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Ecdysone aus Wurzeln und Samen von Helleborus-Arten.

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32018 7
54 I
Ecdysone aus Helleborus
Arch. Pharm. (Weinheim) 320. 541-546 (1987)
Ecdysone aus Wurzeln und Samen von Helleborus-Arten
Brigitte Kiljmer und Max Wichtl
Institut fur Pharmazeutische Biologie der Philipps-Universitat Deutschhausstrane 17%,
D-3550 Marburg
Eingegangen am 23. Juli 1986
Aus den Wurzeln und Samen von Helleborus odorus WALDST. et KIT. und von Helleborus purpurascens WALDST. et KIT. konnten vier Ecdysteroide isoliert werden: 0-Ecdyson (l), 5-a-Hydroxyecdyson
(2), 5-a-Hydroxyecdyson-3-a-D-glucosid
(3) und 5-P-Hydroxyecdyson-3-~-D-glucosid
(4).
Ecdysones from Roots and Seeds of Helleborus Species
From roots and seeds of Helleborus odorus WALDST. et KIT. four ecdysteroids have been isolated:
p-Ecdysone (l), 5-a-hydroxyecdysone (2), 5-a-hydroxyecdysone 3-p-D-giucoside (3), and 5-p-hydroxyecdysone 3-P-I-glucoside (4).
In Fortsetzung unserer Untersuchungen von Inhaltsstoffen der Samen verschiedener HelleborusArten') konnten wir nun sowohl aus den Samen als auch den Wurzeln von Helleborus odorus und von
Helleborus purpurascens Ecdysone isolieren. Bisher sind solche C,,-Steroide nur in den oberirdischen
Organen einiger Helleborus-Arten nachgewiesen worden2,34wobei das Vorkommen oder Fehlen der Ecdysone eine gewisse ubereinstimmung mit der systematischen Gliederung der Gattung Helleborus zeigte.
no
OH
:
OH
Glucose
HO
0
1 Ro = OH
R = H
4 Ro = Glucose R = OH
0365-6233/87/0606-54 I $OZ.SO/O
0 VCH Verlagsgesellschaft mhH, D-6940Weinheim, 1987
542
Kipmer und Wichtl
Arch. Pharm.
Das Auflinden von Glykosiden der Ecdysone konnte neue Aspekte fur die Biogenese von Bufadienoliden erbringen. Moglicherweise handelt es sich bei den Ecdysonglykosiden, ahnlich wie bei Pregnanglykosiden, um Vorstufen, vielleicht stellen sie aber nur einen Seitenweg der Biosynthese dar.
Ein MeOH-Extrakt aus den Wurzeln von Helleborus purpurascens gab bei der sc
Trennung an wassergesattigtem Silicagel rnit Ethylacetat-MeOH (MeOH-Anteile von 5
bis 100 % gesteigert) eine Reihe von Fraktionen, in denen Substanzen enthalten waren,
die abweichend von den Bufadienoliden im DC nach Bespruhen mit Vanillin-H2SO4
grungelbe Zonen, rnit Anisaldehyd-H2S04flaschengrune Zonen gaben.
Die weitere Auftrennung mittels DCCC bzw. RLCC lieferte schliefilich vier Substanzen, deren UV-Spektren weitgehende ubereinstimmung zeigten. Das Absorptionsmaximum bei 242 nm (in EtOH) wies auf a, P-ungesattigte, cyclische Ketone hin.
Auch die IR-Spektren der vier Substanzen, die sich nur im fingerprint-Bereich unterschieden, sprachen rnit den charakteristischen Banden bei 1630 cm-' und 1650 cm-'
fur diese Struktur. Aus den Californium-252 Plasmadesorptions-MS4) (252Cf-PDMS)
ergaben sich fur die Substanzen 2 bis 4 Molekulmassen von 2 = 496,3 = 658 und 4 =
658, woraus bereits einige Schlusse gezogen werden konnten, insbesondere auf das
Vorliegen von Glucosiden im Falle der Verbindungen 3 und 4 (Tab. I, 11).
Tab. 1: FD-Massenspektrum von 1 (% Totalionenstrom)
Tab. 2: 252Cf-PDMS von 2 und 3 (4)
444
(4.03) M+-(H20)2
Substanz 2
520 (M+1 + Na):
519 (M
+Na)
(2.78) M+-(HzO)4
Substanz 3 (4)
705 (M+1 + 2 N a ) l
704 (M
+ 2Na)+
682 (M+1 + Na)+
681 (M
+ Na)+
357 (M
+ Na) -Glucose-H20
409
408
CH3
I
345 (31.80)
R-C = OH (363)
-H2O
( 2 0 ) G3
R = Steroidgrundgerust
131
117
99
81
(3.10)
(34.74) Seitenkettenfragment ab C-22
(11.22) 117-Hz0
(7.67)
99-H20
Die FD-MS von 1 und 2 wiesen mit iibereinstimmenden Massenzahlen 153, 117,
1 11,99,92 und 8 1 auf eine identische Teilstruktur und rnit der zweimaligen Differenz
von 18 (1 17 -+ 99; 99 + 8 1) auf das Vorliegen zweier vicinaler Hydroxygruppen hin.
Hingegen lie13 sich aus den MS keine Aussage uber die Natur des Zuckers bei den Verbindungen 3 und 4 treffen. Es gelang jedoch in beiden Fallen, durch Hydrolyse auf der
DC-Schicht in einer HC1-Atmosphare') den Zucker abzuspalten und als Glucose zu
identifizieren.
Schon die bis dahin erhaltenen Informationen erlaubten den SchluD, da13 die Substanzen 1 bis 4 zu den Ecdysonen gehoren. Durch 'H-NMR- und I3C-NMR-Spektroskopie lie13 sich schliel3lich die Struktur der vier Verbindungen aufklaren, wobei die be-
543
Ecdysone aus Helleborus
320187
reits fur P-Ecdyson und 5-P-Hydroxyecdyson vorliegenden NMR-Daten wertvoll
waren6)(Tab. 111).
Hervorgehoben seien fur 2 die Resonanz des Protons der a-standigen OH-Gruppe
an C-14 bei 4.10 ppm (in DMSO-d6), des Protons an C-7 mit 6 = 5.66 und der kleinen
Kopplungskonstante J7,8 = 2 Hz und die Signale der sechs Methylprotonen von (2-26
und C-27 bei 1.04 pprn bzw. 1.06 ppm (in DMSO-d,); die Protonen der Methylgruppe
C-21 erscheinen als scharfes Singulett bei 6 = 1.03 (in DMSO-d6) bzw. 1.58 ppm (in
Pyridin-d,). Dieses Singulett beweist die Substitution von C-20 durch eine OHGruppe7), andernfalls ware ein Dublett zu erwarten gewesen.
Das Vorkommen von Glucose in den Verbindungen 3 und 4 konnte durch Doppelresonanzexperimente ('H-NMR-Spektrum in DMSO-d6) bestatigt werden, s. Tabelle IV.
Tab. 3: 'H-NMR-Spektren von 1, 2, 3 und 4 (in ppm; 6Skala; DMSO-d6 bzw. Pyridin-d5 (Werte
in Klammern)
Proton(en)
18
(3H)
19
(3H)
21
(3H)
26/27 (3H/3H)
7
14
(1H)
(10H)
1
2
3
4
0.74
(1.15)
0.82
(1.20)
1.03
(1.58)
1.04: 1.06
(1.37)
5.61
(6.25)
4.11
0.75
(1.21)
0.75
(1.17)
0.77
(1.07)
1.03
(1.58)
1.04 ; 1.06
(1.37)
5.66
(6.23)
4.10
0.80
(1.01)
1.05
(1.55)
1.05; 1.07
(1.38)
5.63
(6.27)
4.09
0.75
(1.17)
0.85
(1.12)
1.05
(1.56)
1.05 ; 1.07
(1.38)
5.65
(6.27)
4.09
Irn 'H-NMR-Spektrum, aufgenommen in Pyridin-d,, tritt das anomere Proton bei
4.99 ppm in Resonanz; die grolje Kopplungskonstante von J ~ ~ , z I7=Hz weist auf die
jeweils axiale Stellung von H-1' und H-2' hin, so darJ eine P-D-Glucose vorliegt, die an
der Hydroxygruppe am C-3 des Aglykons gebunden ist, wie aus den 13C-NMR-Daten
hervorgeht. Hier weisen die chemischen Verschiebungen der C-Atome 2 , 3 und 4 den
Tab. 4: Glucose; 'HDaten und C3-H Wert von 3
und 4 in DMSO-d6; h ppm; 6-Skala
C3-H
H::E
4.00
4.34-4.41
C2*-OH
C3*-OH 4.67-4.93
C4*-OH
C3*-H 3.13
C4*-H 2.96
C5*-H unter dem Wasserpeak liegend
C6*-H 3.45
5 44
KiJmer und Wichtl
Arch. Pharm.
typischen Glykosidierungseffekt aufs! Die Resonanzen aller C-Atome der Hexose zeigen Ubereinstimmung mit den Signalen der Glucose in P-Sitosterin-3-0-D-glucosid aus
Helleborus odorus-Samen.
Die Stellung der Substituenten an C-5 ergab sich aus der chemischen Verschiebung
des Methyl-C-19; auf Grund der Hochfeldverschiebung von 24.5 bzw. 24.2 ppm und
16.9 bzw. 17.0 ppm lassen sich 1 und 4 als Koprostanol-, 2 und 3 als Cholestanolderivate erkennen. Die von Hoffmeister et al.?)beobachtete Abspaltung der a-OH-Gruppe
an C- 14 bei P-Ecdyson unter Ausbildung eines A7,''(1S)-Dien-on-Systems,das sich allmahlich in das stabilere A*, I4-Dienon umlagert, verlief auch mit 4 in gleicher Weise:
das UV-Absorptionsmaximum in EtOH zeigte auf Zusatz von HCl eine binnen 6 h ablaufende Anderung, wobei neben dem Maximum von 24 1 nm ein zusatzliches Maximum bei 294 nm auftrat, das sich nach weiteren 18 h nahezu vollstandig zuriickgebildet hatte, wahrend ein neues Absorptionsmaximum bei 244 nm zu beobachten war.
Tab. 5: 13C-NMR-Spektrum von 1, 2, 3 und 4 (in ppm;
Mkala, Pyridin-dg)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
IS
2'
3#
4s
5'
6'
1
2
3
4
38.0
68.2
68.1
32.5
51.4
203.6
121.7
166.1
34.6
38.7
21.7
31.8
48.2
84.3
31.8
21.5
50.2
17.9
24.5
77.0
21.2
77.7
27.5
42.6
69.8
30.0
30.1
35.8
67.7
69.6
34.4
79.6
200.9
119.7
166.7
38.1
44.6
21.8
31.3
47.9
83.9
31.8
21.4
49.8
17.6
16.9
76.8
21.1
77.4
27.2
42.3
69.6
29.6
29.8
38.7
66.8
75.7
35.5
79.6
200.6
120.2
166.5
38.4
44.9
21.9
32.0
48.1
84.1
31.6
21.4
50.0
17.8
17.0
76.9
21.7
77.6
27.5
42.6
69.1
30.0
30.1
102.6
75.4
78.4
71.8
78.6
62.8
38.7
64.8
75.7
32.7
79.6
203.0
121.8
166.O
38.4
44.9
21.9
32.0
48.1
84.3
31.7
21.5
50.1
17.8
24.2
77.0
21.7
77.6
27.5
42.6
69.7
30.0
30.1
102.0
75.5
78.4
71.8
78.6
62.8
545
Ecdysone aus Helleborus
32018 7
Diese nach Saurezusatz verlaufende Wasserabspaltung bei Ecdysonen wurde erstmals
von Karlson et aL9)beschrieben.
Im Verlauf unserer Untersuchungen konnten die Substanzen 1 bis 4 auch aus den
Wurzeln und Samen von Helleborus odorus und den Samen von Hellborus purpurascens isoliert werden.
Experimenteller Teil
Isolierung von 1 und 2 aus den Wurzeln von Helleborus purpurascens.
2 x je 5,5 g eines mit MeOH hergestellten Trockenextraktes wurden zunachst an 25 g wassergesattigtem
Kieselgel (Herst. nach Stoll et al.lO))fraktioniert.
Ethylacetat + MeOH
100
95
80
70
50
30
0
+
+
+
+
0
5
20
30
+ 50
+ 70
+ 100
Menge
0.5 1
0.3 1
0.3 1
0.3 1
0.3 1
0.3 1
0.3 1
Fraktionen fi 100 mi
1- 5
6- 8
9-11
12-14
15-17
18-20
21 -23
Die nach DC-Kontrolle ausgewahlten Fraktionen 9- 11 wurden jeweils vereinigt und gaben zusammen
0.54 g Trockenruckstand, welcher mittels RLCC im System Chloroform-Toluol-MeOH-Wasser(13 + 1
+ 7 + 4), absteigendes Verfahren, weiter getrennt wurde; 131 Fraktionen zu 15 ml wurden erhalten. Aus
den Fraktionen 40-85 resultierten 20 mg 2, aus den Fraktionen 96-131 20 mg 1.
Isolierung von 3 und 4 aus den Wurzeln von Helleborus purpurascens.
1.5 g methanolischer Trockenextrakt wurde mittels DCCC im System Chloroform-Methanol-Wasser (4
4), absteigendes Verfahren, getrennt; bei 115 Fraktionen zu 6 ml enthielten die Fraktionen
106- 115 hauptsachlich 3 und 4, die weitere Aufarbeitung erfolgte uber praparative DC (Kieselgel60 F
254; 0,25 mm Schichtdicke) und erbrachte je 22 mg 3 und 4 (Fp: 162", unkorr.).
+6+
Gerure RLCC-A-Gerat von Tokyo Rikakikai; Tokyo, Japan, mit 16 Saulen aus Borosilicatglas von
11 m m Durchmesser und 450 mm Lange. - DCC-A-Gerat von Tokyo Rikakikai; Tokyo, Japan, mit 300
Saulen aus Borosilicatglas von 2 mm Durchmesser. - Bruker WH 400 ("C-NMR-Spektren 100 MHz;
'H-NMR-Spektren 400 MHz). - Varian-Mat 7 11 (FD-Massenspektren).
Wir danken Herrn Priv.-Doz. Dr. S. Berger und Herrn Dr. K . Steinbach aus dem Fachbereich Chemie
der Philipps-Universitat Marburg fur die Aufnahme der 'H- und I3C-NMR-Spektrenbzw. der FD-Massenspektren. Unser Dank gilt ebenso Herrn L. Schmidt, Fachbereich Physikalische Chemie (Kernchemie) fur die Aufnahme der *''Cf-PDM-Spektren.
546
Herdeis und Gebhard
Arch. Pharm.
Literatur
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
B. Kil3mer und M. Wichtl, Planta Med. 1986, 152.
R. Hardman und T. V. Benjamin, Phytochem. 15, 1515 (1976).
R. Hardman und T. V. Benjamin, Planta Med. 39, 148 (1980).
R. D. Macfarlane und D. F. Torgerson, Science 191, 920 (1976).
D. Kruger und M. Wichtl, Dtsch. Apoth. Ztg. 125, 55 (1985).
J. W. Blunt und J. B. Stothers, Org. Magn. Reson. 9, 439 (1977).
H. Hoffmeister und H. F. Grutzmacher, Tetrahedron Lett. 33, 4017 (1966).
K. Tori, S. Seo, Y. Yoshimura, H. Arita und Y.Tomita, Tetrahedron Lett. 2, 179 (1977).
P. Karlson, H. Hoffmeister, H. Hummel, P. Hocks und G. Spiteller, Chem. Ber. 98,2394 (1965).
A. Stoll, E. Angliker, F. Barfuss, W. Kussmaul und J . Renz, Helv. Chim. Acta 34, 1460 (195 1).
[Ph 2501
Arch. Pharm. (Weinheim) 320,546-553 (1987)
Aminosauren. 8. Mitt.’)
Peptidsynthesen mit (+) 5-Hydroxy-2-pyridylglycin ((+) Pyg
(5-OH)), einer neuen heterocyclisch substituierten Aminosaure
Claus Herdeis* und Rolf Gebhard
Institut fur Pharmazie und Lebensmittelchemie der Universitat Wurzburg, Am Hubland, 8700 Wurzburg
Eingegangen am 14. Juli 1986
Peptidsynthesen mit der neuen heterocyclisch substituierten Aminosaure Pyg(5-OH) (3) werden durchgefuhrt mit dem Ziel, ein (Leu’)-Enkephalinderivat zu synthetisieren, in dem Tyr durch Pyg(5-OH) ersetzt
ist.
Amino Acids, VIII:
Peptide Syntheses with (+)-5-Hydroxy-2-pyridylglycine
Peptide syntheses with the novel heterocyclic amino acid derivative Pyg(5-OH) (3) produce a (Leu5)-enkephalin derivative in which the tyrosine moiety is replaced by 3.
In Fortsetzung unserer Arbeiten auf dem Gebiet der heterocyclisch substituierten
Aminosauren’) berichten wir hier uber Synthesen von Peptiden mit (Leu5)-Enkephalin
(la) Struktur. S-Tyrosin (Tyr) (2a) in la sol1durch 5-Hydroxy-pyridylglycin (3) ersetzt
werden. Die Aminosaure 2b, ein Homologes des Pyg(5-OH) (3) besitzt antivirale Aktivitat und wurde aus Streptomyces chibaensis isoliert3! Ziel der Arbeit war, 6 und lb
darzustellen.
0365-6233/87/0606-546
$ OZ.SO/O
0VCH Verlagsgesellschaft mhH, D-6940 Weinheim, 1987
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