwei andere Unterklassen der G-Proteine, die Gi- und G,-Proteine, direkt oder
indirekt beteiligt sind. G,-Proteine wirken uber die Freisetzung
von Ca2+,das allein, rnit Calmodulin oder mit der Protein-KinaseC agiert. Durch Gi- und G,-Proteine konnen jeweils in
Verbindung rnit der G,,-Untereinheit Adenylat-Cyclasen vom
Typ I1 und wahrscheinlich auch solche vom Typ IV aktiviert
werden. Daruber hinaus konnen diese G-Proteine einer Aktivierung entgegenwirken, wie es bei den Isoformen V und VI der
Fall ist. Beim Typ-I-Enzym sind die Wirkungen der G,- und
(3,-Proteine antagonistisch. Die Untersuchungen, wie Adenylat-Cyclasen reguliert werden, befinden sich zwar noch im Anfangsstadium, doch ist bereits klar, daR diese Enzyme entstanden, um Signalubertragungswege miteinander zu verbinden und
eine Kommunikation zwischen ihnen zu ermoglichen. Die Adenylat-Cyclasen sind Brennpunkte fur das Zusammentreffen vieler Regulationsinformationen.
+
Zukunftige Wege in der Adenylat-Cyclase-Forschung
Adenylat-Cyclasen sind labile, intrinsische Membranproteine. Sie werden auch unter kunstlichen Bedingungen nur in geringem AusmaR exprimiert. Um ihre Strukturen und Regulationsmechanismen weiter untersuchen zu konnen, werden neue
Methoden gebraucht. So versuchte Wei-Ju Tang eine losliche
Adenylat-Cyclase rnit allen charakteristischen Regulatoreigenschaften zu erhalten, die in groRen Mengen hergestellt und genetisch untersucht werden kann" 521. Derzeit verfiigen wir uber
Angebi. Chem. 1995, 107, 1533-1548
/\.
\ 7-
Pi
om
Abb. 13. Moglichkeiten, wie die AdenylatCycldse-Aktivitat reguliert wird. PKC = Protein-Kinase C, CAM = Calmodulin. AC =
Adenylat-Cyclase. Weitere Erklirnngen im
Text (mit freundlicher Genehmigung aus
Lit. [145]).
eine Chimare der C,,-Domane aus Typ-I-Adenylat-Cyclase, die
durch ein Verbindungsstuck rnit der C,-Domane aus dem Typ I1
verbunden ist. Das Molekul wird von E. coli produziert, wo es
sich im Cytoplasma anreichert. Es wird, ausgehend von einer
sehr niedrigen Grundaktivitat, durch die G,,-Untereinheit und
uberraschenderweise durch Forskolin sehr stark aktiviert. E.coli-Stamme, denen Cyclasen fehlen, sind auf die Expression
und die Aktivierung der Adenylat-Cyclase angewiesen. um auf
einem maltosehaltigen Medium wachsen zu konnen. Daher
scheint eine genetische Selektion von Mutanten mit aussagekraftigen Phanotypen moglich zu sein, ebenso eine Reinigung,
eine genaue Charakterisierung und hoffentlich auch eine Strukturanalyse. Wir hoffen, daR wir durch diesen Ansatz bald in der
Lage sein werden, diese wichtigen Proteine wirklich zu verstehen.
Warum G-Proteine?
Warum, so mag man sich fragen, sind G-Proteine an Signalubertragungswegen beteiligt? Warum sind die Strukturen
der beteiligten Systeme so komplex? Signalubertragungen durch
Membranen werden offensichtlich durch einfachere, allerdings
normalerweise oligomere molekulare Assoziate erreicht, z.B.
durch Tyrosin-Kinasen, durch Ionenkanale, die durch die Bindung eines Liganden reguliert werden, und durch Rezeptoren
der Guanylat-Cyclasen. Ich glaube, da13 es mehrere Grunde dafur gibt, daR ein so komplexes Signaliibertrdgungssystem entwickelt wurde. So ist rnit molekularen Schaltern und Zeitschaltuhren eine enorme Signalverstarkung moglich. Ein einziger
Agonist-Rezeptor-Komplex kann in der Zeit, in der eine cc-Untereinheit im aktiven Zustand bleibt, die Aktivierung vieler
G-Proteine katalysieren" 531. Eine verzogerte Inaktivierung der
a-Untereinheit fuhrt zu einer weiteren Verstarkung auf der Stufe
der katalytischen Effektormolekule. Dariiber hinaus konnten
sehr komplexe Regulationsmechanismen vorliegen, durch die
die Signalubertragung sowohl in quantitativer als auch in qualitativer Hinsicht gesteuert wird, indem die Synthese- und Abbaugeschwindigkeiten von vielen Genprodukten beein fluRt werden.
Eine spezifischere Regulation ist durch kovalente Modifizierungen dieser Proteine moglich. Am wichtigsten ist vielleicht, daR
1545
AU FSATZE
A. G. Gilman
wegen des Aufbaus dieser Signalsysteme aus drei Komponenten
sehr viele unterschiedliche Antworten resultieren konnen. Jeder
Schritt der durch G-Proteine regulierten Signalwege ist durch
Koiivergenz und Divergenz gekennzeichnet. So konnen ganz
verschiedene Arten von Rezeptoren einen G-Protein-Typ aktivieren und ein Rezeptortyp kann mit mehreren G-ProteinTypen wechselwirken, was zu mehreren Ereignissen fiihrt. Entsprechend konnen unterschiedliche G-Proteine die Aktivitlt eines Effektors additiv, synergistisch oder antagonistisch andern
und ein einzelnes G-Protein mit mehr als einem Effektor wechselwirken. G-Proteine konnen daruber hinaus uber ihre c(- oder
By-Untereinheiten Wirkungen ausuben. Die Komplexitat der
zellularen ,,Schaktdfel" scheint grofi genug zu sein, da13 jede
Zelle ein eigenes mafigeschneidertes Signal-Repertoire durch
Expression einer relativ geringen Zahl an Bausteinen aufbauen
kann. Im Laufe des kommendeii Jahrzehnts werden sicherlich
alle Bausteine identifiziert werden. Damit werden wir verstehen
konnen, wie die ,,Verdralitung" der Schalttafel fur die
Signalubertragung in jedem Zelltyp aussieht. Dieses Wissen
wird zusammen mit immer raffinierteren Methoden zum Wirkstoffdesign und zur Untersuchung von groRen chemischen Bibliotheken die Pharmakologie und die medizinische Therapeutik revolutionieren.
Mein Dank gilt meinem Vater, der meinen Hang zur Wissenschaft durch eigenes Beispiel,fiirderte, sowie meinem Doktorvater
und meinem Betreuer wahrend der Postdoktorandenzeit: Theodore W Rull, der cines Nobelpreises wiirrlig gewesen ware, und
Marshall c.t: Nirenherg, der ihn verliehen hekam. Wesentliche
Beitrage zur Forschung leistete auch .jeder meiner Studenten und
Postdoktoranden: David Berman, Gary Bokoch, Lawrence Brunton, Patrick Casey, Francoise Coussen, Carmen Dessauer, Alex
Duncan, Kenneth Ferguson. Michael Freissmuth, Boning Gao,
Michael Graziano, Tatsuya Haga, Emanuel Hanski, Bruce Harris, John Hepler, automu Higashijima, Allyn Howlett, Jorge
Miguez-Lluhi. Hiroshi Itoh, Richard Kahn, Toshiaki Katada,
Christiane Kleuss, Tohru Kozasa, John Krupinski, Ethan Lee,
Hsin Chieh (Calvin) Lin. Maurine Linder, Michael Maguire,
David Manning, Pamela Middlelon, Susanne Mumby, John
Northup, Bruce Posner, Lynn Quarmby, Andre Raw, Janet
Robishaw, Elliott Ross, Leonard Schleifkr, Joseph Schwarzmeier,
Murray Smigel, Paul Sternweis, Roger Sunahara, Wei-Jen Tang,
Ronald Taussig und Natsuo Ueda. Auch viele meiner ,fest angestellten Mitarheiter wirkten entscheidend mit. darunter vor alleni
Pamela Stern weis und Wendy Deaner. Weiterhin danke ich Susanne Mumhy, Elliott Ross, Stephen Sprang und Paul Sternweis
f u r ihre gute Zusammenarheit. Seit 1972 wurde unsere Arbeit von
den National Institutes of' Health (zuerst durch das National Institute o j Neurological Disorders and Stroke, danach durch das
National Institute of' General Medical Sciences) und seit 1977
auch von der American Cancer Society gefordert. Weitere Unterstiitzungen erhielten wir von M r . und Mrs. Peter 0 'Dorznell, vom
Lucille P. A4arke.y Charitable Trust, vom Rajvnond Willie Chair
of Molecular Neuropharmacology, von der Perot Family Foundation, lion der Meadows Foundation und voii der Robert A . Welch
Foundat ion.
Eingegangen am 16. Januar 1995 [A 1021
Ubersetzt von Dr. Susanne Baade, Odenthal
Stichworte: Adenylat-Cyclasen . G-Proteine . Nobel-Vortrag
1546
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Interdisziplinares Symposium fur junge Wissenschaftler in Essen
29.09. 01 .I 0.95
-
In Essen wird zum zweitenmal eine Tagung mit Beitragen junger
Naturwissenschaftler stattfinden. Dieses interdisziplinare
Symposium bietet Moglichkeiten zur Entwicklung und zur
Diskussion spezieller Arbeitsgebiete in der Chemie und Physik.
Diese und kunftige Veranstaltungen sollen die Teilnehmer zum
Meinungsaustausch anregen, um so ein tieferes interdisziplinares
Zusammenwirken zu fordern. Als Teilnehmerkreis der
Veranstaltungsreihe sind junge Wissenschaftler aus der
Bundesrepublik angesprochen, die kurz vor Beendigung ihrer
Promotion stehen, post-docs, Habilitanten oder Habilitierte sind.
Der 2. Workshop der Tagungsreihe hat das Thema:
Das Studium von Oberflachenprozessen in Chemie und Physik.
Dazu sind Diskussionsbeitragezu den folgenden Themenkreisen vorgesehen:
Stochiometrische und katalytische Prozesse an Festkorperoberflachen
Spektroskopie und Abbildung von Festkorperoberflachen
Korrosionsprobleme an Oberflachen
Strukturierung von Oberflachen im Nanobereich
9
9
Weitere lnformationen sowie Anmeldung von Beitragen zur Veranstaltung:
Priv.-Doz. Dr. J.J. Schneider und Dr. U. Simon . lnstitut fur Anorganische Chemie der UniversitaVGH-Essen
UniversitatsstraOe 5-7 . 4511 7 Essen . Tel. (02 01) 1 83-24 13/23 98 . Fax (02 01) 1 83-24 02/24 17
1548
Angrw. Chem. 1995, 107. 1533-1548
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