close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Прогнозирование фармакокинетических взаимодействий лекарственных веществ и наносистемы на основе эмульсии перфторуглеродов

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Пшенкина Надежда Николаевна Шифр научной специальности: 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология Шифр диссертационного совета: Д 001.022.03 Название организации: Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины С
На правах рукописи
ПШЕНКИНА Надежда Николаевна
ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ И
НАНОСИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ПЕРФТОРУГЛЕРОДНЫХ
СОЕДИНЕНИЙ
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Санкт-Петербург – 2011
2
Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории лекарственной и
экологической токсикологии научно-исследовательского центра ФГОУ ВПО
«Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны
Российской Федерации.
Научный консультант:
академик РАМН, Заслуженный деятель науки Российской Федерации,
доктор медицинских наук, профессор Софронов Генрих Александрович
Официальные оппоненты:
академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Игнатов Юрий Дмитриевич
доктор медицинских наук, профессор Дьячук Георгий Иванович
доктор биологических наук Кузнецова Ирина Николаевна
Ведущее научное учреждение:
Учреждение Российской академии медицинских наук
«Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова РАМН»
Зашита состоится 22 марта 2012 г. в 11.00 часов на заседании совета
по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.022.03
при Учреждении Российской академии медицинских наук
«Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН»
(197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии
медицинских наук «Научно-исследовательский институт экспериментальной
медицины СЗО РАМН» (197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12).
Автореферат разослан « ____ » ____________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор
Пучкова Людмила Валентиновна
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Одной из проблемных областей современной
фармакологии является анализ фармакокинетического взаимодействия лекарственных
средств и разработка схем рациональной фармакотерапии при комплексном
назначении лекарственных препаратов. Актуальность проблемы обусловлена
сложившейся практикой полифармакотерапии различных заболеваний и
патологических состояний, а также многообразием лекарственных средств на
современном фармацевтическом рынке, что делает проблему анализа лекарственных
взаимодействий чрезвычайно сложной для решения. С внедрением в медицинскую
практику продукции нанотехнологий к существующим аспектам проблемы в
ближайшее время может добавиться новый, который можно обозначить как
взаимодействие наночастиц и фармакотерапевтических средств в условиях их
совместного назначения.
В настоящее время данная проблема еще не проявила себя в полной мере по
ряду причин. Во-первых, большинство препаратов на основе наноматериалов
находятся в стадии экспериментальной разработки, и клинический опыт их
применения практически отсутствует или является недостаточным. Во-вторых, при
создании нанопрепаратов, как правило, основное внимание разработчиков
сосредоточено на повышении специфической активности создаваемых продуктов, как
то адресность доставки лекарств, эффективность газотранспорта и др. (Freitas R.A.,
2005; Шляхто Е.В. и др., 2009; Пиотровский Л.Б., 2009). При этом в стороне остается
вопрос о возможности взаимодействия наносистем с малыми молекулами,
циркулирующими в кровотоке, в том числе с лекарственными веществами и
биологически активными соединениями. Результатом таких взаимодействий может
стать модификация параметров фармакокинетики лекарств, изменение эффективных
доз, искажение фармакодинамических эффектов, появление побочных реакций, а
также нарушение гомеостаза биологически активных молекул.
Проблема фармакокинетических взаимодействий лекарственных веществ и
наносистем является новой и требует разработки подходов к ее анализу, поскольку
объектом исследования является особый вид лекарственных взаимодействий,
который ранее не изучался. Представляется, что важную роль во взаимодействии
наночастиц с малыми молекулами будут играть поверхностно-активные процессы, в
частности адсорбция, поскольку высокая сорбционная активность является
характерным свойством наночастиц в целом (Белоусов А.Н., 2003; Belgorodsky B. et
al., 2005; Тутельян В.А., 2008; 2010).
Многообразие лекарственных веществ делает нерешаемой
задачу
экспериментальной оценки всех возможных комбинаций лекарств и нанопрепаратов в
условиях их совместного применения. Представляется, что поиск путей решения
проблемы следует искать в раскрытии общих закономерностей явления и построения
4
на
их
основе
моделей,
позволяющих
прогнозировать
тенденции
фармакокинетических изменений в условиях in vivo.
Разработке методической базы для исследования биологического действия
наноматериалов уделяется большое значение в современной фармакологии и
токсикологии. Так, «Концепция токсикологических исследований, методологии
оценки риска, методов идентификации и количественного определения
наноматериалов» (2007) подчеркивает, что для оценки биологических эффектов
наноматериалов, помимо исследований на животных, необходимо использовать
современные достижения биоинформатики, а также модельные эксперименты in vitro
и in vivo. Вместе с тем, зачастую остается открытым вопрос экстраполяции
результатов, полученных в экспериментах на модельных системах, на уровень целого
организма. Представляется, что проведение комплексного исследования на разных
уровнях организации живых систем с последующим анализом взаимосвязей между
полученными данными будет способствовать поиску конструктивных решений в этом
направлении. В частности, комплексный разноуровневый анализ влияния
наносистемы на параметры фармакокинетики лекарственных веществ позволит не
только выделить процессы, определяющие характер взаимодействий, но также будет
способствовать установлению общих закономерностей и позволит выйти на уровень
прогнозирования эффектов интерференции в условиях целого организма.
Предиктивная методология интенсивно развивается в фармакологических
исследованиях последних лет (Бородина Ю.В. и др., 2003; Chang C. et al., 2009;
Kharkar P.S., 2010). Современные информационные технологии позволяют не только
анализировать большие массивы данных, но и создавать виртуальные молекулярные
модели высокой сложности. Интеграция знаний квантовой и физической химии в
различного рода программные продукты дает возможность выполнять расчеты
физико-химических свойств соединений in silico (с помощью компьютера) на основе
лишь знания химической структуры. Краеугольным камнем предиктивной
методологии является количественный анализ связи «структура – активность»
(Quantitative Structure Activity Relationships, QSAR) в различных его модификациях
(Poroikov V. et al., 2003; 2005;2007; Fjodorova N. et al., 2008; Baskin I. et al., 2008;
Hardy B. et al., 2010). Технологии in silico находят широкое применение при
прогнозировании параметров фармакокинетики, что позволяет на ранних этапах
разработки лекарственных средств отбраковывать соединения с заведомо
неприемлемыми характеристиками абсорбции, распределения, метаболизма,
элиминации или токсичности (Absorption – Distribution – Metabolism – Excretion –
Toxicity, ADMET) (Hou T. et al., 2003, 2007; Geerts T. et al., 2011).
Применение технологий высокопроизводительного скрининга, в том числе с
использованием методов in silico, многократно повысило эффективность разработки
новых лекарственных средств и способствовало прорыву в области фармацевтики.
Вместе с тем, среди огромного количества публикаций, обращающихся к
5
использованию QSAR-технологий и к прогнозированию ADMET-профиля,
относительно небольшая часть работ посвящена фармакокинетическому анализу
лекарственных взаимодействий. Вопросы фармакокинетического взаимодействия
лекарственных веществ и наносистем в литературе практически не отражены.
При проведении настоящего исследования в качестве модельного прототипа
наносистемы был выбран отечественный препарат «Перфторан», представляющий
собой наноэмульсию перфторуглеродов. Перфторан зарегистрирован в Российской
Федерации в качестве трансфузионного средства с газотранспортными свойствами.
На сегодняшний день российский перфторан – это единственный в мире
искусственный кровезаменитель, прошедший все фазы клинических испытаний и
разрешенный для медицинского применения. В лечебных учреждениях России и
стран СНГ накоплен значительный положительный опыт применения перфторана в
хирургической практике, в комплексной терапии неотложных состояний, в клинике
внутренних болезней, в онкологии, трансплантологии, токсикологии и других
областях медицины (Богданова Л.А. и др., 2004; Шилов В.В. и др., 2004; Мороз В.В. и
др., 2007; Кричевский А.Л., 2007; Усенко Л.В. и др., 2007; Селиванов Е.А. и др.,
2008).
Идентификация перфторана как наносистемы представляется вполне
правомочной. Во-первых, по своим размерным параметрам эмульсия перфторан
удовлетворяет критериям, предъявляемым к наночастицам, а именно – размер хотя
бы в одном из измерений менее 100 нм (Концепция токсикологических исследований
…, 2007). По данным малоуглового рентгеновского рассеяния, частицы эмульсии
представляют собой сферы диаметром, в среднем, 50-70 нм (Вазина А.А. и др., 2004).
Во-вторых, перфторан обладает рядом свойств, которыми не обладают входящие в
его состав компоненты в форме сплошных фаз (Терешина Е.В., 1994, 2002; Rafikova
O. et al., 2004; Кузнецова И.Н., 2007; Иваницкий Г.Р., 2008; Воробьев С.И., 2010).
Перечисленные доводы позволяют рассматривать наноэмульсию перфторан как
адекватный модельный прототип наносистем для исследования взаимодействий
наночастиц и фармакотерапевтических средств в традиционных лекарственных
формах. Важным обстоятельством, обусловившим выбор перфторана в качестве
модельной наносистемы, является и то, что кровезаменитель производится
промышленным способом (ОАО НПФ «Перфторан», Пущино, Московская обл.), что
служит гарантией качества и стандартизации препарата.
Учитывая обширный клинический опыт и разнообразие показаний к
назначению перфторана, в том числе в интенсивной терапии и при неотложных
состояниях, анализ фармакокинетического взаимодействия наноэмульсии и
лекарственных веществ приобретает не только фундаментальное, но и вполне
отчетливое прикладное значение.
Применение системного подхода к анализу взаимовлияния перфторана и
лекарственных веществ позволит не только выделить факторы, определяющие их
6
фармакокинетическое взаимодействие, но и рассмотреть эффекты во взаимосвязи и
взаимообусловленности как основу для формирования прогнозирующей модели.
Проведенный анализ будет способствовать формированию представлений о
механизмах лекарственных взаимодействий наночастиц и фармакотерапевтических
средств, а также позволит раскрыть их зависимость от индивидуальных
характеристик лекарственных соединений.
Цель исследования: экспериментально-теоретическое обоснование подходов к
прогнозированию
фармакокинетических
взаимодействий
наноэмульсии
перфторуглеродов (перфторана) и лекарственных средств в условиях совместного
назначения.
Задачи исследования:
1. Исследовать фармакокинетику лекарственных веществ при сочетанном
введении с наноэмульсией перфторуглеродов в экспериментах на животных и
охарактеризовать эффект фармакокинетического взаимодействия.
2. Охарактеризовать взаимодействие лекарственных веществ с наноэмульсией
перфторан и с естественным транспортным белком крови альбумином в модельных
экспериментах in vitro. Сравнить параметры взаимодействия лекарственных веществ
с наноэмульсией и с альбумином.
3. Проанализировать
зависимость
изменений
фармакокинетики
лекарственных веществ от параметров взаимодействия с перфтораном, с альбумином
и от физико-химических свойств лигандов.
4. Разработать систему прогнозирования изменений фармакокинетики
лекарственных веществ под влиянием наноэмульсии перфторан с использованием
всей совокупности данных, полученных in vivo, in vitro и in silico.
5. Сформулировать предложения по предупреждению негативных проявлений
лекарственных взаимодействий при совместном назначении фармакотерапевтических
средств и наноэмульсии перфторан.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Фармакокинетическое взаимодействие лекарственных веществ и
наноэмульсии перфторуглеродов перфторана в условиях сочетанного введения
проявляется на этапе транспорта и распределения в форме увеличения, уменьшения
или отсутствия изменений суммарной наблюдаемой концентрации лекарств в крови
животных.
2. Наноэмульсия перфторуглеродов in vitro обладает селективной
адсорбционной активностью в отношении лекарственных веществ, которая
определяется липофильностью и полярными свойствами лигандов, и проявляется
перераспределением свободных лигандов в диализной системе в зависимости от
характера взаимодействия лигандов с частицами наноэмульсии.
3. Перфторан и альбумин обладают сопоставимыми значениями констант
сродства к лигандам и показателями сорбционной емкости, что создает предпосылки
7
для конкуренции между ними за связывание лекарственных веществ. Адсорбция
свободных лигандов частицами наноэмульсии приводит к изменению равновесных
концентраций в системе «альбумин – лиганд – перфторан» и является движущей
силой перераспределения лекарственных соединений.
4. Характер фармакокинетических изменений на этапе транспорта и
распределения лекарственных веществ в условиях их сочетанного применения с
наноэмульсией перфторуглеродов определяется совокупностью параметров
адсорбции частицами наноэмульсии, связывания с альбумином и комплексом физикохимических свойств лигандов.
5. Уравнения регрессии, разработанные на основе физико-химических
свойств лигандов, параметров их адсорбции перфтораном и характеристик
связывания с альбумином, позволяют прогнозировать направленность изменений
концентраций лекарственных веществ в крови в условиях их совместного применения
с наноэмульсией перфторуглеродов.
Научная новизна исследования
Впервые установлено и количественно охарактеризовано явление
фармакокинетической
интерференции
наноэмульсии
перфторуглеродов
и
лекарственных веществ в условиях их сочетанного назначения.
Теоретически обосновано и экспериментально подтверждено, что в основе
модифицирующего влияния перфторана на параметры распределения лекарственных
веществ лежит селективная адсорбционная активность эмульсии перфторуглеродов,
обусловленная наноразмерными параметрами частиц.
Впервые исследована и охарактеризована адсорбционная способность
перфторана в отношении лекарственных веществ, обладающих различными физикохимическими свойствами, и проанализирована зависимость между свойствами
лигандов и их адсорбционной способностью. Показано, что, в зависимости от физикохимических свойств, лекарственные вещества могут активно адсорбироваться
наночастицами эмульсии перфторуглеродов, быть индифферентными по отношению
к ней, либо проявлять отрицательное сродство к эмульсии.
Установлена и количественно охарактеризована в условиях сочетанного
применения перфторана и лекарственных веществ обусловленность паттернов
фармакокинетических изменений физико-химическим профилем лекарственных
веществ, а также характером их взаимодействия с частицами наноэмульсии и с
сывороточным альбумином.
Знание причинно-следственных связей, лежащих в основе фармакокинетического взаимодействия лекарственных веществ и наносистем, позволяет не
только понять механизм данного явления, но и дает возможность им управлять, то
есть прогнозировать результирующий биологический эффект.
Результаты
проведенного
исследования
служат
экспериментальнотеоретическим обоснованием постановки новой проблемы фармакологии и
8
наномедицины, которую можно определить как исследование взаимодействий
наносистем с малыми молекулами в условиях их совместной циркуляции в
организме.
Практическая значимость
На основе эмпирических исследований и статистического анализа разработаны
и внедрены методические рекомендации для клинической практики, направленные на
предупреждение нежелательных эффектов фармакокинетического взаимодействия
лекарственных веществ и перфторана в условиях их совместного назначения.
Разработан
комплексный
подход
к
прогнозированию
эффектов
фармакокинетической интерференции лекарственных веществ и наносистем,
опирающийся на максимальное использование данных, полученных в опытах in vitro
и рассчитанных методами in silico, и в конечном итоге устанавливающий зависимость
фармакокинетических откликов на этапе транспорта и распределения от физикохимических свойств лигандов.
Разработанная
методология
прогнозирования
фармакокинетической
интерференции направлена на создание схем рациональной фармакотерапии с
использованием наноматериалов, повышение эффективности лечения и снижение
нежелательных
проявлений
лекарственных
взаимодействий,
что
будет
способствовать внедрению в медицину и фармакологию инновационных разработок,
основанных на достижениях нанотехнологий и наномедицины.
Принципы анализа и прогнозирования, положенные в основу разработанного
методического подхода, могут быть использованы при оценке взаимодействий
лекарственных веществ с другими наносистемами, а также при исследовании
совместных эффектов лекарственных соединений и наносистем на уровне
фармакокинетических процессов абсорбции, метаболизма, экскреции.
Полученные в работе данные о сорбционных свойствах перфторана могут
послужить основой для дальнейших разработок, открывающих новые области
применения наноэмульсий перфторуглеродов в качестве систем доставки лекарств в
ткани с нарушенной микроциркуляцией, в качестве диагностических зондов в
эндовидеотехнологиях, в составе средств экстракорпоральной детоксикации
организма и др.
Личный вклад
Автором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и
зарубежной литературы по изучаемой проблеме, планирование и организация
научной работы. Во всех работах, выполненных с соавторами, автору принадлежит
постановка задачи, концепция основных методов, анализ полученных результатов,
непосредственное участие во всех проведенных исследованиях. Основные
результаты, представленные в диссертации, получены самим соискателем.
9
Апробация работы
Основные результаты исследования доложены на следующих научных
конференциях: Всероссийская научная конференция «Физиологически активные
вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической
медицине» (19-20 июня 2001, СПб); 2 Международная конференция «Клинические
исследования лекарственных средств в России» (20-22 ноября 2002, Москва);
International visions on blood substitutes / Comprising the 5th International Symposium on
“Current Issues in Blood Substitute Research” and the 4th International Course on “From
Structural Genomics to Drug Discovery” (September 17-20, 2006, Parma, Italy);
Междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и
интегративной медицине» (17-27 сентября 2006; 17-28 сентября 2007; Судак,
Украина); Всероссийской конференции с международным участием «Реаниматология
– наука о критических состояниях» (15-17 ноября 2006, Москва); 8th Congress of the
European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics (August 29 – September
1, 2007, Amsterdam, Netherland); II Санкт-Петербургский Международный
экологический форум «Окружающая среда и здоровье человека» (1-5 июля 2008,
Санкт-Петербург); 2 Всероссийская конференция с международным интернетучастием «От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий к наноиндустрии» (810 апреля 2009, Ижевск); III Международная научно-практическая конференция
«Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (1-4 октября 2009,
Ростов-на-Дону); II World Congress of the International Academy of Nanomedicine
(October 3-6, 2010, Antalya, Turkey); III Международный форум по нанотехнологиям
(1-3 ноября 2010, Москва); V Конгресс фармакологов «Рациональная фармакотерапия
и клиническая фармакология» (13-14 октября 2010, Санкт-Петербург); Российская
научная конференция с международным участием «Актуальные проблемы
токсикологии и радиобиологии» (19-20 мая 2011, Санкт-Петербург); Российская
научно-практическая конференция «Актуальные проблемы трансфузиологии» (7
октября 2011, Санкт-Петербург), на заседаниях Ученого совета НИИ
экспериментальной медицины СЗО РАМН (25 мая 2010) и Ученого совета научноисследовательских лабораторий и научно-исследовательского центра Военномедицинской академии им. С.М. Кирова (16 июня 2010).
Реализация результатов исследования
На основании результатов проведенного исследования разработаны
«Методические рекомендации по оптимизации схем сочетанного применения
перфторана и лекарственных средств в клинической практике», утвержденные
начальником Главного военно-медицинского управления МО РФ (2010).
Методические рекомендации разосланы в лечебные учреждения Министерства
обороны РФ, в научно-исследовательские институты, учреждения гражданского
здравоохранения, в основные библиотечные фонды страны.
10
Результаты работы внедрены в практическом здравоохранении и в учебном
процессе на кафедрах фармакологии и военной токсикологии и медицинской защиты
Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова при преподавании разделов
фармакокинетики и нанотоксикологии.
Публикация результатов исследования
Результаты исследования нашли отражение в 47 научных публикациях, из них
– 13 в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК для публикации
основных результатов диссертационных исследований.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 293 страницах машинописного текста и состоит из
введения, двух глав обзора литературы, описания материалов и методов
исследования, пяти глав собственных результатов и их обсуждения, заключения,
выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации
приведены 40 таблиц и 39 рисунков. Список литературы содержит 280 источников, из
них 93 отечественных и 187 зарубежных публикаций.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве модельного прототипа наносистем в работе использовали
наноэмульсию перфторуглеродов с коммерческим названием «Перфторан»
(производства ОАО НПФ Перфторан, Россия) в лекарственной форме 10% эмульсия
для инфузий во флаконах 200 мл. Перфторан зарегистрирован в Российской
Федерации как кровезаменитель с газотранспортной функцией. Инфузии перфторана
показаны при острой и хронической гиповолемии различного генеза, при нарушениях
микроциркуляции и периферического кровообращения, для регионарной перфузии и
противоишемической защиты донорских органов.
Состав перфторана. 100 мл эмульсии содержат: перфтордекалина (ПФД) – 13 г,
перфтор-N-4-(метилциклогексил)-пиперидина (ПМЦП) – 6.5 г, проксанола – 4 г,
натрия хлорида – 0.6 г, калия хлорида – 0.039 г, магния хлорида – 0.019 г, натрия
гидрокарбоната – 0.065 г, натрия фосфата однозамещенного – 0.02 г, глюкозы – 0.2 г,
воды для инъекций – до 100 мл.
Частицы эмульсии перфторана состоят из перфторуглеродного ядра (смесь
ПФД и ПМЦП в отношении 2:1), окруженного слоем поверхностно-активного
вещества проксанола. Диаметр частиц составляет в среднем 50-70 нм, что позволяет
отнести перфторан к наноэмульсиям. Перфторуглероды, входящие в состав
наноэмульсии, химически инертны, не вступают в химические реакции, не
метаболизируются ферментами системы биотрансформации, выводятся в
неизмененном виде с выдыхаемым воздухом (Воробьев С.И., 1994; Иваницкий Г.Р.,
2001).
11
В работе изучено 110 лекарственных веществ, 20 из них исследованы в
экспериментах на животных, 50 – в опытах in vitro, 60 препаратов служили
независимой выборкой для прогнозирования.
В опытах in vitro и in vivo были использованы следующие лекарственные
препараты и субстанции: амикацин (лиоф. д/р-ра для в/м введ.; Красфарма, Россия),
амитриптилин (р-р для в/м введ. 10 мг/мл; Московский эндокринный завод, Россия),
ампициллин (пор. д/р-ра для в/в и в/м введ.; Красфарма, Россия), атенолол
(субстанция; Sigma, США), бендазол (дибазол; р-р для в/в и в/м введ. 1%; Ай Си Эн
Октябрь, Россия), бензилпенициллин (пор. д/р-ра для в/в и в/м введ.; Синтез АКО,
Россия), варфарин (субстанция; Sigma, США), верапамил (р-р для в/в введ. 2,5
мг/мл; Биосинтез, Россия), винпоцетин (конц. для пригот. р-ра д/инф. 0,5%;
Мосхимфармпрепараты, Россия), галантамин (субстанция; Sigma, США),
гентамицин (р-р для в/в и в/м введ.40 мг/мл; Биохимик, Россия), дексаметазон (р-р
для в/в и в/м введ.4 мг/мл; KRKA, Словения), диклофенак (р-р для в/м введ. 25
мг/мл; Сотекс ФармФирма, Россия), диоксидин (р-р для в/в введ. и наружн. прим.
0,5%; Дальхимфарм, Россия), дифенгидрамин (димедрол; р-р для в/в и в/м введ. 1%;
Верофарм, Россия), дротаверин (но-шпа; р-р для в/в и в/м введ. 20 мг/мл; Chinoin,
Венгрия), ибупрофен (субстанция; Sigma, США), имипрамин (мелипрамин; р-р для
в/м введ. 12,5 мг/мл; Egis, Венгрия), кетопрофен (кетонал; р-р для в/в и в/м введ. 50
мг/мл; Lek, Словения), кеторолак (р-р для в/в и в/м введ. 30 мг/мл; Синтез АКО,
Россия), клемастин (тавегил; р-р для в/в и в/м введ. 1 мг/мл; Nycomed, Австрия),
кофеин (субстанция; Sigma, США), лидокаин (р-р д/инъекц. 10%; Биохимик,
Россия), метамизол натрия (анальгин; р-р для в/в и в/м введ. 50 %; Верофарм,
Россия), метоклопрамид (р-р для в/в и в/м введ. 5 мг/мл; Московский эндокринный
завод, Россия), метопролол (субстанция; Sigma, США), метронидазол (метрогил; р-р
д/инф. 5 мг/мл; Unique, Индия), нимодипин (нимотоп; р-р д/инф. 0,2 мг/мл; Bayer
Health Care AG, Германия), офлоксацин (офло; р-р д/инф. 2 мг/мл; Unique, Индия),
папаверин (р-р д/инъекц. 2%; Биосинтез, Россия), пентоксифиллин (р-р для в/в
введ. 20 мг/мл; Новосибхимфарм, Россия), пирацетам (р-р для в/в и в/м введ. 200
мг/мл; Синтез, Россия), пирензепин (гастроцепин; р-р для в/в и в/м введ. 5 мг/мл;
Boehringer Ingelheim Espana, Испания), пирлиндол (субст.-пор.; Усолье-Сибирский
ХФК, Россия), прокаин (новокаин; р-р д/инъекц. 5 мг/мл; Верофарм, Россия),
прометазин (пипольфен; р-р для в/в и в/м введ. 25 мг/мл; Egis, Венгрия),
пропранолол (субстанция; Sigma, США), ранитидин (ацилок; р-р для в/в и в/м введ.
25 мг/мл; Wave Pharmaceuticals, Индия), теофиллин (субстанция; Sigma, США),
фенилбутазон (субстанция; Sigma, США), фторурацил (р-р для в/в введ. 50 мг/мл;
ЛЭНС-Фарм, Россия), фуросемид (р-р для в/в и в/м введ. 10 мг/мл;
Мосхимфармпрепараты, Россия), хлорамфеникол (левомицетин; капли глазн. 0,25%;
Синтез АКО, Россия), хлоропирамин (супрастин; р-р для в/в и в/м введ. 20 мг/мл;
Egis, Венгрия), цефазолин (пор. для пригот. р-ра для в/в и в/м введ.; Биохимик,
12
Россия), цефотаксим (пор. для пригот. р-ра для в/в и в/м введ.; Биохимик, Россия),
ципрофлоксацин (р-р д/инф. 2 мг/мл; Синтез АКО, Россия), эмоксипин (р-р д/ин.
1%; Московский эндокринный завод, Россия), эналаприла малеат (субстанция;
Sigma, США), этамзилат (дицинон; р-р для в/в и в/м введ.; Lek, Словения).
Для расчетов и прогнозирования были использованы следующие
лекарственные вещества (в соответствие с генерическими названиями): амиодарон,
ацетаминофен, бромокриптин, галоперидол, диазепам, дилтиазем, доксициклин,
домперидон, дроперидол, зопиклон, идарубицин, изониазид, индометацин,
итраконазол, каптоприл, кетоконазол, кетотифен, клоназепам, клонидин, кодеин,
лизиноприл, лоперамид, лоратадин, мидазолам, морфин, налидиксовая к-та,
напроксен, нитразепам, нифедипин, нифлуминовая кислота, пефлоксацин,
пироксикам, правастатин, прокаинамид, пропофол, рибавирин, сальбутамол,
сульпирид, теноксикам, тиопентал Na, трамадол, триметазидин, фамотидин,
фенитоин, фенобарбитал, феноксиметилпенициллин, фентанил, флунитразепам,
фозиноприл, хлордиазепоксид, хлорохин, цетиризин, цефадроксил, цефиксим,
цефтриаксон, цефуроксим, циметидин, циннаризин, цитарабин, этакриновая кислота,
этопозид.
Экспериментальные данные по связыванию лекарственных веществ с
альбумином и адсорбции их частицами наноэмульсии перфторан были получены в
опытах in vitro.
Данные о фармакокинетическом взаимодействии перфторана и лекарственных
веществ получены в опытах на 60 беспородных кроликах-самцах массой тела 2,8–3,5
кг. Животные поступали из питомника РАМН «Рапполово» (Ленинградская обл.) и из
питомника Военно-медицинской академии. Вновь поступившие животные
находились на карантинном наблюдении в течение 2-3 недель. Кролики содержались
в клетках по 1 животному. Условия содержания обеспечивали нормальный
биологический фон и полностью соответствовали требованиям Санитарных правил
по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических
клиник (вивариев) от 06.04.1973 г. Рацион питания соответствовал Приказу МЗ
№1179 от 1983 г. Кормление осуществлялось ad libitum, в первой половине дня при
свободном доступе к воде.
В экспериментах на кроликах перфторан всегда вводили внутривенно струйно
медленно в постоянной дозе 5 мл/кг массы тела животного. Кроликам контрольной
группы для создания равных условий гемодилюции в том же объеме вводили
внутривенно физиологический раствор.
Кровь для количественного анализа лекарственных веществ отбирали из
краевой вены уха кроликов через 0,08 – 0,25 – 0,5 – 1,0 – 1,5 – 3,0 – 5,0 – 24 часа после
введения лекарственных препаратов.
При исследовании фармакокинетических взаимодействий перфторана и
лекарственных средств перфторан вводили внутривенно (5 мл/кг) и сразу после
13
окончания инфузии внутривенно или внутримышечно вводили исследуемые
лекарственные вещества в следующих дозах: амитриптилин (6,0 мг/кг, в/м),
ампициллин (100,0 мг/кг, в/м), бендазол (5,0 мг/кг, в/в), верапамил (0,5 мг/кг, в/в),
диклофенак (5,0 мг/кг, в/в), дифенгидрамин (2,0 мг/кг, в/в), дротаверин (6,0 мг/кг, в/в),
имипрамин (2,5 мг/кг, в/м), кетопрофен (20,0 мг/кг, в/м), кеторолак (3,0 мг/кг, в/в),
клемастин (1,0 мг/кг, в/в), метоклопрамид (2,0 мг/кг, в/в), офлоксацин (4,0 мг/кг, в/в),
пентоксифиллин (10,0 мг/кг, в/в), прометазин (2,5 мг/кг, в/в), ранитидин (25,0 мг/кг,
в/в), хлоропирамин (4,0 мг/кг, в/в), цефазолин (20,0 мг/кг, в/в), цефотаксим (25,0
мг/кг, в/в), ципрофлоксацин (4,0 мг/кг, в/в).
Исследование сорбционной способности перфторана в отношении
лекарственных средств проводили в экспериментах in vitro с помощью равновесного
диализа. В качестве полупроницаемой мембраны служили диализные мешки
шириной 25 мм с размером пор 12-14 кДа производства «Orange Scientific» (Бельгия).
При проведении диализа во внутреннюю камеру вносили 5 мл перфторана и 0,5
мл раствора лекарственного вещества в диапазоне конечных концентраций в
диализной системе от 12,5 до 100 мкМ. После преинкубации перфторана с
лекарственным веществом пробы диализировали против 20 мл 1/15 М Na-фосфатного
буфера pH 7,4 при комнатной температуре в течение 18 часов. В контрольных пробах
вместо перфторана использовали фосфатный буфер.
После завершения диализа концентрации лекарств в диализате контрольных и
опытных проб определяли по поглощению в области специфического максимума,
который предварительно определяли для каждого исследуемого препарата.
Количество связанного лекарства Ci рассчитывали как разность между полной
концентрацией, внесенной в диализную систему, и концентрацией свободного
препарата, определяемого в диализате:
Ci L0 Li (V1 V2 )
,
L0
(1)
где L0 – общая концентрация лекарства внесенного в систему; Li – концентрация
свободного лекарства, определяемая во внешней камере (в диализате), V1 и V2 –
объемы внутренней и внешней камер, соответственно.
Для расчета констант взаимодействия лигандов с частицами наноэмульсии и
определения количества адсорбированных лигандов использовали метод Скетчарда,
позволяющий получать искомые величины путем графического решения уравнения:
Ci Li K aff n R0 Ci
(2)
где Ci – концентрация образовавшегося лиганд-перфторанового комплекса, Li –
концентрация свободного лиганда, R0 – полная концентрация перфторана, n –
количество молекул лиганда, связавшегося с 1 частицей эмульсии.
14
Исследование связывания лекарств с альбумином в опытах in vitro
проводили с помощью анализа концентрационного тушения природной
флуоресценции белка при связывании с лигандами (Лакович Дж., 1986; Seetharamappa
J., Kamat B.P., 2004; Zhang Y.Z. et al., 2008).
В экспериментах использовали кристаллический бычий сывороточный
альбумин (BSA) фирмы “Sigma” (фракция V по Кону, свободный от протеаз и γглобулина). Альбумин использовали в постоянной концентрации 10 мкМ,
приготовленной на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4. На том же буфере готовили
разведения лекарственных веществ. В случае плохой водорастворимости разведения
лекарственных субстанций готовили с использованием ДМСО, присутствие которого
не оказывает собственного влияния на процесс связывания лигандов с альбумином.
Лекарственные вещества при исследовании связывания с альбумином использовали в
постоянных концентрациях 2,5 5,0 – 10 – 20 – 40 – 80 – 160 – 320 мкМ. Анализ
связывания лигандов с альбумином проводили при 25°С и при 37°С, что позволило,
помимо кинетических параметров связывания, получить термодинамические
характеристики лиганд-альбуминового взаимодействия.
Измерения флуоресценции проводились на спектрофлуориметре Hitachi модель
MPF-4, снабженном ксеноновой лампой, с использованием кварцевой кюветы
размером 1 см в термостатированной ячейке. Длина волны возбуждающего света
составляла 290 нм, длина волны эмиссии – 340 нм.
Для расчета констант сродства лигандов к альбумину использовали
графическое
решение
уравнения
Штерна-Фольмера,
приведенного
к
логарифмическому виду (Лакович Дж., 1986; Jiang M. et al., 2004):
F F
log 0
log K n log Q
,
F (3)
где K – константа взаимодействия и n – число центров связывания. График,
F0 F от log Q , дает пересечение с осью ординат
построенный в координатах log
F в точке log K , а угол наклона численно равен количеству центров связывания
лиганда n.
Для расчета термодинамических параметров связывания (изменения энтальпии
и энтропии) использовали уравнение Вант-Гоффа:
H S
ln K ,
(4)
RT
R
где H и S , соответственно, изменение энтальпии и энтропии, K – константа
взаимодействия, R – универсальная газовая постоянная, T – температура реакционной
смеси в градусах Кельвина. Решение получали графическим путем построением
15
графика в системе координат lnK от 1
T.
отрезок на оси ординат – отношение S .
R
Наклон графика дает отношение H
, а
R
Анализ сайт-специфического связывания лигандов с основными сайтами
альбумина проводили с помощью метода компьютерного биомоделирования in silico,
используя программное обеспечение, разработанное компанией Quantum
Pharmaceuticals (http://q-pharm.com), при непосредственном участии специалистов
компании. Расчет свободной энергии комплекса (ΔG) выполняли методом стыковки
(docking) лигандов с участками 2BXD и 2BXF молекулы альбумина, в рамках
пространственной сетки размером 20×20×20 Ǻ, ориентированной по центральному
атому лиганда в соответствующем связывающем центре. Результаты, полученные в
результате стыковки лигандов с центрами связывания альбумина, приводили к
значениям логарифма константы взаимодействия log K alb .
Количественный анализ лекарственных веществ в плазме крови кроликов
проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого
давления в обращено-фазном варианте по оригинальным методикам. Подбор метода
анализа, оборудования и условий хроматографического разделения проводили в
соответствие с рекомендациями, изложенными в методических пособиях по
хроматографии (Коган Л.А., 1975; Митрука Б.М., 1978; Хайвер К., 1993).
Подготовку проб для определения плазменной концентрации ампициллина,
офлоксацина, пентоксифиллина, ранитидина, цефазолина, цефотаксима и
ципрофлоксацина проводили по одинаковой схеме. В 0,5 мл плазмы добавляли по 100
мг кристаллического NaCl для солевой денатурации белка и освобождения связанного
препарата. Белки плазмы осаждали добавлением 0,5 мл 50% ТХУ. Пробы охлаждали
и центрифугировали в течение 15 мин при 8000 об/мин и температуре +5С.
Супернатант отбирали и использовали для хроматографического анализа.
Определение проводили на жидкостном хроматографе “Perkin-Elmer”, модель
601 (США), на колонке Bondapac С18 длиной 250 мм и диаметром 4 мм. Скорость
подвижной фазы ацетонитрил : вода (45:55) составляла 1 см3/мин. Детектирование
осуществляли на проточном ультрафиолетовом детекторе при длине волны =254 нм.
Количество свободного препарата в крови определяли методом абсолютной
калибровки. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой
использовали препарат той же партии.
Для определения плазменной концентрации амитриптилина, бендазола,
верапамила, диклофенака, дифенгидрамина, дротаверина, имипрамина, кетопрофена,
кеторолака, клемастина, метоклопрамида, прометазина и хлоропирамина подготовку
проб проводили следующим образом. К 2 мл плазмы добавляли 350 мг
кристаллического хлорида натрия, перемешивали до растворения соли. Вносили по
0,1 мл раствора внутреннего стандарта в концентрации 0,5 мг/мл. В качестве
16
внутреннего стандарта для определения дротаверина использовали кеторолак, и
наоборот; дифенгидрамина, прометазина – хлоропирамин; амитриптилина,
хлоропирамина
–
дифенгидрамин;
бендазола,
имипрамина,
клемастина,
метоклопрамида – прометазин; верапамила – папаверин; диклофенака – кетопрофен,
и наоборот. В предварительно проведенных исследованиях по подбору оптимальных
условий экстрагирования препаратов из плазмы было получено, что максимальный
выход дротаверина, кеторолака, кетопрофена и диклофенака происходит в кислой
среде, остальных препаратов – в щелочной. Необходимую реакцию смеси получали
внесением в образцы по 0,2 мл конц. HCl или по 0,3 мл 25% NH4OH, после чего
добавляли по 6 мл хлористого метилена. Встряхивали в течение 7 мин, затем
центрифугировали 15 мин при 6000 об/мин и температуре +5С. Отбирали нижнюю
органическую фазу, досуха упаривали в токе азота. Сухой остаток растворяли в 0,5 мл
этанола. Для анализа с помощью петлевого дозатора в хроматограф вносили пробу
объемом 25 мкл.
Определение проводили на жидкостном хроматографе производства фирмы
“Perkin-Elmer”, модель 601 (США), на колонке Lichrosorb C18 длиной 250 мм и
диаметром 4,6 мм. В качестве подвижной фазы использовали смесь, содержащую
35% ацетонитрила, 25% 0,05 М TRIS буфера рН 7,4 и 40% воды. Скорость подачи
элюента на колонку составляла 1 мл/мин. Детектирование проводили на
спектрофотометрическом
детекторе
LC-55
(Beckman),
совмещенном
с
хроматографом, при длине волны =254 нм.
Физико-химические параметры лекарственных веществ были почерпнуты из
электронных баз данных DrugBank (http://www.drugbank.ca) и PubChem
(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov), а также получены расчетным путем с помощью webкалькулятора Molinspiration (http://www.molinspiration.com), позволяющего на основе
структурной формулы вещества рассчитать следующие параметры: логарифм
распределения в системе октанол/вода LogP, молекулярная масса MW, площадь
топологической полярной поверхности TPSA, число доноров Don и акцепторов
водорода Acc, число вращающихся связей Rot, молекулярный объем Vol.
С помощью программного обеспечения, разработанного компанией Quantum
Pharmaceuticals (http://q-pharm.com, Москва) и при участии специалистов компании
были рассчитаны параметры растворимости лекарственных соединений в воде
LogSH2O и в неполярном растворителе диметилсульфоксиде LogSDMSO, а также
значения логарифма констант ионизации молекул pKa. Из электронной базы данных
DrugBank были почерпнуты сведения о температуре плавления tпл исследуемых
лекарственных соединений.
Данные о физико-химических свойствах молекул были рассчитаны для всех
110 препаратов, использованных в работе.
17
Методы статистической обработки результатов исследований. Для
математической обработки результатов наблюдений использовали возможности
приложения Microsoft Excel пакета программ Microsoft Office.
Статистический анализ результатов исследования выполняли с применением
пакета прикладных программ SPSS, версия 17 (Юнкеров В.И., Григорьев С.Г., 2002;
Наследов А., 2008). В работе использовали следующие виды статистического анализа:
– многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA);
– многофакторный линейный регрессионный анализ;
– дискриминантный анализ;
– корреляционный анализ с вычислением параметрических корреляций Пирсона и
непараметрических корреляций Спирмена и Кендалла;
– непараметрический анализ с помощью критериев Уилкоксона и критерия знаков
для парных выборок.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На предварительном этапе исследования проведена оценка влияния перфторана
на фармакокинетику липофильного препарата дротаверина и гидрофильного –
цефазолина. Задачей данного раздела исследования было выяснить существование
эффекта фармакокинетического взаимодействия как такового, а также оценить его
зависимость от путей поступления лекарственных веществ и от сроков их
совместного введения с наноэмульсией перфторан. Фармакокинетические эффекты
перфторана исследовали на модели его сочетанного введения с липофильным
лекарственным веществом дротаверином и с гидрофильным препаратом
цефазолином. Перфторан во всех опытах вводили внутривенно болюсно медленно в
постоянной дозе 5 мл/кг.
В экспериментах на кроликах использовали следующие схемы совместного
введения перфторана и дротаверина:
- дротаверин, 2 мг/кг, в/в – сразу после инфузии перфторана (в другую вену); за 0,5 ч
до инфузии перфторана (рис. 1а);
- дротаверин, 5 мг/кг, в/м – сразу после инфузии перфторана; через 1 ч после
инфузии перфторана (рис. 1б);
- дротаверин 10 мг/кг, per os – сразу после инфузии перфторана; за 1 ч до инфузии
перфторана (рис. 1в);
- дротаверин и перфторан смешивали до введения и вводили внутривенно в одном
шприце; доза дротаверина - 2 мг/кг, перфторана – 5 мл/кг (рис. 1г).
Эксперименты с дротаверином показали, что при сочетанном введении
перфторана и лекарственного вещества фармакокинетика последнего претерпевает
существенные изменения, которые проявляются на этапах абсорбции и распределения
лекарственного препарата накоплением дротаверина в крови и увеличении сроков его
элиминации. Наиболее отчетливо изменения фармакокинетики выражены при
18
введении дротаверина сразу после инфузии перфторана при всех использованных
путях поступления. При инфузии перфторана спустя 0,5-1 ч после введения
дротаверина наблюдается та же тенденция в изменении концентраций лекарственного
вещества в крови, но в менее выраженной форме.
3,5
6
Контроль
ПФ + (0 ч) + Дротаверин
Дротаверин + (0,5 ч) + ПФ
3,0
2,5
Контроль
ПФ + (0 ч) + Дротаверин
ПФ + (1 ч) + Дротаверин
5
4
2,0
3
1,5
1,0
2
0,5
1
0,0
0
2
4
6
8
10
0
12
0
2
4
а)
6
5
Контроль
ПФ + (0 ч) + Дротаверин
Дротаверин + (1 ч) + ПФ
5
10
12
б)
7
6
8
Дротаверин с ПФ
Дротаверин без ПФ
ПФД
4
3
4
3
2
2
1
1
0
0
0
2
4
6
в)
8
10
12
0
2
4
6
8
10
12
г)
Рисунок 1 – Динамика концентраций дротаверина в крови кроликов при разных
путях и последовательности его введения в сочетании
с инфузией перфторана (ПФ), 5 мл/кг
По оси абсцисс – время после введения дротаверина, ч. По оси ординат – концентрации
дротаверина в плазме крови кроликов, мкг/мл (на рис. 1в концентрация перфтордекалина
ПФД приведена в мг/мл плазмы).
а) дротаверин 2 мг/кг, в/в, раздельно с ПФ (в разные вены); б) дротаверин 5 мг/кг, в/м;
в) дротаверин 10 мг/кг, per os; г) дротаверин 2 мг/кг и ПФ 5 мл/кг, в/в (в одной системе).
В скобках приведен интервал времени между введением препаратов.
При внутривенном ведении дротаверина сразу после инфузии перфторана
отмечено изменение хода концентрационной кривой и появление дополнительного
максимума, не характерного для динамики концентраций при данном пути введения.
Полученные результаты свидетельствуют о перераспределении дротаверина под
19
влиянием перфторана и о вмешательстве наноэмульсии в процессы транспорта и
распределения лекарственного препарата.
В объяснение данного эффекта была выдвинута гипотеза, согласно которой
наноэмульсия проявляет сорбционную активность в отношение дротаверина, в
результате чего сорбционная емкость крови увеличивается и происходит
перераспределение лекарственного вещества при внутривенном введении, усиление
абсорбции при внутримышечном и пероральном поступлении, а также увеличение
времени циркуляции лекарственного вещества в кровотоке.
Подтверждением выдвинутого предположения о сорбционной активности
наноэмульсии служат результаты экспериментов, приведенные на рисунке 1г. В этих
опытах дротаверин и перфторан смешивали до введения и вводили в дозе,
эквивалентной той, что была использована в эксперименте, отраженном на рисунке
1а. На рисунке 1г, помимо концентраций дротаверина приведена динамика
концентраций перфтордекалина (ПФД), основного компонента наноэмульсии
перфторан. Как видно, профиль концентрационной кривой дротаверина практически
повторяет таковой для ПФД. Полученные результаты можно рассматривать как
свидетельство того, что перфторан и дротаверин циркулируют как единый комплекс.
В следующей серии экспериментов изучали влияние перфторана на
фармакокинетику цефазолина. В данном случае использовали два варианта
постановки опытов – введение цефазолина в/в либо в/м в дозе 20 мг/кг сразу после
инфузии перфторана (5 мл/кг). Анализ параметров фармакокинетики цефазолина
показал, что на фоне введения перфторана усиливается процесс перехода препарата
из крови в ткани при внутривенном пути его поступления. При внутримышечном
введении не отмечено изменений параметров фармакокинетики цефазолина.
Таким
образом,
предварительные
исследования
показали,
что
фармакокинетическое взаимодействие наноэмульсии и лекарственных веществ
существует; оно отчетливо проявляется на этапе транспорта и распределения
лекарственных веществ; наиболее выраженные изменения наблюдаются при
внутривенном введении лекарственного препарата сразу после окончания инфузии
перфторана; в основе модифицирующего влияния наноэмульсии, по-видимому, лежит
ее сорбционная активность; эффект фармакокинетической интерференции является
неоднозначным и зависит от свойств лекарственных веществ.
Дальнейший анализ имел целью установить закономерности, лежащие в основе
фармакокинетических взаимодействий лекарственных веществ и наносистемы, и на
их основе разработать модели, позволяющие прогнозировать эффекты
фармакокинетической интерференции на этапе транспорта и распределения.
Проведенное исследование носило комплексный характер и включало анализ
взаимодействий на разных уровнях организации живых систем. Блок-схема,
иллюстрирующая основные структурные элементы исследования, представлена на
рисунке 2. Структура исследования содержит 4 блока данных, каждый из которых
20
включает комплекс параметров, характеризующих взаимодействие лекарственных
веществ с наноэмульсией (блок 2) и с альбумином (блок 3), данные по исследованию
фармакокинетики в опытах на животных (блок 4), а также сведения о физикохимических свойствах лекарственных веществ (блок 1). Важной составной частью
работы является анализ взаимосвязей между блоками параметров, причем как между
отдельными блоками данных, так и между комплексом параметров в целом. Такой
анализ включает оценку зависимости параметров связывания лекарств с альбумином
(или с перфтораном) от физико-химических свойств лигандов; зависимости
изменений параметров фармакокинетики от характеристик связывания лекарств с
альбумином или адсорбции перфтораном; а также анализ зависимости
фармакокинетического ответа от всего комплекса полученных параметров.
Блок 1
Структурные и физикохимические свойства ЛВ,
рассчитанные методами in silico
Блок 3
Параметры взаимодействия ЛВ
с альбумином, полученные в
опытах in vitro
Блок 2
Параметры взаимодействия ЛВ
с перфтораном, полученные в
опытах in vitro
Блок 4
Изменение параметров
фармакокинетики ЛВ под
влиянием перфторана in vivo
Рисунок 2 – Блок-схема, иллюстрирующая структуру исследования
В конечном итоге перед исследованием ставилась задача получить такую
математическую зависимость, которая позволяла бы прогнозировать характер
изменений фармакокинетики лекарств при сочетанном введении с перфтораном на
основе лишь сведений о структуре и физико-химических свойствах лигандов.
Анализ и прогнозирование сорбционной активности перфторана
в отношении лекарственных веществ
Сорбционная активность перфторана исследовалась в экспериментах in vitro с
помощью равновесного диализа на модели взаимодействия с перфтораном 50
лекарственных веществ, принадлежащих к различным фармакологическим группам и
обладающих широким спектром физико-химических свойств.
В результате исследования выявлено три характерных типа взаимодействия
лигандов с наноэмульсией: позитивное, нейтральное и негативное взаимодействие.
Перфторан-позитивное связывание характеризовалось адсорбцией примерно 50%
21
лиганда, а при перфторан-негативном взаимодействии отмечалось вытеснение лигада
из компартмента, содержащего наноэмульсию, в результате наблюдали кажущееся
увеличение концентрации свободного лиганда. Графики Скетчарда, полученные при
анализе адсорбции некоторых исследованных веществ приведены на рисунке 3.
Ci / Li
пирацетам = 0,001x - 0,195
атенолол = -0,007x + 0,431
пенициллин = -0,001x + 0,140
кетопрофен = -0,01x + 1,24
папаверин = -0,02x + 3,88
5,0
4,0
фенилбутазон
3,0
фенилбутазон= -0,04x + 4,58
2,0
папаверин
кетопрофен
1,0
атенолол
пенициллин
0,0
-100
-50
0
пирацетам
50
100
150
Ci , мкM
-1,0
Рисунок 3 – Графики Скетчарда для взаимодействия некоторых исследованных
лигандов с перфтораном
По оси OX – концентрация связанного лиганда (мкМ); по оси OY – отношение
концентрации связанного лиганда к концентрации свободного.
На рисунке 3 фенилбутазон и папаверин демонстрируют пример лигандов,
активно адсорбирующихся частицами наноэмульсии. На графике Скетчарда они дают
прямые с большим отрицательным углом наклона, пересекающие ось ординат в
области высоких значений, что соответствует константам взаимодействия (KPF) на
уровне 104 М-1. Графики для атенолола, кетопрофена и пенициллин имеют небольшой
отрицательный наклон и лежат в положительной области вблизи начала координат.
Наконец, для пирацетама график Скетчарда имеет положительный наклон и
располагается в отрицательной области системы координат. В результате величина
KPF для пирацетама приобретает отрицательные значения.
На основе совокупности полученных данных (значения констант
взаимодействия KPF, число адсорбированных молекул лиганда в расчете на 1 частицу
наноэмульсии n, степень связывания %) был проведен дискриминантный анализ, в
22
результате которого исследованная выборка распределилась на три группы, в
соответствии с типом взаимодействия (табл.1).
Таблица 1 – Усредненные внутригрупповые значения параметров взаимодействия
лекарственных веществ с перфтораном и статистика межгрупповых различий
Параметры взаимодействия лигандов с перфтораном
Группы
Кол-во
в группе
1
16
2,9·104 ± 3,7·103
159,6 ± 18,8
51,9 ± 4,8
2
17
3,8·103 ± 1,1·103
125,7 ± 32,8
15,8 ± 3,3
3
17
–5,9·103 ± 2,5·103
61,6 ± 22,9
–3,2 ± 3,1
KPF (М–1)
n
%
t1-2
6,27
0,90
6,23
t1-3
7,63
3,31
9,66
t2-3
6,27
0,90
6,23
Условные обозначения:
KPF – константа взаимодействия с лигандов перфтораном; n – число связанных молекул
лиганда в расчете на частицу эмульсии; % - степень связывания, выраженная в процентах.
t1-2; t1-3; t2-3 – t-критерий Стьюдента оценки значимости различий между 1-й и 2-й группами,
1-й и 3-й; 2-й и 3-й, соответственно.
В нижней части таблицы 1 также приведены значения t-критерия Стьюдента
для межгрупповых сравнений по каждому показателю. Как видно, сформированные
группы имеют отчетливые межгрупповые различия с высоким уровнем значимости
практически по всем исследованным параметрам. Поименный перечень препаратов в
соответствие с их принадлежностью к выделенным группам представлен в таблице 2.
Таблица 2 – Распределение лекарственных веществ по группам в зависимости от
параметров их взаимодействия с перфтораном
1 группа
(перфторан-позитивные)
n = 16
2 группа
(нейтральные)
n = 17
3 группа
(перфторан-негативные)
n = 17
1
2
3
Амитриптилин
Бендазол
Варфарин
Верапамил
Винпоцетин
Диклофенак
Дротаверин
Ибупрофен
Имипрамин
Атенолол
Галантамин
Дексаметазон
Диоксидин
Дифенгидрамин
Кеторолак
Лидокаин
Метоклопрамид
Метопролол
Амикацин
Ампициллин
Бензилпенициллин
Гентамицин
Кофеин
Метамизол Na
Метронидазол
Офлоксацин
Пентоксифиллин
23
Продолжение таблицы 2
1
Кетопрофен
Клемастин
Нимодипин
Папаверин
Пирлиндол
Прометазин
Фенилбутазон
2
Пропранолол
Ранитидин
Фуросемид
Хлорамфеникол
Хлоропирамин
Эмоксипин
Эналаприл
Этамзилат
3
Пирацетам
Пирензепин
Прокаин
Теофиллин
Фторурацил
Цефазолин
Цефотаксим
Ципрофлоксацин
Оценка зависимости параметров связывания лекарственных веществ с
перфтораном от физико-химических свойств лигандов проводилась в ходе
корреляционного анализа. Установлена положительная корреляция между
адсорбцией и липофильностью лекарственных веществ LogP, отрицательная – между
сродством к перфторану и водорастворимостью лигандов LogSH2O, а также
параметрами, характеризующими их полярные свойства (TPSA, Don, Acc).
Регрессионный анализ зависимости константы сродства лигандов к перфторану
от физико-химических свойств показал, что при очевидной значимости для данного
взаимодействия липофильных свойств лигандов, уравнение регрессии, составленное
на основе одного лишь параметра LogP дает довольно низкий коэффициент
детерминации (R2 = 0,46). Включение в уравнения регрессии дополнительных
переменных, полученных путем математических преобразований исходных
параметров (возведением в степень, вычислением соотношений между отдельными
физико-химическими свойствами и т.д.), позволило существенно повысить
достоверность прогноза значений KPF на основе физико-химических свойств. В
результате было разработано около 30 уравнений регрессии различной сложности и
статистической значимости, из которых был отобран ряд уравнений, обладающих
наилучшими статистическими характеристиками. Среди них уравнение (5),
устанавливающее квадратичную зависимость KPF от липофильности и константы
ионизации молекул лигандов, с коэффициентом детерминации R2 = 0,81:
K PF 3 10 4 3,4 103 LogP 1 0,25 LogP 7 103 pK a 1 0,1 pK a 3,4 103 LogS H 2O (5)
Полученные данные свидетельствуют о том, что зависимость адсорбции
лекарственных веществ частицами наноэмульсии носит сложный характер,
определяется липофильностью и полярными свойствами молекул, может
прогнозироваться на основе физико-химических свойств лигандов.
24
Анализ и прогнозирование взаимодействий лекарственных веществ
с сывороточным альбумином
Сывороточный альбумин является основным белком крови, осуществляющим
транспорт лекарств и во многом определяющим параметры фармакокинетики на
этапе распределения. Связывание лигандов с альбумином носит сложный характер,
поскольку на молекуле белка существует несколько центров связывания лигандов
(Kragh-Hansen U. et al., 2002). Основными центрами связывания лекарственных
веществ считаются центры I и II по классификации Sudlow, маркерами которых
являются варфарин и диазепам, соответственно (Sudlow G. et al., 1975). Несмотря на
детальную изученность альбумина, прогнозирование параметров связывания
лигандов имеет определенные трудности в силу большой гетерогенности молекул,
вступающих во взаимодействие с белком.
Учитывая значимость транспортной функции альбумина на этапе
распределения лекарственных веществ, цель настоящего раздела работы заключалась
в получении разносторонних характеристик взаимодействия лигандов с альбумином,
в анализе их зависимости от физико-химических свойств лигандов и в разработке
уравнений регрессии для прогнозирования данного взаимодействия.
Связывание 50 лекарственных веществ с альбумином исследовали in vitro с
использованием метода флуоресцентной спектроскопии, основанного на тушении
нативной флуоресценции белка при взаимодействии с лигандами. Анализ проводили
при разных температурах, что позволило получить не только кинетические (константа
сродства Kalb, число мест связывания n), но и термодинамические параметры
взаимодействия (изменение свободной энергии G , энтальпии H и энтропии S
при образовании лиганд-протеинового комплекса).
Комплексный анализ механизма взаимодействия лекарств с альбумином с
использованием кинетического и термодинамического подходов показал, что
связывание имеет сложный характер. При одинаковом значении константы сродства
лигандов к альбумину связывание может происходить как за счет гидрофобного
взаимодействия, так и за счет водородных, донорно-акцепторных и вандерваальсовых
связей. Полученные данные были проанализированы с позиций концепции P.D. Ross
и S. Subramanian (1981), которая позволяет судить о типе химических связей,
вовлеченных в образование лиганд-протеинового комплекса, по характеру изменений
энтальпии и энтропии в ходе реакции. В результате были выделены три типа
взаимодействия лигандов с альбумином. В первом случае связывание происходило с
преимущественным изменением энтальпии, во втором – движущей силой является
изменение энтропии, а в третьем – происходит равнозначный вклад изменений как
энтальпии, так и энтропии. Проведенный дискриминантный анализ позволил
сгруппировать препараты по термодинамическому типу взаимодействия с
альбумином и рассчитать среднегрупповые параметры связывания (табл. 3).
25
Сопоставление термодинамических характеристик взаимодействия со степенью
связывания лекарств с белком показало, что высокоизбирательное связывание может
происходить как по энтальпийному, так и по энтропийному типу. Тогда как при
слабом связывании с альбумином изменение энтальпии и энтропии происходит в
равной степени. Как показали результаты компьютерного моделирования (докинга),
высокоизбирательное связывание лигандов с I или со II центрами альбумина может
происходить как по энтальпийному, так и по энтропийному типу. Лиганды третьего
термодинамического типа (равнозначный тип) взаимодействуют с обоими центрами
альбумина с низким сродством.
Таблица 3 – Межгрупповая статистика параметров взаимодействия лекарственных
веществ с альбумином
Группы по
термодинамическому типу
взаимодействия
Параметры взаимодействия с альбумином
ΔH,
logKalb
|ΔH| / |TΔS|
кДж·М–1
1. Энтальпийный тип
4,70 ± 0,20
–56,55 ± 9,44
2,49 ± 0,45
2. Энтропийный тип
4,77 ± 0,25
37,13 ± 11,8
0,55 ± 0,05
3. Равнозначный тип
2,33 ± 0,15
–5,41 ± 13,8
1,03 ± 0,10
t1–2
–0,24
–6,19
4,29
t1–3
9,56
–3,06
3,16
t2–3
8,46
2,34
–4,42
Корреляционный анализ связи между параметрами взаимодействия лекарств с
альбумином и физико-химическими свойствами лигандов выявил положительную
корреляцию между связыванием и липофильностью веществ, отрицательную – между
связыванием и водорастворимостью и донорно-акцепторным потенциалом молекул
лекарств. С учетом результатов корреляционного анализа проведен множественный
регрессионный анализ, который позволил создать ряд уравнений регрессии,
математически описывающих зависимость logKalb от физико-химических свойств
лигандов, например, уравнение 6:
log K alb 1,25 0,9 LogP 2,6 102 TPSA 0,2 Rot
(6)
В соответствии с полученными уравнениями регрессии были проведены
расчеты logKalb для выборки из 60 препаратов, не исследованных в эксперименте.
Сопоставление рассчитанных значений logKalb с данными литературы выявило
высокую сходимость (81%) прогнозируемых и литературных данных.
Таким образом, в данном разделе работы была установлена математическая
зависимость константы связывания лекарственных веществ с альбумином logKalb от
физико-химических свойств лигандов, а также получен набор кинетических и
26
термодинамических характеристик лиганд-альбуминового взаимодействия, которые в
дальнейшем были использованы в качестве предикторов при разработке модели,
прогнозирующей изменения фармакокинетики in vivo.
Сравнительный анализ взаимодействия лекарственных веществ
с альбумином и с перфтораном
Поскольку в условиях организма наночастицы эмульсии и альбумин будут
совместно циркулировать в кровотоке, представлялось важным в сравнительном
аспекте оценить их сродство к лекарственным веществам и обозначить возможные
взаимоотношения в системе «перфторан – лиганд – альбумин».
Результаты анализа адсорбции лекарственных веществ перфтораном и
связывания с альбумином показали, что константы взаимодействия лигандов с
частицами наноэмульсии и с белком сопоставимы по своим значениям. Поскольку
привести полученные результаты в полном объеме не представляется возможным, в
таблице 4 эти параметры представлены для ряда препаратов исследованной выборки.
Таблица 4 – Константы взаимодействия некоторых исследованных лигандов
с перфтораном (KPF) и с альбумином (Kalb)
Лекарственные
вещества
KPF, М
-1
Kalb, М
Бендазол
5·104
1·104
Варфарин
2·104
8·105
Верапамил
4·104
3·104
Диклофенак
5·104
1·105
Дротаверин
6·104
8·105
Ибупрофен
1·104
2·106
Имипрамин
3·104
2·104
Клемастин
4·104
2·104
Нимодипин
1·104
1·104
Прометазин
1·104
3·104
-1
Сравнение перфторана и альбумина по показателю сорбционной емкости
показывает, что они обладают сопоставимыми значениями этого параметра. Исходя
из того, что диаметр частиц перфторана составляет 50-70 нм, можно подсчитать, что в
1 л 10%-ной эмульсии содержится примерно 1,5·1018 частиц (Иваницкий Г.Р., 2011;
Воробьев С.И., 2008). Если 1 частица наноэмульсии способна адсорбировать около
150 молекул лиганда (табл. 1), то литр перфторана будет адсорбировать 3·1020
молекул лекарственного вещества, что в концентрационном выражении составляет
5·10-4 М. Для сравнения 1 литр альбумина в физиологической концентрации
27
(соответствует примерно 0,6 мМ) при 100%-ном насыщении одного связывающего
центра (чего в реальных условиях не достигается) может связать примерно 6·10-4 М
лекарственного вещества.
Как видим, по параметрам сродства к лигандам и по сорбционной емкости
наноэмульсия перфторан представляет собой систему, способную конкурировать с
естественным
транспортером
альбумином,
и
оказывать
влияние
на
фармакокинетические процессы распределения лекарств в организме.
Наличие конкурентных отношений между перфтораном и альбумином
наглядно демонстрирует график, представленный на рисунке 4.
Доля связанного альбумина,%
90
80
70
60
50
40
30
Контроль
20
Против перфторана
10
0
0
50
100
150
200
250
Концентрация внесенного дротаверина, мкМ
Рисунок 4 – Изменение доли альбумина, связанного с дротаверином, после диализа
дротаверин-альбуминового комплекса против перфторана
Перфторан и альбумин по условиям опыта были отделены друг от друга
полупроницаемой мембраной, исключающей непосредственный контакт между ними.
По одну стороны мембраны альбумин находился в комплексе с дротаверином, по
другую – чистый перфторан. Верхняя кривая на рисунке 3 показывает зависимость
доли связанного белка от концентрации лиганда до начала диализа против
перфторана, а нижняя – после окончания диализа.
Как видно на рисунке 4, доля связанного альбумина после диализа против
перфторана уменьшается примерно в 2 раза. Объяснение данного явления может
состоять в следующем: перфторан адсорбирует на поверхности частиц дротаверин,
находящийся в свободном, не связанном с альбумином, состоянии. В результате
концентрация свободного лиганда снижается, что приводит к изменению равновесия
в системе [A] + [L] ↔ [AL] и диссоциации лиганд-альбуминового комплекса. Так
28
происходит до тех пор, пока в системе не установится новое равновесное состояние.
Подобный процесс, очевидно, имеет место и в кровеносном русле в условиях
совместного введения перфторана и лекарственных соединений. Изменение
равновесных концентраций свободных лекарственных веществ между кровью и
тканями может являться движущей силой перераспределения лекарств и вызывать их
отток из тканей в кровь.
Полученные результаты свидетельствуют, что между альбумином и
перфтораном существуют конкурентные отношения за связывание лигандов. В связи
с этим, при разработке моделей, прогнозирующих фармакокинетические
взаимодействия на этапе транспорта и распределения, необходимо учитывать
параметры взаимодействия лигандов как с перфтораном, так и с альбумином.
Исследование влияния перфторана на фармакокинетику лекарственных
веществ в экспериментах на животных
Для исследования были взяты 20 препаратов, принадлежащих к различным
фармакологическим группам, отличающиеся по физико-химическим свойствам, и по
параметрам взаимодействия с альбумином и с перфтораном. Перфторан вводили
внутривенно (5 мл/кг) и сразу после окончания инфузии животным вводили
лекарственный препарат в/в или в/м в соответствующей дозе. Примеры кривых,
отражающих характерные типы фармакокинетических изменений под влиянием
перфторана, приведены на рисунке 5.
Обращает внимание, что во многих случаях кривая зависимости концентрации
от времени совершенно не соответствует кривой, характерной для кинетики лекарств
при внутривенном введении. Часто наблюдаются значительные колебания
концентраций, появление дополнительных максимумов. Для анализа таких кривых
использование одно- или двухкамерных моделей фармакокинетики неприемлемо. В
связи с этим для количественной оценки рассчитывали площадь под кривой за 5часовой период наблюдения AUC5 и время достижения половины концентрации,
наблюдаемой за 5 часов, Т50.
После статистической обработки полученных данных в соответствии
t-критерием Стьюдента по изменению площади под концентрационной кривой AUC5
исследованные препараты разделились на три группы:
1 группа – уменьшение концентрации препарата в крови под влиянием
перфторана (пентоксифиллин, цефазолин, цефотаксим).
2 группа – отсутствие статистически значимых изменений концентрации
(ампициллин, кеторолак, метоклопрамид, ранитидин, ципрофлоксацин).
3 группа – увеличение концентрации препарата в крови под влиянием
перфторана (амитриптилин, бендазол, верапамил, диклофенак, дифенгидрамин,
дротаверин, имипрамин, кетопрофен, клемастин, офлоксацин, прометазин,
хлоропирамин).
29
Диклофенак 5 мг/кг, в/в
Кетопрофен 20 мг/кг в/м
10
25
Опыт
8
Опыт
20
Контроль
6
15
4
10
2
5
Контроль
0
0
0
1
2
3
4
0
5
1
Кеторолак 3 мг/кг, в/в
2
3
4
5
Цефотаксим 25 мг/кг, в/в
6
100
5
80
4
Контроль
Опыт
3
Контроль
Опыт
60
40
2
20
1
0
0
0
1
2
3
4
5
0
Прометазин 2,5 мг/кг, в/в
1
2
3
5
Верапамил 0,5 мг/кг в/в
4
1,6
Контроль
Опыт
3
4
Контроль
Опыт
1,4
1,2
1,0
2
0,8
0,6
1
0,4
0,2
0
0,0
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
Рисунок 5 – Динамика концентраций диклофенака, верапамила, кеторолака и
цефотаксима в крови кроликов
«Контроль» - содержание лекарственных веществ в крови при раздельном введении;
«Опыт» - содержание лекарственных веществ в крови при введении на фоне перфторана.
По оси ординат – концентрация лекарственных веществ (мкг/мл плазмы).
По оси абсцисс – время после введения лекарства (ч).
30
Обращает внимание, что деление препаратов на группы по характеру
изменений концентраций в крови в значительной мере совпадает с распределением их
на группы по типу взаимодействия с перфтораном в опытах in vitro (см. табл. 2).
Разработка уравнений регрессии для прогнозирования направленности
изменений фармакокинетики лекарств при их сочетанном назначении
с перфтораном
При разработке уравнений регрессии для прогнозирования направленности
фармакокинетических изменений под влиянием перфторана в качестве зависимой
(прогнозируемой) переменной был выбран параметр, который получил условное
обозначение tAUC5. По смысловому значению он близок к широко применяемому в
статистике t-критерию Стьюдента проверки значимости различий между двумя
выборками. В контексте данного исследования параметр tAUC5 означает, насколько
значимы изменения наблюдаемой концентрации лекарства в крови AUC5 под
влиянием перфторана по сравнению с контролем (введение препарата без
перфторана).
В качестве независимых переменных (предикторов) была использована вся
совокупность данных, полученных в экспериментах in vitro при анализе связывания
лекарственных веществ с перфтораном и с альбумином, а также 11 физикохимических характеристик лигандов, рассчитанных методами in silico. При
разработке уравнений регрессии стремились подойти к прогнозированию с разных
сторон, используя как отдельные блоки параметров, так и их различные комбинации
(табл. 5). Представляется, что такой подход позволяет получить совокупность
уравнений, обеспечивающих объективность прогноза. Всего было сгенерировано
около 30 уравнений регрессии различной сложности статистической значимости.
Таблица 5 – Уравнения регрессии, прогнозирующие значения параметра tAUC5
для изменения наблюдаемой концентрации лекарств в крови AUC5
Уравнения регрессии
На основе параметров сорбции перфтораном
R2
t AUC 5 0,52 1,45 10 4 K PF
На основе параметров связывания с альбумином
40,6
(7)
t AUC 5 4,98 0,037H 1,64 log K alb
61,4
(8)
На основе параметров взаимодействия с альбумином и с перфтораном
t AUC 5 2,6 1,6 LogP 0,03 H 0,7 pK a
71,9
0,01 TPSA 11 LogP
85,1
LogP
pK a
На основе физико-химических свойств и параметров сорбции перфтораном
t AUC 5 1,36 0,01 H 0,9 log KsiteII t AUC 5 0,2 5,5 10 6 K PF 8,6 LogP 0,18 pK a
pK a
LogP
70,3
(9)
(10)
(11)
31
На основе физико-химических свойств и параметров взаимодействия с
альбумином и с перфтораном
t AUC 5 6,2 1,6 log K siteII 0,035 nPF 0,08 BPF 11,4 LogP 0,27 pK a
pK a
LogP
94,8
(12)
72,9
(13)
На основе физико-химических свойств
t AUC 5 3,3 1,25 LogP 0,19 pK a
0,7 Rot
LogP
Несмотря на очевидную связь между сорбционной активностью наноэмульсии
и изменениями концентраций лекарственных веществ в крови животных при
сочетанном введении с перфтораном, уравнение регрессии, составленное на основе
константы сродства лигандов к перфторану, имело достаточно низкий уровень
детерминации (R2 = 40,6). Прогноз, составленный на основе параметров связывания с
альбумином, был более достоверным (R2 = 61,4). Наиболее высокие статистические
показатели имели уравнения, разработанные на основе комплекса предикторов,
включающих физико-химические свойства и параметры, полученные в
экспериментах in vitro при исследовании адсорбции лекарственных веществ
частицами наноэмульсии и при анализе связывания лигандов с альбумином.
Сходимость расчетных значений параметра tAUC5 , полученного с помощью уравнений
10 и 12, с экспериментальными данными составила 85,1 и 94,8%, соответственно.
Разработанные уравнения регрессии решают задачу экстраполяции данных,
полученных в модельных экспериментах, на уровень целого организма. Они
позволяют прогнозировать, как свойства и активность лекарственного вещества,
выявленные в опытах in vitro или in silico, будут влиять на его активность in vivo.
Следует отметить, что полученные зависимости оперируют данными,
полученными в результате конкретного эксперимента, и не могут иметь широкого
применения другими исследователями. Вместе с тем, представлялось важным
разработать уравнения регрессии, которые позволяли бы на основе общедоступных
сведений (физико-химических свойств лекарственных соединений) прогнозировать
направленность изменений фармакокинетики под влиянием наноэмульсии
перфторуглеродов. Как известно, достоверность прогноза в значительной мере
зависит от численности используемой выборки. В то же время эксперименты на
животных представляют собой самый трудоемкий этап исследований, сопряженный с
определенными этическими проблемами.
Разработанные уравнения регрессии были использованы для расчета параметра
tAUC5 для 50 препаратов с привлечением всей совокупности экспериментальных и
расчетных данных. Расчеты выполнялись на основании уравнений (9) – (13), после
чего было получено среднее прогнозируемое значение параметра tAUC5. Таким
способом была получена расширенная экспериментально-теоретическая выборка,
содержащая значения параметра tAUC5 для 50 лекарственных веществ. Проверка
32
соответствия расчетных и экспериментальных значений tAUC5 в отношение 20
препаратов, исследованных на животных, дала 85% сходимость значений. Это
позволило использовать расширенную выборку для дальнейшего регрессионного
анализа, в ходе которого были установлены зависимости параметра tAUC5
непосредственно от физико-химических свойств лигандов.
Основные этапы разработки уравнений регрессии схематически представлены
на рисунке 6.
Физико-химические
свойства лигандов
Взаимодействие лигандов
с альбумином in vitro
Взаимодействие лигандов
с перфтораном in vitro
Фармакокинетика в экспериментах in vivo
˗ Исследование фармакокинетики в экспериментах
на животных
˗ Выбор параметра для прогнозирования
Разработка уравнений регрессии на базе всей
совокупности данных, полученных in vitro и in silico
Отбор уравнений, дающих наилучшую сходимость расчетных и
экспериментальных значений прогнозируемого параметра tAUC5
Формирование расширенной выборки для параметра tAUC5
на основе расчетно-экспериментальных данных, полученных
с помощью разработанных уравнений регрессии
Разработка уравнений регрессии для расширенной выборки,
прогнозирующей параметр tAUC5 на основе физико-химических
свойств лигандов
Рисунок 6 – Этапы разработки уравнений регрессии для прогнозирования
направленности изменений концентраций лекарств в крови под влиянием перфторана
Из числа разработанных уравнений регрессии были отобраны 3 зависимости,
которые приведены в таблице 6. Полученные уравнения имели высокие значения
33
коэффициента детерминации и критерия Фишера, что позволило применить их при
прогнозировании фармакокинетических тенденций для 60 препаратов, которые не
исследовались в экспериментах, но для которых были рассчитаны физикохимические параметры.
Таблица 6 – Уравнения регрессии, прогнозирующие значения параметра tAUC5
на основе физико-химических свойств лигандов
Уравнения регрессии
t AUC 5 0,045 1,2 LogP t AUC 5 0,95 t AUC 5 0,84 0,15 pK a
LogP
7,15 LogP 0,15 pK a 4,15 TPSA
pK a
LogP
MW
8 LogP 0,08 TPSA 0,1 pK a 0,06 Don Acc pK a
Acc
LogP
R2
F
74,3
68,0
(14)
87,5
107,3
(15)
88,7
88,7
(16)
По результатам прогнозируемых тенденций в изменении концентраций
лекарств в крови под влиянием перфторана был проведен дискриминантный анализ, в
результате которого препараты распределились на три группы в зависимости от
характера прогнозируемых изменений (рис. 7). Для группировки препаратов были
заданы граничные значения параметра tAUC5:
tAUC5 ≤ –2,0 – прогнозируется уменьшение концентрации;
0 < | tAUC5 | < 2,0 – прогнозируется отсутствие влияния перфторана;
tAUC5 ≥ 2,0 – прогнозируется увеличение концентрации лекарства в крови.
Рисунок 7 – Группировка препаратов по результатам дискриминантного анализа
Список препаратов в соответствие с их принадлежностью к выделенным
группам приведен в таблице 7.
34
Таблица 7 – Группировка препаратов в зависимости от прогнозируемого изменения
концентраций лекарств в крови при сочетанном применении с перфтораном
Прогнозируемая направленность изменений концентраций в крови
Уменьшение (n=8)
Нет эффекта (n=48)
Увеличение (n=54)
Амикацин
Ампициллин
Амиодарон
Атенолол
Ацетаминофен
Амитриптилин
Гентамицин
Галантамин
Бендазол
Пентоксифиллин
Дексаметазон
Бензилпенициллин
Рибавирин
Диоксидин
Бромкриптин
Цефтриаксон
Доксициклин
Варфарин
Цитарабин
Зопиклон
Верапамил
Этамзилат
Идарубицин
Винпоцетин
Изониазид
Галоперидол
Кодеин
Диазепам
Кофеин
Диклофенак
Лидокаин
Дилтиазем
Лизиноприл
Дифенгидрамин
Метамизол натрия
Домперидон
Метоклопрамид
Дроперидол
Метопролол
Дротаверин
Морфин
Ибупрофен
Налидиксовая кислота
Имипрамин
Офлоксацин
Индометацин
Пефлоксацин
Итраконазол
Пирацетам
Кетоконазол
Пирензепин
Кетопрофен
Пироксикам
Кеторолак
Прокаин
Кетотифен
Прокаинамид
Клемастин
Ранитидин
Клоназепам
Сальбутамол
Клонидин
Сульпирид
Лоперамид
Теноксикам
Лоратадин
Теофиллин
Метронидазол
Трамадол
Мидазолам
Триметазидин
Напроксен
Фамотидин
Нимодипин
Фенитоин
Нитразепам
Фенобарбитал
Нифедипин
Феноксиметилпенициллин
Нифлуминовая кислота
Фторурацил
Оксазепам
Хлорамфеникол
Папаверин
Цетиризин
Пирлиндол
Цефадроксил
Правастатин
Цефазолин
Прометазин
Цефиксим
Пропофол
Цефотаксим
Пропранолол
Цефуроксим
Тиопентал
Циметидин
Фентанил
Ципрофлоксацин
Флунитразепам
Эналаприл
Фозиноприл
Этопозид
Фуросемид
Хлордиазепоксид
Хлорокин
Хлоропирамин
Циннаризин
Эмоксипин
Этакриновая кислота
tAUC5 = 0,24 ± 0,17
tAUC5 = 4,75 ± 0,33
tAUC5 = 3,26 ± 0,66
35
Первую группу составили 8 препаратов, для которых прогнозируется усиление
элиминации из крови под влиянием перфторана. Вторая группа включает 48
препаратов, концентрация которых не будет претерпевать изменений. Третью группу
составили 54 препарата, для которых ожидается увеличение концентрации в крови в
условиях совместного введения с перфтораном (табл. 7).
Как видно в таблице 7, среди препаратов, для которых прогнозируется
тенденция к увеличению концентраций в крови при совместном применении с
перфтораном, представлены кардиотропные, нейротропные, антигистаминные и
противовоспалительные средства. Для противоопухолевых и антибактериальных
препаратов, напротив, характерно либо усиление элиминации лекарственных веществ
из кровотока под влиянием перфторана, либо отсутствие влияния кровезаменителя. С
целью минимизации нежелательных эффектов фармакокинетической интерференции
разработаны практические рекомендации.
Заключение
В результате проведенного исследования на модели взаимодействия
наноэмульсии перфторуглеродов и лекарственных веществ выявлен и
охарактеризован новый вид фармакокинетического взаимодействия, который на этапе
транспорта и распределения заключается в возникновении конкурентных
взаимодействий между наносистемой и сывороточным альбумином за связывание
лигандов. Результатом этих взаимодействий является увеличение сорбционной
емкости крови и уменьшение концентрации свободных лигандов, что приводит к
изменению равновесных концентраций свободных лекарственных веществ между
кровью и тканями. Сдвиг равновесных концентраций сопровождается
перераспределением
лекарственных
соединений
между
центральным
и
периферическим компартментами организма и проявляется реабсорбцией
лекарственных веществ в кровоток, увеличением плазменных концентраций и
появлением дополнительных максимумов.
Проведенный анализ показал, что не все лекарственные вещества подвержены
фармакокинетическому взаимодействию с наноэмульсией. Взаимодействие с
перфтораном носит селективный характер и определяется липофильностью и
полярными свойствами лигандов. По способности адсорбироваться на поверхности
частиц наноэмульсии лекарственные вещества разделены на три группы: перфторанпозитивные, нейтральные и перфторан-негативные. Эти свойства в значительной
мере определяют направленность фармакокинетических изменений, наблюдаемых
при сочетанном применении перфторана и лекарственных соединений in vivo. Однако
одних только сведений о параметрах адсорбции лигандов частицами наноэмульсии
оказалось недостаточно для получения надежного прогноза в отношении
фармакокинетических изменений в условиях организма. Привлечение для разработки
уравнений регрессии совокупности данных, полученных при анализе связывания
36
лигандов с альбумином, позволило значительно повысить достоверность прогноза,
что еще раз подтверждает значимость взаимоотношений между транспортным белком
и
наносистемой
для
результирующего
эффекта
фармакокинетического
взаимодействия.
В результате не только определено новое направление исследований, которое
можно обозначить как анализ взаимодействия наночастиц и лекарственных веществ в
условиях их совместного назначения, но и предложен подход к разработке данной
проблемы. Суть подхода заключается в комплексной оценке взаимодействий
наносистемы и лекарственных веществ на разных уровнях организации живых
систем, в привлечении экспериментальных и расчетных методов с целью получения
всесторонних характеристик как самих веществ, так и исследуемых процессов, в
выявлении закономерностей, лежащих в основе исследуемых взаимодействий, и в
разработке на их основе математических моделей, основанных на общедоступных
параметрах, и позволяющих прогнозировать тенденции фармакокинетических
взаимодействий.
В настоящей работе объектом исследования служили фармакокинетические
взаимодействия перфторана и лекарственных веществ, возникающие на этапе
транспорта и распределения. Разработанная структура исследования может быть
полностью воспроизведена при анализе взаимодействий лекарственных веществ с
другими наносистемами, которые пригодны для внутривенного и парентерального
введения. При этом могут быть использованы имеющиеся конститутивные
характеристики лекарственных веществ, например, физико-химические свойства и
параметры связывания с альбумином. Аналогичный принцип построения
исследования может применяться для изучения взаимодействий наносистем и
лекарственных веществ в проекции на другие этапы фармакокинетики. В зависимости
от задач исследования содержание блоков данных будет меняться, но принцип
комплексного использования модельных экспериментов и наблюдений in vivo может
быть реализован и для решения таких задач, как анализ биодоступности или
метаболизма. Так, для моделирования кишечной проницаемости широко
используется культура клеток Caco-2, а для анализа метаболизма – микросомальные
фракции печени. Кроме того, в последние годы разработаны компьютерные
программы, позволяющие расчетными методами получать параметры проницаемости
и метаболизма. Безусловно, прогнозируемые тенденции должны иметь
экспериментальное подтверждение, которое может быть получено в ходе
комплексного исследования.
В целом результаты проведенного исследования будут способствовать
разработке схем рациональной фармакотерапии с использованием наноматериалов,
внедрению в медицину препаратов на основе нанотехнологий, а также
целенаправленному подходу к разработке новых лекарственных форм на базе
наносистем.
37
ВЫВОДЫ
1. Перфторуглеродная наноэмульсия перфторан способна изменять
фармакокинетику лекарственных веществ при их сочетанном назначении.
Фармакокинетическое взаимодействие наноэмульсии и лекарственных соединений
отчетливо проявляется на этапе транспорта и распределения лекарственных веществ
и выражается изменениями действующих концентраций лекарств в крови
экспериментальных животных. Характер изменений фармакокинетики определяется
сорбционной способностью наноэмульсии перфторуглеродов и зависит от физикохимических свойств лекарственных соединений.
2. Изменения фармакокинетики липофильного препарата дротаверина имеют
место при внутривенном, внутримышечном и пероральном путях его введения
кроликам в сочетании с инфузией перфторана (5 мл/кг). При внесистемном введении
дротаверина усиливается его абсорбция, а при внутривенном – происходит
перераспределение лекарственного препарата между кровью и тканями; при всех
путях введения имеет место уменьшение объема распределения и снижение общего
клиренса. Наиболее отчетливо явление фармакокинетической интерференции
проявляется при введении дротаверина сразу после окончания инфузии перфторана.
При инфузии перфторана через 30-60 мин после введения дротаверина изменения
фармакокинетики менее выражены.
3. При исследовании фармакокинетики 20 лекарственных веществ в условиях
их внутривенного либо внутримышечного введения кроликам сразу после окончания
инфузии перфторана выявлены три типа фармакокинетического отклика: достоверное
повышение, снижение или отсутствие изменений суммарной наблюдаемой за 5 ч
концентрации лекарственных веществ в крови животных. Изменения хода
концентрационной кривой начинают регистрироваться через 15 мин после введения
лекарственных веществ; в случае увеличения концентраций часто сопровождаются
появлением дополнительных максимумов.
4. Наноэмульсия перфторуглеродов в опытах in vitro проявляет селективную
адсорбционную активность в отношении лекарственных веществ, которая выражается
в перераспределении свободных лигандов в системе «диализирующий раствор перфторан». По типу взаимодействия с перфтораном лекарственные вещества из
числа 50 исследованных соединений делятся на эффективно адсорбируемые, слабо
адсорбируемые и вытесняемые частицами наноэмульсии из компартмента,
содержащего перфторан. Константы сродства для эффективно адсорбируемых
соединений составляют порядка 104 М-1; для слабо адсорбируемых – порядка 102 М-1;
для вытесняемых веществ константы имеют отрицательные значения порядка
103 М-1.
5. Эффективное связывание лекарственных веществ с альбумином в опытах
in vitro сопровождается преимущественным изменением энтальпии либо энтропии;
при связывании лигандов с низким сродством соотношение между энтальпией и
38
энтропией не изменяется. Высокоизбирательное связывание лигандов с альбумином
характеризуется константами сродства 104÷106 М-1, что соответствует степени
связывания лекарственных веществ в крови на уровне 85-99%. Константы
аффинитета при низкоизбирательном связывании составляют 101÷103 М-1
(соответствует степени связывания в крови до 40%).
6. Константы сродства лигандов к частицам наноэмульсии и к альбумину
сопоставимы по своим значениям, что создает предпосылки для конкурентных
отношений в системе «альбумин – перфторан» за взаимодействие с лекарственными
веществами. Сорбционная емкость перфторана близка сорбционной емкости
альбумина в физиологической концентрации. Это способствует формированию
дополнительного пула лекарственных веществ, связанных с эмульсией, и приводит к
изменению равновесных концентраций свободных лекарственных соединений.
7. Для лекарственных веществ, активно адсорбируемых наноэмульсией,
характерно увеличение суммарной наблюдаемой за 5 ч концентрации в крови при
введении лабораторным животным на фоне инфузии перфторана, а для соединений,
характеризующихся отрицательными константами взаимодействия с наноэмульсией,
характерно снижение концентраций лекарств в крови в условиях сочетанного
назначения с перфтораном.
8. Изменение концентраций лекарственных веществ in vivo определяется не
только способностью лекарств адсорбироваться частицами наноэмульсии, но также
параметрами взаимодействия лигандов с альбумином и физико-химическими
свойствами лекарственных соединений. Уравнения регрессии, описывающие
зависимость изменений концентраций лекарственных веществ in vivo от константы
адсорбции лигандов перфтораном, имеют коэффициент детерминации всего 40,6%.
Дополнительное включение в уравнения регрессии в качестве дескрипторов
параметров связывания с альбумином и физико-химических характеристик лигандов,
сопровождается увеличением коэффициентов детерминации прогнозирующих
математических моделей до 70-95%.
9. Разработанный алгоритм прогнозирования эффектов фармакокинетической
интерференции, основанный на использовании совокупности данных, полученных in
silico, in vitro и in vivo, позволяет прогнозировать направленность изменений
концентраций лекарственных веществ в условиях сочетанного введения с
перфтораном на основе сведений о физико-химических свойствах лигандов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Минимизации
нежелательных
эффектов
фармакокинетического
взаимодействия лекарственных веществ и перфторана будут способствовать
следующие рекомендации:
1.Первоначально рекомендуется определить характер ожидаемого влияния
перфторана на действующие концентрации интересующего лекарственного
39
соединения. Для этого следует, используя разработанные в данной работе уравнения
регрессии и сведения о физико-химических свойствах лекарственного препарата,
вычислить значения параметра tAUC5. Необходимые физико-химические параметры
можно почерпнуть в электронных базах данных или рассчитать самостоятельно с
помощью молекулярного калькулятора.
2.Если рассчитанное значение tAUC5 < –2, то для данного препарата ожидается
ускорение элиминации из кровеносного русла при внутривенном введении и
замедление поступления в кровь при внесистемном введении в сочетании с
перфтораном. Если полученное значение находится в диапазоне –2 < tAUC5 < 2, то
изменений фармакокинетики лекарства под влиянием перфторана не ожидается. Если
величина рассчитанного параметра tAUC5 > 2, то для данного лекарственного вещества
прогнозируется увеличение действующей концентрации при совместном
использовании с перфтораном. Эти препараты требуют к себе пристального внимания
при использовании в схемах терапии совместно с перфтораном.
3.Чтобы минимизировать эффекты фармакокинетического взаимодействия
лекарственные препараты, активно адсорбируемые эмульсией, рекомендуется
вводить до начала инфузии перфторана. Интервал между введением лекарственного
препарата и инфузией перфторана определяется периодом полураспределения
лекарства, который показывает время, в течение которого половина введенного
лекарства распределяется в ткани и вступает во взаимодействие со специфическими
структурами. При инфузии кровезаменителя после введения лекарства с интервалом
времени, соизмеримым с периодом полураспределения лекарственного вещества,
модифицирующее влияние перфторана будет менее выраженным. Если сведения о
фармакокинетике отсутствуют, можно придерживаться срока введения лекарства за
1 ч и более до инфузии перфторана.
4.Если препарат, принадлежащий к числу перфторан-позитивных веществ
необходимо вводить одновременно либо после инфузии кровезаменителя,
целесообразно уменьшить дозу лекарства. Следует иметь в виду, что в присутствии
перфторана эффективность транспорта липофильных лекарственных соединений
возрастает.
5.При недостаточной выраженности ожидаемого лечебного эффекта от введения
лекарственного препарата на фоне инфузии перфторана не следует форсировать
дозовую нагрузку во избежание развития отставленных эффектов передозировки в
связи с возможностью пролонгирования фармакологического действия.
6.В связи с большой вероятностью образования комплексов между частицами
эмульсии и липофильными лекарственными веществами, не рекомендуется вводить
перфторан-позитивные препараты в одной системе с перфтораном. Данная
предосторожность обусловлена тем, что вопросы стабильности эмульсии при
образовании такого рода комплексов не исследованы.
40
СПИСОК ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
В рецензируемых научных изданиях
1. Мурзина Е.В., Андреева Н.Б., Пшенкина Н.Н., Губанов А.И. Модификация
кинетики метилового и этилового спиртов под влиянием перфторана // Вестник
Российской Военно-медицинской академии. 2004. №1 (11). С. 47-52.
2. Пшенкина Н.Н., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М., Губанов А.И.
Фармакокинетика ампициллина и амитриптилина в условиях предварительного
введения перфторана // Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2005.
№1 (13). С. 54-57.
3. Пшенкина Н.Н., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М., Губанов А.И.
Анализ влияния перфторана на фармакокинетику некоторых лекарственных средств //
Общая реаниматология. 2007. Т. 3. № 3/1. С .25-30.
4. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М.,
Губанов А.И., Каширцева Е.В. Влияние перфторана на фармакокинетику диазепама
при разных вариантах их сочетанного введения // Вестник Российской Военномедицинской академии. 2007. №4 (20). С. 99-104.
5. Пшенкина Н.Н. Кинетический и термодинамический анализ взаимодействия
лигандов с альбумином // Медицинский академический журнал. 2010. Т. 10. № 3. С.
130-138.
6. Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В., Андреева Н.Б., Софронов Г.А.
Исследование сорбции лекарственных веществ перфтораном // Общая
реаниматология. 2011. Т. 7. № 2. С. 63-67.
7. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А. Анализ и прогнозирование сорбции
лекарственных веществ перфтораном на основе физико-химических свойств лигандов
// Общая реаниматология. 2011. Т. 7. № 3. С. 56-60.
8. Селиванов Е.А., Пшенкина Н.Н., Мурзина Е.В., Софронов Г.А., Ханевич М.Д.,
Сарычев В.А. Кровезаменители с газотранспортной функцией на основе гемоглобина
// Биомедицинский журнал Medline.ru. 2011. Т. 12. С. 990-1013. URL:
http://www.medline.ru
9. Софронов Г.А., Селиванов Е.А., Ханевич М.Д., Фадеев Р.В., Гипарович М.А.,
Юсифов С.А., Столяров И.К., Пшенкина Н.Н. Использование антигипоксантных
инфузионных растворов в хирургии // Вестник Национального медикохирургического центра им. Н.И. Пирогова. 2011. Т. 6. № 1. С. 87-91.
10. Софронов Г.А., Ханевич М.Д., Манихас Г.М., Лисянская А.С., Селиванов
Е.А., Феофанова А.В., Фадеев Р.В., Гипарович М.А., Пшенкина Н.Н., Диникин М.С.
Особенности гемокомпонентной терапии у онкологических больных // Вестник
хирургии им. И.И. Грекова. 2011. Т. 170. № 3. С. 64-68.
11. Пшенкина Н.Н. Прогнозирование связывания лекарственных веществ с
альбумином на основе физико-химических свойств лигандов // Биомедицинский
журнал Medline.ru. 2011. Т. 12. С. 980-989. URL: http://www.medline.ru
12. Пшенкина Н.Н. Сывороточный альбумин: структура и транспортная
функция // Биомедицинский журнал Medline.ru. 2011. Т. 12. С. 1048-1066. URL:
http://www.medline.ru
41
13. Пшенкина Н.Н. Предиктивные технологии в исследовании новых
лекарственных веществ // Биомедицинский журнал Medline.ru. 2011. Т. 12. С. 10671091. URL: http://www.medline.ru
В других научных изданиях
14. Пшенкина Н.Н., Шилов В.В., Веселова О.М., Мурзина Е.В. Активность
холинэстеразы в крови и тканях крыс, отравленных карбофосом, при включении
перфторана в схему антидотной терапии // Физиологически активные вещества на
основе перфторуглеродов в военной медицине: Матер. Всеарм. научн. конф., СПб.
СПб: ВМА. 1997. С. 88-89.
15. Пшенкина Н.Н., Андреева, Н.Б. Веселова, О.М. Мурзина, Е.В. Глухова Ю.В.
Влияние перфторана на содержание эндогенных нитратов в крови крыс //
Физиологически
активные
вещества
на
основе
перфторуглеродов
в
экспериментальной и клинической медицине: Матер. Всеарм. научн. конф., СПб.
СПб: ВМА. 1999. С. 66-67.
16. Андреева Н.Б., Губанов А.И., Пшенкина Н.Н., Мурзина Е.В. Влияние
перфторана на фармакокинетику ампициллина у кроликов // Физиологически
активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической
медицине: Матер. Всерос. научн. конф. 19-20 июня 2001, СПб. СПб: ВМедА. 2001. С.
3-4.
17. Андреева Н.Б., Глухова Ю.В., Пшенкина Н.Н., Веселова О.М. Модификация
фармакокинетики амитриптилина у кроликов в условиях предварительного введения
перфторана // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в
экспериментальной и клинической медицине: Матер. Всерос. научн. конф. 19-20
июня 2001, СПб. СПб: ВМедА. 2001. С. 4-6.
18. Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В., Андреева Н.Б. Оценка
состояния донорской крови в условиях ее хранения с добавлением перфторуглеродов
// Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в
экспериментальной и клинической медицине: Матер. Всерос. научн. конф. 19-20
июня 2001, СПб. СПб: ВМедА. 2001. С. 58-60.
19. Софронов Г.А., Шилов В.В., Андреева Н.Б., Васильева Т.П., Пшенкина Н.Н.
и др. Методические рекомендации для постановки и проведения клиникоэкспериментальных исследований по изучению модифицирующего действия
перфторана на фармакокинетику лекарственных препаратов // Применение
перфторорганических соединений в экспериментальной и клинической медицине: Сб.
метод. реком. / Под общей ред. акад. РАМН проф. Г.А.Софронова. – СПб.: ВМедА.
2002. С. 5-20.
20. Плужников Н.Н., Софронов Г.А., Сосюкин А.Е., Головко А.И., Шилов В.В.,
Андреева Н.Б., Пшенкина Н.Н. и др. Использование препарата перфторан в схемах
лечения отравлений дихлорэтаном. Методические рекомендации. // Применение
перфторорганических соединений в экспериментальной и клинической медицине: Сб.
метод. реком. / Под общей ред. акад. РАМН проф. Г.А.Софронова. – СПб.: ВМедА.
2002. С. 21-30.
42
21. Софронов Г.А., Шилов В.В., Ханевич М.Д., Сосюкин А.Е., Матвеев С.Ю.,
Скорик В.И., Андреева Н.Б., Судус А.В., Пшенкина Н.Н. и др. Применение
препаратов
на
основе
перфторуглеродных
соединений
при
тяжелых
гастродуоденальных
кровотечениях,
искусственном
кровообращении
в
кардиохирургии и острых отравлениях липофильными ядами. Методические
рекомендации // Применение перфторорганических соединений в экспериментальной
и клинической медицине: Сб. метод. реком. / Под общей ред. акад. РАМН проф.
Г.А.Софронова. СПб.: ВМедА. 2002. С. 31-52.
22. Андреева Н.Б., Пшенкина Н.Н., Мурзина Е.В., Губанов А.И., Веселова О.М.
К вопросу о фармакокинетической интерференции перфторана и лекарственных
средств // Клинические исследования лекарственных средств в России: Матер. 2
Междунар. конф. 20-22 ноября 2002, М. М.: 2002. С. 21-22.
23. Васильева Т.П., Пшенкина Н.Н., Железкова Е.В., Кудряшова Л.И.
Перфторорганические соединения в экспериментальной и клинической медицине:
Информационный бюллетень 2000-2004 гг. // Под общей ред. акад. РАМН проф.
Г.А.Софронова. СПб.: ВМедА. 2004. 86 с.
24. Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В., Андреева Н.Б. Влияние
перфторана на радиационный апоптоз тимоцитов // Перфторуглероды в клинических
и экспериментальных исследованиях: Матер. Рос. науч. конф. 8-10 сент. 2004. СПб.
СПб.: ВМедА. 2004. С. 102-103.
25. Пшенкина Н.Н., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Губанов А.И., Веселова О.М.
Модификация перфтораном фармакокинетики лекарств // Вестник Российской
Военно-медицинской академии. 2005. № 1. (14). Прил. С. 251.
26. Pshenkina N.N., Sofronov G.A., Andreeva N.B., Murzina E.V., Veselova O.M.
Modifying of drug pharmacokinetics by perfluorocarbon blood substitute // International
visions on blood substitutes / Comprising the 5th Int. Symp. on “Current Issues in Blood
Substitute Research” and the 4th Int. Course on “From Structural Genomics to Drug
Discovery”. Parma, Sept. 17-20, 2006. Parma: 2006. P. 81.
27. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А., Куропатенко М.В. Кровезаменителипереносчики кислорода для профилактической и интегративной медицины // От
экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине:
Междисциплинарный симпозиум, Судак, Крым, Украина, 17-27 сент. 2006 г.: Труды
Симпозиума / Под ред. И.В. Тимофеева, Н.Г. Перминовой. Новосибирск: 2006. С. 5860.
28. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М.
Перфторуглеродная кровезамещающая наноэмульсия может изменять распределение
и транспорт и лекарственных веществ // От экспериментальной биологии к
превентивной и интегративной медицине: Международный Междисциплинарный
симпозиум, Судак, Крым, Украина, 17-28 сент. 2007 г.: Труды Симпозиума / Под ред.
И.В. Тимофеева, Н.Г. Перминовой. Новосибирск: 2007. С. 98-100.
29. Pshenkina N., Andreeva N. Artificial blood substitutes may distort drugs
pharmacokinetics // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 2007. Vol. 101. Issue
S1. P. 144.
43
30. Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В., Андреева Н.Б. Влияние
перфторана на радиационный апоптоз тимоцитов и оксидативный стресс // Вестник
Российской Военно-медицинской академии. 2008. № 3. (23) Прил. 1. С. 222-223.
31. Пшенкина Н.Н., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М., Каширцева
Е.В., Губанов А.И. Взаимодействие перфторуглеродного кровезаменителя и
лекарственных средств при их экспериментальном сочетанном применении // Вестник
Российской Военно-медицинской академии. 2008. № 3. (23) Прил. 2. Ч. I. С. 154-155.
32. Софронов Г.А., Пшенкина Н.Н., Бурякова Л.В., Лазаренко Д.Ю.
Искусственные кровезаменители-переносчики кислорода как альтернатива донорской
крови и средство профилактики гемотрансмиссивных инфекций // Вестник
Российской Военно-медицинской академии. 2008. № 3. (23) Прил. 2. Ч. II. С. 348-349.
33. Пшенкина Н.Н., Мурзина Е.В., Веселова О.М., Каширцева Е.В.
Сорбционные свойства перфторуглеродной кровезамещающей наноэмульсии в
отношении лекарственных веществ // Вестник Российской Военно-медицинской
академии. 2008. № 3. (23) Прил. 2. Ч. II. С. 491.
34. Андреева Н.Б., Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В. Оценка
влияния внесения перфторорганических соединений в среду гемоконсервации на
гематологические показатели донорской крови в процессе ее хранения // Актуальные
вопросы профилактической медицины / Труды НИЦ ВМедА им. С.М.Кирова. СПб.:
ВМедА. 2008. Вып. II. С. 117-127.
35. Пшенкина Н.Н. Перфторуглеродная кровезамещающая наноразмерная
эмульсия с газотранспортными и сорбционными свойствами // От наноструктур,
наноматериалов и нанотехнологий к наноиндустрии: Тез. докл. 2 Всерос. конф. с
междунар. интернет-участием, Ижевск, 8-10 апр. 2009. Ижевск: ИЖ ГТУ. 2009. С. 96.
36. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А. Особенности перфторуглеродного
кровезаменителя Перфторан с точки зрения наноразмерной структуры // Актуальные
проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: Матер. III Междунар. науч.-практ.
конф., Ростов-на-Дону, 1-4 октября 2009. Ростов н/Д.: 2009. С. 269-270.
37. Софронов Г.А., Пшенкина Н.Н., Андреева Н.Б. Методические рекомендации
по оптимизации схем сочетанного применения перфторана и лекарственных средств в
клинической практике // Методические рекомендации / М.: МО РФ. 2010. 32 с.
38. Pshenkina N.N., Sofronov G.A. Influence of Perftoran on plasma concentrations of
drugs at their joint applying with blood substitute // II World Congress of the International
Academy of Nanomedicine., Antalya, Turkey, Oct.3-6, 2010. Antalya: 2010. P. 85-86.
39. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М.
Перфторуглеродные наноэмульсии: свойства, медицинское применение и
перспективы его расширения // III Международный форум по нанотехнологиям, 1-3
ноября 2010, Москва (CD-диск).
40. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А. Новые комплексные препараты на основе
кровезаменителей с газотранспортными свойствами // Инновационная деятельность в
Вооруженных силах РФ: Тр. Всеарм. науч.-практ. конф. 25-26 ноя. 2010 г. СПб.: 2010.
С. 382-383.
44
41. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А. Способ прогнозирования фармакокинетических взаимодействий лекарств и надмолекулярных комплексов in vivo //
Инновационная деятельность в Вооруженных силах РФ: Тр. Всеарм. науч.-практ.
конф. 25-26 ноя. 2010 г. СПб.: 2010. С. 383-386.
42. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А., Мурзина Е.В., Веселова О.М., Андреева Н.Б.
Сорбционные свойства наноэмульсии Перфторан как фактор, определяющий
изменения концентраций лекарств в крови // V Конгресс «Рациональная
фармакотерапия и клиническая фармакология», Санкт-Петербург, 13-14 октября 2010
г.: Сб. научн. матер. СПб.: 2010. С. 234-239.
43. Софронов Г.А., Пшенкина Н.Н. Анализ и прогнозирование влияния
наноэмульсии перфторан на содержание лекарственных веществ в крови //
Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии. Тезисы Росс. научн. конф. с
межд. уч-ем, 19-20 мая 2011 г., СПб. СПб: Фолиант. 2011. С. 22-23.
44. Мурзина Е.В., Пшенкина Н.Н. Состояние разработки и внедрения
кровезаменителей на основе гемоглобина в нашей стране и за рубежом //
Современные проблемы профилактической медицины: состояние и пути решения:
Матер. Росс. науч.-практ. конф. 17-18 ноября 2011 г., СПб. СПб.: ВМедА. 2011. С.
212.
45. Пшенкина Н.Н., Бурякова Л.В., Лазаренко Д.Ю., Мурзина Е.В., Веселова
О.М. Вклад НИЛ лекарственной и экологической токсикологии НИЦ в исследование
перфторуглеродных кровезаменителей // Актуальные проблемы трансфузиологии:
Матер. Росс. науч.-практ. конф. 7 октября 2011 г., СПб. СПб.: ВМедА. 2011. С. 89-90.
46. Пшенкина Н.Н., Мурзина Е.В., Веселова О.М. Прогнозирование влияния
перфторана на фармакокинетику лекарственных веществ при их сочетанном
использовании с кровезаменителем // Актуальные проблемы трансфузиологии:
Матер. Росс. науч.-практ. конф. 7 октября 2011 г., СПб. СПб.: ВМедА. 2011. С. 87-88.
47. Некраш
Н.А.,
Куликов
А.Н.,
Пшенкина
Н.Н.
Применение
перфторуглеродных соединений в офтальмологии: некоторые результаты и
перспективы // Актуальные проблемы трансфузиологии: Матер. Росс. науч.-практ.
конф. 7 октября 2011 г., СПб. СПб.: ВМедА. 2011. С. 70-72.
Документ
Категория
Биологические науки
Просмотров
105
Размер файла
630 Кб
Теги
Докторская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа