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Molecular Modelling-Studien zur Hormonbindungsstelle des Estrogen-Rezeptors.

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Molecular Modelling
Molecular Modelling-Studien zur Hormonbindungsstelle des
Estrogen-Rezeptors*
Hans-Dieter Holtje
Institut fur Pharmazie der Freien Universitat Berlin, Konigin-Luise-Str. 274, D-14195 Berlin
Mit Hilfe von Molecular Modelling-Verfahren wurden die Struktureigenschaften von Liganden rnit hoher Affinitat zum Estrogen-Rezeptor untersucht. Zur Bestimmung der biologisch aktiven Konformationen und Orientierungen innerhalb der Hormonbindungsstelle wurde eine vergleichende
Einleitung
In letzter Zeit werden immer haufiger AminosauresequenZen von Enzymen und Rezeptoren aufgeklart. Leider ist
damit nur indirekt eine Information iiber die dreidimensionale Gestalt des Proteins gefunden. Von besonderem therapeutischen Interesse ist nur die Kenntnis der Geometrie der
jeweiligen reaktiven Zentren. Ein moglicher Weg zu
Modellen von Arzneistoff-Bindungsstellenfuhrt iiber Vergleichsstudien rnit funktionshomologen und durch Rontgenstrukturanalyse strukturbekannten Proteinen.
Die von Holtje und Dall kiirzlich beschriebene Untersuchung der Hormonbindungsstelle des Estrogen-Rezeptors')
ist ein Beispiel fur diese Vorgehensweise. Die Sequenz des
Estrogen-Rezeptors ist bekannt, es gibt jedoch keine Informationen uber die Struktur des Proteins. Durch die Kombination von Pharmakophorbestimmung und 3D-Proteinmodellierung auf der Grundlage einer Sequenzanalyse konnte
trotz bisher unbekannter Proteinstruktur ein dreidimensionales Model1 der Hormonbindungsstelle entwickelt werden.
Studie auf der Basis von Molekulvolumina und molekularen Interaktionsfeldern durchgefiihrt. Der daraus abgeleitete Pharmakophor stellt die
Grundlage fur ein Aminosaure-Modell der Hormonbindungsstelle dar, rnit
dem einige experimentelle Daten e r k k t werden konnen.
Tab. 1: Strukturen hochaffiner Liganden des Estrogen-Rezeptors.
Die Berechnungen von 25 und 26 wurden mit einer Hydroxylgruppe
anstelle der Seitenkette durchgefuhrt.
Methoden
In die Pharmakophorsuche wurden strukturell unterschiedliche, hochaffine Strukturen einbezogen (Tab. 1):
Estradiol (21), Indenestrol-A (22), Diethylstilbestrol (23),
Hexestrol (24), 4-Hydroxy- tamoxifen (25), Desmethylnafoxidin (26) und ein Dihydroxy-triphenyl-acrylonitril
(27)'-@.Das abgeleitete Pharmakophormodell sollte daher
Ruckschlusse uber Struktur und Eigenschaften der Hormonbindungsstelle zulassen. Weiterhin wurde die Aminosauresequenz der Hormonbindungsdomane analysiert.
Durch Sequenzvergleiche mit anderen Steroidrezeptoren
und steroidbindenden Proteinen sollten potentielle Frag-
*) Plenarvortrag anlU31ich der Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft vom 22. - 25. September 1993 in Saarbriicken.
Arch. Pharm. (Weinheim) 326, 765-768 (1993)
L
O-H
27
mente der Hormonbindungsstelle identifiziert werden.
Zusammenfassend wurde schlieBlich ein Rezeptormodell
erstellt, welches mit experimentellen Daten korrespondieren soll. Zu erwahnen sind hier vor allem Identifizierungen
0VCH Verlagsgesellschaft mbH, D-6945 1 Weinheim, 19930365-6233/93/1010-0765 $5.00 + .25/0
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Holtje
von Aminosauren der Hormonbindungsdomane mittels
kovalent bindender radioaktiv markierter Liganden (affinity
labeling).
Ergebnisse und Diskussion
Zur Konstruktion des Pharmakophormodells wurden die
potentiell biologisch aktiven Wirkkonformationen ermittelt
und auf strukturelle Gemeinsamkeiten untersucht. Um die
Wirkkonformationen zu ermitteln, wurde eine systematische Konformationsanalyse durchgefiihrt. In einem erstem
Schritt wurden die konformatorisch eingeschrankten Verbindungen 22 und 25 untersucht. Die lokalen Minima-Konfomationen mit den besten Uberlagerungen zum Estradiol
wurden als biologisch aktive Wirkkonformationen postuliert. AnschlieBend wurden die flexibleren Molekule nach
analogen energetisch giinstigen Konformationen untersucht.
Um sterische Gemeinsamkeiten der potentiellen Wirkkonformationen zu analysieren, wurden ihre RMS-Ebenen
berechnet und dargestellt. Alle Liganden konnen sich
annahemd in der Ebene von Estradiol orientieren (Abb. 1).
Abb. 1: Uberlagerung der potentiellen Wirkkonfoimationen
in der Molekulebene von Estrddiol.
Die Abstande der einzelnen Atome zu der Eberie sind ebenfalls vergleichbar. Da Van der Waals-Interaktionen fur die
Bindungsaffinitaten eine entscheidende Rolle spielen [7],
wurden Wechselwirkungsfelder mit einer hydrophoben
Probe (Methylgruppe) berechnet. D a m diente das Prograinm GRID. Die energetisch gunstigsten Interaktionsbereiche wurden als Isokonturlinien visualisiert. Sie befinden
sich ausnahmslos oberhalb und unterhalb der A/B-Region
von Estradiol (Abb. 2).
Abb. 2
Ergebnis der GRID-Berechnung.
(Die schwarzen Pfeile markeren stake, die grauen
Pfeile schwachere Dispenions-Wechselwirkungen.)
In einem nachsten Schritt wurde, ausgehend von der
Primarsequenz des Estrogen-Rezeptors, ein Aminosauremodel1 der Hormonbindungsstelle erstellt. Durch Sequenzvergleich der Hormonbindungsdomanen (HBD) aller Steroidrezeptoren wurde ein besonders homologer Bereich zwischen Trp 360 und Ser 395 lokalisiert (Positionen 60 und
100 bezogen auf die HBD). Von 36 Arninosaurepositionen
sind 12 Positionen identisch. In diesem Bereich ist ein
Sequenzabschnitt lokalisiert, der homolog ist zu entsprechenden Sequenzabschnitten anderer steroidbindender Proteine (Tab. 2). Dieser Abschnitt wird nachfolgend als
Tab. 2: Sequenz I
Hoinologien zwischen Steroidrezeptoren und Steroid-bindenden Proteinen.
(Die Aminosauren, die vermutlich an der Bindung von
Liganden beteiligt sind, sind eingekreist. Das mit einem
Dreieck umrahmte Methioniii im Glukokortikoid-Rezeptor
wurde photoaffinitatsmarkiert.)
Protein name
Amino acid sequence alignment
I
h-Estrogen
Receptor
379
L@C
I L M
388
h-Progesteron
Receptor
752
I 0 Y S W M S L M V
761
h-Androgen
Receptor
h-Glucocorticoid
Receptor
739
I O O S W M G L M V
748
597
L 0 Y S W M F L
A
606
h-Mineralocorticoid 803
Receptor
I 0 Y S W M C L S S
812
h-NJlf-ATPase
306
L E Y T W L E A V I
315
SteroidDehydrogenase
341
P L Y T W E E A K O
350
A@L
E
Sequenz I bezeichnet. Besonderes Merkmal von Sequenz 1
ist ein konservatives Tryptophan (Trp 383). Tryptophan
besitzt unter den physiologischen Aminosauren die groljte
hydrophobe Oberflache. Das hydrophobe Steroidgeriist von
Estradiol sollte besonders gunstige Wechselwirkungen zu
Trp 383 eingehen konnen. Die Grundgeruste der anderen
Steroide sind ebenfalls hydrophob. Sie sollten daher vergleichbar hohe Affinitlten zu dem konservativen Tryptophan aufweisen.
Drei Positionen vor dem konservativen Tryptophan
besitzt der Estrogen-Rezeptor eine Glutaminsaure (Glu
380). Deren Carboxylgruppe ware ein optimaler Bindungspartner der phenolischen Hydroxylgruppe. Die anderen
Steroide besitzen in 3-Position anstelle der Hydroxyl- eine
Carbonylgruppe. Diese Carbonylgruppe wurde von der Carboxylgruppe abgestoBen. In der Tat binden Keto-Steroide
kaum an den Estrogen-Rezeptor. Glutaminsaure 380 ist in
diesen Steroidrezeptoren gegen ein Glutamin ausgetauscht,
dessen Saureamid-Funktion als Wasserstoffbrucken-Donator niit den Carbonylgruppen wechselwirken kann. Das
Glutamin ist in den Rezeptoren der Keto-Steroide konservativ. Moglicherweise ist das ein Grund fur deren ausgepragte
Kreuzaffinitaten.
Die Analyse der HBD fuhrte zu einem potentiellen
Bestandteil der Bindungsstelle. Zwei Aminosauren, Trp
Arch Pharm (Weinhelm)326 765-768 (1993)
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Molecular Modelling
383 und Glu 380, sind moglicherweise an der Ligandenbindung beteiligt. Die hohe Rezeptoraffinitat von Estradiol ist
jedoch nicht durch Wechselwirkungen rnit lediglich zwei
Aminosauren zu erklaren. Weitere Aminosauren mussen in
die Bindung von Liganden involviert sein. In diesem
Zusammenhang ist eine Untersuchung von Picado-Leonard
und Miller iiber steroidbindende Cytochrome aufschlul3reich*). P450-Cl7 (17a-Hydroxylase) und P450-C21 (21 Hydroxylase) sind insgesamt zu lediglich 28% identisch.
Ein bestimmter 21 Aminosauren langer Sequenzabschnitt
hingegen enthalt 17 identische Positionen. Charakteristisches Merkmal dieses Bereiches ist ein ausgepragt hydrophobes Tetrapeptid-Fragment aus vorwiegend aliphatischen
Aminosauren. Steroidrezeptoren weisen einen analogen
Bereich auf (Tab. 3 ) , der nachfolgend als Sequenz I1 bezeichnet wird. Dieser Bereich ist durch eine variierende
Aminosaure von einem konservativen Lysin getrennt.
Tab. 3: Sequenz I1
Homologien zwischen Steroidrezeptoren und Steroidbindenden Cytochromen.
(Die potentiell bindungsrelevanten Aminosauren im Estrogen-Rezeptor sind eingekreist. Das affinitatsmarkierte
Histidin im SHBG ist durch ein Dreieck rnarkiert.)
Protein name
Uteroglobin ist ein Progesteron-bindendes Protein, das als
Dimer vorliegt. Jedes Monomer besteht aus 70 Aminosauren, die in vier a-Helices auffalten. Zwischen den Helices
befinden sich Loops unterschiedlicher Liinge. Zwei Disulfid-Brucken verbinden die Monomere. Die Kristallstruktur 11) wurde mit einer Auflosung von 1,64 A aufgeklart. Mit
Hilfe von SUKO wurden die Multialignments der beiden
Sequenzabschnitte I und I1 aller Steroidrezeptoren rnit der
Uteroglobin-Sequenz verglichen. Uberraschenderweise ordnete das Programm jedem der beiden Bereiche den gleichen
Sequenzabschnitt zu. Er entspricht exakt der ersten Helix
des Uteroglobin-Monomers. Daraufhin wurden die beiden
Sequenzabschnitte als Helix modelliert und ein Wechselwirkungskomplex zwischen den Helices und Estradiol
gebildet. AnschlieBend wurden Helix 1A und 1B des Uteroglobins mit dem Wechselwirkungsmodell uberlagert. Das
Ergebnis ist in Abb. 3 zu sehen. Man erkennt eine gute
Ubereinstimmung bezogen auf die Orientierung der Helices
zueinander.
Amino acid sequence alignment
h-Progesteron
Receptor
830
C M K V L L L L N T
839
h-Glucocorticoid
Receptor
665
C M K T L L L L S S
674
h-Androgen
Receptor
807
C M K A L L L F S I
816
h-Mineralocort.
Receptor
P450-C17
871
I M K V L L L L S T
880
346
D R N R L L L L E A
355
P450-C21
338
D R A R L P L L N A
347
SHBG
231
G S G A L L A L G T
240
Markierungsexperimente mit 17a-organometallisch substituierten Estradiol-Derivaten fuhrten zu der Annahme, daI3
ein Lysin in der Bindungsstelle des Estrogen-Rezeptors
lokalisiert ist9). Die genaue Sequenznummer ist jedoch
nicht bestimmt worden. Es konnte sich naturlich auch um
Lys 449 des humanen Estrogen-Rezeptors handeln. Dies ist
ein erster Hinweis auf die mogliche Beteiligung dieses
Sequenzabschnittes, der nachfolgend als Sequenz I1 bezeichnet wird, am Bindungsgeschehen im HBD-Bereich.
Auch ein Sequenzabschnitt im Sexualhormonbindenden
Globulin (SHBG), der auf eine affinitatsmarkierte Aminosaure (Histidin 235) folgt, ist zu diesem Abschnitt homolog.
Urn die Sekundarstrukturen zu bestimmen, wurden die
beiden Sequenzabschnitte rnit Uteroglobin, einem steroidbindenden Protein rnit bekannter Kristallstruktur, verglichen. Der Sequenzvergleich wurde rnit SUKO") durchgefiihrt (SUche nach KOnservativen Sequenzregionen). Das
Programm ordnet einem Multialignment die entsprechend
konservative Sequenzregion eines Vergleichsproteins zu.
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Abb. 3: Uberlagerung des Bindungsstellenmodells (schwarze Ribbons) mit den entsprechenden Helices im
Uteroglobin (graue Ribbons).
Ein Rezeptormodell, das nur fur eine Verbindung gilt,
besitzt keine groBe Aussagekraft. So wie das Pharmakophormodell gemeinsame Strukturelemente hochaffiner
Liganden beschreibt, sollte das Rezeptormodell analoge
Wechselwirkungsenergien liefern. DemgemaB wurde das
Rezeptormodell auf die in das Phannakophormodell einbezogenen Liganden ubertragen. Rezeptor- und Pharmakophormodell sollten sich erganzen. Daher wurden die Liganden in ihrer pharmakophoren Orientierung und Konformation zunachst in die Bindungsstelle eingepaljt. Die Position
der helikalen Geriiste blieb dabei unverandert. Aufgrund
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der dichten Packung zwischen den Helices traten zunachst
abstoRende Van der Waals Kontakte zwischen den Liganden und einigen Aminosaureseitenketten auf. Diese konnten
durch Rotation um Einfachbindungen der betreffenden Seitenketten problemlos beseitigt werden. Mit Hilfe der interaktiven DOCK-Routine wurde eine energetisch gunstige
Orientierung der Liganden zwischen den Helices eingestellt
und mit MAXIMIN optimiert. Anschlieljend wurden die an
der Bindung beteiligten Seitenketten sowie die Hydroxylgruppen der Liganden molekuldynamisch optimiert. Erfreulicherweise liefern alle hochaffine Liganden Wechselwirkungsenergien, die der von Estradiol mit dem Rezeptormodell entsprechen. Dies kann als Unterstutzung fur das
Model1 angesehen werden.
Literatur
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2
Holtje
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