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EinflUsse des Nhrmediums bei der PrUfung antimykobakterieller Verbindungen. Influences of the Culture Medium in the Testing of Antimycobacterial Compounds

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453
Antimykobakterielle Verbindungen - Niihrmedium
Einfliisse des Nahrmediums bei der Priifung antimykobakterieller
Verbindungen
Influences of the Culture Mediuim in the Testing of Antimycobacterial Compounds
Wolfgang Meindl' und Helmut Schonenberger
Institut fur Pharmazie der Universitat Regensburg, UniversitWstraBe 31,8400 Regensburg, FRG
Eingegmgen am 17. Januar 1989
Standardmedium fur die Anzucht von Mycobacterium tuberculosis,
sowohl aus biologischem Material als auch zur Priifung von neuen antimykobakteriellen Verbindungen, ist der Ni4hrboden nach LowensteinJensen. Dieses lipidreiche Medium enthalt als Hauptbestandteil komplex
zusammengesetzte Eifliissigkeit. Um Fremdwachstum zu unterdriicken,
wird Malachitgriin zugesetzt I).
Eine weitere Moglichkeit zur Kultivierung von M . tuberculosis sind einfache synthetische Medien. Allerdings welchsen die Bakterien darauf sehr
langsam, kleine lnokula werden durch die Anwesenheit geringer Mengen
toxischer Fettsauren IxeinfluDt '). Wird dieser toxische Effekt freier Fettsauren durch die Zugabe von tierischem Serum oder von Albumin neutralisiert, 50 vermogen Fettsauren sogar das Wachstum zu fordem 'I. Dies ist
besonders der Fall, wenn in flussigen Medien unter Zusatz von OberflC
chenaktiven Substanzen wie z.B. Tween 80 gearbeitet wird. Diese Tenside
benetzen die Oberflache der Bakterien, die nonnalerweise in Klumpen
wachsen. und erlauben somit ein disperses Wachstum 'I, ohne in den verwendeten Konzentrationen das Wachstuni zu hemmen. - Beispiel fur ein
Medium dieser Art ist die Middlebrook-7H[Y-Nirlosung I).
Feste Medien wie der Luwensfein-Jensen-Niihrboden sind
zwar fur die Bestimmung von minimalen Hemmkonzentrationen (MHK-Werten) grundsatzlich geeignet, haben aber
den Nachteil, daO durch die eingieschrankte Diffusion Versuche zu synergistischen Effekten in Wirkstoffkombinationen sowie Versuche zur Antagonisierung einer gefundenen
Wirkung nur bedingt aussagekraftig sind.
Eine weitere Schwierigkeit bei der Verwendung des
LOwenstein-Jensen-Nahrbodensist die E r w h u n g auf 85
"C zur Koagulierung des EiweiR. Der zu priifende Wirkstoff
wird miterhitzt.
Eine thermische Inaktivierung der Testsubstanzen ist
damit ebenso moglich wie eine Reaktion mit Nahrbodenbestandteilen. Neben chemischen Reaktionen ist dabei in
erster Linie an die Adsorption tler Verbindungen z.B. an
Proteine zu denken. Folglich kijnnten antimykobakteriell
wirksame Verbindungen durch eine ausschliefilichePriifung
auf dem Lowenstein-Jensen-Mediumunerkannt bleiben.
Aus diesem Grund ist es sinnvoll, die F'riifung von Verbindungen auf antimykobakterielle Eigenschaften nicht nur
auf LOwenstein-Jensen-Nahrboden, sondem zusatzlich auf
einem synthetischen Flussigmedium wie der Middlebrook7H9-Losung durchzuftihren. Eindrucksvolle Beispiele fur
die Einflusse des Nahrmediums auf die MHK-Werte zeigt
Tab. 1.
Viele Antihistaminika besitzen antimykobakterielle Eigenschaften 3)4)5). Tab. 1 zeigt eine Auswahl dieser
Verbindungen und stellt die Ergebnisse der Priifung
Arch. Pharm. (Weinheim)322.453-456 (1989)
gegen M. tuberculosis H 37 Ra auf Lowenstein-JensenNahrboden und Middlebrook-7H9-Medium gegenuber.
Wiihrend keine der untersuchten Verbindungen auf dem
Eiemiihrboden nach Liiwenstein-Jensen wirksam ist (MHK
> 256 pg/ml), liegen die MHK-Werte der meisten Antihistaminika bei der Priifung auf dem normalen Middlebrook-7H9-Medium (Gehalt an Rinderserumalbumin Fraktion V = 0.4%) zwischen 8 und 32 p.s/ml.
Das menschliche Blutplasma enthalt mit circa 4.4%
Albumin und 2.6% Globulin eine g r o k Menge Proteine,
von denen vor allem die Albumine fur eine Bindung der
Pharmaka in Frage kommen.
Um zu kliken, ob lediglich der hohe EiweiBgehalt des LOwenstein-Jensen-Mediums (6%) fur die Unterschiede in der
Wirksamkeit verantwortlich ist, wurden die wirksamsten
Antihistaminika auf einer modifizierten Middlebrook-Niihrlosung mit 2% Rinderserumalbumin gepriift. Die MHKWerte der Verbindungen 2-4,6,8-11,15 und 16 gebenuber
M. tuberculosis H 37 Ra erhohen sich dadurch urn eine geometrische Verdunnungsstufe, lediglich bei Mequitazin (14)
bleibt die Hemmwirkung gleich.
Die Priifung von Chlorpromazin-HC1 (S), Clemastin-hydrogenfumarat (9) und Cyproheptadin-HC1 (11) auf einem
Middlebrook-Medium mit 4% Albumin - dies entspricht beziiglich des Albumingehalts ungeffir physiologischen Verhdtnissen - gibt eine weitere Erhohung der MHK.
Allerdings ist hervorzuheben, daR durch ein Anheben des
Albumingehalts auf physiologische Verhdtnisse die MHK
der Testsubstanzen zwar ansteigt, die Verbindungen
dadurch aber nicht unwirksam werden (Kriterium fur
Inaktiviat: MHK > 256 pdml), wie dies auf LiiwensfeinJensen-Medium der Fall ist.
Die Hitzekoagulation bei der Herstellung des Eiemiihrbodens und eine dabei eintretende thermische Inaktivierung
oder eine unphysiologisch hohe Proteinbindung der Wirksubstanzen bleiben als E r k l h n g der Wirkungsunterschiede
im Vergleich zum synthetischen Medium bestehen.
Zusammenfassend 1 s t sich sagen, dal3 die Verwendung
des N6hrbodens nach LOwenstein-Jensen fur die Suche nach
antimykobakteriellen Verbindungen nicht geeignet ist. Als
Alternative bietet sich die Priifung auf einem synthetischen
Flussigmedium wie der Middlebrook-7H9-Niihrlosungan.
Die Autoren danken Frau E. Schreiber fur die ausgezeichnete Zusammenarbeit bei den mikrobiologischen Versuchen.
OVCH Verlagsgesellschaft mbH, D-6940 Weinheim, 1989
0365-6233/89/0707-0453 $02.50/0
454
Meindl und Schonenberger
-
Tab. 1: Minimale Hemmkonzenwationen (in &ml) der Verbindungen 1 17 gegen M. tuberculosis H 37 Ra auf Lilwensrein-Jensen- und Middlebrook7H9-Medium
Nr.
Verbindung
1
2
3
Antazolin-HCI
Astemizol
Azelastin-HCI
Bamipin
Brompheniraminhydrogenmaleat
Chlorcyclizin-HC1
Chlorphenaminhydrogenmaleat
Chlorpromazin-HC1
Clemastinhydrogenfumarat
Cyamemazin
Cyproheptadin-HC1
Diphenhydramin-HC1
Imipramin-HC1
Mequitazin
Pizotifenhydrogenmalat
Prochlorperazinedisilat
Promethazin-HCI
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
”-”
LowensreinJensen-Medium
Middlebrook-7H9-Medium
Albumingehalt:
b) 2%
a) 0.4%
c) 4%
>256
>256
2256
>256
r256
128
8
16
16
64
>256
>256
16
64
32
>256
>256
16
8
32
16
32
32
>256
>256
>256
>256
>256
>256
16
16
64
32
8
16
32
32
64
>256
16
32
>256
32
16
32
32
8
32
= nicht getestet
1. Nahrmedien ”
100.0ml blsPure-Albumin-Komplexenthalten:
0.06 ml &.Sure in 5 ml0.05 N NaOH
4 g RinderserumalbuminFraktion V
a) LBwenstein-Jensen-Medium
2.MikrobiologischePruwthoden
ExperimentellerTeil
Kaliumdihydrogenphosphat
Magnesiumsulfat . 7H20
Magnesiumcitrat
Asparagin
Kartoffelmehl
Glycerin
HZO
Eiflbsigkeit
Malachitgriin, 2%in H2O
2.40 g
0.24 g
0.60 g
3.60 g
30.00 g
12.00 ml
600.00 ml
1OOO.00 ml
200.00 ml
Die Verbindungen werden dem Medium in geometrischer Verdiinnungsreihe vor der Hitzekoagulationzugesetzt. Die Teswhrchen werden mit 10
pl einer Suspension von M. tuberculosis H 37 Ra in physiologischerKoch
salzlosung (E = 0.1; Spezialkulturgefa Schott-Duran, 18 nun Durchmesser, 546 nm, Eppendorf 1101 M Photometer) beimpft. Dies entspricht eher
Inokulummenge von 5 . lo4 Kei.men/Rohrchen. Nach 21 d Inkubation bei
37 ‘C erfolgt die Auswertung. Als MHK wird die kleinste Konzenhation
bezeichnet, die das Wachstum von M. tuberculosis verhindert.
b) Priifung auf Middlebrook-7H9-Medium
b) Middlebrook-7H9-Liisung
Kaliumdihydrogenphosphat
Dinatriumhydrogenphosphat
L-Glutaminslure
Natriumcitrat
Ammoniumsulfat
Ammoniumeisen(1ll)citrat
Magnesiumsulfat
Pyridoxin
Zinksulfat
Kupfersulfat
Biotin
Calciumchlorid
H2O
Tween 80
Dextrose
i)lsSure- A1bumin-Komplex
a) Priiifung auf Ldwensrein-Jensen-Medium
1.Ooog
2.500 g
0.500 g
0.100 g
0.500 g
0.040 g
0.050 g
I.0mg
1.0 mg
1.O mg
0.5 mg
0.5 mg
900.0 ml
0.5 ml
2.0 g
100.0 ml
Die Verbindungen werden in H2O oder DMSO gelost und der Nhrlijsung in geometrischerVerdiinnungsreihezugegeben. Die Endkonzentration
an DMSO beMgt 2.5%. Die Teswhrchen werden anschlieknd mit einer
Suspension von M. tuberculosis H 37 Ra in physiologischer KochsalzlG
sung so beimpft, daB in den KulturgeftiSen (1 8 mm Durchmesser) eine Extinktionsdifferenzvon 0.04 festzustellen ist (Eppendorf 1101 M Photometer, 546 nm). Dies entspricht 5 . lo6 Keimen/ml. Die Inkubation erfolgt
21 d bei 37 ‘C in einem Rundschiittler (TR-1 und ITH-1, B. Braun-Melsungen, 100 Umdrehungedmin). Das Bakterienwachstumwird Ix tiglich und
5x wochentlichdurch Triibungsmessungausgewertet. Die kleinste Konzentration einer Verbindung. die eine.Wachstumskurve ergibt, die den Wert
0.2 nicht iibersteigt, wird als MHK bezeichnet.
Abweichend werden bei der Herstellung der Middebrook-7H9-NiihrW
den mit hiiheren Albumingehalten entspr. Mengen Rindemrum-Albumin
zugesetzt.
Arch. Pharm. (Weinheim) 322,453456 (1989)
Buchbesprechungen
455
nische PK. bei der Arzneistoffentwicklung, ihren EinfluB auf Pharmakologie, Toxikologie, Voraussagen der PK. beim Menschen, Hinweise auf die
optimale Arzneifom, Chronopharmakologie, Datenauswertung, etc. Die
1 E.H. Lennette, E.H. Spaulding und J.P. Truant, Manual of Clinical
Microbiology, 2. Aufl., S . 908, American Society for Microbiology,
Untersuchungsmethoden sind zwar durch US-Vorgaben gepragt, bieten
Washington 1974.
aber ein gutes allgemein gultiges Bild eines typisch pharmazeutischen Auf2 E. Jawetz, J.L. Melnick und E.A. Adelberg, Medizinische Mikrobiologabenfeldes in der l,,dus,ie, zumal F~~~~~der plaCentagkgigkeit, der
gie. 5. Aufl., S. 272, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York
Konzentrationen in Muttermilch, der Proteinbindung und Datenauswertung
1980.
kritisch gewertet werden. - Als logische Folge behandelt Kap. 5 klinische
3 W. Meindl, Arch. Pharm. (Weinheim) 321,473 (1988).
PK., wiederum nach den Richtlinien der FDA. Hier wird vor einer
4 w. Meindl und R. b s k e , Arch. phmi. (Weinheim), 322,133 (1989).
Uberbewertung von Pk.-Daten zur Voraussage klinischer Effekte gewamt.
5 W. Meindl, Arch. Pharm. (Weinheim). im Druck (1989).
[KPh499] Die Problemstellungen sind nach den klinischen Phasen I, I1 und I11 geordnet und an Beispielen erlautert. - Kap. 6 beschreibt Modelle, die die Absorption nach oraler Gabe durch beschleunigte Magenentleerung und verBuchbesprechungen
stiirkt Motiliat des Magen-Darm-Traktes simulieren. Hier wird u.a auf
schnell resorbierte Wirkstoffe und Absorption unter Carrier-EinfluB eingePharmakokinetics,
gangen. - Das 7. Kap. konzentriert sich auf solche Pk.-Konzepte, die eingeRegulatory, Industrial, Academic Perspectives; P.E. Welling and F.L.S.
setzt werden konnen, um Moglichkeiten und Grenzen der in vivo-Freigabe
Tse, editors; 537 S., Marcel Dekker, Inc., New York and Basel, 1988. Preis
eines Wirkstoffes an vorgegebene Organe zu bestimmen: gesucht werden
150 US-Dollar.
Wirkstoffe, die nicht nur spezifisch an einen bestimmten Rezeptor binden,
Dieses Buch ist Band 33 einer von J. Swarbrick herausgegebenen Reihe
sondem sich auch in der Arzneiform ihr spezielles Zielorgan suchen. Le"Drugs and the Pharmaceutical Sciences". - Vol. 1 und Vol. 15 betreffen
senswen sind die Definitionen fur drug, prodrug, delivery system, u.&. - Im
ebenfalls die Pharmakokinetik, im folgentien PK. abgekurzt. - 26 Autoren
8. Kap. werden Probleme von Bioverfiigbarkeit und Bioaquivalenz, u.a im
haben die 13 Kapitel des vorliegenden Werkes geschrieben. Das 1. Kap.
Hinblick auf Generica besprochen. Hier entwickelt die FDA verbindliche
beginnt mit einer Einfuhrung, die vie1 weiterfuhrende Lit. zitiert und stellt
Kriterien fur die kontrollierte Wirkstoff-Freigabe. Auch in diesem Kap.
die Kompartiment-Modelle vor. Ein bedeutender Abschnitt bespricht die
sind die Definitionen wichtig: man weiB dann, was der entspr. terminus
Nicht-Kompartiment-Analyse mit exakten Definitionen 2.B. von Bioavailatechnicus umfaBt. - Wer - wie der Rezensent - noch nichts gehort hat uber
bility, Metabolic clearance, Total body cilearance, usw. in sog. WortgleiVergleichbarkeit und Widerspruche zwischen "Classic and Population
chungen. Die gegenwartig bedeutsamen Fragenstellen der PK. @.a. UberPharmacokinetics" wird das 9. Kap. lesen, um festzustellen, daB es sich
tragbarkeit toxikologischer Untersuchungen mit im Vergleich zu therapeuhier mehr oder weniger um ein Wortgefecht handelt: klassische PK. betischen Dosierungen hohen Dosen, ,,Ubersetzung" von PK.-Daten fur den
trachtet die individuelle Antwort auf ein Pharmakon, "population based
Kliniker) und einc Liste mit Zukunftsaufgstben fur den Pharmakokinetiker PK. sucht die zentrale Tendenz einer solchen Antwort in einer Population
u.a. individuelle PK. - beschlieben dieses Kapitel. - Ohne Analytik keine
und die Varianz zwischen den Individuen, aber naturlich mu0 das theoretiPK.: im 2. Kap. werden jungste Entwicklungen der Analytik vorgestellt,
sche Konzept, ausgedriickt in der Wahl des Modells, kier entspr. der Zielspeziell die Microcolumn Liquid Chroma1:ography. Laborroboter und Mesetzung ausgewiihlt werden. - Das 10. Kap. behandelt Faktoren, die schon
thoden der chromatographischen Enantiomierentrennung. - In der MLC sind
wilhrend der Entwicklung eines Arzneistoffes im Hinblick auf seine Metaes die Saulen mit Durchmessem von 15 pm - 2 mm, deren Anwendung in
bolisierung beachtet werden sollten. Hier wird deutlich, daJ3 die PK. von
der PK. vorgestellt wird. Vor- und Nachteile werden beschrieben. Der draMetaboliten komplizierter ist als die des zugefuhrten Arzneistoffes, weil
stisch reduzierte Verbrauch an Losungsniitteln gehort zu den Vorteilen.
dessen Verteilung und Metabolisierung der Metaboliten-PK. vorgelagert
Dem stehen u.a. Miniaturisierungsprobleme des Gerateumfeldes gegensind. - Eingehend werden die Leber und ihre metabolischen Aktiviaten beuber. Theoretisch mogliche Vorteile werden gegen die praktische Erfahsprochen: Enzymverteilung, Lipidmembranen, Bindung an Gewebe, usw.
rung abgewogen. Es folgt eine Diskussion von Detektorzellen, der InjekDie Autoren schliekn mit der Wamung vor Modellen zur PK., die biochetionsmengen, der Pumpen und Detektorsytiteme. - Seit 1982 gibt es Labormische, physiologische, anatomische und zirkulatorische Faktoren des
roboter fur Pk.- Probleme, die die Aufarbeiitung von Proben standardisieren
jeweils zum Modell simplifizierten Organes auller Acht lassen. - Das kurze
und so mensclitiche Vanationen ausschli.eBen ("sample preparation and
11. Kap. befaBt sich mit Methoden zu Metabolisierungs- und Metabolitenhandling was the weak link"). Hier werden Fragen nach der Sicherung des
Fragen. Nach den Zellkulturen - Vor- und Nachteile sowie EinschrbkunArbeitsplatzes, der Programmgestaltung, der Datenflutbewdtigung und der
gen in den Aussagen werden diskutiert - wird der Einsatz solcher MikroorLaborsicherheit (reduzierter Kontakt mit Radioaktivitat, etc.) angesprochen. - Der Abschnitt "Chromatographic Techniques for Chiral Resolution"
ganismen besprochen, deren mikrobielles Cytochrom P 450-System dem
von Saugem entspricht. - Es folgen qualitative und quantitative Metaboweist einleitend auf die unterschiedliche Metabolisierung von Enantiomelitenuntersuchungen. Eingehend besprochen ist die HPLC radioaktiv marren bin. Die Autoren fassen Ubersichten eineut zusammen, so daB hier ein
kierter Verbindungen. Detektoren, die ohne Scintillatorzusatz auskommen,
besonders empfehlenswerter Uberblick uber direkte und indirekte Racematverbessem diese Methode. Eine Verbesserung gegenuber konventionellen
trennungen bei GC- und LC-Analysen geboten wird. 155 Lit.-Zitate runden
Wegen stellt die sog. IR-MS dar, keine Kombination von Infrarot- und
allein dieses Kap. ab. - Kap. 3 behandelt Pr'ege der Arzneimittelgabe (oral,
Massenspektrometrie, sondem die Abkurzung von Isotope Ratio-MS, bei
parented). Nach wie vor steht die perorale Applikation, oft sogar als kaufder das Verhatnis von '*N/'% bzw. 'H/'H bestimmt wird. Die anschliemannische Vorgabe, als Ziel einer Medikament-Entwicklung im VorderBenden Besprechungen der MS in vielen Varianten und der 'H- bzw. 13Cgrund. Arzneimittelwechselwirkungen und Wechselwirkungen der A.M.
NMR-Spektroskopie mussen im Rahmen dieses Buches skizzenhaft
mit Nahrungsmitteln bzw. den physiologischen Reaktionspartnerri des
bleiben. - Welche PK.-Probleme treten im Sattigungsbereich der metaboMagen-Dam-Traktes werden besprochen. - Die parenterale Zufuhr umgeht
lisierenden Enzyme aut? Dieses Generalthema behandelt das 12. Kap. Hier
vor allem die Probleme der Bioverfugbarki:it. Fragen der iv., i.m., s.c., inleistet die Michaelis-Menten-Kinetik gute Dienste. Ein erschreckendes Beitraarteriellen, intrathecalen und intraperitonealen Injektion werden besprospiel bietet der exponentielle Anstieg des Phenytoin-Blutspiegels bei lineachen. - Neue Applikationswege folgen: bnccale, nasale und transdermale
rer Dosiserhohung. - Das letzte Kap. behandelt jiingste Entwicklungen z.B.
Zufuhr sowie die Inhalation werden behandelt. Dieses Kap. ist wohl insbeder Chrono-PK. anhand von Beispielen (Indometacin, Li, Cisplatin, usw.)
sondere fur pharmaz. Technologen wertvoll. - Kap. 4 behandelt die vorkli-
Literatur
Arch. Pharm. (Wrinheim) 322.453-456 (1989)
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