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Die dUnnschichtchromatographische Bestimmung von Acetylsalicylsure Salicylsure und Salicylursure in Plasma durch Fluoreszenzmessung.

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Spahn und Mutschler
Arch. Pharm.
Arch. Pharm. (Weinheim) 316, 364-367 (1983)
Die diinnschichtchromatographische Bestimmung von
Acetylsalicylsaure, Salicylsaure und Salicylursaure in Plasma
durch Fluoreszenzmessung
Hildegard Spahn und Ernst Mutschler*
Pharmakologisches Institut fur Natunvissenschaftler der Johann Wolfgang Goethe-Universitat in
Frankfurt am Main, Theodor-Stern-Kai 7, Gebaude 75 A, 6000 FrankfudMain 70
Eingegangen am 25. Marz 1982
Es wird ein diinnschichtchromatographisches Verfahren zur gleichzeitigen fluorimetrischen Bestimmung von Acetylsalicylsaure, Salicylsaure und Salicylursaure in Plasma beschrieben. Nach
Extraktion aus angesauertem Plasma mit einem Toluol-Essigsaureethylester-Gemisch,
Chromatographie auf Kieselgel 60-Platten mit Cyclohexan/DiisopropyletherlIsopropanol/Ameisensaureund
alkalischer Hydrolyse der Acetylsalicylsaurezu fluoreszierender Salicylsaurewerden die Plasmakonzentrationen der drei Substanzen durch direkte Fluoreszenzmessung auf der DC-Platte bestimmt .
Fluorimetric Determination of Acetylsalicylic Acid, Salicylic Acid and Salicyluric Acid by Direct
Evaluation of 'Wm-Layer Chromatogams
A thin-layer chromatographic method for the simultaneous fluorimetric determination of acetylsalicylic acid, salicylic acid and salicyluric acid is described. After extraction from acidified plasma
samples with toluenelethyl acetate, chromatographic separation on tlc plates (silica gel) with
cyclohexane/diisopropylether/isopropanol/formic acid and alkaline hydrolysis of acetylsalicylicacid
to fluorescing salicylic acid the concentrations of the three substances are determined by measuring
the fluorescence on the tlc plates.
In der klinischen Chemie werden analytische Methoden angestrebt, die bei guter Reproduzierbarkeit und Genauigkeit rasch und einfach durchfuhrbar sind. Daher wurde von uns ein neues, fur
Serienanalysen geeignetes dc Verfahren fur die Bestimmung von Acetylsalicylsaure (ASS),
Salicylsaure (SS) und Salicylursaure(SUS) in biologischem Material entwickelt, obwohl fur ASS und
SS und 2.T. auch fur SUS bereits eine Reihe von Bestimmungsmethoden beschrieben wurde
(z.B. 1-3)).
Bei dieser Methode ist eine gleichzeitige Bestimmung von ASS, SS und SUS durch
direkte Fluoreszenzmessung nach d c Trennung moglich. Die drei zu bestimmenden
Substanzen werden aus d er angesauerten Plasmaphase mit einem Toluol-Essigsaureethylester-Gemisch extrahiert. Das Extraktionsmittel wird direkt auf die DC-Platte aufgetragen, so daR ein Eindampfen von Extrakten nicht erforderlich ist und dadurch eine
Zersetzung von ASS bei der Aufarbeitung verhindert wird. Auch bei der nachfolgenden
Chromatographie auf einer Kieselgel-Platte findet keine Zersetzung von ASS zu SS statt.
Nach der Chromatographie wird die von ihren fluoreszierenden Metaboliten SS und SUS
gut abgetrennte nicht fluoreszierende ASS durch einmaliges Tauchen der DC-Platte in
wal3rig-methanolische Natronlauge in fluoreszierende SS iiberfuhrt. (Mehrmaliges
03654233/83/040&0361 $ 02.50/0
6 Verlag Chernie GmbH, Weinheim 1983
316183
DC-Bestimmung von Acetylsalicylsdure und Metaboliten
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Tauchen der Platte in Natronlauge bringt in der Regel keine weitere Fluoreszenzerhohung; es kann daher von einer raschen vollstandigen Hydrolyse der ASS ausgegangen
werden.) Die Detektion erfolgt durch densitometrische Messung der Fluoreszenzintensitat auf der Platte (Abb. 1).
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Abb. 1: Fluoreszenzintensitats-Orts-Kurvevon Plasrnaextrakten nach dc Trennung (1= ASS, 2 = S S ,
3 = SUS). a: Leerplasma, b: 60min nach oraler Applikation von 400rng ASS.
Linearitat zwischen den Plasmakonzentrationen und den Peakflachen besteht bei ASS
bis 30 @ml Plasma, bei SS bis 50~g/mlPlasma und bei SUS bis 25 pglml Plasma. Liegen
die Konzentrationen auaerhalb dieser Bereiche (z.B. bei steady-state-Untersuchungen),
muB das Plasmavol. verringert oder die Extraktionsmittelmenge erhoht werden.
Die Nachweisgrenzendes Verfahrens liegen bei 0,s ng/Fleck (50 ng/ml Plasma) fur ASS,
0,s ng/Fleck (50ng/ml Plasma) fiir SS und 0,2 @Fleck (20ng/ml Plasma) fiir SUS. Durch
Erhohung der Plasmamenge laat sich die Nachweisgrenze, falls erforderlich, noch
erniedrigen. Die Wiederfindungsraten betragen bei einmaliger Extraktion fiir ASS 92 70,
fiir SS 79% und fiir SUS 90%. Als relative Standardabweichung wurden mit
Plasmastandards (10 und 20 pg/ml) Werte von 3,2 % fiir ASS, 4,1% fur SS und 2,1% fiir
SUS ermittelt. Mit der beschriebenen Methode wurden ASS-, SS- und SUS-Spiegel bei
Probanden nach einmaliger oraler Applikation von ASS bestimmt (Abb. 2).
Das Verfahren erwies sich bei der Analyse von Plasrnaproben als gut anwendbar und
erlaubt die Bestimmung von ASS mit wesentlich niedrigerer Nachweisgrenze als bei einer
1979 von Klitgaard) beschriebenen DC-Methode und ermoglicht ferner die Bestimmung
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Spahn und Murschler
Arch. Pharm.
rohl .
10-
5-
tE3m
Abb. 2: Plasmaspiegelkurvenvon ASS (l),SS (2) und SUS (3) nach oraler Applikation von 400mg
ASS bei einem gesunden Probanden.
der wichtigsten Metabolite. Auch halbquantitative Untersuchungen von Plasmaproben
(z.B. zur Uberpriifung der Patienten-Compliance) ohne genaue densitometrische
Auswertung sind mit diesem Verfahren rasch und einfach durchzufiihren.
Der Dr. Robert-Pfleger-Stiftung danken wir fur eine Sachbeihilfe. Ferner danken wir Frau Susanne
Catfarius-Korbfur technische Unterstutzung.
Experimenteller Teil
Geriite: Chromatogramm-SpektralphotometerKM 3 der Fa. Zeiss, Perkin-Elmer-Recorder 56;
Linomat 111 (Camag) mit Hamilton-Spritze; Tecam@-Heizblockmit Stickstoffbegasung. Chemikalien: Die Standardsubstanzen Acetylsalicylsaure, Salicylsaure und Salicylursaure wurden von der
Bayer AG zur Verfugung gestellt. Die Losungsmittel (p.a.-Qualitat) und die DC-Platten (Kieselgel
60-HPTLC-Platten, ohne Fluoreszenzindikator) wurden von der Fa. Merck (Darmstadt) bezogen.
Gewinnung von Plasmaproben
Wie 1967 von Rowland und Riegelman4’beschrieben, wird das Blut sofort nach der Entnahme mit
Heparin und Kalium- oder Natriumfluorid stabilisiert. Das Plasma wird unter Kuhlung im Eisbad
gewonnen, die Proben werden bei -70” bis zur Analyse gelagert.
Extrakfion und Chromafographie
loop1 Plasma werden in einem EppendorfQ-GefaB mit 20 pl Phosphorsaure (8Sproz.) und 2Wpl
ToluollEssigsaureethylester (1/1,V N ) versetzt. Die ExtraktionsgefaRewerden gut verschlossen, 30 s
316/83
Absolute Konfinuration von Tussilanin
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intensiv geschiittelt (Reax, Fa. Heidolph) und 2min zentrifugiert (12000 U/min). 20 pl der
uberstehenden organischen Phase werden mit dem Linomaten 111 auf HPTLC-Platten bandformig
aufgetragen (Bandbreite 5 mm). Neben Plasmaproben mit unbekanntem Gehalt an ASS, SS und SUS
werden auf jede Platte zusatzlich 3 Plasmastandards aufgetragen, die jeweils ASS, SS und SUS
enthalten. Zur Herstellung von Plasmastandardlosungen werden mit Heparin und Fluorid
stabilisiertem Leerplasma definierte Mengen ASS, SS und SUS zugesetzt. Die Plasmastandardlosungen werden in gleicher Weise wie die Plasmaproben aufgearbeitet.
Die DC-Platte wird in Cyclohexan/Diisopropylether/Isopropanol/Ameisensaure(70/22,5/7,5/2;
VNNN; unter Kammersattigung) entwickelt (Laufhohe des FlieBmittels: 10 cm).
Die hRf-Werte von ASS, SS und SUS betragen 25, 39 und 13. Die Bestimmung storende
Plasmabestandteile werden nicht mitextrahiert. Nach Trocknung an der Luft wird die DC-Platte in
eine 1Oproz. Losung von Natriumhydroxid in MethanoYAqua dest. (1/1) getaucht. Die getrocknete
Platte wird densitometrisch ausgewertet.
Detektion und Auswertung
Gemessen wird die Fluoreszenzintensitat (Exzitation: 313nm-Linie der Quecksilbermitteldrucklampe ST 41, Emission: Sperrfilter FL 43; Spalt 0,5 x6mm) auf der DC-Platte. Die Auswertung erfolgt
iiber die Berechnung der Peakflachen (Hohe ma1 Halbwertsbreite). Bei der Ermittlung des Gehalts
von Plasmaproben werden mit Hilfe der Plasmastandards, die unterschiedliche Konzentrationen der
drei Substanzen enthalten, Eichgeraden erstellt.
Literatur
1
2
3
4
M. Mandelli und G. Tognoni, Clin. Pharmacokinet. 5 , 424 (1980).
L.I. Harrison, M.L. Funk und R.E. Ober, J. Pharm. Sci. 69, 1268 (1980).
N.A. Klitgaard, Arch. Pharm. Chemi Sci. Ed. 7,128 (1979).
M. Rowland und S. Riegelman, J. Pharm. Sci. 56, 717 (1967).
[Ph 5891
Arch. Pharm. (Weinheim) 316,367-371 (1983)
Die absolute Konfiguration des Pyrrolizidin-Alkaloids Tussilagin
Helmut Wiedenfeld*, Erhard Roder ,
Pharmazeutisches Institut der Universitat Bonn, An der Immenburg 4, D-5300Bonn-Endenich
Armin Kirfel und Georg Will
Mineralogisches Institut der Universitat Bonn, Poppelsdorfer SchloO, D-5300 Bonn-Poppelsdorf
Eingegangen am 29. Marz 1982
Die absolute Konfiguration des Pyrrolizidin-AlkaloidsTussilagin wird durch Rontgenstrukturanalyse
(-)-(1S,2S,8S)-1a-Methoxycarbonyl-2a-hydroxy-2B-methyl-1,2,3,5,6,8-hexahyermittelt
als
dro-7H-pyrrolizin.
0365-62331831LNCM-0367f LX2.5010
0 Verlag Chemie GmbH, Weinheirn 1983
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