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Enantioselektivitt der Biotransformation eines neuen Theophyllinderivats.

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593
Enantioselektivitiit der Biotransformation eines neuen Theophyllindenvats
Enantioselektivitat der Biotransformation eines neuen
Theophyllinderivats*)
Christian Harschea),Herbert OelschlageB)*und Jiirgen Engelb)
Institut fiir PharmazeutischeChemie der Johann Wolfgang Goethe-Universitat,Georg-Voigt-Str. 14, D-6000 Frankfurt am Main
b,
Pharma-Forschung der ASTA-Pharma, D-6000 Frankfurt am Main
Eingegangen am 14. August 1991
7-((RS)2-((RS)-1 -Methyl-2-phenylethylamino)propyl)-theophyllin 3 laDt sich
vorteilhafter durch reduktive Aminierung von 7-Acetonyltheophyllin (4) mit
(RS)-Amphetamin (2) (Diastereomerenverhhltnis 1:1) als durch SN-ReaktiOn
von Proxyphyllintosylat mit (RS)-2 darstellen (Diastereomerenverhdtnis
9:l).
3 ist infolge sterischer Hinderung praktisch kein Rodrug mehr fiir die intermediiire Bildung von (RS)-2 (Ratte). Die Enantioselektivitiit des nach oraler
Gabe im 24-h Ham in Mengen von ca. I% der Dosis aus 3 gefundenen
(RS)-2 wurde HPLC auf einer Cyclobond-Saule iiber seine Isoindolderivate,
gebildet aus o-Phthalaldehyd, Thioglykolsaure und 2, zu 65.2% (Bereich
63-688) S(+)- und 34.8% R(-)-Amphetamin (Bereich 32-37%) bestimmt.
Problemstellung
Fenetyllin (Captagon@,1) wird seit iiber 23 Jahen erfolgreich zur Therapie des hyperkinetischenSyndroms bei Kindem eingesetzt”. Im Vergleich
rnit Amphetamin (2) und verwandten Psychostimulantien tritt nach seiner
Gabe psychische Abhiingigkeit wesentlich seltener ein”. Neuere Untersuchungen betonen sein eigenstiindiges Wirkprofil*)und folgem daraus, da6 1
zu Unrecht untes die Betiiubungsmittelverschreibungsverordnung gestellt
worden ist, weil es in gewissem Umfang ein Prodrug fiir 2 ist.
Unsere Arbeitsgruppe beschiiftigt sich seit geraumer %it rnit der Frage
der Stereoselektivitiit des Metabolismus von 1zu 2 sowohl an der Ratte als
auch am Menschen. Die Versuche an Ratten (Schlundsondierung) fiihrten
zu dem Ergebnis, da6 die oxidative N-Dealkylierung von 1 unter Bildung
von 2 nicht stereospezifisch,sondern stereoselektivverltiuft.
Das entstandene Amphetamin setzt sich im Durchschnitt (n = 6) aus
63.3% S(+)- und 36.7% R(-)-Enantiomer zusammen. Das VerhlUUtnis S zu R
der Stereoisomeren betriigt somit 1.7S3? Die Versuche an Probanden (n =
6) ergaben nach oraler Gabe fur 2 ein Verhamis von S zu R von 1.32, also
im Mittel einen Anteil von rund 57% S(+)-Amphetamin3), dessen zentralstimulierende Wirkung 3-Smal @ b r ist als die des R(-)-Enantiomeren4’.
Unter quantitativen Aspekten wurde bei der Ratte nach oraler Applikation
von 10-50 m a g 1eine Bildung von (RS)-2 zu ca. 4.3% der Dosis (Bereich
2.5-6.84). beim Menschen nach oraler Dosis von SO mg 1durchschnittlich
11.3% (Bereich 5.5-16.9%), ermittelt3! Diese Ergebnisse wurden mit Hilfe
einer von Oefschfigerund Fend?) entwickelten Reaktion erzielt, die auf
der Bildung der S(-)-Phenylethylisocyanat- (= PEIC) Derivate und HPLCT r e ~ ~ der
n gbeiden Stereoisomereals Diastereomereberuht. Die Derivatisierung von Amphetamin, aber auch von Fenetyllin, mit S(-)-PEIC verlauft
in unprotischen Uisungsmitteln (z.B. Diethylether oder Ethylacetat) nach
halbstiindiger Reaktion nahezu quantitativ.
Ziel unserer z.Zt. laufenden prap. Bemiih~ngen~)
ist es,
biotransformationsstabile Fenetyllinderivate zu finden, deren pharmakodynamisches Profil im Rahmen des Fenetyl*)
Enantioselective Blotransformation of a New Theophylline Derivative
Reductive amination of 4 with (RS)-2 is an improved method to obtain
7-((RS)2-((RS)-l-Methyl-2-phenylethylamino)propyl)-theophylli~(3) (ratio of diastereomers 1:l) compared with SN-displacement of proxyphyllintosylate with (RS)-2 (ratio of diastereomers 9:l). Due to steric hindrance 3 is
no noteworthy prodrug for the intermediate formation of (RS)-2 in rats. The
enantioselectivity of 2 after a single oral dose of 3 is determined in 24-h
urine by HPLC on a Cyclobond-column using the isoindole derivatives,
formed from o-phthalaldehyde. thioglycolic acid, and 2. The R(-)-amphetamine isomer is formed to a lesser amount (34.8%, range 32-37%) than the
S(+)-isomer (65.22, range 6348%).
Iin-Profils liegt, die aber kein Prodrug fur 2 darstellen. iiber
eine erste Substanz, die diesen Anfordemngen entsprechen
konnte, haben wir bereits berichtet6).
Ergebnisse
Das 7-((RS)2-((RS)-1-Methyl-2-phenylethylamino)propy1)-theophyllin (3) wurde durch Umsetzung von (RS)Proxyphyllintosylat rnit iiberschiissigem (RS)-2 bei 150°C
in 35~1-02,Ausbeute (Diastereomerenverhaltnis 9: 1, ‘HNMR-Spektrum) erhalted). Vorteilhafter l%t sich 3, wie
wir fanden, durch reduktive Aminiemng von 7-Acetonyltheophyllin (4)’) mit (RS)-2 unter Normaldruck und 6OoC
bei Einsatz eines 5proz. Pd-Katalysators gewinnen (Diaste1:I, genau 495 1 ‘H-NMR-Spekreomerenverhiiltnis
trum). Die Ausbeute betragt 52%, wahrend die SN-Reaktion
nur 35% erbrachte.
3 besitzt 2 Chiralitatszentren,dernzufolge sind 2 Enantiomerenpaare moglich, die auf einer Chiralcel OD-Saule
nachgewiesen werden konnten.
3 wurde als Diastereomerengemisch an Mausen im Vergleich mit (RS)-2 und 1auf motorische Aktivitat im Motility-Test nach Boissier und auf psychostimulierende Wirkung
im Tail-Suspension-Test geprtift, wobei die tierpharmakologischen Befunde gut rnit dem pharmakologischen Wirkprofil von 1,nicht aber mit dem von (RS)-2 iibereinstimmten6).
Hinsichtlich der Biotransformation von 3 zeigten Versuche an Ratten (n = 8, orale Gabe), daE durchschnittlich nur
1% der theoretisch moglichen Menge (RS)-2 bei der Korperpassage gebildet wird, was bedeutet, daB 3 im Vergleich
zu 1lediglich zu 115 in Richtung auf 2 metabolisiert wird6).
-
H e m Prof. Dr.M.Protiva, Prag, in freundschaftlicherVerbundenheit zum 70. Geburtstag gewidmet.
Arch. Pharm. (Weinheim) 325,593-595 (1992)
OVCH VerlagsgesellschaftmbH, D-6940 Weinheim, 1992 0365-6233/92/0909-0593 S 3.50 + .1-5/0
594
Harsche, Oelschlgger und Engel
1
CH3
mit Thiolen und primaren Aminen unter Bildung von Isoindoldenvaten an. Anstelle des bevorzugten wenig polaren
P-Mercaptoethanols wurde Thioglycolsaure (TGA) als
Thiol eingesetzt, da die TGA-Isoindolderivate von 2 aufgrund der starken Polaritat der Carboxylgruppe leichter von
der verwendeten Cyclobond-I-Saule eluieren.
2
TGA-lsohdol-derivat
Abb. 3: Reaktion von 2 mit o-Phthalaldehyd und Thioglykolsiiure
-4
CH3
Abb. 1: Formeln der Verbindungen 1-4
0
1
0
1
1
H
,
1
10 20 30 40
1
1
1
1
I
2 622 8J
Neben dem Vorteil der sehr kurzen Dauer (1 min) der
Derivatisierungsreaktion bietet das Verfahren auch die
Moglichkeit, eine enantioselektive HPLC fur 2 im Reversed-Phase-Modus durchzufuhren. Die quantitative HPLCAnalytik von Amphetaminen durch Pre-column-Derivatisierung mittels dieser Reaktion wurde bereits 1982 von Fame11
und JefSeries") entwickelt, aber die Frage der Stereoselektivitat hatten die Autoren ausgeklammert.
Das UV-Absorptionsmaximum des TGA-Isoindolderivats
liegt in ijbereinstimmung mit analogen Isoindolderivaten
bei 340 nm. Unter diesen Bedingungen erhielten wir eine
sehr gut analytisch verwertbare Trennung der Enantiomeren
(o! = 1.08, R = 1.3).
-
t hinl
Abb. 2: Trennung von 3 in die Stereoisomeren
t
In
Eine offene Frage war nun, in welchem Verhalmis die
Stereoisomeren von 2 bei der Biotransfonnation von 3
durch die Ratte entstehen. Da die Abklarung der Stereoselektivitat iiber die PEIC-Derivate, also als Diastereomere,
durch HPLC auf achiralen Saulen einen erheblichen expenmentellen Mehraufwand impliziert, haben wir den Versuch
unternommen, eine direkte HPLC-Trennung der Enantiomeren von 2 auf chiralen Saulen als Isoindolderivate durchzufuhren. Erfolgreiche Versuche, eine Trennung auf chiralen
Saulen durch Normalphasenchromatographiezu erreichen,
wurden bereits von Nagai und Kamiyama') sowie von Doyle und Brunnep) durchgefuhrt, nachdem die Enantiomere
von 2 in ihre Benzoylderivate bzw. 3,5-Dinitrobenzoylderivate ubergefiihrt worden sind. Ein Nachteil dieser Verfahren
ist aber, daL3 zunachst zeitaufwendig die Amide durch 20
min Reaktion in wasserfreiem Milieu hergestellt und danach
extrahiert werden mussen.
Unser analytisches Verfahren lehnt sich an die von Sirnons
und J ~ h r n o n gefundene
~~)
Reaktion von o-Phthalaldehyd
b
io
io
io
& &-t
lrninl
Abb. 4: Trennung der TGA-Isoindol-Derivate von 2
Im 24-h Sammelham von 6 mannlichen White WistarRatten (250-300 g) wurden nach einmaliger oraler Gabe
(Schlundsondierung von 80 m@g von 3 als Diastereomerengemisch) die durch oxidative N-Dealkylierung gebildeten 2-Enantiomeren bestimmt.
Tab. 1 zeigt, da8 R(-)-2 zu durchschnittlich 34.8% (Bereich 32-3796) und S(+)-2 zu 65.2% (Bereich 63-68%) gebildet wird.
Die Gesamtmenge an durch Biotransformation entstandenem 2 liegt, wie bereits berichtet6', bei ca. 1% der applizierten Dosis 3.
Dem Fonds der Chemischen Industrie, Frankfurt a.M., und der Deutschen Forschungsgemeinschaft, Bonn-Bad Godesberg, sind wir fur die F6rderung vorstehender Arbeit verbunden. Herrn Dr.D.Rorhley danken wir
fur wenvolle Diskussionen.
Arch. Pharm. (Weinheim)325,593-595 (1992)
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Enantioselektivitiit der Biotransformation eines neuen Theophyllinderivats
-
o
io
20
30@&
3.96 (m; 4H. N-CH2), 3.41 und 3.36 (s; 3H, N-CH,, N-3), 3.23 und 3.19 (s;
3H, N-CH3, N-l), 3.13-3.05 (m; 2H, CH-N), 2.80-2.76 (m; 2H, N-CH),
2.71-2.65 und 2.41-2.31 (2m; 2H, CH2-Phenyl), 1.34 und 1.22 (s; IH, NH,
aust.), 0.91 und 0.85 (d;J = 7 Hz, 3H, N-CH2-CH-CH3),0.89 und 0.76 (d;
J = 7 Hz, 3H, Phenyl-CH2-CH-CH3).
SI.1
Biotransformation
-
t lminl
Abb. 5: HPLC-Chromatogramm (24-h Ham) der Amphetamin-Enantiomere und intemer Standard (Phenylethylamin)
Tab. 1: R(-)- und S(+)-Amphetamin (in %) im 24-h Ham, entstanden
durch Biotransformation von 3
R(-)-Amphetamin
S(+)-Amphetamin
32
35
34
37
36
35
68
65
66
63
Ratte 1
Ratte 2
Ratte 3
Ratte 4
Ratte 5
Ratte 6
64
65
An 6 manniiche White-Wistar Ratten (250-300 g, Fa. Ivanowas, KisslegglBRD) wurde 3-Hydrochlorid oral (80 m@g) als waSrige Losung per
Schlundsonde appliziert. In Stoffwechselkatigen wurde der 24-h Ham gesammelt und sofort aufgearbeitet. Die Urinproben wurden mittels Festphasenextraktion iiber Bondelut Certify-Kartuschen (ICT, Frankfurt) nach der
von Analytichem International empfohlenen Methode extrahiert. Die Eluate wurden im trockenen N2-Strom bei 35°C eingeengt, der Ruckstand wurde in 1 ml H20 gelost. Nach Zugabe von 100 p1 o-Phthaldialdehyd-Rz. (Fa.
Sigma-Chemie, Deisenhofen, BRD, ohne Thiolzusatz; das Rz. enthat 50
mg o-Phthaldialdehydund 3 g Borsaure in 100 ml H20, eingestellt auf pH
10.5) und 100 p1 ThioglycolsSurel6sung (100 pl TGA auf 15 ml Methanol)
wurde 1 min geschiittelt und danach mit Eluens verdiinnt. Zur HPLC-Untersuchung wurden 20 p1 eingesetzt.
HPLC-Parameterf i r Amphetamin
ERMA ERC-7210, UV-Detektor h = 340 nm.- Saule: Cyclobond-I
(250/4.6 mm, Astec).- Eluens: 18 Teile Acetonitril (Merck), 82 Tei1e.- 20
mmol NH4N03/2 mmol Tetrabutylammoniumbromid (Fluka) Puffer, pH
6.15 (isokratisch).- Flow rate: 1.5 ml/min.- Int. Standard PhenylethylaminHCl(50 pglml), Schmp. 221°C.
HPLC-Parameterfiir IEnanriomere
Experimenteller Teil
Shimadzu SPDdA, UV-Detektor h = 271 nm.- Saule: Chiralcel OD
(250/4.6 mm, Daicel).- Eluens: Hexaflthanol (99 + l)/plus 0.1 ml Triethylamin.- Flow rate: 1.0 ml/min.
Synthese von
7-((RS)2-((RS)-l -Methyl-2-phenylethylamino)propyl)-theophyllin
(3)
Literatur
1.5 g (0.0064 mol) 7-Acetonyltheophyllin,bereitet aus Theophyllin-KSalz und Chloraceton gem56'). und 1.8 g (0.0132 mol) racem. Amphetaminbase werden in 70 ml wasserfreiem Ethanol unter Zugabe von 300 mg
5proz. Pd/C-Katalysator und 2 g getrocknetem Na2S04 bei 60°C unter
Nonnaldruck bis zur Beendigung der H2-Aufnahme hydriert (= 4 h). Man
l a t abkiihlen, filaiert und destilliert das Losungmittel i.Vak. ab.- Der
Ruckstand wird sc iiber 70 g Kieselgel Woelm TSC (Saule 50 x 2.5 cm)
mit Ethylacetat/Ethanol(95 + 5) gereinigt. Die Produkt-Fraktionen werden
vereinigt (dc Priifung) und i.Vak. eingeengt. Das zuriickbleibende 61 wird
in Diethylether gelost und mit etherischer HCI versetzt: Hydrochlorid als
1: 1 Diastereomerengemisch. Schmp. der farblosen Kristalle 234-241"C.
Ausbeute 1.3 g (52%).
G. Kristen, A. Schaefer und A. v. Schlichtegroll, Drug Alcohol Depend. 17,259 (1986).
2 B. Nickel, G. Niebch, G. Peter, A. v. Schlichtegroll und U. Tibes,
Drug Alcohol Depend. 17,235 (1986).
3 R. Fendt, Dissertation, UniversitZt Frankfurt a.M. (1990).
4 R. Young und R.A. Glennen, Med. Res. Rev. 6, 108 (1986).
5 C. Harsche, Dissertation, UniversitXt Frankfurt a.M. (in Vorbereitung).
6 H. Oelschlager, C. Harsche und J. Engel, Arch. P h m . (Weinheim)
324,543 (1991).
7 R. Zelnik, M. Pesson und M. Polonovski, Bull. SOC.Chim. Fr., P. 888
(1956); rf. C.A. 51,1203 (1956).
8 T. Nagai und S. Kamiyama, J. Chromatogr. 525,203 (1990).
9 T.D. Doyle, C.A. Bnmner und D.G. Cunningham, Poster Presentation,
Association of Official Analytical Chemists Annual Meeting, Palm
Beach,FL,U.S.A., 1988.
10 S.S. Simons und D.F. Johnson, J. Org. Chem. 43,2886 (1978).
11 B.M. Farrell und T.M. Jefferies, J. Chromatogr. 272, 111 (1983).
[Ph982]
Spektroskopie der 3-Base
Bruker AC 300, 'H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, TMS als int. Standard.-
6 (ppm) = 7.99 und 7.81 (s; lH, H-8), 7.27-7.03 (m;lOH, aromat.), 4.18-
Arch. Pharm. (Weinheim)325.593-595 (1992)
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