close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Особенности взаимодействия Bacillus atrophaeus B – 9918 с растениями и фитопатогенными грибами

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Коряжкина Мария Федоровна Шифр научной специальности: 03.02.03 - микробиология Шифр диссертационного совета: Д 002.146.01 Название организации: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН Адрес организации: 410049,
На правах рукописи
Коряжкина Мария Федоровна
ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ BACILLUS ATROPHAEUS В - 9918 С РАСТЕНИЯМИ И ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ
03.02.03 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов-2012
Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории микробиологического мониторинга ФГБОУ ВПО "Астраханский государственный технический университет" Научный руководитель:доктор биологических наук, профессор
Дзержинская Ирина Станиславовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Карпунина Лидия Владимировна
доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович Ведущая организация:Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Пушкин)
Защита состоится "14" марта 2012 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).
Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ и на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnyy-sovet/ С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан " " февраля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор В.Е. Никитина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus имеют широкое распространение в биосфере, входят в состав сапротрофов и занимают различные экологические ниши в почвенных и водных экосистемах, однако по своей совокупной биомассе превалируют в почвенном покрове (Vargas-Ayala et al., 2000; McSpadden Gardener, 2004; Мелентьев, 2007; Современная микробиология..., 2009).
Представители рода Bacillus способны заселять ризосферу и ризоплану растений, используя питательные вещества, продуцируемые растениями в виде корневых экзометаболитов. Они могут также синтезировать необходимые для растений биоконтрольные вещества, фитогормоны и витамины (Martin et al., 1987; Foldes et al., 2000; Мелентьев, 2007; Idris et al., 2007; Ortíz-Castro et al., 2008; Ahmed, Hasnain, 2010; Chen et al., 2010). Все вышеперечисленные свойства позволяют отнести их, наряду с ризобиями, псевдомонадами и микоризными грибами к группе PGPR (Schippers, 1992). Бациллы участвуют во всех формах взаимоотношений с растениями: могут являться возбудителями заболеваний (Hosford, 1982; Пересыпкин, 1989; George N. Agrios, 2005); способствовать устойчивому росту и развитию растения; защищать растение от фитопатогенов (Nielsen, Sorensen, 1997; Широков и др., 2002; Harsh et al., 2004; Мелентьев, 2007; Чеботарь, 2007; Halalisani Gumede, 2008; Saharan, Nehra, 2011). На природном явлении антагонизма микроорганизмов по отношению к фитопатогенам основан микробиологический способ защиты растений от болезней, который является одним из самых перспективных в связи с эго эффективностью и экологичностью. На протяжении последних двадцати лет рядом исследователей (Filippi, 1987; Kim et al., 1997; Кузьмина, 1998; Новикова, 2004; Мелентьев, 2007; Gacitúa et al., 2009; Patent US № 8025875, 2009) проводится работа по поиску бациллярных штаммов для создания эффективных биопрепаратов и средств защиты растений. Такие препараты перспективны, так как штаммы, входящие в их состав, продуцируют БАВ, гормоны и витамины, а также обладают пластичным метаболизмом и смешанной жизненной стратегией, сочетающей элементы r-, L- и K- стратегов (Новикова, 2005). Это позволяет им приспосабливаться к различным почвенным условиям, в том числе влажности (Backman et al., 1997; Мелентьев, 2000). Бациллярные биопрепараты совместимы с протравителями семян, гербицидами и инсектицидами (Кузьмина, 1998; Захарова, 2006; Фомина, 2009). У них выше срок хранения, благодаря наличию эндоспор, позволяющих сохранить культуру в жизнеспособном состоянии длительное время (Алехин, Злотников, 2006; Lolloo et al., 2010), что является важным условием при использовании их в интегрированной защите растений.
Современный ассортимент биопрепаратов позволяет осуществлять защиту сельскохозяйственных культур от наиболее опасных заболеваний. Однако их эффективность зависит от множества факторов, например: конкурентоспособности штаммов, входящих в состав биопрепарата по отношению к аборигенным микроорганизмам и возбудителям заболеваний растений, почвенно-климатических и других региональных условий (Захарова, 2006; Хайруллин и др., 2010). Биопрепаратов и микробиологических средств защиты, максимально адаптированных к условиям аридной зоны России в настоящее время не разработано. Таким образом, поиск среди представителей рода Bacillus штаммов, выделенных из агроэкосистем аридной зоны, и обладающих биоконтрольными свойствами является весьма актуальным.
Цель исследований. Исследование особенностей взаимодействия Bacillus atrophаeus В - 9918 с растениями и фитопатогенными грибами для использования штамма в агротехнологиях.
Задачи исследований:
1. Выделить представителей рода Bacillus из агроэкосистемы и изучить их морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства. 2. Исследовать взаимодействие выделенных штаммов с растениями и фитопатогенными грибами.
3. Идентифицировать штамм с наибольшей фунгицидной и фитостимулирующей активностью и определить его способность к колонизации растений.
4. Изучить влияние штамма на рост томатов в вегетационных условиях.
5. Изучить влияние штамма на рост и устойчивость растений к заболеваниям в полевых опытах на томатах и арбузах.
Научная новизна работы. Из агроэкосистемы аридной зоны выделено 16 бациллярных штаммов и изучено их взаимодействие с микромицетами. Впервые установлено, что штамм Bacillus atrophaeus В - 9918 обладает фунгицидной активностью к широкому спектру фитопатогенов, фитостимулирующей активностью и способностью к эффективной колонизации ризосферы и ризопланы растений (на примере томата).
Показана зависимость фунгицидной и фитостимулирующей активности штамма Bacillus atrophaeus B-9918 от фазы роста культуры. Впервые показана перспективность применения суспензии штамма Bacillus atrophaeus B-9918 как средства защиты сельскохозяйственных растений на примере томатов и арбузов.
Практическая значимость. Штамм Bacillus atrophaeus B-9918 предложен в качестве средства для стимуляции роста сельскохозяйственных растений и защиты их от болезней. Полученная лабораторная партия средства апробирована в вегетационных и полевых опытах. Разработана технология применения средства, включающая бактеризацию семян, инокуляцию под корень и опрыскивание.
Штамм B. atrophaeus помещен в ВКПМ под номером B-9918. Подана заявка на изобретение "Штамм Bacillus atrophaeus B-9918 в качестве средства для стимуляции роста и защиты растений от грибных болезней" (заявка № 2010111829 (заявл. 26.03.2010)). Результаты исследований являлись частью научной работы по госконтракту: "Разработка микробного препарата для борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных культур Астраханской области" в 2010 - 2011 гг. Материалы диссертации использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами специальности "Микробиология", бакалаврами направления "Биология" и магистрами магистерской программы "Микробиология и вирусология" института рыбного хозяйства, биологии и природопользования АГТУ.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Из агроэкосистемы выделен и идентифицирован штамм Bacillus atrophaeus, обладающий фунгицидными, фитостимулирующими свойствами и способностью к колонизации растений.
2. Штамм Bacillus atrophaeus B-9918 подавляет рост F. culmorum, F. graminearum, F. poae, F. sporotrichoides, Aspergillus niger, Alternaria tenuissima, Cladosporium sp., Mycelia sterilia, Phytium ultium, и вызывает аутолиз мицелия у Alternaria sp.
3. Фитостимулирующие свойства и способность к колонизации растений подтверждены в лабораторных экспериментах, вегетационных и полевых опытах активизацией ростовых процессов растений.
4. Показана, что фунгицидная и фитостимулирующая активность штамма Bacillus atrophaeus B-9918 зависит от фазы роста культуры. Максимум антифунгальной и стимулирующей рост и развитие растений активности приходится на экспоненциальную фазу роста.
5. Выявлена оптимальная концентрация клеток B. atrophaeus В-9918 в суспензии (107КОЕ/мл), при обработке которой наблюдается наибольший эффект стимуляции роста и развития арбузов в полевых и томатов в полевых и вегетационных опытах, а также снижение развития фузариоза и альтернариоза. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы и результаты исследований докладывались на: научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения К.В. Горбунова "Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем" (Астрахань, 2008); 13-й, 14-й Пущинских международных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2009, 2010); Всероссийской научной конференции с международным участием "Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах" (Москва, 2009); Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых "Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы" (Белгород, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием "Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов" (Москва, 2009); Первых Международных Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Актуальные проблемы современной науки и образования" (Уфа, 2010); Международной научной конференции: "Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности "АСТИНТЕХ - 2010" (Астрахань, 2010); Международной отраслевой научной конференции профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященной 80-летию основания АГТУ (Астрахань, 2010); Международной конференции молодых ученых: "Биология: от молекулы до биосферы" (Харьков, Украина, 2010), на Международной конференции с элементами научной школы для молодежи: "Экокультура и фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на Каспии" (Астрахань, 2010). Работа выполнена в лаборатории микробиологического мониторинга Астраханского государственного технического университета в соответствии с плановой темой НИР: "Скрининг микроорганизмов с полезными свойствами для использования в экологической и сельскохозяйственной биотехнологии" (№ гос. регистрации 01201051559, научный руководитель зав. лаб., д.б.н., проф. Дзержинская И.С.). Работа поддержана госконтрактом с министерством сельского хозяйства Астраханской области на выполнение научно-исследовательских и фундаментально-прикладных работ в 2010 - 2011 гг.: "Разработка микробного препарата для борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных культур Астраханской области" (№ гос. регистрации 01.2.009.00158, научный руководитель зав. лаб., д.б.н., проф. Дзержинская И.С.).
Личный вклад соискателя. Представленные экспериментальные результаты получены лично автором. Определение концентрации цитокининов и ауксинов в культуральной жидкости определялось в Институте биологии Уфимского научного центра РАН совместно с к.б.н. Веселовым Д.С., нитрогеназную активность штамма B. atrophaeus B-9918 исследовали совместно с сотрудниками ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке всех задач исследования, подготовке и проведении экспериментов, вегетационных опытов и полевых исследований, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах ВАК. Подана заявка № 2010111829 (заявл. 26.03.2010) на выдачу патента РФ "Штамм Bacillus atrophaeus B-9918 в качестве средства для стимуляции роста и защиты растений от грибных болезней" / Дзержинская И.С., Коряжкина М.Ф.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста, иллюстрированы 27 таблицами и 29 рисунками.
Работа выполнялась под руководством д.б.н., проф. И.С. Дзержинской которой автор выражает особую признательность и благодарность. Автор выражает глубокую благодарность к.б.н. Т.С. Фоминых за методическую помощь в постановке полевых экспериментов и ценные советы; к.б.н. В.К. Чеботарю за ценные советы и помощь в работе; д.с.-х. н. Ш.Б. Байрамбекову и к. с.-х. н. Е.В. Поляковой за методическую помощь в постановке полевых экспериментов; всему коллективу кафедры "Прикладная биология и микробиология" АГТУ за помощь и поддержку в процессе работы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава посвящена описанию особенностей взаимодействия бацилл с растениями и фитопатогенами. Рассмотрены механизмы защитного и стимулирующего воздействия бацилл на растения. Выявлена перспективность бацилл для создания эффективных биопрепаратов и средств защиты растений.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В работе использовались микроорганизмы рода Bacillus, выделенные из агроэкосистемы Ахтубинского района Астраханской области; штамм B. subtilis Ч13, фитопатогенные микромицеты Fusarium culmorum, F. graminearum, F.poae, F. sporotrichoides, Phytium ultium, Alternaria tenuissima предоставленные лабораторией технологий микробных препаратов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН и микромицеты Aspergillus niger, Alternaria sp., Cladosporium sp., Mycelia sterilia из коллекции кафедры "Прикладная биология и микробиология" АГТУ, семена кресс-салата "Весенний", растения томата сортов "Победитель", "Новичок" и "Рио-Гранде Оригинал", растения арбуза сорта "Васко".
Пробы почвы и воды для выделения микроорганизмов отбирались непосредственно в агроценозе (станция №1) и во фрагментах естественных агроэкосистем (водоеме - станция №2 и дубовом лесу - станция №3), входящих в состав агроэкосистемы. Пробы почвы и воды из исследуемой агроэкосистемы отбирались общепринятыми методами (Родина, 1965; Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005) в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51592-2000, ГОСТ 17.4.3.01-83; ГОСТ 28168-89. Отбор образцов растительного материала для фитопатологических анализов осуществлялся в соответствии с практикумами по фитопатологии (Попкова, 1988; Головин и др., 2002). Отбор проб для агрохимических анализов проводили классическими методами в соответствии с практикумами по агрохимии (Минеев, 1989; Практикум по агрохимии, 2001) и учебным пособием "Основы научных исследований в агрономии" (Моисейченко, 1996). Микробиологические методы исследования включали: выделение и учет численности сапротрофных споровых и бесспоровых форм микроорганизмов (Родина, 1965; Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005; Зимоглядова др., 2007), исследование морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств микроорганизмов (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983; 1995; Избранные задачи большого практикума по микробиологии, 1991; Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005), определение фунгицидной активности штаммов (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983), определение фитотоксичности и фитостимулирующей активности микроорганизмов (Методы экспериментальной микологии, 1982; Берестецкий, 1982; Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991; Ганнибал, 2007). Предварительную идентификацию микроорганизмов проводили по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам, используя монографию Скворцовой И.Н. "Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus" (1983), а также определители бактерий Берги (1980; 1997). Видовую идентификацию штамма B. atrophaeus В-9918 проводили путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК в ФГУП "ГосНИИГенетика". Для определения способности штаммов к колонизации томатов в лабораторных условиях использовали гнотобиотическую установку (Simons et al., 1996) и методику стерилизации семян разработанную Н.В. Мальфамновой (Мальфамнова, 2008). Определение концентрации цитокининов и ауксинов в культуральной жидкости определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (Veselov et al., 1992).
Биотехнологические методы исследования включали: получение маточной культуры и суспензии штамма B. atrophaeus В - 9918, а также определение кинетики роста микроорганизмов (Промышленная микробиология, 1989; Практикум по микробиологии, 2005).
Агрохимические анализы почв проводили по общепринятым методам: pH солевой вытяжки (ГОСТ 26483-85); влажность почвы, количество легкогидролизуемого азота, фосфора и калия (Практикум по агрохимии, 1989; Практикум по агрохимии, 2001). Постановку и проведение вегетационных и полевых опытов, фенологических наблюдений, снятие биометрических показателей, учет урожая вели в соответствии с практикумами по агрохимии (Ягодин, 1987; Практикум по агрохимии, 1989) и учебным пособием "Основы научных исследований в агрономии" (Моисейченко, 1996).
В работе также были использованы методы фитопатологии: определение видового состава комплекса плесневых грибов (Пидопличко, 1977; Саттон, 2001), развитие альтернариоза (Котова, 1986), развитие фузариоза (Попкова, 1988; Головин и др., 2002).
В вегетационных опытах проводили исследование влияния на томаты сорта "Победитель" бактеризации семян суспензией штамма B. atrophaeus В -9918 с титром клеток 109 КОЕ/мл, а также однократной и двукратной инокуляции под корень суспензией штамма с титром от 107 до 109 КОЕ/мл. Полевые испытания были проведены в Астраханской области в Енотаевском районе (2009 г) на гибриде арбуза первого поколения "Васко" и в Харабалинском районе (2010 г) на томате "Рио-Гранде Оригинал". Для бактеризации семян использовался рабочий раствор с концентрацией клеток штамма B. atrophaeus В -9918 - 107 КОЕ/мл. В опытах проводили фенологические наблюдения, снятие биометрических показателей, определение степени поражения растений заболеваниями. Анализ достоверности данных вели стандартными биометрическими методами (Доспехов, 1985; Ягодин, 1987; Практикум по агрохимии,1989; Платонов, 2000) с использованием пакета статистической обработки данных Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование взаимодействия представителей рода Bacillus с растениями и фитопатогенными грибами
Изучение представителей рода Bacillus, выделенных из агроценоза и фрагментов естественных агроэкосистем. Учет численности и оценка микробного разнообразия в сапротрофных сообществах проводились с целью исследования аэробных споровых форм. Исследования показали, что среди этой группы были выделены бактерии, актиномицеты и микромицеты (таблица 1). Численность аэробных спорообразующих бактерий в агроценозе составляет 8% , в почве дубового леса - 64%, в эвтрофированном водоеме - 21% от общей численности споровых форм. Таблица 1. Численность некоторых групп микроорганизмов в сапротрофном сообществе агроэкосистемы
Место отбора пробЧисленность сапротрофов, lg xОбщая численностьСпоровые формыАэробные спорообразующие бактерииАктиномицето - подобные формыПлесневые грибы Агроценоз
(1 станция)9,274±9,267,130±4,815,728±5,676,653±5,706,301±6,00Дубовый лес
(2 станция)9,021± 8,986,875± 6,406,602±6,006,097±5,886,006±5,99Эвтрофный водоем (3станция)5,170±4,904,398±3,703,732±3,664,176±3,703,732±3,66 Аэробные спорообразующие бактерии выделяли чашечным методом с использованием питательных сред, селективным агентом в которых являлись соединения фосфора. Среди выросших колоний были отобраны бактерии с типичными для микроорганизмов рода Bacillus признаками: палочковидной формой клеток, грамположительные, спорообразующие, имеющие фермент каталазу. Всего было выделено 16 аэробных спорообразующих бактерий и получены их чистые культуры.
Исследование морфологических свойств чистых культур показало, что все исследуемые штаммы - грамположительные прямые палочки размером 1,5-6,3×0,6-2,5 мкм, с овальными или круглыми эндоспорами. Изучение культуральных и физиолого-биохимические свойства штаммов подтвердило, что все они являются представителями рода Bacillus.
По совокупности изученных свойств, штамм № 4 можно отнести к B. megaterium, штаммы № 6,8,11,13 и 15 к B. cereus, штамм №14 - к B. macerans. Штаммы № 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 16 не имеют совокупности физиолого-биохимических свойств, характерных для видов, описанных в определителях Скворцовой (1983) и Берги (1980; 1997). Исследование взаимодействия выделенных штаммов с фитопатогенными грибами
Среди полученных 16 чистых фосформобилизующих штаммов бацилл был проведен первичный скрининг по фунгицидной активности. В качестве тест-культур использовались фитопатогенные микромицеты F. culmorum и F. graminearum. Таблица 2. Фунгицидная активность исследуемых чистых культур бацилл
№ чистой культурыДиаметр зоны ингибирования, ммFusarium graminearumFusarium culmorumAspergillus nigerAlternaria sp.Cladosporium
sp.Mycelia sterilia Bacillus sp.119,5±1,0***0---- Bacillus sp.2021,5±1,1***---- Bacillus sp.318,5±0,9***21,5±1,1***17,0±2,7***24,0±0,1**28,5±1,4***22,0±0,1*** Bacillus sp.400---- Bacillus sp.5020,0±1,0*---- Bacillus sp.620,0±1,0***21,5±1,1***17,0±2,7***30,0±4,1**23,0±0,1***27,0±5,5*** Bacillus sp.711,0±0,6***17,0±0,9**---- Bacillus sp.815,0±0,8***0---- Bacillus sp.916,5±0,8***0---- Bacillus sp. 1022,5±1,1***25,0±1,3***15,5±1,4**26,0±2,7**29,5±4,1**22,0±4,1*** Bacillus sp. 1100---- Bacillus sp.12020,0±1,0**---- Bacillus sp. 1313,5±0,7*20,0±1,0***---- Bacillus sp. 1416,0±0,8*19,5±1,0*---- Bacillus sp.1522,0±1,1***21,0±1,1***15,5±1,4**22,0±0,1*19,5±6,9**17,5±0,1*** Bacillus sp.1618,5±0,9***0---- Примечание: жирным шрифтом обозначены штаммы с высокой фунгицидной активностью одновременно к F. culmorum и F. graminearum; * - усиленное спороношение, ** - аутолиз мицелия, *** - полное подавление роста, "-" - свойство не исследовалось.
Анализ данных представленных в таблице 2 показал, что фунгицидной активностью по отношению к F. graminearum обладают 11, к F. culmorum - 10 из 16 исследуемых штаммов, 2 штамма (№ 4 и 11) не проявляли фунгицидной активности ни к одной из тест-культур. Штаммы № 3,6,7,10,13,14,15 ингибировали рост одновременно двух тест-объектов. Исследуемые антагонисты отличались по характеру воздействия на мицелиальные грибы, которое проявлялось в аутолизе мицелия (№7), усиленном спороношении (№13,14), полном подавлении прорастания конидий (№ 3,6,10,15). У штаммов № 3,6, 10 и 15 также были обнаружены наибольшие зоны ингибирования роста фитопатогенов (18,5-25 мм). Таким образом, для вторичного скрининга отобраны штаммы № 3,6,10,15. Данные штаммы исследовались на наличие фунгицидной активности по отношению к Aspergillus niger, Alternaria sp., Mycelia sterilia и Cladosporium sp. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Установлено, что аутолиз мицелия Aspergillus niger и Cladosporium sp. вызывают штаммы № 10 и 15, полностью подавляют рост данных микромицетов штаммы № 3 и 6. К усиленному спороношению Alternaria sp. приводят штаммы 3,6, 10, штамм № 15 вызывает аутолиз его мицелия. Все исследуемые штаммы подавляют рост Mycelia sterilia. Проведенное исследование подтверждает мнение А.И. Мелентьева (2007) о том, что действие бацилл может быть избирательным и специфически проявляется по отношению к определенным видам грибов. По нашим данным (таблица 2) наиболее устойчивой к воздействию исследуемых бацилл является Alternaria sp., наиболее чувствительной - Mycelia sterilia.
Вторичный скрининг показал, что штаммы № 3 и 6 обладают наибольшими зонами ингибирования микромицетов и полностью подавляют их рост. Для исследования взаимодействия этих штаммов с растениями кроме них для сравнения использовали штаммы № 10 и 15.
Изучение взаимодействия выделенных штаммов с растениями
Взаимодействие выделенных штаммов с растениями изучали на основании проявлениями ими фитотоксичности и фитостимулирующей активности в эксперименте на прорастание семян кресс-салата "Весенний". Семена замачивали в суспензии штаммов с титром клеток 109-1010КОЕ/мл. Токсичными считали культуры, вызывающие снижение всхожести семян или угнетение роста проростков и корней более чем на 30% по сравнению с контролем (Методы экспериментальной микологии, 1982). Количество проросших семян, а также длина корня и побега в контроле были приняты за 100 %. Результаты эксперимента приведены в таблице 3.
Таблица 3. Фитотоксичность и фитостимулирующая активность исследуемых штаммов.
№ чистой культурыВсхожесть семян, в %Количество проросших семянДлина проростков кресс- салатав абс.
величинах, шт.в % к контролюв абс. величинах, ммв % к контролюкореньпобегкореньпобегконтроль8241±2,110044,4±4,523,5±1,0100100Bacillus sp. 39648±2,411747,8±3,626,1±0,9107,7111,1Bacillus sp. 68844±2,210741,9±3,926,0±0,994,4110,6Bacillus sp. 108643±2,210455,0±4,824,0±1,1123,9102,1Bacillus sp. 159648±2,411726,6±2,920,8±1,059,988,5 Анализ ростовых показателей и всхожести семян выявил, что штамм № 15 фитотоксичен, штаммы № 3, 6, и 10 являются не токсичными для растений и стимулируют их рост. Наибольшее положительное воздействие на всхожесть и ростовые процессы растения оказывает штамм № 3 (таблица 3).
По совокупности выявленных фунгицидных и фитостимулирующих свойств штамм №3 может быть использован в агроэкологии как средство защиты растений от грибных заболеваний и стимуляции их роста. Идентификация штамма Bacillus sp. 3 путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК позволила отнести его к Bacillus atrophaeus. Штамм депонирован ВКПМ под коллекционным номером В - 9918.
Изучение взаимодействия Bacillus atropheus В - 9918 с растениями и фитопатогенными грибами
Установлено, что B. atrophaeus B-9918 (Bacillus sp. 3) проявляет фунгицидную активность по отношению к следующим микромицетам: F. сulmorum, F. graminearum, Aspergillus niger, Alternaria sp., Cladosporium sp. и Mycelia steriliа. Фунгицидные свойства штамма проявлялись в полном подавлении прорастания F. culmorum, F. graminearum, Aspergillus niger, Cladosporium sp, и в аутолизе мицелия Alternaria sр. Для исследования более широкого спектра фунгицидных свойств штамма B. atropheus B-9918 использовались тест-культуры: F. poaе, F. sporotrichoides, Phytium ultium, Alternaria tenuissima. Исследования показали, что штамм B. atrophaeus B-9918 обладает выраженной фунгицидной активностью по отношению к исследуемым тест-объектам и подавляет прорастание конидий, что связано, по видимому, с высокой концентрацией антибиотических веществ, выделяемых антагонистом в среду. На рисунке 1 представлен полный спектр фунгицидного действия B. atrophaeus B-9918 и характер его воздействия на все исследуемые фитопатогенные грибы.
Рисунок 1 - Фунгицидная активность Bacillus atrophaeus B-9918
Штамм B. atrophaeus B-9918 оказывает фунгицидное воздействие на следующие фитопатогенные грибы: F. сulmorum, F. graminearum, F. poaе, F. sporotrichoides, Aspergillus niger, Alternaria tenuissima, Alternaria sp., Cladosporium sp., Mycelia sterilia, Phytium ultium. У всех исследуемых тест-объектов, кроме Alternaria sp., B. atrophaeus B-9918 вызывает полное подавление роста (рисунок 1). У Alternaria sp. штамм вызывает аутолиз мицелия.
Исследование способности штамма B. atrophaeus В -9918 к эффективной колонизации томатов в лабораторных условиях. Микроорганизмы проявляют комплекс положительных эффектов на рост и развитие растений, в том числе фитостимуляцию, только при успешной колонизации корней и способности поддерживать свою численность в ризосфере (Benizeri et al., 2001). Положительный эффект на рост и развитие растений достигается при поддержании в ризоплане минимальной концентрации бактериальных клеток > 104 КОЕ/см2 корня (Соколов, 1990). Ранее показана фитостимулирующая активность штамма, что вызывает необходимость подтверждения этого эффекта исследованием способности штамма к колонизации и поддержанию численности в ризосфере растения. Способность штамма B. atrophaeus В -9918 к эффективной колонизации ризосферы и ризопланы растений исследовали на томатах сорта "Новичок". В качестве эталона использовался штамм B. subtilis Ч13, обладающий фунгицидной активностью, рост-стимулирующими свойствами и являющийся активным колонизатором ризосферы и ризопланы растений (Кравченко и др., 2002; Чеботарь 2007).
Для получения проростков томата использовали методы поверхностной стерилизации семян и гнотобиотическую установку, разработанную Симонсом с коллегами (Simons et al., 1996). Поверхностно стерилизованные семена томата обрабатывали суспензией штаммов B. atrophaeus В -9918 и B. subtilis Ч13 с титром клеток 107 и 106 КОЕ/мл в течение 1 ч при комнатной температуре. Семена помещали в стерильный кварцевый песок, предварительно смоченный питательным раствором для растений, на глубину 1,0 см и проращивали в течение 14 - 35 суток при температуре 200C в люминостате. Затем определяли количество микроорганизмов в ризосферной почве и численность микроорганизмов ризопланы. Результаты исследования представлены на рисунке 2.
Численность В. atrophaeus В -9918 в ризосфере томата на 14 сутки при обработке семян суспензией с титром 106 КОЕ/мл составляла 5×108 КОЕ/г. При обработке семян суспензией с титром 107КОЕ/мл - 3×108 КОЕ/г. Численность B. subtilis Ч-13 в ризосфере при обработке семян суспензией штамма с титром 107 КОЕ/мл была несколько выше (5×109 КОЕ/г) (рисунок 2).
а) б)
Примечание - а) В. atrophaeus В -9918 с титром 106 КОЕ/ мл; б) В. atrophaeus В -9918 с титром 107 КОЕ/ мл; в) B. subtilis Ч13 с титром 106 КОЕ/ мл; г) B. subtilis Ч13 с титром 107 КОЕ/ мл
Рисунок 2 - Динамика численности исследуемого штамма в а) ризосфере и б) ризоплане томата в гнотобиотических системах.
На 20 сутки в ризосферной почве растений, бактеризованных суспензией B. atrophaeus B-9918 с титром 106 КОЕ/мл, численность клеток штамма осталась на прежнем уровне (5×108 КОЕ/г). В ризосфере растений, бактеризованных суспензией штамма с титром 107 КОЕ/мл, численность клеток B. atrophaeus B-9918 на 20 сутки увеличилась до 1010 КОЕ/г. Численность эталонного штамма в ризосфере томатов, бактеризованных суспензией с титром 106 КОЕ/мл, увеличилась до 1011 КОЕ/г, а в ризосфере растений, бактеризованных суспензией с титром 107 КОЕ/мл, составила 1010 КОЕ/г. На 35 сутки после бактеризации численность всех штаммов интродуцентов в ризосфере томата снижается до 108 КОЕ/г. Следовательно, B. atrophaeus B-9918 стабильно присутствует в ризосферной почве исследуемых томатов в течение эксперимента. В наших экспериментах установлено, что штамм B. atrophaeus В -9918 заселяет не только ризосферу растения, но и поверхность корня (ризоплану) (рисунок 2). В ризоплане в течение всего эксперимента численность клеток штаммов B. atrophaeus B-9918 и B. subtilis Ч-13 колебалась незначительно в приделах 104-105 КОЕ/см2 корня (рисунок 2).
Таким образом, еще раз подтверждена колонизирующая способность эталонного штамма B. subtilis Ч-13 и показано, что численность B. atrophaeus B-9918 на протяжении всего эксперимента была не ниже 104 КОЕ/см2 корня, что необходимо для проявления положительных эффектов на рост и развитие растений.
Изучение взаимодействия Bacillus atrophaeus В - 9918 с растениями и фитопатогенными грибами в условиях вегетационных и полевых опытов
Фунгицидная и фитостимулирующая активность штамма в различные фазы культивирования. Для исследования фунгицидной и фитостимулирующей активности B. atrophaeus В -9918 в процессе культивирования использовали оптимальные для роста штамма жидкие среды: бобовый отвар и среду ВКМ-1. Штамм культивировали при температуре 280С и непрерывном перемешивании на качалке (120 об/мин). В качестве тест-объекта использовался микромицет F. graminearum. Фунгицидная активность суспензии штамма определялась каждые 24 часа в течение 10 суток с помощью модификации метода диффузии в агар с использованием лунок на среде Чапека с титром F. graminearum - 106 спор/мл (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983; ГОСТ 9.048-89). Полученные результаты представлены на рисунке 3 (а, б).
а) б)
в)
Рисунок 3. Фунгицидная и фитостимулирующая активность B. atrophaeus В -9918 в динамике: а) фунгицидная активность на бобовом отваре; б) фунгицидная активность на жидкой среде ВКМ-1; в) фитостимулирующая активность на бобовом отваре.
Установлено, что пики фунгицидной активности B. atrophaeus B-9918 при его культивировании на бобовом отваре приходятся на экспоненциальную фазу роста с титром клеток 5*109 КОЕ/мл (48ч культивирования) и на фазу отмирания с титром клеток 1012 КОЕ/мл (216 ч культивирования). Наличие двух максимумов фунгицидной активности при культивировании B. atrophaeus В-9918 на бобовом отваре, по-видимому, связано с выделением первичных метаболитов в экспоненциальной фазе роста, а также вторичных метаболитов (антибиотики) в фазе отмирания. Полученные данные соответствуют мнению Г.Э. Актуганова с соавторами (Актуганов и др., 2003) о комплексном механизме подавления роста грибов штаммами рода Bacillus, заключающемся во взаимодействии гидролитических ферментов с антибиотическими веществами.
При культивировании штамма на жидкой питательной среде ВКМ-1 пик фунгицидной активности приходится на экспоненциальную фазу роста (72 ч) с титром клеток в суспензии - 1010 КОЕ/мл (рисунок 3 (б)). Установлено, что максимум фунгицидной активности штамма при культивировании на бобовом отваре приходится на 48 ч культивирования, а на ВКМ-1 на 72 часа культивирования. При культивировании штамма на среде ВКМ-1 физиологическое действие штамма заключается как в полном подавлении роста фитопатогена (48-148 ч), так и в аутолизе мицелия (24 ч, 192-216ч) и усилении спороношения микромицета (240 ч). При культивировании B. atrophaeus В-9918 на бобовом отваре фитопатоген чувствительнее к суспензии штамма, что проявляется в полном подавлении роста микромицета, а также в большем, чем на среде ВКМ-1 диаметре стерильных зон. Таким образом, бобовый отвар по сравнению со средой ВКМ-1 является средой наиболее оптимальной для культивирования B. atrophaeus B-9918 и проявления им фунгицидных свойств. Поэтому для исследования фитотоксичности и фитостимулирующих свойств, проявляемых в процессе культивирования штамма, использовался бобовый отвар.
Фитотоксичность и фитостимулирующую активность штамма определяли каждые 24 часа с помощью бактеризации семян кресс-салата "Весенний". Зависимость длины проростков кресс-салата от фазы роста штамма B.atrophaeus В-9918 представлена на рисунке 3 (в). Исследования показали, что максимумы стимуляции роста проростков приходятся на 48 и 216 часов культивирования при титре клеток 109 и 1012 КОЕ/мл соответственно (рис. 3 (в)).
Таким образом, суспензию штамма B. atrophaeus B-9918 с активными антифунгальными свойствами и фитостимулирующей активностью можно получить через 48 часов культивирования на бобовом отваре, при этом титр клеток составляет 109 КОЕ/мл. Вегетационные опыты с томатами сорта "Победитель". Изучение влияния на рост томатов бактеризации семян и однократной и двукратной корневой инокуляции растений суспензией штамма B. atrophaeus B-9918 проводилось в вегетационных опытах на томатах сорта "Победитель". В опыте по бактеризации семян использовалась суспензия штамма в экспоненциальной фазе роста с титром клеток 109 КОЕ/мл. В эксперименте по изучению влияния однократной и двукратной инокуляции использовался интервал значений титра клеток от 107 до 109 КОЕ/мл. Полученные данные представлены в таблице 4.
При бактеризации семян суспензией штамма B. atrophaeus B-9918 с титром клеток 109КОЕ/мл высота растения и длина корня соответствуют данным контроля (таблица 4). Биомасса растений в опыте была ниже, чем контроле. Таблица 4. Влияние бактеризации и корневой инокуляции суспензией штамма Bacillus atrophaeus В-9918 на ростовые показатели томата.
Титр клеток в суспензии, КОЕ/г (количество обработок)возраст растений (сут.)средняя высота растений, ммсредняя длина корня, ммбиомасса растений, гКонтроль-1567,6±15,461,3±1,31,2±0,21 25132,8±16,640183,3±30,3Бактеризация1091559,2±5,346,5±1,50,65±0,07 *25102,1±7,240132,0±3,1Корневая инокуляция107 (однократно)15128,4±9,5*41,5±9,81,94±0,1 (61%) 25184,0±2440214,2±5,8107 (двукратно)15113,1±1,9*60,0±10,01,60±0,10 (33%)*25167,5±18,040240,0±5,8*
5*107 (однократно)1572,8±9,044,2±7,51,27±0,2525106,1±13,640133,1±19,2
5*107 (двукратно)1598,3±6,8*43,3±1,70,65±0,08
(-46%)*25124,8±8,940150,3±18,1108 (однократно)1590,2±4,1*48,5±1,01,14±0,4125114,0±7,740155,8±15,9108 (двукратно)1589,2±8,8*37,5±7,50,73±0,04
(-39%)*25123,6±13,040158,7±2,85*108 (однократно)1575,3±16,862,5±17,51,27±0,4125119,3±29,340190,3±39,45*108 (двукратно)1567,9±4,543,9±7,60,64±0,15 (-47%)*25106,1±16,640150,3±18,1109 (однократно)1582,8±11,250,0±10,00,96±0,125128,6±18,640155,5±29,3109 (двукратно)1565,5±12,440,0±1,10,60±0,1 (-45%)25104,0±15,040135,7±20,1 Примечание: * различия с контролем существенны при p=0,95, в скобках указан % стимуляции или ингибирования роста по отношению к контролю
Анализ данных эксперимента (40 суток) показал, что инокуляция под корень суспензии штамма B. atrophaeus B-9918 может не оказывать влияния, ингибировать или стимулировать рост томатов в зависимости от титра клеток и от варианта обработки. Суспензия с титром >107 КОЕ/мл при однократной инокуляции не оказывает влияния на ростовые процессы томатов, при двукратной инокуляции ингибирует прирост биомассы. Угнетение роста томатов, возможно, связано с высокой концентрацией метаболитов в суспензии, что согласуется с мнением А.И. Мелентьева (Мелентьев, 2007), о том, что микроорганизмы рода Bacillus при высоких концентрациях подавляют рост растений, а при низких - активируют защитные реакции организма, и тем самым стимулируют их рост. Последнее наблюдается при однократной и двукратной инокуляции суспензией клеток с титром 107 КОЕ/мл. При этом прирост биомассы составляет 61% и 33 % соответственно.
Таким образом, наиболее выраженное положительное влияние на томаты оказывают однократная и двукратная инокуляция суспензией штамма с титром 107 КОЕ/мл под корень растения.
Полевые опыты. Изучение влияния штамма B. atrophaeus B-9918 на рост и устойчивость арбузов к фузариозу проводилось в открытом грунте на гибриде арбуза первого поколения "Васко". Для инокуляции семян использовался рабочий раствор с концентрацией клеток штамма B. atrophaeus B-9918 - 107 КОЕ/мл. В полевом опыте определяли нарастание биомассы, количество настоящих листьев, симптомы фузариоза и влияние интродукции штамма на аборигенную микрофлору ризосферы арбуза. Установлено, что бактеризация семян суспензией B.atrophaeus B-9918 не оказывает негативного влияния на аборигенную микрофлору ризосферы арбуза. В контроле количество растений с симптомами фузариоза составляет 9%, у растений, обработанных суспензией штамма, симптомы фузариоза отсутствуют. При этом прирост биомассы по сравнению с контролем составляет 79%. Изучение влияния штамма B. atrophaeus B-9918 на рост и устойчивость томатов к альтернариозу проводили на томате "Рио-Гранде Оригинал". В опыте использовался рабочий раствор с концентрацией клеток B. atrophaeus B-9918 - 107 КОЕ/мл. Схема опыта включала следующие варианты: 1) контроль; 2) бактеризация семян; 3) бактеризация семян + 2-х кратный пролив растений под корень; 4) бактеризация семян + 2-х кратное опрыскивание. Установлено, что бактеризация семян штаммом B. atrophaeus B-9918 с титром клеток 107 КОЕ/мл не оказывает ингибирующего воздействия на основные ростовые показатели томатов в фазу 1-4 настоящего листа и фазу цветения, при этом наблюдается более раннее образование первой цветочной кисти. Исследование ростовых показателей томатов в фазу цветения при обработке рабочим раствором показало, что высота растений, общая длина побегов и площадь листовой поверхности зависят от вариантов опыта. Наиболее эффективным вариантом является бактеризация + опрыскивание, при котором высота растений превышает контрольную на 33%, площадь листовой поверхности - на 72%.
Исследования биометрии томатов в фазу плодообразования показало, что все варианты обработки растений рабочим раствором оказывают стимулирующее воздействие на высоту растений (12-22%) и количество плодов (121-182%). В варианте бактеризация + опрыскивание кроме того наблюдается увеличение площади листовой поверхности на 54,8%. Анализ развития альтернариоза в фазу плодообразования показал, что альтернариоз отмечен как в контроле, так и во всех вариантах опыта. Сопоставимые результаты получены в контроле и в варианте бактеризация + пролив. Биологическая эффективность суспензии штамма B. atrophaeus B-9918 против альтернариоза отмечена в вариантах бактеризация (8,1%) и бактеризация + опрыскивание (34,6%).
По совокупности положительных эффектов можно отметить вариант бактеризация + опрыскивание, при котором наблюдается стимуляция роста томатов, на фоне которой фунгицидные свойства штамма B. atrophaeus B-9918 способствуют снижению развития альтернариоза. Таким образом, суспензию штамма B. atrophaeus B-9918 с титром 107КОЕ/мл можно рекомендовать для разработки средства для стимуляции роста и защиты растений от грибных болезней.
ВЫВОДЫ
1. Из агроэкосистемы аридной зоны выделено 16 штаммов аэробных спорообразующих бактерий, которые по морфологическим, культуральным и физиолого-биохимическим свойствам отнесены к роду Bacillus.
2. В результате скрининга по фунгицидной активности отобрано 14 штаммов, действие которых по отношению к исследуемым микромицетам является избирательным и специфичным. Наибольшей антифунгальной активностью обладают 4 штамма, из них один - фитотоксичен, три - способны к фитостимуляции. 3. Штамм, обладающий наиболее выраженной фунгицидной активностью к представителям рода Fusarium и Alternaria, фитостимулирующей активностью и способностью к колонизации растений идентифицирован как Bacillus atrophaeus. Штамм B. atrophaeus В-9918 способен поддерживать численность в ризосфере томата в приделах 2*107-1010 КОЕ/ г а.с.п.; в ризоплане - в приделах 4,8*104-4,6*105 КОЕ/ см2 корня, что достаточно для проявления положительных эффектов на рост и развитие растений.
4. Наиболее эффективной концентрацией клеток в суспензии при корневой инокуляции томатов в вегетационных экспериментах является титр 107 КОЕ/мл, стимулирующий прирост биомассы растения на 61% и 33% при однократной и двукратной инокуляции соответственно.
5. В полевых опытах на арбузах показано, что бактеризация семян суспензией штамма B. atrophaeus В-9918 с титром 107 КОЕ/мл стимулирует прирост биомассы растения на 79% и подавляет развитие фузариоза на 100%.
6. В полевых опытах на томатах во всех вариантах обработки (бактеризация семян, бактеризация + опрыскивание, бактеризация + пролив под корень) суспензией штамма B. atrophaeus В-9918 с титром 107 КОЕ/мл стимулируются ростовые процессы растения: увеличивается высота растений (12-33%), площадь листовой поверхности (38-72%). Наиболее эффективным вариантом обработки, снижающим развитие альтернариоза на 34,6%, является бактеризация + опрыскивание.
РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Коряжкина М.Ф. Исследование фунгицидной активности представителей рода Bacillus // Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем: Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения К.В. Горбунова. - Астрахань, 2008.- С. 121-124.
2. Дзержинская И.С., Коряжкина М.Ф. Исследование фунгицидной активности представителей рода Bacillus // Естественные науки. - 2009.- № 2. - С. 16-20.
3. Коряжкина М.Ф., Дзержинская И.С. Полифункциональный комплекс микроорганизмов для повышения эффективности биоремедиации прибрежных нефтезагрязненных территорий // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. - 2009. - №9. - С. 59-61.
4. Коряжкина М.Ф. Фунгицидные и фитостимулирующие свойства Bacillus atrophaeus // Биология - наука XXI века: Тезисы 13-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2009. - С. 168.
5. Дзержинская И.С., Коряжкина М.Ф. Фунгицидные свойства Bacillus atrophaeus // Бюллетень Московского Общества испытателей природы. Отдел биологический. Приложение 1 "Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах". - Москва, 2009. - Том 114. - Выпуск 2. -С. 229-231.
6. Коряжкина М.Ф. Метаболиты, участвующие в формировании фунгицидной активности Bacillus atrophaeus // Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы: тезисы Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых. - Белгород, 2009. - С. 21-23.
7. Коряжкина М.Ф., Дзержинская И.С. Bacillus atrophaeus B-9918 - перспективный штамм для разработки биопрепарата для защиты растений и стимуляции их роста // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. - М.:МАКС Пресс, 2009. - С. 55.
8. Коряжкина М.Ф. Исследование фунгицидных и фитостмулирующих свойств штамма B. atrophaeus B-9918 в лабораторных и полевых экспериментах // Биология - наука XXI века: Тезисы 14-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2010. - С. 260-261.
9. Коряжкина М.Ф. Использование культуры Bacillus atrophaeus SKD- 1 для разработки биопрепарата с фунгицидными свойствами // Первые Международные Беккеровские чтения (Волгоград, 27-29 мая 2009 года). Сборник научных трудов по материалам конференции. Часть 2. - Волгоград, 2009. - С. 123-125.
10. Коряжкина М.Ф. Исследование эффекта колонизации арбузов (CITRULLUS VULGARIS) штаммом Bacillus atrophaeus B-9918 // Актуальные проблемы современной науки и образования. Биологические науки: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Том 2.-Уфа: РИЦ БашГУ, 2010. - С. 234-239.
11. Коряжкина М.Ф. Новый микробный препарат для борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных культур и оздоровления почв сельскохозяйственного назначения // Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности "АСТИНТЕХ- 2010": Материалы. Международной научной конференции (Астрахань, 11-14 мая 2010 года). Том 3. - Астрахань, 2010. - С. 33 - 34.
12. Дзержинская И.С., Коряжкина М.Ф. Штамм Bacillus atrophaeus B-9918- перспективный объект сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии // Международная отраслевая научная конференция профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященная 80-летию основания АГТУ. - Астрахань, 2010. - С. 19-20.
13. Коряжкина М.Ф. Bacillus atrophaeus SKD - 1 как перспективный штамм для разработки биопрепарата // Юг России: экология, развитие. -2010. - № 4. - С. 80-83.
14. Коряжкина М.Ф. Изучение хозяйственно-ценных свойств штамма Bacillus atrophaeus // Материалы V Международной конференции молодых ученых (Харьков, Украина, 22-25 ноября 2010 года).- Х.: Оперативная полиграфия, 2010. - С. 224-225.
15. Коряжкина М.Ф. Изучение фунгицидных и фитостимулирующих свойств штамма Bacillus atrophaeus B-9918 в условиях лабораторного эксперимента // Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии: Материалы Международной конференции с элементами научной школы для молодежи. - Астрахань: Издательский дом "Астраханский университет", 2010. - С. 368 - 371.
2
Документ
Категория
Биологические науки
Просмотров
189
Размер файла
489 Кб
Теги
кандидатская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа