Isolierung eines Gallussuremethylesters aus Cotinus Coggygria Scop. Rhus cotinus L. durch Chromatographie an Polyamid
код для вставкиСкачатьARCHIV DER PHARMAZIE UND BERICHTE DER DEUTSCHEN PHARMAZEUTISCHEN CESELLSCHAFT -~ Juai 1958 291./63. BAND - ~ ~ Heft 6 _. 1671. L. Horhammer, H. Wagner, J. Izquierdo und H. Endres Isolierung eines Gallussauremethylesters aus Cotinus Coggygria Scop. (Rhus cotinus L.) durch Chromatographie an Polyamid*) Bus dem Institut fur Pharmazeutische Arzneimittellehre der Universitiit Mlinchen Direktor: Prof. Dr. L.H&hmmer und dem Max-Planck-Institut ftir EiweiO- und Lederforschung, Miinchen Direktor: Prof. Dr. W . araaemann (Eingegangen am 30. Januar 1968) Eine papierchromatographische Untersuchung methanolischer Ausziige verschiedener Cotinm- und Rhus-Arten ergab, da13 dicse neben dem von W . Grassm u m und Mitarbeiternl) a m Rhus coriaria und Rhus typhina isolierten Gallussauretetrasaccharid (I)noch eine zweite Eisenchlorid-farbende Verbindung (11)enthalten. Die Substanz liegt mit einem Rf-Wert von 0,80**)hoher als I (R,= 0,63), sie ist im Gegcnsatz zu I durch Azeton nicht extrahierbar und liefert bei der Hydrolyse ebenfalls Gallussaure. Zur Isolierung von I1 gingen wir von Cotinus-Coggygria-Bliittern aus. I n dem methanolischen Extrakt waren die beiden Gallussiiure-Derivate und drei Flavone nachweisbar. Eine Trennung der beiden ersten gelang dureh Vorfraktionierung des in Wasser aufgenommenen Estraktes mit einem Gemisch am gleichen Teilen k h e r und Benzin. Substanz I1 ging quantitativ in die organische Phase uber, wahrend Substanz I im wiiBrigen Extrakt verblieb. Um auch die flavonischen Bestandteile abzutrennen, benutzten wir das chromatographische Verfahren an einer Polyamidsiiule (Perlon), das bereits bei der Auftrennung eines Fichtenrindengerbstoffesz) mit Erfolg benutzt worden war. Fur 7,7 g Mischlnistallisat wiihlten wir eine Saule von 36 cm Fiillhohe und 6 cm Durchmesser. Eluiert wurdc nacheinander mit Wasser, Wasser-Methanol, Methanol und einem Methanol-hetonGemisch und das Gesamteluat auf Grund der Eisenchloridreaktion, des Zirkonoxychloridtestes und nach einer papierchromatographischen Priifung in zwolf Fraktionen unterteilt. Substanz I1 fand sich nahezu quantitativ in der ersten Fraktion, braun gefarbte Verunreinignngen verblieben in den Fraktionen 2 bis 9, wahrend die Flavone in den Fraktionen 9 rnit 11 erschienen. I n einem zweiten Arbeitsgang gelang die Isolierung von I1 auch ohne vorherige Extraktion mit einem Ather-Benzi ngernisch. *) Herrn Prof. Dr. L.Bruiimr, Direktor des Botanischen Instituts d. Univ. MUnchen, zum 60. Geburtstag gewidmet. * *) Liisungsmittelsystem: Butanol-Eisessig-Wuer (4 1 5). 1) W.Osaasmann, a. fltie,fenhofer und H . Endres, Chem. Ber. 89, 454 (1956). e ) W . Oraasmann, H.Endres, W. Pauckner und If. Mathes, Chem. Ber. 90, 1125 (1957). + + Archlv 291./63. Heft 6 19 270 Horhammer, Wagner, I z q u i e r d o unrl E n d r e s Archiv der Pharmezte Die leichte Eluierbarkeit von Sub-stanz I1 deutete darauf hin, daD das Molekiil nur wenige, zur Wasseratoffbriickenbildung befahigte Gruppen enthielt. Verglichen mit der Laufgeschwindigkeit der Flavone aus demselben Rhus-Extrakt und in ubereinstimmung mit den von W. 6k2.mnunn3) fiir einfache Phenole und von L.H6rhammer4) fur Flavone gefundenen GesetzmiiDigkeiten bei der Chromatographie an Polyamid, waren fiir I1 hochstena drei phenolische Gruppen zu postulieren. Diese Vermutung hat sich, wie am dem folgenden ersichtlich ist, voll und ganz bestatigt. Die Chromatographie an Polyamid gestattet demnach bei Stoffen mit Wasserstoffbriicken-ausbildenden Substituenten eine wesentlich genauere Vorhersage uber Zahl und Anordnung funktioneller Gruppen, a h dies auf Grund ihres Verhaltens an Adsorbentien oder bei der Verteilung zwischen zwei Phasen moglich ist. Nach dem Umkristallisieren aua heiDem Wasser resultierten aua der eraten Fraktion 3,8 g einer bei 198--200" C schmelzenden weiden Substanz. Wir hydrolysierten mit Schwefelaaure und isolierten a m der kherausschuttelung schmelzpunktsreine Gallussaure (Smp. 236-240" C). Auf Grund der Molekulargewichtsbestimmung (Molekulargewicht nach Rast = 184) schied eine Zugehorigkeit zur Gruppe der Gallokatechine aus. Die Differenz von 184 zu 170 (Mo1.-Gew. der Gallussaure) wurde durch eine Methoxylgruppe (Mikro-Zeisel) erklart. Zusammenstellung der Analysenwerte : her. 52,10yv 4.35% 10.84% 184,O gef. C H OCH, Molekulargewicht nach Ilaat Esterzahl 51,86% 4934% 17,0% 184 309 305 Die Entscheidung ob Ester- oder hhermethoxyl war durch die leichte Hydrolysierbarkeit mit Saure und die quantitativ verlaufene Tannasespaltung gegeben. Zum Nachweis des Methylesters wurde die Substanz mit K a b u g e verseift, der gcbildete Methylalkohol mit Wasserstoffsuperoxyd oxydiert und als Formaldehyd mit Schiffs Reagenz nachgewiesen. Der isolierte Ester stimmte im Schmelzpunkt, UV-Spektrum und IR-spektroskopisch (Abb. 1 und 2) mit dem von u s dargestellten Gallussauremethylester iiberein. - Zifcm-') P-3, Abb. 1. IR-Spektrum von Cfallussiiurernethylester isoliert W . Qraasmann, H. Hbmann und A. Had, Mekromolekulare Chem. 21, 37 (1956). L. Hbhammer, H. Wagner und .'fI Leeb, Naturwissenschaften 44, 513 (1966). ?91./63. Bd. 1958, Nr.6 Iaolierung einea aaUuesiiuremethyhter.3 aue Cotinue Cogg ygria B c o ~ . 2 7 1 ~~ - . ~ ~ ~ ~ 7- 1100 .$80 2 60 2 Ml wet, 8 1 2 3 l 4 I 5 I I -" 6 7 8 I I , I , I 9101112737415 PAbb. 2. Spektrum von Cduasiiurcmethylester synthetiaiert. Bei den anderen Rhus- und Cotinus-Arten, die laut Chromatogamm ebenfalls diesen Ester enthalten, handelt es sich u m Cotinus oboratus Raf. (C. americanus Nutt.), Cotinus Coggygria Scop., var. purpureus (Dupuy-Jamin), A. Rehd. u. cult. rubra (hort. bot. mon.), Rhus trilobata Nutt., Rhus oxyacantha Cav., €&us toxicodendron L., Rhus typhina L. und Rhus glabra L. *). tfber die Auftrennung und Identifizierung der Flavone berichten wir in einem anderen Znsammenhang. Diskassion Ein Gallussauremethylester wurde bisher nur aus den Friichten von Caesalpinia brevifolia (Cae~alpiniaceae)~) und Juglans regia (Juglandaceae)6), ferner aua einem Vertreter der Geraniaceee'), der Euphorbiaceae*) und der Sapindaceaeg) isoliert. Die Isolierung auch aus Cotinus coggygria und der papierchromatographische Nachweis in anderen Arten der gleichen Familie zeigt, daS dieser Ester im Pflanzenreich weiter verbreitet ist a h fr&er angenommen wurde. Nachdem Li. Erdtmannlo), J. I€erzigll) und Wrzlich auch B. E. Hathaway12) in Modellversuchen zeigen konnten, daI3 nur Gallussaureester, nicht aber Gallussaure selbst unter bestimmten Bedingungen iiber Hexaoxydiphensaure als Zwischenglied zu Ellagsame dehydrierbar sind und andererseits Ellagsaure in der Pflanze meistens mit Gallussauremethylester zusammen auftritt, darf angenommen werden, daI3 dieser Weg auch in der Pflanze beachitten wird. Zu ahnlichen Befunden kam auch W. &ntherlS) bei seinen Stndien tiber Corilagin, das er ah den Diester einer Hexaoxydiphensaure identifizieren konntc. Es ist nicht ausgeschlossen, da13 der Gallussauremethylester daruber hinaus auch beim Aufbau anderer hoher molekularer Gallotannino eine wiahtige Rolle spielt. - - *) Wir danken Herrn Dr. Dr. Heina Heine, Botanisches Institut der Universitat Miinohen, fur die Bcstimmnng der einzelnen Subspezies. b, M.Niere&in, Collegium [Haltingen] 162, 197 (1906). 6, L. Jurd, J. h e r . chem. SOC. 78, 3445 (1966). ?) H . H w i k a w und Y.Ina, J. pharmac. SOC.Japan 60, 12.5 (1940); E. Fyikuwa, J. Nakumura und K . Aeami, J. pharmac. SOC. Japan 62, 343 (1942). a) K . Hutii, H. Huizkawa nnd Y.Kudo, J. pharmac. SOC. Japan 67, 140 (1937). 0 ) 61. J . Carlaon, P. Olynyk. H . Duncan und A . S m l i n , Antibiot. u. Chemother. I , 431 (1951). 10) H . Erdtmann, Svensk kem. Tidakr. 47, 230 (1935). 11) J . Herzig, J . Pollak und ill. v . Bronneck, Mh. Chem. 29. 277 (1908). 19) E . Huthaway, Riochem. J . 67, 445 (1957). 18) W.aiint?w-,DipLArboit, UniversitBt Heidelberg, 1956. 19 * 272 Hiirhammer, W a g n e r , I z q u i e r d o und Endres Archiv der Pharmazie Beschwibung der Veraache 1. I s o l i e r u n g d e s Gallusstiuremethylesters 1,5 kg luftgetrocknete, geschnittene Bltitter aus dem Botanischen Garten, Miinchen*), wurden im Soxhlet mit 9Oxigem Methanol erschopfend extrahiert. Die Abtrennung des Chlorophylls erfolgte nach Entfernung des Nethanols in iiblicher Weise durch Aufnahme des bis zur Sirupkonsistenz eingedampften Extraktes in Wasser und anachlieBende Filtration. Fiir die weitere Reinigung versetzten wir das Filtrat wiederum mit einem merschul3 an destilliertem Wasser, worauf die letzten Ballaststoffe ausfielen. Die Lijsung lieI3en wir iiber Nacht im Eisschrank stehen und zentrifugierten vom Riickstand ab. Zur Trennung von I1 und I wurde der wiisserige Extrakt mit einem Ather-Benzin-Gemisch (1 : 1) so lange ausgeschiittclt, bis papierchromatographkch keine Substanz I1 im wasserigen Ruckstand nachweisbar war. Dic Gesamtmenge des Ather-Benzin-Gemisches betrug 1,5 1. Nun wurde abdestilliert, dcr Riickstand gcaammelt und bei 90" getrocknet. Fiir die Abtrennung dcr Flavone verwendetcn wir cine SBule mit 36 cm Polyamidfiillhohe und 6 cm Durchmesser. 220 g Perlonpulver, fein, h c h e n w e i t e 0,2 mm (DIN 30) der Farbwerke Hoechst (Werk Bobingen) lieBen wir 2 bis 3 Stunden in Wasser quellen und schltimmten anschlieBend den Brei in kleinen Portionen in die Glase&ule,die a m unteren Ende mit einer Glaafritte und einer h g e Watte versehen war. Vor dem Auftragen der Substanz wuschen wir rnit etwa 1 Wasser nach bis die Eluate frei von Schwebeteilchen abtropften. Nun losten wir 7,7 g des KristallisaM in 25 ml Methanol und trugen mit einer Pipette auf die Stiule auf. Bei einer Abtropfgeschwindigkeit von 2,5 ml pro Minute passierten im Verlauf von 3 Tagen nacheinander 7 Losungsmittel bzw. -gemkche dic Sriule: 1. destilliertes Waaser, 270 ml, 2. Wwer-Methanol-Gcmisch 4 : 1, 900 ml, 3. Wasser-Methanol-Gemisch 3 : 2, 460 ml, 4. Wasser-Methanol-Gemisch 1: 1, 900 ml, 5. Wasser-Methanol-Gemisch 1: 3, 10,9 1, 6. Methanol, 7,7 1, 7. Azeton-Methanol 1 : 1, 10 1. Der Usungsmittelwechsel erfolgte jewe& dann, wenn die Elavonzonen mit einem der Losungsmittel keine weaentliche Wandcrungsgeschwindigkcit mchr in der Siiule hatten. Die Tcstung der einzelnen Fraktionen erfolgte 1. mit 2%iger methanolischer Zirkonoxychloridlosung, 2. mit 2%iger tithanoliacher Eisenchloridbsung und 3. papierchromatographisch im System Butanol-EisessigW w e r (4 1 5 ) ; Spriihreagenzien: 5%iges Aluminiumchlorid und 2%ige iithanolische Eisenchloridlosung. Eluatfraktion I wurde zur Trockene eingedampft und die hierbei resultierende Substanz (3,8 g) aus heiBem Wasecr bis zur Schmelzpunktskonatanz umkristaUisiert (Schmp. 198-200" C). + + 2. Siiurehydrolysc 250 mg Substanz wurden mit 50 ml 2,5yoiger Schwefelsilure 2 Stunden am RiickfluD erhitzt. Nach dem Erkalten extrahierten wir die Hydrolyseloeung mehrmala mit je 50 ml Ather, brachten den Ather zur Trockene und kristalliaiertan die zuriickbleibende Substanzmenge aua heiBem Wasscr um (Schmp. 235-240' C, R,-Wcrt in Butanol-Eisessig-Wasser 0,80). 3. E n z y m a t i s c h e H y d r o l y s e 100 mg Substanz wurden in einer Reibschale mit 50 mg Tannase (Spaltwert 47), die nach einer Vorschrift von Fredmberg und VoUbrechP) aus Aspergillus niger hergestellt worden war, vermischt und mit 20 ml Wasser zu einem Brei verriihrt. Die Inkubation erfolgte bei 30' C unter of5rem Umschiitteln. Kach 3 Tagcn wurde die Lasung in gleicher Weise wie unter 2. mit Ather extrahiert und der Riichtand papierchromatographich untemuch t,. *) Wir danken Herrn Professor Dr. L. Brauner, Direktor des Botanischen Gartens, Miinchen, ftir die Vberlassung des Pflanzenmaterials. 14) Collegium [Darmstadt] 468 (1921) 11. 398 (1927). 291./63. Bd. 1958, N ~6 . Isolierung eines &lluasauremethyhters am Cotinu.9 Coggygrk 3 w p . 273 4. Bestimmung der E s t e r z a h l 0,9846 g Ester wurdc mit 25 ml n weingeistigcr KOH (F = 1,002) am RUckfluB 1 Stunde verseift. Zur Riicktitration waren 14,20 ml 1/2 n HCl (F = 1,0) notig, was einem Verbrauch von 10.80 ml KOH entsprwh. Die Esterzahl errechnete sich m h der Glei10 80 1 002 * 28 055 ’- -’zu 309. Esterzahl authentischen Gdussituremethylchung x = 0,9846 esters = 305. - 5. R’achweis des Methylesters 2 ml der nach 4. erhdtenen alkalischen Lijsung wurden mit verdiinnter Schwefelsirurc angesiruert, mit Ather extrahiert, die wcisserige Losung asschliefknd mit 2 ml 3%igem Wasserstoffiuperoxyd veraetzt und 5 Minuten lang erhitzt. Auf Zusatz von 2 ml SchiffaReagens (fuchainschweflige Siiure) entstand die fiir Formaldehyd typische Rotfirbung. 6. Synthese des Gallussaurcmethylesters 8 g Gallussiure wurden mit 20 ml Mcthylalkohol und 0,5 ml konzentrierter Schwcfelskure 10 Stunden am RiickfluB zum Sieden erhitzt, iiber Nacht stehen gelwen, hierauf der Methyhlkohol abdestilliert, der Riickstand mit 10 ml kaltem Wasser vermischt, abfiltriert und mit wenig kaltem Wasscr gewaschen. Umkristdisation aus heiI3em Wrtsser Schmp. = 236-240O C. . 7. S p e k t r e n Die W-Measung erfolgte im Unicam-QuarzspektrophotometerSP 600 in methanolischer Lijsung bei einer Schichtdicke von 1 cm Konzentration = 1,2 mg/lOO ml. Maximum1 = 220 mp (log = 4,36), Maximumn = 275 mp (log = 4,OO). Aufnahme des 11%-Spcktrumsmit einem Leitz-Gerat.; Konzentration 1 mg/l6O nig KBr. 8. Papierchromatographie Chromatographiert wurden irthanolixche Extrakte der einzelnen Drogen auf Schleicher & SchW-Papier 2043b GI. in den Systomen (a) Butmol-Eiseasig-Wasser (4 1 5) und (b) Isopropanol-Eisessi~~V~ser (7 1 -/- 2) absteigend. Spriihreagenzien: 2%ige + + + iithanolische Eisenchloridlosung zum Nachweis der Gallussirurederivate und 6%ige Aluminiumchloridlosung znm Nachweis der Flavone. Rf-Wert des Gellueaituremethylesters in (a) = 0,80, in (b) = 0,17. Wir danken Herrn Dr . I. TJgi, Organisch-Chemisches Institut der Universitat Munchen (Direktor: Prof. Dr. R. Huisgen) fur die Aufnahme der IR-Spektren, ferner Herrn Ih. MoZZer, Farbwerke Hoechst, Werk Bobingen, fiir die tfberlessung des Perlonpulvers. -~ ~ Anschrift: Prof. Dr. I,. H6rhammer. Inatitut fiir pharmazeutische Arzneimittellehre, Mlinchen 2, XarlstraOe 29.
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