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Quantitative DUnnschichtchromatographie Auswertung von in situ-Fluoreszenzmessungen durch Zweipunkteichung.

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940
Ebel, Herold, Scheck und Schultze
Arch. F'harmaz
S. Ebel, G. Herold, M. Scheck und K. Schultze
Quantitative Diinnschichtchromatographie
Auswertung von in situ-Fluoreszenzmessungendurch Zweipunkteichung
Aus dem Fachbereich Pharmazie und Lebensmittelchemie der Philipps-Universitat Marburg/Lahn.
(Eingegangen am 7. Januar 1975)
Es wird die quantitative Bestimmung von Salicylsaure nach dc Trennung durch in situ-Fluorimetrie beschrieben. Eine genauere Betrachtung der Eichgeraden ergibt, dai3 es genugt, eine
Zweipunkteichung vorzunehmen. Aus einem Plattenstandard und der ermittelten scheinbaren
Nachweisgrenze - defmiert als Abszissenabschnitt der Eichgeraden -- wird der Analysengehalt
ermittelt. Der Fehler, ausgedriickt durch die genaherte relative Standardabweichung, liegt nur
unwesentlich hoher (- 1.8 %) als bei der Auswertung uber Eichgeraden (- 1.2 %). Liegen Plattenstandard und AMIYSCbei gleicher Konzentration, so betragt der Fehler ca. 0.5 %. Bei der
hier beschriebenen Methode ergeben sich hohere Analysenzahlen pro DC-Platte.
.
Quantitative Thin-Iayer-Chromatography
Evaluation of in Situ Fluorimetric Analyses by Two Point Regression.
A method for the determination of salicylic acid by in situ fluorimetry after TLC separation
is described. The resulting straight lines differ in slope but not in the section of ordinate. Therefore it is possible to determine substances by two point regression: an individual plate standard
and a probable detection limit, defined by the section of the straight line with the concentration
axis. The error of the method is of the order of 1.8 76 (relative standard deviation) and
comparable with the error by gauging functions (- 1,2 %). Several analyses can be done on
the same TLC-plate.
Die quantitative in situ-Auswertung von dunnschichtchromatographisch getrennten
Substanzen wird heute in einer Reihe von Laboratorien routinemafiig durchgefuhrt.
Durch Kopplung des DC-Spektralfotometers mit digitalen Datenerfassungssystemen
ergeben sich dabei hohere Genauigkeiten bei besserer Reproduzierbarkeit. Neben der
Bestimmung und Auswertung des Remissionsminirnums oder des Fluoreszenzmaximums hat sich vor allem auch die elektronische Integration des Ausgangssignals
des DC-Scanners bewahrt. Solche Geratekombinationen wurden von uns fur die DCFluorimetrie') und fur die Remissionsmessung beschrieben2).
Auswertung: Eichgeraden
Ublicherweise geht man bei glen in situ-Messungen auf der DC-Platte so vor, daA
man aus einer Reihe von Eichflecken bekannten Gehaltes eine Eichfunktion be1 S. Ebel und G. Herold, Z. analyt. Chem. 266, 281 (1973).
2 S. Ebel und G. Herold, Z. analyt. Chem. 270, 19 (1974).
308 f 75
Quantitative Diinnschichtchrornatographie
94 1
stimmt. Bei unseren Versuchen wurden fiir die Aufstellung der Eichgeraden vier
Eichflecke in dem Bereich von 50 bis 200 ng Salicylsaure/Fleck verwendet. Es ist
somit moglich, auf einer DC-Platte mindestens 4 Analysenflecke aufzutragen. Eine
hohere Anzahl von Eichflecken bringt keinen signifikanten Gewinn an Reproduzierbarkeit der Eichgeraden. Tabelle 1 zeigt die Korrelationskoeffizienten von 8 DCPlatten, die nach dem hier beschriebenen Verfahren ausgewertet wurden.
Tab. 1: Korrclationskoeffizienten und Steigungen der Eichgeraden bei der Bestimmung von
Salicyldure
Platte
Korrelationskoeffizient')
m
1
2
3
4
5
6
7
8
0.99931
0.99974
0.99966
0.99987
0.99943
0.99998
0.99995
0.9997 1
2.416
2.583
2.250
2.391
2.676
2.068
2.250
1.308")
+)
n = 4; c = 50, 100,150, 200 ng/Fleck
++) abweichende Scangeschwindigkeit
Jede DC-Platte enthielt weiterhin vier Analysenflecke im gleichen Konzentrationsbereich. Zur Kontrolle des Gesamtfehlers und urn statistisch gesicherte Aussagen treffen zu konnen, wurden die Analysenflecke aus denselben Liisungen wie die Eichflekke aufgetragen. Am hier betrachteten Beispiel der Bestimmung der Salicyldure treten
im oberen Bereich der Eichgeraden keine signifikanten Abweichungen auf, wie sie
durch die relative Nachbarschaft von Anregungswellenlange und Fluoreszenz bei
einigen Substanzen beobachtet werden. Es genugt daher, eine lineare Eichfunktion
zur Auswertung heranzuziehen; im anderen Falle muB man rnit nichtlinearen Eichfunktionen, z. B. mit parabolischen R e g r e ~ s i o n e n ~arbeiten.
)~)
Dagegen ergeben sich
im Bereich niedriger Konzentrationen (- 50 ng) zum Teil groBere Abweichungen,
die sich im Gesamtergebnis durch eine entsprechende Erhohung der genaherten relativen Standardabweichung bemerkbar machen (Tab. 2).
3 S. Ebel und G. Herold, Dtsch. Lebcnsmittcl-Rdsch. 70, 133 (1974).
4 J . C. Touchstone,' S. S. Levin und T. Murawec in J.C. Touchstone: Quantitative Thinlayer
Chromatography, Wiley, New York 1973.
942
Ebel, Herold, Scheck und Schultze
Arch. Pharmaz.
Tab. 2: Ergebnisse der Bestimmung von Salicylsaure durch in situ-Fluorimetrie. Auswertung
uber Eichgeraden (vgl. auch Tab. 1).
~
~~~~
Platte Salicylsaure
gegeben gcfunden
[ngl
[%I
1
2
3
4
5
6
7
8
50.0
1
2
3
4
5
6
7
8
100.0
1
2
3
4
5
6
7
8
150.0
1
2
3
4
5
6
7
8
200.0
Fehler
X
[%I
[ng]
[%I
-0.5
+O. 9
% = 50.41
Orel = 1.84
Orel
( n = 8)
49.5
50.9
50.1
51.5
51.1
49.7
51.4
49.1
+1.5
+1.1
-0.3
+1.4
-0.9
-1.0
+1.8
+o.2
+3.0
+2.2
-0.6
+2.8
-1.8
96.9
96.5
99.3
98.2
96.8
98.1
96.8
99.1
-3.1
-3.5
-0.7
-1.8
-3.2
-1.9
-3.2
-0.9
-3.1
-3.5
-0.7
-1.8
-3.2
-1.9
-3.2
-0.9
are!= 1.14
148.5
148.0
148.9
149.4
151.4
146.9
149.8
147.4
-1.5
-2.0
-1.1
-0.6
+1.4
-3.1
-0.2
-2.6
-1.0
-1.33
-0,74
-0.4
M.92
-2.0
--0.13
-1.72
Orel =
203:6
200.4
200.6
194.2
199.9
199.0
198.8
197.8
+3.6
M.4
+0.6
-5.8
-0.1
-1.0
-1.2
-2.2
+1.8
M.2
+O. 3
-2.9
-0.05
-0.5
-0.6
-1.1
% = 199.29
Or,,= 1.35
M.1
%= 97.71
% = 148.79
0.96
Auswertung: Zweipunkteichung
Im Zusammenhang rnit der in situ-Fluorimetrie interessierte uns weiterhin die Frage, inwieweit irgendwelche Korrelationen zwischen Meaparametern auf verschiedenen Platten moglich sind. Ein prinzipieller Nachteil der quantitativen DC liegt nam-
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Quantitative Diinnschichtchromatographie
943
lich darin, daB fur jede DC-Platte erneut eine individuelle Eichfunktion bestimmt
werden muB. Aus den Steigungen der verschiedenen Eichgeraden (Tab. 1) folgt jedoch unmittelbar, daf3 eine Ubertragung der Eichgerade einer Platte auf eine andere
selbst unter den hier angewendeten MeBbedingungen (keine Anderung an Spaltbreite, Spaltlange, Mefiwellenlange) mit einem Fehler von ca. 12 % behaftet ist. Es WUF
de deshalb versucht, eine Eichkonzentration (150 ng) als Plattenstandard zu verwen.
den. Aus Abb. 1 geht unmittelbar hervor, dat3 zwar eine recht gute Approximation
der MeBdaten durch die Eichgeraden erfolgt, daB aber durch systematische Abweichungen der Eichflecke mit der niedrigsten Konzentration ein Fehler hervorgerufen wird. Es wurde deshalb als zweiter Fixpunkt fur die Festlegung der Eichgeraden
die unter den angegebenen Bedingungen sich ergebende “scheinbare Nachweisgrenze” von 1 5 ng gewahlt. Als “scheinbare Nachweisgrenze” wird in diesem Zusammenhang der Abszissenabschnitt angesehen. Roeder, Eich und Mutschler’) verwendeten
bei der fluorimetrischen in situ-Messung ebenfalls eine Zweipunkteichung. Die Autoren gingen jedoch davon aus, daa jede Eichgerade durch den Koordinatennullpunkt
geht. Ein anderes Verfahren zur Festlegung eines Plattenstandards wurde von Klaus6)
angegeben.
kt
//I/
L
Bezugspunkt
Abb. 1: Typische Eichgeraden bei der quantitativen in situ-Fluorimetrie von Salicyldure.
5 K. Roeder, E. Eich und E. Mutschler, Pharmaz Ztg. 115, 1430 (1970).
6 R. Klaus, J . Chromatogr. (Amsterdam) 6 2 , 9 9 (1971).
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Ebel, Herold, Scheck und Schultze
Arch. Pharmaz
Unter Verwendung der Flache unter der Fluoreszenz-Ortskurvedes 1 50 ng-Flecks
FIs0und der angenommenen scheinbaren Nachweisgrenze C, von 15 ng (experimentell 15.1 ? 2.1) ergibt sich als Eichfunktion die Gleichung (1). Diese Gleichung
folgt unmittelbar aus der Zweipunktformel fur eine Gerade. Ergebnisse, die mit dieser Auswertung erzielt wurden, sind in Tab. 3 aufgefuhrt.
Cg
CN
FX
Fg
Konzentration des Bezugsfleckes
scheinbare Nachweisgrenze
Fllche der Fluoreszenz-Ortskurve des zu bestimmenden Fleckes
des Bezugfleckes
Tab. 3: Fluorimetrische in situ-Auswertung von Salicyldure (Zweipunkteichung).
~
gegeben
"g
50.0
gefunden
ng
50.52
47.89
50.43
53.67
52.21
52.92
53.57
Ergebnis
49.35
50.75
50.25
50.62
51.79
50.22
x= 51.09
Orel = 3.28 %
(n = 13)
100.0
79.93
96.93
98.48
96.58
99.63
100.90
99.59
101.15
99.32
99.23
96.87
95.55
95.52
99.33
x= 98.36
O r e l = 1.86 %
(n = 14)
200.0
205.76
207.34
203.66
203.03
201.57
200.98
198.96
193.22
200.36
199.46
202.87
201.49
199.25
198.31
x= 201.16 70
Orel = 1.72
(n = 14)
Quantitative Dun nsch ich tchro ma tographie
308175
945
Die folgende Tabelle zeigt eine Gegenuberstellung der drei genannten Auswerteverfahren: uber eine Eichgerade aus vier Eichflecken, uber die Zweipunkteichung nach
Roeder, Eich und Mutschler’) und uber die hier beschriebene Zweipunkteichung. Die
Ergebnisse sind unmittelbar miteinander vergleichbar, da sie auf Messungen derselben
DC-Platten, d. h. mit denselben Rohdaten, basieren.
Tab. 4: Ergebnisse der Bestimmung von Salicylsaure durch in situ-Fluorimetrie. Vergleich verschiedener Auswertungen.
Verfahren
gegeben
[ngl
gefunden
[ngl
U
Eichgerade
(vgl. Tab. 2)
50
100
150
200
50.41
97.73
148.79
199.29
1.84
1.14
0.96
1.35
8
8
8
8
Zweipunktcichung’)
50
100
150
200
41.27
93.81
149.38
205.17
5.82
3.07
0.83
1.41
13
14
8
14
Zweipunkteichung
hier beschriebene
Methode
(vgl. Tab. 3)
50
100
150
200
51.09
98.36
149.43
201.16
3.28
1.86
0.59
1.72
13
14
8
14
[;q
bei
n=
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dal3 durch die Auswertung uber eine Eichfunktion
auf jeder Platte die besten Ergebnisse erzielt werden (arrl= 1.30 %, n = 32). Die Auswertung uber die Zweipunkteichung ergibt schlechtere Ergebnisse (Verfahren Roeder
ure, = 3.41 %, hier beschriebene Methode u = 2.12 %, n = 49), doch steht dem als
nicht zu unterschatzender Vorteil die hohere Analysenzahl pro DC-Platte gegenuber.
Wahrend bei der Auswertung uber Eichgeraden nur 4 Analysen a u s f ~ b a sind,
r
konnen bei der Zweipunkteichung 7 Analysen auf einer DC-Platte untergebracht werden.
Beschreibung der Versuche
Substanz: Salicylsiure p. a. (E. Merck, Darmstadt); verwendete Losung: 10, 20, 30,40 rng/100
m l = 50, 100, 150, 200 ng/0.5 c(1 Auftragemenge.
DC-Platten: DC-Fertigplatten Kieselgel 60 (E. Merck, Darmstadt)
Fliefimittel: Benzol/Dioxan/Eisessig 90 : 25 : 4 (V/V)
Auftragetechnik: 0.5 /A-Microcaps (Drummond Scientific, Vertrieb: Shandon, Frankfurt)
Zeiss-DC-Spektralfotometer: Meflanordnung: Lampe/Monochromator/Probe/Kantenfilter/
Ernpfanger (M/Pr)
946
Kahlert und Zymalkowski
Arch. Pharmaz
Anregung: Hg-Lampe, 31 3 nm, Quarzmonochromator, Spalt 0.4 mm. Kantenfilter: Zeiss
FL 39 (Sperrbereich 365 nm, Durchlafibereich 400 nm).
Spaltlange: 8 mm; MeOkopfhohe: M. 2 mm; Tischvorschub: 30 mm/min, 60 mm/min.;
Verstiirkung: 5/1/1/F
Infotronics-Integrator CRS 104: Base line tracking: 600 pV/min; Threshold level: 200 pV;
Count rate: 4 kHz; Input noise rejection: 6;Slope sensitivity: 2;Digital filtering: 2000 counts/
peak.
<
>
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wir fur die Unterstutzung dieser Arbeiten durch
Sach- und Personalmittel.
Anschrift: Prof. Dr. S. Ebel, 385 MarburglLahn, Marbacher Weg 6
[Ph 5321
E.-U. Kahlert und F. Zymalkowski*)
Herstellung und reaktives Verhalten einiger a-Bromketale
Aus dem Pharmazeutischen Institut der Universitat Bonn
(Eingegangen am 9. Januar 1975)
Es wird eine praktische Methode zur Umwandlungvon eBromketonen in eBromketalc bcschrieben. Durch Behandlung mit sekundaren Aminen entstehen abungesittigte Ketale. N u r
wenn,eine HBr-Abspaltung strukturell nicht moglich ist, wird Brom geaen Amin ausgetauscht.
(3) ergibt anstelle des unge
2’-Brom-spireL 1,3-dioxolan-2,1‘-(1’,2’,3’,4’-tetrahydronaphthalin)]
sattigten Ketals 12 den Monoathylenglykolather des &Naphthols (1 3).
Synthesis and Reactivity of Some a-Bromoketals
A practical method for preparation of ebromoketals from c*bromoketones is described. By
influence of sec. amines d u n s a t u r a t e d ketals are formed. If elimination of HBr is impossible,
1’,2‘,3‘,4’-tetrahydre
bromine is substituted by amine. 2‘-Bromo-spir~[l,3-dioxolane-2,1’-(
naphthene)] (3) forms the monoethylene glycol ether of a-naphthol (13) instead of the
unsaturated ketal 12.
Die Umsetzung von 2-Bromtetralon-1 ( I ) rnit sekundaren Aminen gibt die erwarteten
Aminotetralone (Weg a) nur in ganz geringen Ausbeuten. Hauptreaktion bleibt trotz
vielfacher Variation der Versuchsbedingungen die Abspaltung von Bromwasserstoff
und Isomerisierung des nicht fafibaren a,P-ungesiittigten Ketons 2 zu &-Naphthol
(Weg b):
*
Aus der Dissertation von Ernst-Ulrich Kahlert, Bonn 1974.
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