close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Ein Phasenkontrastmikroskop zur Messung des Phasen- und Amplitudeneinflusses isolierter Objekte.

код для вставкиСкачать
Ein Phasenkontrastmikroskop zur Messung des
Phasen- und Amplitudeneinflusses isolierter Objekte
Von U l r i c h G r a d m a n n
&fit 5 Abbildungcn
Inhaltsiibersicht
In eineni I’hascnkontrastinikroskop tritt an die Stelle des Z e r n i k e scheii
Phasenstreifens im Objektiv ein durchbohrtes Glimmerplattchen. Unter Verwendung weiterer polarisationsoptischer Elernente lassen sich dann die optische Dicke und die Absorption isolierter Objektc durch Elliptizitlitaanalyse
im Bild bestimmen. Das Prinzip wird rea,lisiert an zwei Achromaten (45x,
NA. @,65und lOOx, NA. 1,3@),rnit dencn Objekte von Breiten bis maximal
6 p vermnssen werden konnen. Die MeBgenauigkeit hangt in komplizierter
Weise von den Objektdateri ab. Sie betragt 1’ in der Ph.ase und 1%in der
Amplitude fur giinstige, bis zu 8’ bzw. 911/0 fur cxtrem ungiinstige Objekte.
Als Testobjektc dicnen hornogene Zaponlackstreifen und diinnc Glasfaden.
1. Einleitung
Fur die Messung der optisclien Dicke und der Absorption mikroskopischcr
Objekte stand bisher kein befriedigendes Verfahren zur Verfiigung. B a r e r 1)
inaB zwar die optische Dicke lebender Zellen niit Hilfe des Interferenzmikroskops von Dysona), die Mehenauigkeit ist jedoch nicht sehr pol3 (all@
ohne Photometrie), und die Absorption 1aBt sich auf diesem Wege uberhaupt
nicht bcstimmen. Diese und andere Untcrsuchungen B a r e r s (er mal3 auch
den Brechungsindex von Zellen mit einer Iinmersionsmethode3) zeigen aber
jedenfalls deutlich, was ohnehin zu erwarten war, daB hier nhmlich lohnende
biologische Probleme liegen. Daher erschien ein gutes Verfahren zur Messung
der optischen Dicke und der Absorption rnikroskopischcr Objekte erwiinscht.
Grundsiitzlich bietet das Phasenkontrastverfahren von Z e r n i k e einc
Moglichkeit zur Messung des Phaseneinflusses auf dem Weg iiber die photographisehe Photometric von Plmsenkontrastbildern. Das Verfahren ist jedoch
umstiindlich und ungenau. Daher versuchten melirere Autoren (Franc;on
iind N o m a r s k i 4 ) , H a r t l e y 6 ) , K a s t l e r und Montarnal6), Loquin’),
1)
2)
8,
4)
5)
6)
7)
R. Barer, Nature 171, 720 (1953).
J. D y s o n , Proc. Roy. SOC. TAondan(A)?04, 170 (1950).
R.Barer, Nature 175, 1097 (1953).
M.Franqon u. U. Nomarski, C. R. Acad. Sci. Paris 830, 1050, 1392 (1950).
W. G. H a r t l e y , Nature 160, 329 (1950).
A. Kastler u. R. Montarnal, Nature 171,357 (1948).
M.Loquin, Microscopie 1, M 4 7 (1948).
0 s t e r b e g 0 s t er b e r g und P r i d e 9), 'Ya y 1o r
und PayneIO), dieses Verfahren mit polarisationsoptischen Mitteln zu einem MeBverfahren
auszubauen, das Phasen- und Amplitudeneinflurj
des Objekts zugleich liefern sollte. Bei all diesen
Verfahren sind leider Polarisatoren und doppelbrechende Pliittchen so kompliziert ins Objektiv
eingebaut, da13 eine Realisierung fiir hoch aufliisende Mikroobjektive aussichtslos erscheint.
Nun gab aber W o l t e r l l ) ein ahnliches Verrahren an und realisierte es auch a n einer
makroskopischen Apparatur, niit dem er den
Phasen- und Amplitudencinflurj geeigneter Objekte, namlich homogener Streifen, mit sehr
hoher Genauigkeit messen konnte. In das Objektiv selbst war nur ein relativ einfaches Element einzubauen, narnlich ein durchbohrtes
Glimmerpliittchen, so daB es durchaus mijglich
crschien, das Verfahren auch auf hoch auflosende
Mikroobjektive anzuwenden. Das macht sich
die vorliegende Arbeit zur Aufgabe. AuBerdem
sol1 untersucht werden, wie sich neben homogenen Streifen andere, biologisch interessantcre
Obj ekte vermessen lassen.
h
0
/
'\
m
Abb. 1. Aufbau
des Mikro-
skops. (a)Kondcnsor, (b) Licht2. Das Prinzip des Verfahrens
quellenblende, (c) Objektebene,
Abb. 1 zeigt den Aufbau des Mikroskops: (d) Objektiv, (e) Objektivbreimebene mit durchbohrh i Brennpunkt des Mikroskopkondensors (a)
befindet sich die Lichtquellenblende (b), die tern Glimmerplattchen, ( f ) Rildebenc, (g) Objekt, (h) Polariwir als punktformig voraussetzen. Liegt kein sator, ( i )114-Glimmcrplattchen,
Objekt in der Objektebene (c), so wird die (k) Analymtor, ( I ) Lanqw,
Blende (b) durch den Kondensor und das Ob- ( m ) Kollektor, (n) Gesichtsjrktiv (d) in die hintere Objektivbrennebene (P) feldblcnde, ( 0 ) Filter. Dancbcn
vier Ebenen senkrecht zur
abgebildet. Die Objektebene durchsetzt dann optischon Achse mit den in
(,in Parallelstrahlenbiindel, die Lichterregung ihnen liegendon Koordinatcnist dort konstant, sie ist es also auch in der systemen. Vonobcnnachuntm:
Rildebene ( f ) . Wir normieren sie auf 1(8. Abb. 2). Bildebene ( f ) ; {x, y} parallel zu
den Achsen des GlimmerpliittNun legen wir ein kleines isoliertes Objekt (9) chonsin (e), {x', y'} mit y'-Achsr
in die Objektebene. Es habe uber seine ganze parallel sum Objekt. ObjrktivFlache konstante optische Eigenschaften, die brcnnebcne (e); { y , c} mit tdurrh eine komplexe Zahl P nach Phase und Achse parallel zum Obielit.
Glimmerachsen dorch DoppelAmplitude erfafit werden (s. Abb. 2). Dieselbe pfeile gekennzeichnet. ObjektLichterregung P herrscht dsnn auch im Bild. cbene (c); {x',y'} mit y'-Achse
parallel zum Objekt der Hreitc
8)
H . O s t c r b c r g , J. Opt. Soc. Amcr. 37, 72G,
523 (1947).
b. Objektfeldgrenzen - F/2<
< <
x'< F/2, - G/2 y' a/2.
u. G . E. P r i d c , J. Opt. SOC. Ebenc dcs Polarisators (h) ;
Amcr. 40, 64 (1960).
{z,y} parallel zu den Achsen
lo) E. W. T a y l o r u. H.0. P a y n c , Naturc 160, des Glimmerpliittchens in (e).
329 (1960).
Untcr 4 6 O dazu Polarisations11) H. W o l t c r , Z. Physik 140, 57 (1955).
richtung (Doppelpfeil)
9)
H.Ostcrbcrg
240
Annalen dar Physik. 7. Folge. Band 1 . 1956
In der hinteren Objektivbrennebene entsteht ein Fraunhofersches Beugungsspektrum des Objekts. Es besteht aus dem nach Phase und Amplitude praktisch unveranderten direkten Bild der Blende ( b ) , dem ,,Spektrum nullter
Ordnung", das also in der Bildebene (1) wieder 1
liefert, und aus dem abgebeugten Licht, den ,,Seitenspektren", die im Bild zu P-1 interferieren; denn
beide Anteile zusaiiimen sollen ja P egeben. (Das
Spektrum nullter Ordnung ist praktisch unverandert,
da das Objektfeld ja fast leer ist.)
Beim einfachen Phasenkontrastverfahren bringt
P- I
man nun in der Brennebene (e) einen Phasenschieber
an, der die Seitenspektren gegen das Spektruni
P
Abb. 2. Tichterregungen nullter Ordnung uni eine Phase 6 verdreht (Winkelin der Gaunschon Zahlen- vorzeichen richten sich hier und im folgenden nach
ebene, strenger Phasenkontrast. 1 = Sprktruni dem mathematischen Drehsinn), also etwa eine in1
nullter Ordnung; P = Bild der Blende durchbohrte Zaponlackfolie. Dann
Objektrinflun; P - 1 = hat niari im Bild die Lichterregung
Seitenspektren, die urn 8
B = 1 (P- 1) eiO (s. Abb. 2).
(1)
gedreht werden. Erregung
@
L
+
im Bilc1 B = ( P - 1) ei6
Bei unserem I'crfahren liegt nun in der Brenncbene (e) ein doppelbrechender Phasenschieber, ein
durchbohrtes Glinimerplattchen, das in seinen beiden Hauptschwingungsrichtungen die Seitenspektren um 6, bzw. tYw verdreht. Stellen wir einen
Polarisator (h) vor der Kondensorblende parallel zur einen oder anderen
Glimmerrichtung, so erhalten wir in1 Bild, in das wir ein Koordinatensystern
{x,y} parallel zu den beiden Glinimerrichtungen legen, dic Lichtcrrcgungen
bzw.
Stellen wir den Polarisator (h) unter 45" gegen die beiden Glimmerrichtuiigcri
(und norrnieren nun die Gesamtintensitat auf 2), so erhalten wir die beiden
sich geometrisch deckenden, sonst aber verschiedenen, senkrecht zueinander
polarisierten Bilder (2), die sich also zu einer Schwingungselhpse uberlagem.
Orientierung, Hauptachsenverhiiltnis und Umlaufsinn dieser Ellipse
lassen sich in der ublichen Weise mit Hilfe eines elliptischen Analystors bestimmen, der aus dem 1/4-Glimmerplattchen ( i ) und dem Analysator (k) besteht. Man legt dazu das Glimnierplattchen mit seinen beiden Hauptschwingungsrichtungen parallel zu den Hauptachsen der Ellipse. Hinter dem Glimmer
ist das Licht dann linear polarisiert in Richtung der einen cder der anderen
Diagonalen des Rechtecks, das man der Ellipse hauptachsenparallel umschreibt. Das Licht kann dann mit dem Analysator vollig ausgeloscht werden.
Man hat also zwei Stellungen des Analysators, fur die das Objekt schwarz
wird, sie sind die eigentlichen MeBwerte. Aus ihnen lassen sich die Daten der
Ellipse, und daraus lassen sich wied er die Objekteigenschaftcn P bercchnen.
Das ist bei Wolterll) ausfuhrlich behandelt.
Diesc einfachen Betrachtungen gelten jedoch nur fur schmale Objckte,
genauer gesagt fur
h Ai< 1,
(3)
/ I . GIndirroitis: Plcasciikonlrasliika'kioakoii zur Miesscrnr~ asolicrltr Obpklr
241
b die Objektbreite, A , die Apertur des Lochs im Glimmer und ildie Vakuumwellenlange des benutzten Lichtes ist ; man spricht dann von ,,strengeni
Phasenkontrast". Wolterll) konnte (3) erfullen, indeni er bei seiner makroskopischen Apparatur einen schmalen Spalt statt einer Lochblende als Lichtquellenblende benutzte ; dieser Spalt konnte dann kleinere Aperturen haben.
W o l t e r mu13te aber seine Streifenobjekte parallel zu diesem Spalt legen.
Da eine solche Orientierung in der mikroskopischen Praxis oft nicht moglich
ist, mul3te am Mikroskop eine Lochblende verwendet werden. AuBerdem
bedingen die kleinen Brennweiten der Mikroobjektivc groBe Aperturen A i
dcs Lochs im Glimmer (seiner GroBe sind nach unten technische Grenzen
gcsetzt). Daher konnte (3) hier nicht mehr erfiillt werden. Damit traten
Komplikationen anf, wie sie fur einfache Phasenkontrastbilder von Menze112),
Schuster13) und Wolter1*)15) diskutiert wnrden. Bei einem 45fachen
Objektiv der N. A. 0,65 etwa geniigt die einfache Theorie nur fur Objektc,
die bis zu 1,u brcit sind. Bei 1,u liegt das Auflosungsvermijgen des Objektivs !
Da dicsc Fragen entschcidend fur dic Konstruktion der Apparatur sind,
hollen sie zunarhst im folgenden Abschnitt in eingeliender Analyse grkliiri.
\I crden, bevor die Apparatur beschrieben wird. Diese Analysc w i d zuglrirli
die Moglichkeit geben, den MeBbereich wcscntlich zu erweitern.
HO
3. Eingehendc Theorie fur breite Objekte
Wir sctzcn auch hier wieder eine punktformigc Lichtquelleriblendc voraus
(s. Abh. 1). Liegt dann in der Objcktebene, in dic wir ein Koordinatcnsystem {d,y'} legen wollcn, das mit dem System (2,y} des Glimmers in
lieinerlei Beziehung steh t, ein Objekt, dessen Phasen- und Amplitudeneinflu13 durch eine komplexe Objektfunktion 0 (d,
y') beschrieben werden kann,
so erhalt man in der hinteren Objektivbrennebene das F r a u n h o f e r s c h c
Reugungsspektrum
I Iabei benutzen wir als Koordinatcn in der Objrktivbrcnnebenc die Richtungsvariabcln
wo 18 der Brechungsindex im Raum zwischen Objekt und Objektiv ist, 01 und p
die Winkel sind, die ein Strahl dort mit der d-bzw. der y'-Achsc bildet, und
A die Vakuumwellenlange des benutzten Lichtes ist. Die Grenzen des Objektfcldes nehmen wir zunachst an als
- F / 2 < 2' < F / 2 ,
(6)
- G / 2 < y' < (312.
_____
E. M e n z e l , Optik 6,385 (1949).
K. S c h u s t e r , Jenacr Jahrbuch 1961, H. 22.
14) H. Woltor, Ann. Physik (F) 7, 33 (1960).
u) H. Wolter, Ann. Physik (6) 7, 147 (1950).
12)
242
Annalen dsr Phyaik. 7. Folge. Band 1. 1958
I n der Brennebene wird das Licht nun durch ein Glimmerpliittchen beeinfluflt, das in1 Zentrum ein kreisrundes Loch triigt. I n die Mitte des Lochs
f d l t das Bild der Lichtquellenblende. Das Licht wird also mit ciner ,,Eingriffsfunktion" Q (y, t) multipliziert, die hier die Form hat
y2 -I- 52 < y;
( J ( y , ( ) = = cia fiir
fur y i < y 2 + ( 2 < y z
I'
10
fiir y:
(7)
< y2 + (2.
(Wir spezialisicrrn zuniichst fiir lineare Polarisation in x- oder y-Rich tung
[ Climmersystem !] und lassen einfachlieitshalber rlic Indixcs wcg.) y J = A,
ist die nnmerische Apertur des Lochs im Glimmer, y, A = A, die ties Objektivs.
Im Bild erhalt man dann eine Lirliterregung
a,
L3
(XI,y') =
JJ E (y, 5) Q (y, ()
c?Xi(yx'+CV')
dy d i .
-00
Wir m i i s s m
iillri
nuf hrsondere Objektfornien spczialisic~rcn.
a) Eindimeneionales Streitenobjekt
Als erstrs Ubjekt behandeln wir einen honiogenen, unendlich langen Streifen
cler Breite b (s. Abb. l), der syinnietrisch zur y'-Achse liegt. Seine Objektfunktion ist
Dahc4 ist P cine feste koriiplexc Zalil. Eiiisctzoii iii (4)liofort,
Lassrri wir also dir C4rctizrri /+
so crhaltcn wir
uiitl
G unwrcs Crrsic*litsfoltl~s
srlir grol3 werden,
E(y,i)=d(C,O) ( d ( Y , O ) f ( P - W
sin ?G b y I
nl,r j '
Das Spektrum licgt also ganz auf dcr C-Achac). Als Bildfunktion erhalten
wir dann aus (8) unter Beachtung von (7)
t?. Gradniasrr:
~ ' ~ l ~ s e a k o t k f r a s l t ~ i ~Zur
~ r oUsc~svs pu s g auoliwler Objcklc
\V ir fiihrcn nun nacli Wol tcr14) ciric iicuc Fuiiktion cin
U
so
Prhalten wir die Bildfiiiiktion
B (v) = 1
+ (P- 1) e i " I I (ua,v) 4-( P - 1) (1 - e i 6 ) n (ui,v).
Fur U, -+ 00, ui-+ 0 (gutc Auflbung, verschwindendes I'rodukt aus Objektbreite und Apertur des Lochs iin Glimmer) geht (15) in (1) uber,'wie man mil
Hilfe von (13) leicht sieht.
Durch einfache Umformung gewinnt man aus (15)
Steht der Polarisator (h) unter 45' gegen die x- und die y-Achsc, so erhalt
man also die beiden parallel zu den Achsen polarisierten Bildfunktioncn
B, (v) = c {1+ 6*'. (P' - l)}
B, (v) = G {1+
cia!( (1'' -
l)),
+
w0bc-i (7 = {l ( P - I ) II (ui,v)} niclit von dcr Polarisationsrichtung abhangt. Durch Vergleich von (17) niit (2) sieht inan, da13 man durch Auswertung
nach Wol t erll) linter der Voraussetxung strengen Phasenkontrasts zunachst
ein fchlcrhaftcs P' gewinnt, das aber mit P in der einfachen Relat,ion steht
Man gewinnt. also (lurch Korrektur das wahrc
>
Fur eine vernunftige Messung mu8 das Objekt gut aufgelost sein (u, 3 ,
praktisch geniigt etwa u, > 2 n). Ferner sol1 B (v) fur 12'1 < 1 praktisch
konstant sein. Diese Forderung ubertragt sich dann auf
Ui
- Ui
244
A I I I I ~ &r
C ~ P~ h p i k . 7. F ~ l g r .Band 1. 1958
Dies Integral ist, aber wegen der Symmetric von
sin ?L
~~
‘IL
von
unabhangig,
sobald wir bei der Entwicklung der Exponentialfunktion nacli dern lineareti
Glied abbrechen.
Wir fordern also uz< 1. Praktisch genugt ui< 4; dort wird dann
2
f1 (ui,
c) w -- u iund wir erhalten im MeBbereich
x
(21))
ails (19) .
( 19a.)
b) Zylinderobjekte beliebigen irnd besonders elliptischen Qaerschnitts
Der homogene Parallelstreifen ist zwar einfach theoretiscli zu behandeln
und zu vermessen, hat jedoch in der Biologie kauni Bedeutung. Interessanter
sind dort Zylinderobjekte anderen, vor allem elliptischen Querschnitts.
Daher wollen wir hier auch ganz allgemeine Querschnitte behandeln.
1st die Differenz /In = no - nEl der Brechungsindizes n,, der Umgebung
iind nbIunseres Fadenobjektes klein, so kann man die Wirkung des Objekts
naherungsweise duroh eine (in unsercni Fall eindimensionale) Objektfunktiori
0 (2’) erfassen (das Objekt der Breite 2 R liege wieder symmetrisch zur y’Achsc). Es ist also
1 fur 1 2’ I <
0 (2‘)=
(2 1)
= 1sonst.
Fiir cincii Brriszvlinder ist
I+
n
I
n a b t i is6 lwi felllender Absorption
((21) gilt mit sinngeniaB abgeaiidertciri
Einsetzcn in (4) ergibt
/?aucli fiir dcii cl1iptisc:lien Zylirider).
(33)
Aucli liier liegen die Spektren also ganz auf der <-Achsc.
Wir fuhren nun analog zu (14) die dimensionslose Variablc u ciri
u=ZzRy
(144
U.Gradmann: Phosenkonlrastmikroakop zur
und setzen voraus, daB fur symmetrische Objektc mit 0 (2')= 0 (-
praktisch genugt ui< 3.
245
Messung isolierter Objekte
2')
gelte
+ ui
ei"i w
1
4<
1;
Fur nicht symmetrische Objekte gclte
(24a)
praktisch geniigt ui < 4.
Dann wird fur Punkte im Glimmerloch (y2
+ c2 > yf)
R
R
eine von y unabhlingige Konstante, und man kann die Bildfunktion nach (8)
berechnen zu
YU
B (2')= ese
J
- Yo
+ (1-
e2nJyz'
j"0 (z-)
e-eniyz
-00
Yi
J
eta)
e2niyz'
(6(y, 0)
dy
+ M ) o+
-Yi
+ (1 -
= ke 0 (5')
eJ0)
(1
+ 2 yiM ) ,
wenn man gute Auflosung voraussetzt, was wir hier tun wollen. Durch leichte
Urnformung erhalt man
Durch Vergleich mit (2) sieht man w i d e r wie bei den Betrachtungen zu
Formel (16), daB man zweckmaRig von einer fehlerhaften Funktion 0'(5')
ausgeht, die man unter der Vorausetzung strengen Phasenkontrasts gewinnt,
und dann das wahre 0 (x') durch Korrektur gewinnt nach der Formel
0 (2') = 0' (5') (1
+ 2 yi M ) .
(27)
Die Formeln (26) und (27) gelten wegen der Voraussetzung guter Auflbung
und wegen (24) fur symmetrische Objekte mit prektisch ausreichender Naheruag im MeBbereich
2
1
Yo
2ZYi
-<<R<-.
Pa)
Auf die problematische Frage, ob man tatshhlich bei der Messung auf
vollige Dunkelheit einer Objektstelle einstellen kann, werden wir weiter unten
im Zusammenhang mit der Messung an Clasfiiden eingehen.
246
Annalen der Physik. 7. FoEge. Band 1. 1958
Die Berechnung von M kann im Einzelfall sehr kompliziert werden. Wir
wollen sie wenigstens fur den elliptischen Zylinder durchfuhren. Dort ist
K
/
0 ( 2 ‘ )dx’ = J
4 2
eiP
~R’”’*dx’ =
-R
0 bjekt
x uJ
ecSRcosu R cos udu
4 2
n/2
=2
J
- n/E
cos
(p x cos U) cos u du + 2 i R J
u
fi[=nRl-I
n
sin
( p R cos u) cos u dzi
+ SZ (p R) -I- i 1, (p R ) ) .
(254
Dabri ist Il die erstc Bcsselfunktion i m l
(lurch folgcndc Reihc darstellbar:
c) Hleine zweidlmensionsle Objekte
Ueliebige’gut auflosbare Objekte, die durch eine Objektfunktion 0 (x’,y‘)
beschrieben werdcn konnen, kann man in ganz analoger Weise behandeln,
wenn sie in einem sonst leeren Objektfeld und ganz in einem Kreis um den
Nullpunkt vom Radius R liegen, fur den mit (14) u = 2 n R y folgende Ungleichungen gelten :
U?<L
(24)
praktisch geniigt ui< 4, fur Objekte rnit zwci senkrwhten Symmetrieachsen.
fur die also im gecignet gelegten System (x‘, y‘} gilt
0 (x’,y’) = 0 (- x’, y’) = 0 (d,
-g’) = 0 (-x’, -y‘)*
Fur nicht symmetrischc Objekte sol1 gellcii
a.
prrtktisch geniigt ui <
Aus (4) wird dann fiir Punkte
m
Ui<
it11
1,
Glitnincrlorh (y2 4-C2 < y?)
(34a)
ti. Gradinanit: Phascenkoiilraslmikroskop ZUT Messung isolierler Objckh
24;
fiir das Innere des Lochs im Glimmer wieder eine von y und 5 unabhiingigc
Konshnte. Aus (8) folgt dann wegen der Voraussetzung guter Auflosung
13 = e"0 (z',y')
=P
Ulltl
; ~ (x',
O y')
+ (1- cia)
JJ
7
' + C'
< Yi'
e 2 n i ( ~ . r ~cv')
'
(6
(Y,0) 6 (5, 0)
+ (1- eg") (1 + n y: N )
91
B(z',y') = { 1 + n Y i 8 N } ( 1 + k a ( - P - : ~ ~ ~~,
+ N } dY d5
("M)
+
0 (d,
y') = 0' (x', y') (1 7d g N )
(274
in vollcr Analogie zu den Formeln (26) und (27). Auch die Auswertung cler
Messung verlauft in analoger Weise. Die Berechnung des Integrals N kanu
auch hier erhcbliche Schwierigkeiten machen. Fur ein homogenes Objekt
vom Fliicheninhalt @ mit der konstanten Objektfunktion P wird einfach
N = ( P - 1) @.
Man beachte, daB alle drei Objektformen eines gemein haben : Das Objekt
liegt isoliert in einem sonst leeren Gesichtsfeld (s. die Ansatze (9), (21) und die
entsprechende Bemcrkung im ersten Absatz von c)).
4. Die Apparatur
Uei der Realisierung der Apparatur, wie sie in Abb. 1 skizziert ist, waren
zwei Forderungen zu beachten:
1. Um einer moglichst guten Annaherung an strengen Phasenkontrast
willen, bzw. um den MeBbereich (20) grol3 zu machen, muBten die Aperturen
der Beleuchtung und des Lochs im Glimmer mijglichst klein gehalten werden.
2. Streulicht erniedrigt die MeBgenauigkeit und kann systematische
Fehler bewirken. Es mu13 daher auf ein Minimum reduziert werden.
Um der zweiten Forderung willen wurden alle Optiken vergiitet. Weiterhin
wurde ein strenger Koh lerscher Beleuchtungsapparat verwendet. Die
Streuung am Rande des Lochs im Glimmer wurde durch Einbetten in IZanadabalsam verringert. Endlich war strenge Monoehromasie erforderlich. Sie
war durch eine Quecksilberhochstdrucklampe in Verbindung mit eineni
Tnterferenz-Bandfilter fiir die griine Quecksilberlinie (A = 546 nap) gegeben.
Nach all diesen MrtBnahmen betrug die Streuintensitat noch etwa 0,2%
der Gesamtintensitat (fiir beide Objektive (a. u.) ubereinstimmend).
Die erste Forderung bedeutet die Notwendigkeit, Locher von etwa
mm
Durchmesser in Glimmer zu bohren. Da ein 1/2-Glimmerpliittchen,das gute
MeBgenauigkeit und bequeme Auswertung fiir sich hat, 0,05mm dick ist,
der Glimmer sehr leicht spaltet, was natiirlich vermieden werden muB, und
da der Rand des Bohrloches moglichst glatt sein sollte, machte die Bohrung
zunachst Schwierigkeiten. Von Hand kann man Locher bis zu 0,12 mm Durchmesaer mit Uhrmacherspitzbohrern bohren ; brauchbare Locher mit Durchmessern bis zu 0,05 mm gelangen mit Uhrmacher-Spiralbohrern auf einer
Priizisionsbohrmaschine. Der kruchrand war 5-10 p breit.
Doppelbrechende Folien, etwa die Polyvinylfolien von Kiisemann ,
sind zwar dunner und lassen sich leichter bohren als Glimmer. Ihre optischen
Qualitaten genugen zur Zeit jedoch noch nicht den Anspriichen des Verfahrens.
24 8
Annalen der Phyeik. 7. Folge. Band 1. 1958
Zwei Mikroobjektive der Firma E. Leitz wurden fiir das Verfahren eingerichtet, die Achromaten P6L, 45x, N. A. 0,65, und 1/12 01, lOOx, N. A. 1,30.
Der Brennpunkt des schwacheren Objektivs P6L liegt nahe dem letzten
Linsenscheitel, daher konnte das Glimmerplattchen direkt hinter die letzte
Linse auf das Objektiv gelegt werden. Ein 1/2-Glimmerplattchen mit einem
Iach von 0,12mm Durchmesser wurde d a m zwischen zwei Deckglliser in
Kanadabalsam eingebettet, um das Streulicht von den Lochrhdern her zu
vermindern und einen Intensitatsunterschied zwischen Spektrum nullter
Ordnung und den Seitenspektren durch Reflexionsverluste zu vermeiden.
Mit der Objektivapertur A , = 0,65 und der Apertur des Lochs im Glimmer
A , = 0,018 (uber die Messung von Ai s. u.) ergsb sich der MeRbereich (20) zu
Die Korrekturen des Abschnitts 3 sind durchaus erforderlich. Das Bild der
Kondensorblende (b), die im Blendenrevolver des Phasenkontrastkondensors
von ZeiB-Opton bequem justierbar angebracht war, hatte einen Durchmesser
von etwa 0,04 mm. Damit war eine hinreichende Anniiherung an eine punktformige Lichtquelle gegeben. Das hatte auch den Vorteil, daR trotz der miil3ig
guteii Abbildung der Kondensorblende - die Optiken sind ja nicht fur diese
Abbildung korrigiert - das ganze Spektrum nullter Ordnung durch das
Loch ging. Da dies bei wesentlich kleineren Lochern Schwierigkeiten gemacht
hatte und da bei so kleinen Beleuchtungsaperturen die Leuchtdichte selbst
der verwendeten Hochstdrucklampe keine hinreichende Helligkeit des Gesichtsfelds mehr ermoglicht hatte, wurde hier auf noch kleinere Locher verzichtet.
Fur die Anwendung ist natiirlich ein Immersionsobjektiv wichtiger. Da
die Brennebene hier stets tief im Objektiv liegt, muBte das Glimmerpliittchen
ins optische System eingebaut werden. Die Firma E. Leitz iibernahm es
freundlicherweise, eine Linse ihres Iminersionsobjektivs 1/12 01 aufzuschneiden
und ein 1/2-Glimmerpllittchen einzukitten, das eine Bohrung von 0,05 mm
Durchmesser trug. Mit A , = 1,30 und A i= 0,020 ergab sich der MeBbereich
(20) zu
(20")
0,8p < b < 4,5,u.
Aus technischen Griinden konnten die Glimmerplattchen nicht genau in
die Objektivbrennebenen eingebaut werden. Da dann auch die Kondensorblende nicht im Brennpunkt des Kondensors liegt, durchsetzt die Objektebene kein Parallelbiindel und unsere Theorie aus Abschnitt 3 scheint zunachst fraglich zu werden, da sie doch F r a u n h o f er sche Beugungstheorie
ist. Man kann sich aber durch eine einfache nberlegung helfen.
Die Kondensorblende (b) (s. Abb. 3) befinde sich nicht in der Brennebene
des Kondensors (a). Dann durchsetzt die Objektebene (c) ein divergentes
Biindel, das in dieser Ebene, in die wir ein Koordinatensytem {z, y} legen,
durch E (z, y) beschrieben uiird. Legt man nun ein Objekt der Objektfunktion 0 (2,3) in die Objektebene, so hat man direkt hinter ihr die Lichterregung E (z, y) 0 (x,y), die in der Ebene G, in die bei fehlendem Objekt die
Blende (b) abgebildet wird, zu einem Beugungsbild interferiert. Dieses Beugungsbild laBt sich also prinzipiell aus E (z, y) 0 (z, y) berechnen. Nun konnen
wir uns E (2,y) 0 ( x , y) aber auch auf andere Weise entstanden denken:
u. Gradrnann: Phasenkontrastmikroskop
ZUT
Messung kolierler Objekte
249
%s falle ein Parallelbundel auf die Objektebene. In ihr liege wieder das Objekt
und direkt dahinter eine unendlich diinne, endlich starke Linse (e), die durch
E (x,y) beschrieben werden kann. Direkt hinter der Linse (e) haben wir dann
wieder die Lichterregung E (2, y) 0 (x,y). FaBt man diese Linse nun mit dem
Objektiv ( d ) zu einem neuen Objektiv (d') zusammen,
so ist G dessen Brennebene und das Beugungsbild
I
dort offensichtlich Fraunhofersch. Die Apertur A i
G
des Glimmerlochs kann nun freilich nicht uber die
ja unbekannte Brennweite des gedachten Objektivs
(d') bestimmt werden. Zu ihrer Messung legt man
vielmehr am einfachsten ein Gitter als Objekt in die
Objektebene, z. B. einfach ein Objektmikrometer.
Die Aperturen der Beugungsspektren dieses 'Gitters
sind bekannt, und man miBt A i durch Vergleich
der Lochgrofie mit dem Spektrenabstand. Die
Ebenen G der beiden Objektive wurden photographiert. Aus den Photographien wurden die Aperturen A , bestimmt.
b YI
Der Brechungsindex von Kanadabalsam hangt
von der Temperatur ab. (Fiir Glimmer kann man Abb. 3. Zum Vcrgleich
diese Abhangigkeit vernachliissigen.) Mit diesem F r a un h o f e rscher und
nicht Fraunhoferscher
Brechungsindex no andert sich auch die Phasen- Beugung. ( a ) Kondensor,
drehung 6 der Seitenspektren im Glimmerplattchen (b) Kondensorblende, (c)
mit der Temperatur T.1st d die Dicke des Glimmer- Objektebene, ( d )Objektiv,
(e) gedachte diinne Linse,
plattchens, so gilt
d_
B
-- 360'(ET
dn
d dn,
A -.
dT
+
(d') = (d e) gedachtes
(Objektiv, (U) Ebene der
Bcugungsfigur
-
Bei 25" C ist 4
= 3,15 lo4/" C. d = 53 p wurde mit einer MikromeBuhr
dl'
d8
gemessen. So erhalt man - = 1 2 , O 0 / O C. Die Temperatur des Objektivs
dT
und damit des Kanadabalsams mu13 also auf Bruchteile eines Grads genau
regulierbar sein. Beide Objektive wurden daher mit Temperierzylindern
umgeben. Diese wurden an einen Umlaufthermostaten angeschlossen, mit
dem sich eine Temperaturkonstanz von 0,02" C bequem erreichen lieB.
Die Polarisatoren (k) und (h) (s. Abb. 1) maren Polarisationsfolien der
Firma Kasemann. Alle Teile waren an einem ZeiBschen Universalstativ
alterer Bauart montiert, die drehbare Gliminerplatte (i) und der drehbare
Analysator (k) direkt am Tubus hinter dem Okular.
~
5. Messungen an Streitenobjekten; MeBgenauigkeit
Die einfachsten Probeobjekte zur Prufung des Geriits sind homogene, nicht
a,bsorbierende Streifen, wie man sie sich rnit einem Rasierklingensplitter unter
dem Phasenkontrastmikroskop aus Zaponlackschichten schneiden kann.
Es gelang, Streifen mit Breiten bis zu 1p herab zu schneiden. Solche Streifen
eignen sich zugleich zur Eichung der Objektive. Da der AmplitudeneinflurJ des Objekts Po= 1 hier bekannt ist, kann man der Messung statt dessen
eine andere GroBe entnehmen, die Phasendrehung 6s bzw. 6, der SeitenAnn. Phvsik. i. Folge. Bd. 1
17
250
Annalen der Physik. Y. Folge. Band 1. 1958
spektren im Objektiv, wie man sich leicht uberlegen kann. (6, - tYZ wird
natiirlich mit Hilfe eines Kompensators geniessen.) Die Eichung uber den
Temperaturbereich von 16--50°C ergab die nach (28) zu erwartende Proportionalitat zum Brechungsindex von Kanadabalsam bzw. zu seinem Temperaturgradienten.
Es empfiehlt sich, bei der Messung mit Hilfe des Thermostaten solche
Werte von 6, und 6, einzustellen, daB die Bildellipse flach wird, da dann die
MeQenauigkeit besonders hoch ist. Fur nicht zu starke Objekte (Icpol < 90')
ist das bei den hier verwendeten 1/2-Glimmerplattchen fur 6, = - 6, = 90'
der Fall.
Die MeBgenauigkeit wird in1 wesentlichen durch Streulicht begrenzt.
Der Schwingungsellipse (2) uberlagert sich (meist unpolarisiertes) Streulicht,
die Ellipse kann daher nicht mehr einwandfrei vermessen werden. Systematische Fehler treten bei den geringen Streulichtmengen (0,2%) praktisch
nicht auf, wenn die Phase des Objekts mehr als 4" betr2igt. Die Einstellgenauigkeit a m elliptischen Analysator betriigt lo.
Wegen des unvermeidlichen Bruchrands des Lochs im Glimmer ist die
Apertur dieses Lochs nur auf 10% genau fiir das Objektiv P6L und auf 20%
genau f i i r das Objektiv
01 bestimmbar. Diese Unbestimmtheit wirkt
sich auf die Mekenauigkeit fur breite Objekte aus, wie (19a) zeigt (uienthalt
das Produkt am der Objektbreite und der Apertur des Lochs im Glimmer als
Faktor). Endlich lassen sich die Phasendrehungen 8z bzw. 8, im Objektiv
nur auf 1,5" genau bestimmen, was sich auch auf die MeBgenauigkeit auswirkt.
Die MeBgenauigkeit, die also durch diese drei Faktoren begrenzt wird,
hangt in ziemlich unubersichtlicher Weise von den Objektdaten ab. Die
MeBfehler wachsen mit der Objektbreite und mit dem PhaseneinfluB des
Objekts. Fur schwache Objekte (lq0l < 40') mit Breiten von weniger als 4p
betragt die MeBgenauigkeit lo in der Phase und 1% in der Amplitude. Fur
ungunstige Objekte konnen Fehler bis zu 8' bzw. 9% auftreten. Es handelt
sich dabei uni den mittleren Fehler der Einzelmessung. Da systematische
Fehler mit eingehen und da aufeinanderfolgende Messungen zudem durch die
Physiologie des Beobach ters gekoppelt sind, wird der Mittelwert aus einer
grooeren Zahl von Messungen nicht wesentlich genauer.
Als Vergleichsverfahren diente das Dreistrahl-Interferenzverfahren von
Zernike16) in einer Ausfuhrung nach S t r o h m a i e r l ' ) , Das Verfahren hat
eine Mekenauigkeit von 1/20. Die nach beiden Verfahren gemessenen Werte
fur den PhaseneinfluB des Objekts stimmten in den Fehlergrenzen gut iiberein.
6. Messungcn an Zglinderobjekten (Glasflden)
Eine in der Biologie haufige Objektform ist der Kreiszylinder, man denke
etwa an Bakterien und Pilze. Daher war eine entscheidende Frage, ob fur
solche Objekte gut reproduzierbare, kennzeichnende hnalysatorstellungen
existieren und wie sich gegebenenfalls aus ihnen die Objektdaten errechnen
lassen. Es schien ratsam, die Frage an einfachen Modellobjekten zu Lintersuchen, wozu sich Glasfaden verschiedener Dicke in verschieden brechenclen
Immersionsflussigkeiten gut eigneten.
16)
)'1
F. Zernike, J. Opt. SOC.Amcr. 40, 326 (1950).
K. Strohmaier, Z. Physil; 135, 44 (1953).
U.Gradmann: Phasenkontrastmikroskop zur Messung isolierter Objekle
251
Die diinnen Glasfriden wurden auf folgende Weise in der Flamme eines
Bunsenbrenners hergestellt : Zuerst wird aus einem runden Stab ein Faden von
wenigen Zehntel mm Dicke gezogen, der gute elastische Eigenschaften hat.
Ein U-formiger Bogen dieses Fadens wird in den obersten Teil der Flamme
gehalten. Bei einer bestimmten Temperatur des Fadens schnellt dieser durch
seine eigenen elastischen Krafte auseinander ; die beiden Enden sind dann,
wenn man etwas Gliick gehabt hat, diinne Fiiden, deren Durchmesser auf
einer Lange von wenigen em von 10 ,u bis auf Bruchteile von 1,u abnimmt.
Dieser Dickenbereich interessiert gerade. Geht man dabei von Staben kreisrunden Querschnitts aus, so ist auch der Querschnitt der Friden mit hinreichender Naherung kreisrund. Legt man solch einen Faden auf einen Objekttrager und befestigt das dicke Ende mit einem Tropfen Zaponlack, so haftet er
fest, auch wenn man ihn haufig in wechselnde Immersionsfliissigkeiten einbettet, wofiir sich die in der Mineralogie iiblichen hlischungen aus or-Bromnaphthalin und Kerosin eignen. Da man sich aus den beiden Flussigkeiten
Losungen mit beliebigem Brechungsindex zwischen 1,44 (Kerosin) und 1,64
(or-Bromnaphthalin) herstellen kann, bietet der Glasfaden (sein Brechungsindex war nF = 1,51) in solchen Losungen den gesamten praktisch interessierenden Teil des zweidimensionalen Kontinuums aller nicht absorbierenden
Kreiszylinderobjekte.
Die geometrische Fadendicke konnte im Hellfeld mit einem Immersionsobjektiv und Mikrometerokular auf 0,l ,u genau gemessen werden. Der
Brechungsindex nF des Fadens ergab sich aus den Messungen selbst durch
Interpolation zwischen den Ergebnissen b d sehr kleinen positiven und negativen Indexdifferenzen (An = no - np 2 0 und ldnl < 0,010). Bemerkenswert ist, dal3 der Brechungsindex der Fiiden in den Grenzen der Mel3genauigkeit (f 0,0004) f i i r Durchmesser von 10 ,u bis 0,3 ,u konstant war.
Der Ausgangspunkt fiir eine Diskussion der Messungen an solchen Glasfaden ist die Tatsache, daI3 es im MeBbereich (20) und fiir ldnj <0,05 fur
jedes Fadenobjekt zwei auf 1' reproduzierbare Analysatorstellungen gibt,
fur die das ganze Objekt gleichmal3ig schwarz wird. Fiir breitere und vor
allem fur starker brechende Objekte geht die Reproduzierbarkeit rasch zuriick.
Der Vergleich von fiinf Beobachtern ergab fiir diese Stellungen Ubereinstimmung der ersten vier auf lo,wahrend beim fiinften, der auch schon bei
Messungen an Zaponlackstreifen aus der Reihe fiel, Abweichungen bis zu 5'
auftraten. Die Existenz dieser reproduzierbaren Stellungen gleichmafiig
schwarzen Objekts erstaunt zuniichst, da die optische Dicke ja gar nicht uber
das ganze Objekt hin konstant ist, wie beim Zaponlackstreifen. Mijglicherweise erklart sie sich zum Teil so, daI3 bei diesen Stellungen tatsachlich fiir
keine Objektstelle das absolute Intensitatsminimum vorliegt, das Objekt also
im Grunde (auch nach Abzug des Streulichts) nur gleichmaI3ig grau ist. Vermutlich wirkt hier aber auch der bekannte physiologische Effekt mit, daB das
Auge Kontraste iiberhoht. Dadurch kann eine etwaige Aufhellung der Rander
gegeniiber der schwarzen Mitte physiologisch z. T. kompensiert werden.
Die Messungen wurden daher unter der Annahme ausgewertet, dal3 sic
sich auf das Minimum der Intensitat in der Objektmitte beziehen. Die Auswertung lieferte dann die optischen Eigenschaften in der Objektmitte. Die
so gewonnenen Werte q& fiir die Phase und P(, fur die Amplitude wurden ver17*
252
Annalen der Physik. 7. Folge. Band 1. 1958
2 RAn
glichen mit den zu erwartenden Werten Po = 1 und qo = 360'
q.+, errechnet sich aus der geometrischen Dicke 2 R, den Brechungsindizes und der
Vakuumwellenlange 3, des benutzten Lichts.
Ein Faden wurde in jeweils 9 verschiedenen Lijsurigen unter beiden Objektiven durchgemessen. Die Abb. 4 und 5 zeigen die Ergebnisse. In ihnen ist
das Verhiiltnis @ = q&/vo
und die Differenz Aqo = q& - cpo der gemessenen
An=- 0.004
An=-0,013
An =+O,W
An=+O,O?%
2 4p 6
Objektbreite ZR
Abb. 4. Messungen mit dein Objektiv P6L (6r = - 6, = 90') a n einem Glasfaden vom
Brechungsindex n, in Losungen von verschiedcnen Brechungsindizes no* An = n, - nlP
als Parameter. 1st vh die gemessene Phase, v0die aus den Brechungsindizes und derobjektbreite 2 R errechnete Phase, so ist oben Avo = pi - ~ 7 und
a
CJ = &/v0 gegen die Objektbreite aufgetragen, unten die gemessenen Amplitude PA. Zu erwarten wLre @ = 1, Pi = 1.
Die gestrichelten Keile geben die Fehlergrenzen an, wie sie auf Grund der in Abschnitt 6
diskutierten Fehlerquellen und der Fehler in An und 2 R zu erwarten sind. Die Fehler
durch Inkonstanz der optischen Diclte und durch den Naherungsansatz (2la) sind darin
nicht enthalten
Phase q; und der berechneten Phase vo sowie die gemessene Amplitude P;
gegen die Objektbreite 2 R aufgetragen. Zu erwarten ist @ = 1, Avo= 0 und
PA = 1. Die gestrichelten Keile geben die Fehlergrenzen fur AT,, und P; an,
wie sie sich aus den in Abschnitt 5 diskutierten Fehlerquellen und aus den
Fehlern fur An (f 0,0005) und 2 R (+0 , l p) ergeben.
Im MeBbereich (20') fur P6L (1,6 p < 2 R < 5,O p) bzw. im MeBbereich
(20") fur 1/12 01 (0,8p < 2 R < 4 , 5 p ) , zum Teil auch noch daruber hinaus,
stimmen fur \ A n \ < 0,04 die gemessenen Phasen und fur lAn[ < 0,02 auch
die gemessenen Smplituden in den Fehlergrenzen mit den berechneten
U.Gradmann: Phasenkontraslmikroskop zur Messung isolierler Objekte
253
iiberein. Die Abweichungen fur breitere und vor allem fur starker brechende
Objekte sind z. T. darauf zuriickzufuhren, da8 die Reproduzierbarkeit der
Einstellung zuriickgeht, weshalb in den starker brechenden Lbungen such
nur diinne Fiiden vermessen werden konnten, vor allem aber darauf, da8
offenbar fur ldnl > 0,04 der Ansatz (2la) die Wirkung des Objekts nicht
mehr in hinreichender Naherung beschreibt. Auf Grund einer strengen Beugungstheorie des Zylinders lal3t sich der MeBbereich also prinzipiell noch erwei-
An=-0,003
A n=-
Om
An=- 0,027
A n=+O,O38
A n=+
Om
----______
D n =- 0.M3
An=+OP38
2
An=+O,O60
&cI
Ob/eMbrerte 2R
Abb. 6. Messungen mit dem Objektiv 1/,2 81 (8,= - 8, = 90') an demselben Faden
und in vollig analoger Wcise wie in Abb. 4
tern. Solange diese fehlt, ist man auBerhalb des oben angegebenen MeBbereichs auf Vergleichsmessungen angewiesen. Die Diagramme der Abb. 4 und 5
konnen dann als Eichdiagramme der beiden Objektive fiir schwach absorbierende Objekte benutzt werden.
7. Zusammonfassung
Im AnschluB an Z e r n i k e s Phasenkontrastmikroskop wurde ein Mikroskop gebaut, mit dem sich der Phasen- und der AmplitudeneinfluB eines
isolierten Objekts messen lassen. Dabei tritt an die Stelle des Z e r n i k e scben Phasenstreifens im Objektiv ein zentral durchbohrtes Glimmerplattchen ;
es entstehen dann zwei senkrecht zueinander polarisierte, geometrisch sich
deckende, sonst aber verschiedene Phasenkontrastbilder. Die polarisationsoptische Analyse der Schwingungsellipse, zu der sich diese beiden Schwin-
254
Annalen der Physik. 7. Fdge.
Band 1. 1958
gungen uberlagern, liefert die ObjektgroBen. Ihr Zusammenhang mit den
Ellipsendaten ist relativ einfach fur ,,strengen Phasenkontrast", d. h. wenn
das Produkt aus Objektbreite und Apertur des Lochs im Glimmerplattchen
gegen Null geht. Die kleinsten erreichbaren Lochdurchmesser betragen
0,05 mm. Auch bei diesen kleinsten Lochern kommt man jedoch z. B. ftir
eine Olimmersion (100 x, N. A. 1,30) nur fur Objektbreiten bis maximal 1 p
d. h. gerade bis kurz iiber die Auflosungsgrenze, mit der einfachen Theorie
fur strengen Phasenkontrast aus. Man kann den MeBbereich bis zu Objektbreiten von 5,u erweitern auf Grund Finer ausfiihrlichen Fraunhoferschen
Beugungstheorie, die fur drei Objektformen durchgefuhrt ist : Als strenge
Theorie fur den homogenen Parallelstreifen, als Naherung fur den elliptischen
Zylinder und fiir ein kleines Scheibchen.
Bei Messungen an homogenen Parallelstreifen (Zaponlackstreifen) ergab
sich innerhalb der Fehlergrenzen (lo in der Phase und 1% in der Amplitude
fur giinstige Objekte, fiir ungiinstige Objekte bis zu 8" bzw. 904) ffbereinstimmung mit einem unabhangigen Yerfahren, dem Dreistrahl-Interferenzverfahren von Zernike.
Als Modelle biologisch wichtiger Ob jekte wurden Glasfaden verschiedener
Dicke in verschieden brechenden Immersionsflussigkeiten vermessen. Die
Fehler werden im Text im einzelnen diskutiert, man kann aber kurz etwa sagen,
da13 F d e n von weniger als 5 p Durchmesser ohne weiteres vermessen werden
konnen, wenn der Unterschied ihres Brechungsindexes von dem der Umgebung dem Betrage nach-weniger als 0,04 betriigt. Die Mekenauigkeit ist
dort dieselbe wie bei homogenen Streifen. Oberhalb dieser Grenzen ist man
auf Vergleichsmessungen angewiesen, solange eine strenge Beugungstheorie
des I'erfahrens fehlt.
Dem Direktor dea Instituts, Herrn Prof. Dr. W o l t e r , mochte ich an dieser
Stelle danken fur die Anregung zu der Arbeit, fiir seine stete Hilfsbereitschaft
und fur forderliche Diskussionen. Der Firma E. Leitz danke ich fur ihre Hilfe
1-01' allem durch die Bearbeitung ihres Immersionsobjektivs llla 01, der Deutschen Forsrhnngsgemeinschaft fur die Unterstutzung durch Leihgerate.
b l a r b u r g l l a h n , Institut fur Angewandte Physik der Universitat.
Bei der Redaktion eingegangen am 26. September 1957.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
947 Кб
Теги
amplitudeneinflusses, objekte, isolierte, zur, phasenkontrastmikroskope, messung, des, ein, phase, und
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа