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Die Reaktion des Pikrotoxinins mit Triphenyltetrazolium-chlorid.

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d z l t e s h o f f umi F l a c h
460
Ardriv der
Pharmaaie
2116. H. Auterhoff und H.-J. F l a c h
Die Reaktion des Pikrotoxinins mit Triphenyltetrazoliumchlorid*)
Bus dem Institut fur Pharmaeeutische Chemie der Technischen Hochschule Braunschweig
(Eingegangen am 1. November 1961)
Pikrotoxin, das als Analeptikum therapeutische Bedeutung hat, besteht aus etwa
gleichen Teilen Pihotoxinin (I) und Pikrotin (11). Da die pharmakologische Wirkung praktisch nur I zukommt, konnte man von der iiblichen pharmakologischen
Standardisierung eines Pikrotoxinpraparates abkommen, wenn es gelange, den
I-Anteil auf chemischem Wege quantitativ zu bestimmen. Hierzu bietet sich die
Ausnutzung der Reduktionseigenschaften von I im alkalischen Milieu an. Wir versuchten daher, mit Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) umzusetzen und das gebildete rote Formazanderivat quantitativ zu erfassen. Die Versuche zeigen, daB
dies prinzipiell moglich ist, daD aber zahlreiche Faktoren beriicksichtigt werden
miissen, um eine befriedigende Genauigkeit der Werte zu erzielen. Die Schwierigkeit
der Bestimmung liegt nicht zuletzt darin, daD nicht I selbst TTC reduziert, sondern
eine Spaltung von I im alkalischen Milieu in zwei Carbonsauren (I11 und IV) vorangehen muD, von denen nur die ,,a-Keto1"-Saure (IV) TTC reduziert. Die eigenartige
Spaltung von I in Gegenwart von Lauge, die von Sutter und Schlittlerl) erstmals
beschrieben worden ist und fur die Carman und Mitarb.2) neuerdings eine plausible
Deutung gegeben haben, geht so rasch vor sich, daD die Existenz einer Pikrotoxinindicarbonsaure, mie sie Horrmann3) angenommen hat, sehr unwahrscheinlich ist.
a
I
lv
*) Herrn Prof. Dr. K . Winterfe2d zum 70. Geburtstag gewidmet.
M . Sutter und E . Schlittler, Helv. chim. A& 32, 1855, 1860 (1949).
z, R. M. Carman, R. a. C d e , R . B. Johns und A . D . Ward, J. chem. SOC.(London) 1960,
l)
1965.
3,
P. Horrmunn, Liebigs Ann. Chem. 411, 273 (1916).
295. Bd.
1962, Nr. 6
Die Reaktion des Pikrotoxinina
mit Triphenyltetrazoliumh~r~
461
Die rasche Alkalispaltung und damit die TTC-Reaktion tritt auBer bei I noch ein
z. B. bei der a-Pikrotoxininsaure und beim Dihydropikrotoxinin, sie bleibt aus bei
11, beim Brompikrotoxinin, bei der Pikrotoxinsaure u. a. Derivaten (Formeln vgl.
A ~ t e r h o f f ~I) m
) . Pikrotoxin liegen aber nur I und I1 vor.
Lost man Pikrotoxinin in verdiinnter Natronlauge, sauert die Losung an und
extrahiert mit Ather, so erhiilt man aus der atherischen Losung ein oliges Produkt,
das papierchromatographisch durch zwei Flecke charakterisiert ist, von denen sich
nur einer mit TTC und Lauge rot farbt. Die Substanz des Fleckes, der nicht mit
TTC reagiert, ist charakterisiert durch ein UV-Absorptionsmaximum bei 235 mp
(log E N 4) und entspricht 111; die TTC-positive Substanz IV hat ein wenig ausgepriigtes UV-Maximum bei 276 mp (log E N l$).
Um den Reaktionsablauf von IV mit TTC zu klaren, m d t e n 111und IV getrennt
werden. Die hierfur von Szctter und Schlittler angegebene Methode uber Brucinsalze
ergab bei uns nicht geniigende Mengen reiner Sauren, so da13 wir als Modellsubstanz
6 - H y d r o x y l a v u l i n s a u r e (V) synthetisierten und an dieser die Reaktion von
TTC und Lauge mit a-Ketol-Verbindungen studierten. V wurde im Prinzip nach
dem von A r d , Eistert und Purtuk5) angegebenem Verfahren fur a-Ketole dargestellt :
//O
H z C C , C,H,OH
SOCI,
CH N
0 -+
H,C,OOC-CH,-CH,-COOH-+
R-CO-Cl-2+zR-CO-CH"z
HzC-C'
I
+
O\
CH3CooH
----+
R-CO-CH2-OOCCH,
3HOOC-CH,-CH,-CO-CH,OH
V
R
= -CH,-CH,-COOC2H,
V kristallisiert in kleinen, farblosen, plattenformigen Nadeln vom Schmp. 99-103"
und gibt mit iiberschiissigem Phenylhydrttzin ein Osazon-hydrazid vom Schmp.
175". Mit TTC und Alkali entsteht nicht wie erwartet ein Ketoaldehyd, sondern
vielmehr unter intramolekularer Disproportionierung und Wasseranlagerung aH y d r o x y g l u t a r s i i u r e ( V I ) , die durch Schmp., IR-Spektrum und Papierchromatogramm identifiziert wurde.
v
TTC
H,O
[HOOC-CH,-CH,-CO-CH@] -+
OHOH-
----+
HOOC-CH,-CH,-CHOH-COOH
VI
Die B e s t i m m u n g s m e t h o d e fur Pikrotoxinin mit TTC ist in allen Einzelheiten
von F1.cha) beschrieben worden und mird hier im experimentellen Teil nur in der
endgiiltigen Form wiedergegeben.
4,
5,
6,
H . Auterhff, Dtsch. Apotheker-Ztg. 99, 960 (1959).
P . Arndt, B. Eistert und W . Partale, Ber. dtsch. chem. Gcs. 60, 1364 (1927).
H.-J. P h h , Dissertation Braunschweig 1961.
A u t e r h o f f und Flach
462
Archiv der
Pharmazie
Zusammenfassung
E s wird eine Methode zur Bestimmung des Pikrotoxininanteils im Pikrotoxin auf
der Basis der Umsetzung mit Triphenyltetrazoliumchlorid i n Lauge ausgearbeitet.
TTC reagiert nicht mit Pikrotoxinin selbst, sondern mit der durch Alkalieinwirkung
entstehenden ~-1sopropeny1-6-hydroxylavdinsaure
(IV). Zum Studium der Reaktion von ,,a-Keto1"-Sauren mit TTC wurde 6-Hydroxylavulinsaure (V) synthetisiert. Es zeigte sich, da13 durch TTC-Einwirkung in alkalischem Milieu dabei nicht
der erwartete Ketoaldehyd entsteht, sondern unter Disproportionierung und Wasseranlagerung eine a-Hydroxyglutarsaure.
Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft fiir die Oberlassung eines IRSpektrophotometers und dem Fonds Chemie des Verbandes der chemischen Industrie fiir
grolziigige Untemtiitzung.
Besehreibung der Versuehe
Bestimmungsmethode f u r I in Pikrotoxin
Etwa 50 mg Pikrotoxin werden genau gewogen, in einem 50-ml-MeBkolbenunter Schutteln in Wasser gelost und die Losung auf 50 ml eingestellt. 5-8 ml der Maung werden aus
einer Mikrobiirette genau abgemeasen und in einen 100-ml-MeBkolbengegeben. Man fiigt
1 ml 5prOZ. TTC-Usung und 0,5 ml 30proz. Natronlauge hinzu und verdriingt aus dem
Kolben die Luft durch Einleiten von Stickstoff. Nach lstdg. Stehen im Dunkeln wird rnit
30p1-02. Essigsiiure angeeiiuert und sofort mit absolutem khan01 auf 100 ml aufgefiillt.
Man miBt die Extinktion der roten Losung im Spektrophotometer bei 485 mp oder im
Elk0 I1 mit Filter ,,S 49". Der I-Gehalt wird an einer Eichkurve abgelesen, die rnit I unter
gleichen Bedingungen aufgeatellt wird (z. B. 3 mg I entspr. E = 0,832, Spektrophotometer,
1-cm-Kiivetten). Bei 3 Bestimmungen weicht der Mittelwert erfahrungsgemitl hochstens
2 bis 3% von den Einzelwerten ab.
um
E r 1ii u t er u n g en z u r Be 8 t i m m u n g s method e
1. Modifikationen der Methode, bei denen das gebildete Formazan rnit einem lipophilen
Usungsmittel ausgeschiittelt wurde, gaben zu groBe Schwankungen de; Werte.
2. Setzt man Pikrotoxin mit TTC und Lauge in iithanolischer Losung um (analog
Cortison), so verblaBt die zuniichst entstehende Rotfkrbung sehr rasch.
3. Essigsiiure wird zum Ansiiuern venvendet, da NaCl in Bthanol nicht laslich ist.
4. Fiihrt man die Bestimmung unter Luft statt unter Stickstoff durch, so erhalt man
niedrigere Werte, und der Fehler ist groBer.
5. Ein sehr genau untersuchtea Pikrotoxin enthielt 53,8% I, was mit iilteren Angaben')
in etwa ubereinstimmt. Bei aquimolarer Zusammensetzung miiBten 48,57; I vorliegen.
Papierchromatographie
FlieBmittel: n-Butanol-Essigsiiure-Wasser= 4 : 1 : 1. Papier Schleicher u. Sohiill2043b
Mgl. Zur Sichtbarmachung dienten: 1.0,lproz. KMn0,-Losung; 2.1% TTC in 0,5 n NaOH;
3. 3prm. Losung von Hydrazin in methanol: n KOH. Trocknen bei ,105O, Fluoreszenz im
W-Licht.
') R . J . V e , v e r und
P. Brwger, Ber. dtsch. ohem. Ges. 31, 2958 (1898).
1962,
Nr.6
295.m.
Die Reaktion des Pikrotoxinins ntit Triphenylietrazoliumchbrid
U-Pikrotoxininsiluw
DihJdl.OpkOtOxin
PikmtoxinezrUre
0,73
0,89
0,76
LWnO,
TTC/NaOH
+0
+0
+
+
+
+
0
++
0
0
+
,
I
I
I
463
Hydrazin/UV
:
+
+0
++
10,O g Pikrotoxin wurden in 300 ml siedendem Waeser gelost und die heiDe Ldsung rnit
Bromwasser bis zur bleibenden Gelbfiirbungversetzt. Das ausgefallene Brompikrotoxinin
wurde noch heil3 abfiltriert, mit siedendem Wasser ausgewaschen, getrocknet und aus
Athanol umkristallieiert. Ausbeute: 4,6 g, Schmp. 260-270° (Zers.). Aus'dem Filtrat der
Brompikrotoxininfiillung kristallisierten innerhalb 24 Std. 4,9 g rohes Pikrotin &us, das
nach Waechen mit heisem Chloroform 3,5 g reines Pikrotin, Schmp. 249-250", ergab.
5,O g Brompikrotoxinin wurden in 100 ml Athano1 suspendiert, die Suspension zum
Sieden erhitzt, mit 5 ml2Oproz. w&OrigerAmmoniumchloridlosungversetzt und in kleinen
Anteilen 1,5 g Zinkstaub eingetragen. Nach nochmaliger Zugabe der gleichen Mengen
NH,Cl und Zink wurde einige Min. weiter erhitzt, das uberschiissige Zink abfiltriert und
das Filtrat mit 25 m12 n H,SO, stehengelassen, abfiltriert und aus Wasser umkristallisiert.
Ausbeute 3,2 g, Schmp. 209-210".
R e a k t i o n s p r o d u k t aus I und Lauge
200,O mg I wurden in 50 mlO,5 n NaOH gelost. Die Liisung fiirbte sich in wenigen Min.
gelb. Nach 1 SM. wurde mit Salzsiiure angesiiuert und die nun farblose Liisung wiederholt
mit Ather ausgeschiittelt, der Atherauszug mit Natriumsulfat getrocknet und der Ather
abdestilliert. Es blieben 95 mg eines gelben Oles zuriick. - Der Versuch verliiuft in gleicher
Weise, wenn man I mit lOproz. Sodalosung 30 Min. auf 80" erhitzt.
Versuche zur Trennung vom I11 und IV auf siiulenchromatographischem Wege (M,O,,
Ionenaustauscher, Cellulosepulver)verliefen negativ. Die Elution mit Wasser aus PC fiihrte
zu kleinen Mengen reiner Substanzen.
Bern s t einsii ur e m ono&t h y 1e s t e r ( = BS-Monoitthylester)
50 g BS-Anhydrid wurden mit 230 ml absol. Athano1 6 Std.unter RuckfluD zum Sieden
erhitzt. Nach Abdestillieren des iiberschiieaigen hthanols i. Vak. wurde der olige Riickstand
bei 10mm fraktioniert. Bei 95-97O ging wenig Diiithylester uber, bei 136-138" der
Monoiithylester als farblose, olige Fliiasigkeit. Ausbeute: 50 g (68,50/, d. Th.).
BS-Athylesterchlorid
50 g BS-Monoiithylester wurden mit 100 g SOC1, 20 SM. stehengelassen, dann 1 Std.
auf 50" e r w h n t und i. Vak. das uberschiieaige SOC1, abdestilliert. Bei 77-79'/6
Torr ging
das Siiurechlorid als farblose, olige Fliissigkeit uber. Ausbeute 39,7 g (70,2% d. Th.).
Diazoketon aus dem BS-Bthylesterchlorid
250 ml Ather wurden mit 35 ml45proz. Kalilauge untersohichtet, die Mischung mit Eis
gekiihlt und in kleinen Anteilen mit 17,5 g Nitrosomethylharnstoff versetzt. Die Atherschicht opupde durch ein trockenes Faltenfilter dekantiert. Man tropfte eine Usung von
7 g BS-khylesterchlorid in 50 ml absol. Ather allmiihlich zu.Nach Abklingen der lebhaften
Reaktion wurde 16 Std. stehengelassen und der Ather bei 20" abdestilliert. Das zuriickbleibende rohe Diazoketon (7,2 g) uwrde sofort weiterverarbeitet.
464
Friedrich
Archiv der
Pinarmazie
8-Hydroxylaevulinsiure (V)
Das rohe Diazoketon (7,2 g) wurde in 120 ml auf U O " erwarmte Ewigsiiure getropft
und der Ansatz 1 Std. auf 90" erwiirmt. Nach Abklingen der N,-Entwicklung destillierte
man die Essigsiure i. Vak. ab, nahm den Ruckstand in Ather auf, wusch mit n NaHC03
und Wasser und destillierte den Ather ab. Der Ruckstand (5,5 g) wurde rnit 8 g Kaliumcarbonat, 50 ml Methanol und 40 ml Wasser versetzt und 18 Std. stehengelassen. Nach
Abdestillieren des Methanols bei 30" i. Vak. wurde die wiil3rige %sung mit Schwefelaure
angesiiuert und kontinuierlich mehrere Std. mit Ather extrahiert. Aus dem Ather wurde
nach dem Trocknen mit Natriumaulfat ein gelbes 61 gewonnen, das durchkristallisierte.
Ausbeute 1,l g (30,6y0 d. Th.), Schmp. 99-102". IR-Banden bei 2.9; 3,4; 5,85; 7 , l ; 7,6;
8 , l ; 8,2; 9 , l ; 9,8; 10,6 p.
C,H,O, ( 1 3 2 ~ )
Ber.: C 45,45
H 6,lO
Gef.: C 45,45
H 6,22
C 45,62
H 6,15
Osazon-hydrazid von V
0,28 g V, 3,O g Phenylhydrazinhydrochlorid und 6 g Natriumacetat wurden in 55 ml
Wasser 4 Std. erhitzt. Ein allmiihlich sich ausscheidendes braunes61 erstarrte iiber Nacht;
die Substanz wurde mit heil3em Wasser gewaschen und aus Ather umkristallisiert. Ausbeute
0,094 g ( 10,6y0 d. Th.), Schmp. 175O.
C,,H,*N,O (40095)
Ber.: C 68,97
H 6,04
N 20,98
Gef.: C 68,41
H 5,99
N 20,64
Umsetzung von V m i t TTC
0,95 g V wurden mit einer Losung von 3,2 g TTC in 70 ml Wasser und 70 ml n NaOH
3 Std. im Dunkeln stehengelassen. Nach dem Ansiiuern mit Salzsiiure wurde das Formazan
abfiltriert und das Filtrat mehrere Std.kontinuierlich mit Ather extrahiert. Aus dem nach
Abdestillieren des Athers erhaltenen gelben oligen Ruckstand (0,49 g) kristallisierten h r b lose Plitttchen vom Schmp. 96-98O, die IR-apektroskopisch und pc als a-Hydroxyglutarsiture identifiziert wurden. FlieDmittel: Athylacetat-Ameisensiiure5 : 1, Rf 0,30, V-Rf 0,41.
Detektion mit KMnO,.
Anschrift: Prof. Dr. H. Aoterhoff, Braunschweig, Pockelsstr. 4.
2117. H. F r i e d r i c h
Untersuchungen iiber die Isorhamnetinglykoside aus den
Bluten von Calendula officinalis L.
Aus dem Institut fur Pharmakognosie der Westflilischen Wilhelms-Universitat Miinster
(Eingegangen am 7. November 1961)
Aus den Bluten von Calendula officinalis konnten vier Glykoside isoliert werden,
die mit Go, GI, G , und G, bezeichnet wurden und alle vom Isorhamnetin abzuleiten
sind').
Verbindung Go fallt aus Methanol in blaflgelben Nadeln a n ; Schmp. 184-186';
1 max. 259,358 mp.
Verbindung Gl ist griingelb gefarbt, stark hygroskopisch und kristallisiert nicht ;
Schmp. 189-193" (Zers.); %max. 258, 362 mp.
1)
H . Friedrich, Arch. Pharmaz. 295, 39 (1962).
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