Isolierung eines Gallussuremethylesters aus Cotinus Coggygria Scop. Rhus cotinus L. durch Chromatographie an Polyamid

ARCHIV DER PHARMAZIE
UND BERICHTE DER DEUTSCHEN PHARMAZEUTISCHEN CESELLSCHAFT
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Juai 1958
291./63. BAND
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Heft 6
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1671. L. Horhammer, H. Wagner, J. Izquierdo und H. Endres
Isolierung eines Gallussauremethylesters aus Cotinus
Coggygria Scop. (Rhus cotinus L.) durch Chromatographie
an Polyamid*)
Bus dem Institut fur Pharmazeutische Arzneimittellehre der Universitiit Mlinchen
Direktor: Prof. Dr. L.H&hmmer
und dem Max-Planck-Institut ftir EiweiO- und Lederforschung, Miinchen
Direktor: Prof. Dr. W . araaemann
(Eingegangen am 30. Januar 1968)
Eine papierchromatographische Untersuchung methanolischer Ausziige verschiedener Cotinm- und Rhus-Arten ergab, da13 dicse neben dem von W . Grassm u m und Mitarbeiternl) a m Rhus coriaria und Rhus typhina isolierten Gallussauretetrasaccharid (I)noch eine zweite Eisenchlorid-farbende Verbindung (11)enthalten. Die Substanz liegt mit einem Rf-Wert von 0,80**)hoher als I (R,= 0,63),
sie ist im Gegcnsatz zu I durch Azeton nicht extrahierbar und liefert bei der Hydrolyse ebenfalls Gallussaure.
Zur Isolierung von I1 gingen wir von Cotinus-Coggygria-Bliittern aus. I n dem
methanolischen Extrakt waren die beiden Gallussiiure-Derivate und drei Flavone
nachweisbar. Eine Trennung der beiden ersten gelang dureh Vorfraktionierung
des in Wasser aufgenommenen Estraktes mit einem Gemisch am gleichen Teilen
k h e r und Benzin. Substanz I1 ging quantitativ in die organische Phase uber,
wahrend Substanz I im wiiBrigen Extrakt verblieb. Um auch die flavonischen
Bestandteile abzutrennen, benutzten wir das chromatographische Verfahren an
einer Polyamidsiiule (Perlon), das bereits bei der Auftrennung eines Fichtenrindengerbstoffesz) mit Erfolg benutzt worden war. Fur 7,7 g Mischlnistallisat wiihlten
wir eine Saule von 36 cm Fiillhohe und 6 cm Durchmesser. Eluiert wurdc nacheinander mit Wasser, Wasser-Methanol, Methanol und einem Methanol-hetonGemisch und das Gesamteluat auf Grund der Eisenchloridreaktion, des Zirkonoxychloridtestes und nach einer papierchromatographischen Priifung in zwolf
Fraktionen unterteilt. Substanz I1 fand sich nahezu quantitativ in der ersten
Fraktion, braun gefarbte Verunreinignngen verblieben in den Fraktionen 2 bis 9,
wahrend die Flavone in den Fraktionen 9 rnit 11 erschienen. I n einem zweiten
Arbeitsgang gelang die Isolierung von I1 auch ohne vorherige Extraktion mit einem
Ather-Benzi ngernisch.
*) Herrn Prof. Dr. L.Bruiimr, Direktor des Botanischen Instituts d. Univ. MUnchen, zum
60. Geburtstag gewidmet.
* *) Liisungsmittelsystem: Butanol-Eisessig-Wuer (4 1 5).
1) W.Osaasmann, a. fltie,fenhofer und H . Endres, Chem. Ber. 89, 454 (1956).
e ) W . Oraasmann, H.Endres, W. Pauckner und If. Mathes, Chem. Ber. 90, 1125 (1957).
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Archlv 291./63. Heft 6
19
270
Horhammer, Wagner, I z q u i e r d o unrl E n d r e s
Archiv der
Pharmezte
Die leichte Eluierbarkeit von Sub-stanz I1 deutete darauf hin, daD das Molekiil
nur wenige, zur Wasseratoffbriickenbildung befahigte Gruppen enthielt. Verglichen
mit der Laufgeschwindigkeit der Flavone aus demselben Rhus-Extrakt und in
ubereinstimmung mit den von W. 6k2.mnunn3) fiir einfache Phenole und von
L.H6rhammer4) fur Flavone gefundenen GesetzmiiDigkeiten bei der Chromatographie an Polyamid, waren fiir I1 hochstena drei phenolische Gruppen zu postulieren. Diese Vermutung hat sich, wie am dem folgenden ersichtlich ist, voll und
ganz bestatigt. Die Chromatographie an Polyamid gestattet demnach bei Stoffen
mit Wasserstoffbriicken-ausbildenden Substituenten eine wesentlich genauere Vorhersage uber Zahl und Anordnung funktioneller Gruppen, a h dies auf Grund ihres
Verhaltens an Adsorbentien oder bei der Verteilung zwischen zwei Phasen moglich ist.
Nach dem Umkristallisieren aua heiDem Wasser resultierten aua der eraten Fraktion 3,8 g einer bei 198--200" C schmelzenden weiden Substanz. Wir hydrolysierten
mit Schwefelaaure und isolierten a m der kherausschuttelung schmelzpunktsreine
Gallussaure (Smp. 236-240" C). Auf Grund der Molekulargewichtsbestimmung
(Molekulargewicht nach Rast = 184) schied eine Zugehorigkeit zur Gruppe der
Gallokatechine aus. Die Differenz von 184 zu 170 (Mo1.-Gew. der Gallussaure)
wurde durch eine Methoxylgruppe (Mikro-Zeisel) erklart.
Zusammenstellung der Analysenwerte :
her.
52,10yv
4.35%
10.84%
184,O
gef.
C
H
OCH,
Molekulargewicht nach Ilaat
Esterzahl
51,86%
4934%
17,0%
184
309
305
Die Entscheidung ob Ester- oder hhermethoxyl war durch die leichte Hydrolysierbarkeit mit Saure und die quantitativ verlaufene Tannasespaltung gegeben.
Zum Nachweis des Methylesters wurde die Substanz mit K a b u g e verseift, der
gcbildete Methylalkohol mit Wasserstoffsuperoxyd oxydiert und als Formaldehyd
mit Schiffs Reagenz nachgewiesen. Der isolierte Ester stimmte im Schmelzpunkt,
UV-Spektrum und IR-spektroskopisch (Abb. 1 und 2) mit dem von u s dargestellten Gallussauremethylester iiberein.
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Zifcm-')
P-3,
Abb. 1. IR-Spektrum von Cfallussiiurernethylester isoliert
W . Qraasmann, H. Hbmann und A. Had, Mekromolekulare Chem. 21, 37 (1956).
L. Hbhammer, H. Wagner und .'fI Leeb, Naturwissenschaften 44, 513 (1966).
?91./63. Bd.
1958, Nr.6
Iaolierung einea aaUuesiiuremethyhter.3 aue Cotinue Cogg ygria B c o ~ . 2 7 1
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5
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6 7 8
I
I
,
I
,
I
9101112737415
PAbb. 2. Spektrum von Cduasiiurcmethylester synthetiaiert.
Bei den anderen Rhus- und Cotinus-Arten, die laut Chromatogamm ebenfalls
diesen Ester enthalten, handelt es sich u m Cotinus oboratus Raf. (C. americanus
Nutt.), Cotinus Coggygria Scop., var. purpureus (Dupuy-Jamin), A. Rehd. u. cult.
rubra (hort. bot. mon.), Rhus trilobata Nutt., Rhus oxyacantha Cav., €&us toxicodendron L., Rhus typhina L. und Rhus glabra L. *). tfber die Auftrennung und
Identifizierung der Flavone berichten wir in einem anderen Znsammenhang.
Diskassion
Ein Gallussauremethylester wurde bisher nur aus den Friichten von Caesalpinia
brevifolia (Cae~alpiniaceae)~)
und Juglans regia (Juglandaceae)6), ferner aua einem
Vertreter der Geraniaceee'), der Euphorbiaceae*) und der Sapindaceaeg) isoliert.
Die Isolierung auch aus Cotinus coggygria und der papierchromatographische
Nachweis in anderen Arten der gleichen Familie zeigt, daS dieser Ester im Pflanzenreich weiter verbreitet ist a h fr&er angenommen wurde. Nachdem Li. Erdtmannlo),
J. I€erzigll) und Wrzlich auch B. E. Hathaway12) in Modellversuchen zeigen
konnten, daI3 nur Gallussaureester, nicht aber Gallussaure selbst unter bestimmten
Bedingungen iiber Hexaoxydiphensaure als Zwischenglied zu Ellagsame dehydrierbar sind und andererseits Ellagsaure in der Pflanze meistens mit Gallussauremethylester zusammen auftritt, darf angenommen werden, daI3 dieser Weg auch in der
Pflanze beachitten wird. Zu ahnlichen Befunden kam auch W. &ntherlS) bei seinen
Stndien tiber Corilagin, das er ah den Diester einer Hexaoxydiphensaure identifizieren konntc. Es ist nicht ausgeschlossen, da13 der Gallussauremethylester daruber
hinaus auch beim Aufbau anderer hoher molekularer Gallotannino eine wiahtige
Rolle spielt.
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*) Wir danken Herrn Dr. Dr. Heina Heine, Botanisches Institut der Universitat Miinohen,
fur die Bcstimmnng der einzelnen Subspezies.
b, M.Niere&in,
Collegium [Haltingen] 162, 197 (1906).
6, L. Jurd, J. h e r . chem. SOC. 78, 3445 (1966).
?) H . H w i k a w und Y.Ina, J. pharmac. SOC.Japan 60, 12.5 (1940); E. Fyikuwa, J. Nakumura und K . Aeami, J. pharmac. SOC. Japan 62, 343 (1942).
a) K . Hutii, H. Huizkawa nnd Y.Kudo, J. pharmac. SOC. Japan 67, 140 (1937).
0 ) 61. J . Carlaon, P. Olynyk. H . Duncan und A . S m l i n , Antibiot. u. Chemother. I , 431 (1951).
10) H . Erdtmann, Svensk kem. Tidakr. 47, 230 (1935).
11) J . Herzig, J . Pollak und ill. v . Bronneck, Mh. Chem. 29. 277 (1908).
19) E . Huthaway, Riochem. J . 67, 445 (1957).
18) W.aiint?w-,DipLArboit, UniversitBt Heidelberg, 1956.
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Hiirhammer, W a g n e r , I z q u i e r d o und Endres
Archiv der
Pharmazie
Beschwibung der Veraache
1. I s o l i e r u n g d e s Gallusstiuremethylesters
1,5 kg luftgetrocknete, geschnittene Bltitter aus dem Botanischen Garten, Miinchen*),
wurden im Soxhlet mit 9Oxigem Methanol erschopfend extrahiert. Die Abtrennung des
Chlorophylls erfolgte nach Entfernung des Nethanols in iiblicher Weise durch Aufnahme
des bis zur Sirupkonsistenz eingedampften Extraktes in Wasser und anachlieBende Filtration. Fiir die weitere Reinigung versetzten wir das Filtrat wiederum mit einem merschul3
an destilliertem Wasser, worauf die letzten Ballaststoffe ausfielen. Die Lijsung lieI3en wir
iiber Nacht im Eisschrank stehen und zentrifugierten vom Riickstand ab. Zur Trennung
von I1 und I wurde der wiisserige Extrakt mit einem Ather-Benzin-Gemisch (1 : 1) so lange
ausgeschiittclt, bis papierchromatographkch keine Substanz I1 im wasserigen Ruckstand
nachweisbar war. Dic Gesamtmenge des Ather-Benzin-Gemisches betrug 1,5 1. Nun wurde
abdestilliert, dcr Riickstand gcaammelt und bei 90" getrocknet. Fiir die Abtrennung dcr
Flavone verwendetcn wir cine SBule mit 36 cm Polyamidfiillhohe und 6 cm Durchmesser.
220 g Perlonpulver, fein, h c h e n w e i t e 0,2 mm (DIN 30) der Farbwerke Hoechst (Werk
Bobingen) lieBen wir 2 bis 3 Stunden in Wasser quellen und schltimmten anschlieBend den
Brei in kleinen Portionen in die Glase&ule,die a m unteren Ende mit einer Glaafritte und
einer h g e Watte versehen war. Vor dem Auftragen der Substanz wuschen wir rnit etwa
1 Wasser nach bis die Eluate frei von Schwebeteilchen abtropften. Nun losten wir
7,7 g des KristallisaM in 25 ml Methanol und trugen mit einer Pipette auf die Stiule auf.
Bei einer Abtropfgeschwindigkeit von 2,5 ml pro Minute passierten im Verlauf von 3 Tagen
nacheinander 7 Losungsmittel bzw. -gemkche dic Sriule: 1. destilliertes Waaser, 270 ml,
2. Wwer-Methanol-Gcmisch 4 : 1, 900 ml, 3. Wasser-Methanol-Gemisch 3 : 2, 460 ml,
4. Wasser-Methanol-Gemisch 1: 1, 900 ml, 5. Wasser-Methanol-Gemisch 1: 3, 10,9 1,
6. Methanol, 7,7 1, 7. Azeton-Methanol 1 : 1, 10 1. Der Usungsmittelwechsel erfolgte jewe& dann, wenn die Elavonzonen mit einem der Losungsmittel keine weaentliche Wandcrungsgeschwindigkcit mchr in der Siiule hatten. Die Tcstung der einzelnen Fraktionen
erfolgte 1. mit 2%iger methanolischer Zirkonoxychloridlosung, 2. mit 2%iger tithanoliacher Eisenchloridbsung und 3. papierchromatographisch im System Butanol-EisessigW w e r (4 1 5 ) ; Spriihreagenzien: 5%iges Aluminiumchlorid und 2%ige iithanolische
Eisenchloridlosung. Eluatfraktion I wurde zur Trockene eingedampft und die hierbei
resultierende Substanz (3,8 g) aus heiBem Wasecr bis zur Schmelzpunktskonatanz umkristaUisiert (Schmp. 198-200" C).
+ +
2. Siiurehydrolysc
250 mg Substanz wurden mit 50 ml 2,5yoiger Schwefelsilure 2 Stunden am RiickfluD
erhitzt. Nach dem Erkalten extrahierten wir die Hydrolyseloeung mehrmala mit je 50 ml
Ather, brachten den Ather zur Trockene und kristalliaiertan die zuriickbleibende Substanzmenge aua heiBem Wasscr um (Schmp. 235-240' C, R,-Wcrt in Butanol-Eisessig-Wasser
0,80).
3. E n z y m a t i s c h e H y d r o l y s e
100 mg Substanz wurden in einer Reibschale mit 50 mg Tannase (Spaltwert 47), die
nach einer Vorschrift von Fredmberg und VoUbrechP) aus Aspergillus niger hergestellt
worden war, vermischt und mit 20 ml Wasser zu einem Brei verriihrt. Die Inkubation
erfolgte bei 30' C unter of5rem Umschiitteln. Kach 3 Tagcn wurde die Lasung in gleicher
Weise wie unter 2. mit Ather extrahiert und der Riichtand papierchromatographich
untemuch t,.
*) Wir danken Herrn Professor Dr. L. Brauner, Direktor des Botanischen Gartens, Miinchen, ftir die Vberlassung des Pflanzenmaterials.
14) Collegium [Darmstadt] 468 (1921) 11. 398 (1927).
291./63. Bd.
1958, N ~6 .
Isolierung eines &lluasauremethyhters am Cotinu.9 Coggygrk 3 w p .
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4. Bestimmung der E s t e r z a h l
0,9846 g Ester wurdc mit 25 ml
n weingeistigcr KOH (F = 1,002) am RUckfluB
1 Stunde verseift. Zur Riicktitration waren 14,20 ml 1/2 n HCl (F = 1,0) notig, was einem
Verbrauch von 10.80 ml KOH entsprwh. Die Esterzahl errechnete sich m h der Glei10 80 1 002 * 28 055
’- -’zu 309. Esterzahl authentischen Gdussituremethylchung x =
0,9846
esters = 305.
-
5. R’achweis des Methylesters
2 ml der nach 4. erhdtenen alkalischen Lijsung wurden mit verdiinnter Schwefelsirurc
angesiruert, mit Ather extrahiert, die wcisserige Losung asschliefknd mit 2 ml 3%igem
Wasserstoffiuperoxyd veraetzt und 5 Minuten lang erhitzt. Auf Zusatz von 2 ml SchiffaReagens (fuchainschweflige Siiure) entstand die fiir Formaldehyd typische Rotfirbung.
6. Synthese des Gallussaurcmethylesters
8 g Gallussiure wurden mit 20 ml Mcthylalkohol und 0,5 ml konzentrierter Schwcfelskure 10 Stunden am RiickfluB zum Sieden erhitzt, iiber Nacht stehen gelwen, hierauf
der Methyhlkohol abdestilliert, der Riickstand mit 10 ml kaltem Wasser vermischt, abfiltriert und mit wenig kaltem Wasscr gewaschen. Umkristdisation aus heiI3em Wrtsser
Schmp. = 236-240O C.
.
7. S p e k t r e n
Die W-Measung erfolgte im Unicam-QuarzspektrophotometerSP 600 in methanolischer
Lijsung bei einer Schichtdicke von 1 cm Konzentration = 1,2 mg/lOO ml. Maximum1
= 220 mp (log = 4,36), Maximumn = 275 mp (log = 4,OO).
Aufnahme des 11%-Spcktrumsmit einem Leitz-Gerat.; Konzentration 1 mg/l6O nig KBr.
8. Papierchromatographie
Chromatographiert wurden irthanolixche Extrakte der einzelnen Drogen auf Schleicher
& SchW-Papier 2043b GI. in den Systomen (a) Butmol-Eiseasig-Wasser (4 1 5)
und (b) Isopropanol-Eisessi~~V~ser
(7 1 -/- 2) absteigend. Spriihreagenzien: 2%ige
+
+ +
iithanolische Eisenchloridlosung zum Nachweis der Gallussirurederivate und 6%ige Aluminiumchloridlosung znm Nachweis der Flavone. Rf-Wert des Gellueaituremethylesters
in (a) = 0,80, in (b) = 0,17.
Wir danken Herrn Dr . I. TJgi, Organisch-Chemisches Institut der Universitat
Munchen (Direktor: Prof. Dr. R. Huisgen) fur die Aufnahme der IR-Spektren,
ferner Herrn Ih. MoZZer, Farbwerke Hoechst, Werk Bobingen, fiir die tfberlessung
des Perlonpulvers.
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Anschrift: Prof. Dr. I,. H6rhammer. Inatitut fiir pharmazeutische Arzneimittellehre, Mlinchen 2,
XarlstraOe 29.