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Verfahren zur Amylasebestimmung in Fermentprparaten tierischer Herkunft.

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890
Z i p / und S c h i i b i d
Archiv det
Pharmazie
von 1,9 g (0,01 Mol) XVIII in 135 ml abs. Ather ziemlich rasch zutropfen, kocht noch
1 Std.am RuckfluB, gibt nach dem A4bkiihlenvorsichtig 0,4 ml Wasser zu, gieI3t nun in
wenig Eiswssser, siiuert mit verdunnter Schw-efelsaurean, siittigt mit Kochsalz und athert,
noch zweimal nach. Kach Waschen mit wenig Soda- und Kochsalzlosung trocknet ma,n
iiber Natriumsulfat, vertreibt den Ather und erhalt (mit A-Kohle)aus Methanol - Wasser
1 : 1 farblose Nadeln vom Fp. 139-140" in Ci6yoiger Ausbeute.
Cl,H1,OS (192,21)
Ber.: C 68,70
H 6,29
S 16,67
Gef.: C 68,90
H 6,12
S 17,24
Benzoat (XX)
Nit Benzoylchlorid inBeiizol + wenig Pyridin, zunachst 24 Stdn. bei Zimmertemperatur,
daiin 2 Stdn. unter RiickfluB kochen. ,411s Methanol gelbstichig weiBe Nadeln, Fp. 158".
C,,H,,O,S
(296,37)
Ber.: C 72,93
H 5,44
S 10,82
Gef.: C 72,80
H 5,35
S 11,18
Ansclirift: Yrof. Ur. A. Luttrhighaus. Chem. Inst. dcr Universitat, Frciburg/Hrvkgai;,Albertstr. 21.
1922. K. Zipf und A. S c h m i d
Verfaliren zur Amylasebestimmung in Fermentpraparaten
tierischer Herkunft")
Aus den1 Institut fur Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Tierarztlichen Fakultat dcr Universitat Munchen
Direktor: Prof. Dr. K . Zipj
(Eingegangen
21. Marz 1960)
Nach Purrlo)besitzt die Ermittlung der Smylasewirkung durch Bestimmung der
Spaltprodukte Mangel, da auf diese Weise nur das Ende der aus mehreren Teilprozessen bestehenden amylatischen Abbaureaktion (die a d e r d c m noch mehr oder
weniger gehernmt sein kann) erfaBt werde. Wenn dariiber hinaus noch Maltase iiii
Gemisch mit Amylase vorliege, reiche die Spaltproduktbestimmung nicht aus. Man
darf diese Ansicht erganzen durch die Feststellung, daR unter diesen Umstanden
die Bestimmung der Spaltprodukte sogar zu falschen Aussagen iiber die Amylasewirkung fiihrt, ein Gesichtspunkt, der gerade hinsichtlich der Fermentpraiparate
des Handels bedeutungsvoll sein diirfte und anscheinend immer wieder auBer acht
gelassen wirdl).
Aus diesen Griinden erscheint es wiinschenswert, - nach Purr sogar notwendig
-- auch iiber Methoden zu verfiigen, mit denen die Substratabnahme und damit
der weitgehend ungehemmte Anfang der Amylolyse erfal3t werden kann. Eine prinzipielle Moglichkeit dazu stellt die Ausnut.zung cfer Jod-Starkereaktion dar.
Die erste Methode, welche auf diesem Prinzip beruht, wurde von Robertsll) ausgearbeitet. Es folgten Salkowski12), WaZtherls),Schutze und BraunI3)und schliel3lich
im Jalire 1908 WohZgem~th~~)
mit einer eigenen Methode. Diese wurde spater von
iWic7zaeZiss) modifiziert. I m gleichen Jahre veroffent1icht)e E'jront4)
eine Jod* ) Herrii Prof. Ur. K.W. 3terz z u m 60. Grburtstag gewidinet.
293. 69. 136.
1960, Nr. 10
891
Verfahren ZUT Am ylusebestiinrriung in Ferwentpruparaten
StDrkemethode und 10 Jalire spater verbesserten Chrzaszcz und Janicki3)die Starkekleisterplattenmethode von Mullerg)durch Verwendung von Jod. Alle diese Methoden diirften heute die Bedeutung von Abschatzverfahren kaum ubersteigen. Wir
mochten in diese Beurteilung sogar das Verfahren von Shaldon14)aus dem Jahre
1956 einschlieBen, das im wesentlichen nach dem alten Prinzip von Roberts arbeitet.
In neuerer Zeit folgten weitere, exaktere Methoden (2) 5 , 15)16)17), jedoch fast
ausnahmslos fur die Amylasebestimmung im Serum oder anderen Korperflussigkeiten. Zur Bestimmung in pharmazeutischen Praparaten Iiegt noch keine JodStarkemethode vor. Es ist auch kein anderes, die Xubstratveranderung erfassendes
und fur Fermentpraparate ausgearbeitetes Verfahren bekannt. Eine solche Methode
sei im folgenden beschrieben.
Eiyene Cntersiichungei?,
Vorversuche
Die hier vorgelegten Versuche wurden unter denselben Bedingungen durchgefiihrt
wie sie weiter unten (Durchfiihrung der Fermentbestimmung) beschrieben sind.
In Abb. 1 ist die Absorption der Jod-Xiarkefarbe bei konstanter Temperatur
dargestellt.
Danach besitzt die Farbe ein Absorptionsmaximum bei 565 mp.
Aus Abb. 2 ist die Veranderung der Transparenz (T) bei verschiedenen Temperaturen ersichtlich.
Die Abbildung zeigt die hohe Temperaturempfindlichkeit der Farbe. Damit erhebt sich die Forderung, den MeBvorgang bei konstanter Temperatur durchzufiihren. Unter dieser Bedingung betragt die Farbanderung von der 10. bis zur
30. Minute nach der Jod-Starkereaktion nur 0,l Durchliissigkeitsprozent. Fur die
photometrische Buswertung herrschen somit konstante Bedingungen.
Y
*
.
A..
/-3
081
nas
089
I
,
093
lge
Abb. I. Typische Farbkurve (Konzeiitra tion in g/l)
25
30
35
Lo
oc
Abb. 2. Temperaturabhaiigigkeit der JodStarkefarbe
892
Archiv der
Z i p f und S c h m i d
0
L
Pharmazie
b
l
LO 60 50 100 120 1L0 rnin
Abb. 4. Inaktivierung von a-Amylase in
waBriger Losung bei Zimmertemperatur
(A = dktivitatsabfall)
20
Abb. 3. Extinktion in rlbhangigkeit von
tler Starkekonzentration bei 565 m p
In der nachsten Abbildung ist die Beziehung zwischen Starlrekonzentration und
Extinktion (E) der gefarbten Losung dargestellt.
Das Lambert-Beersche Gesetz ist - wie ersichtlich - praktisch erfullt.
In einem weiteren Versuch wurde die Stabilitat verschiedener Fermentpraparate
in wal3riger Losung gepruft und eine erhebliche Aktivitatsabnahme in kurzer Zcit
festgestellt (Abb. 4).
Dieser Effekt wird auf ein vernachlassigbares MaB herabgedriickt, wenn als
Losungsmittel glycerinhaltiger Phosphatpuffer verwendet wird.
Der Zusammenhang Substratabbau - Reaktionszeit ist aus Abb. 5 ersichtlich.
S = Starkespaltung in yo des Ansatzes.
Aus der Abbildung la& sich entnehmen, daB bis zu einem Abbau von 20% des
Ansatzes lineare Proportionalitat zwischen Spaltprodukten und Reaktionszeit besteht.
Dieselbe Proportionalitat findet sich zwischen Spaltprodukten und Fermentinenge in dem erwahnten Bereich (Ahb. ti).
rerrneptmerge /mgl/Ansatz
Abb. 5. Starkespaltung als Funktion der
Reaktionszeit
Abb. 6 . Starkeabbau als Funktion der
Fermentkonzentratioii
Bd.
1x0,
Nr. 10
293.165.
I'erfuhren zur Am yheebeetimmung in Fernaentpraparuten
893
Auf Grund dieser Ergebnisse ergab sich folgende
Durchfuhrung der Fermentbestimmung
Prinzip
Kach kurzer Fermenteinwirkung wird Starkelosung mit Jodreagens versetzt, die entstehende Farbe photometrisch bestimmt und rnit Hilfe einer Eichkurve ausgewertet.
R e a g e n z i e n (p. a. - Qualitat)
Amylum solubile Merek, Glycerin. bidest., dyoo 1,23, Jodum resublimatum, K J , NaC1,
n-HC1, KH,PO, n. Sorensen, Na,HPO, * 2H,O n. Sorensen.
Losungen
S t a r k c l o s u n g . 1 g Starke wird in Aqua dest. kalt suspendiert, unter Erwiirmen gelost,
nach dem Abkuhlen mit 0,5 g NaCl versetzt und schlie13lich ad 500 ml aufgefiillt.
J o d r e a g e n s . 1 g J o d wird mit 3 g K J in der Reibschale. fein zerrieben, mit wenig
Wasser gelost und ad 500 ml aufgefullt.
P h o s p h a t p u f f e r , 0,2 normal: 4,64 g Kaliumphosphat und 5,82 g Natriumphosphat
werden ad 1000 ml mit Aqua dest. aufgefullt (pH 6 3 ) und mit 2 Vol yo Glycerin versetzt.
F e r m e n t l o s u n g (hergestellt und verdunnt mit Phosphatpuffer). 3 Tabletten bza-.
500 mg Fermentpulver werden mit Seesand fein zerrieben, in einen MeBkolben ubergefuhrt,
30 Minuten rnit etwa 50 ml Losung geschiitteIt und ad 1000 ml aufgefullt. Each Zentrifugieren (10 min, 3 4 0 0 0 U/min, 20" C) und Abfiltrieren (Schleicher & Schull Nr. 595)
wird vom Filtrat eine Verdiinnung hergestellt, von welcher 10ml nicht mchr als 4 m g
Starke/min entfarben.
Hauptversuch
10 ml Fermentlosung uiid 10 ml Starlrelosung werden im Wasserbad auf 37,O" C gebracht, gemischt, weiter im Wasserbad gehalten und nach genau l min rnit 2 ml HC1 und
10 ml Jodreagens versetzt. Ein Teil des Ansatzes wird rnit Aq. dest. 1 : 9 verdunnt, auf
37" C eingestellt, in eine I0 mm-Kuvette ubergefiihrt und in ein durch das Wasserbad miterwarmtes Photometer gebracht. Nach Temperaturausgleich wird 10 min nach Jodzugabe
die Bestimmung der optischen Durchlassigkeit gegen Aqua dest. bei 565 nip vorgenommen.
Eichkurve
Die Auswertung der MeBergebnisse erfolgt unter Verwendung einer Eichkurve, die mit
verdiinnten Starkelosungen durch Auftragen von Extinktion oder Transparenz gegen den
Stkkeabbau erhalten wird:
S t a r k e l o s un g (ml)
A q u a d e s t . (ml)
entspricht S t a r k e a b b a u (in
satzes)
20
0
19
1
18
2
17
3
16
4
0
5
10
15
20
yo d. An-
Jede Verdunnung wird wie ein gewohnlioher Ansatz behandelt mit dem Unterschied,
da13 an Stelle der Fermentlosung Phosphatpuffer Verwendung findet.
Zur Ausschaltung von Fehlern durch einen ctwaigen Starkegehalt des Praparates, dessen
Eigenfarbe usw. mu13 zu jedem Hauptversuch ein Leerversuch, bei dem die HC1 vor dem
894
Archiv der
Phxmazie
Z i p f und 8 c h m i d
Mischen von Ferment- und Starkeliisuuagzugefiigt wird, durchgefiihrt werden. Die Differenz
z wischen Leerwert und Anfangswert der Eichkurve (zo/o Punkt) wird beim MeBergebnis
des Hauptversuches sinngemaB beriicksichtigt. DaB so verfahren werden kann, wurde an
62 Eichkurven, die mit inaktivierten Fermentlosungen von 33 verschiedenfarbigen Handelspraparaten aufgestellt wurden, bestatigt gefunden : sie liefen alle parallel.
Auf diese Weise kommt man zu der Aussage, daB die im Ansatz enthaltene Fermentmenge eine Substratveranderung/min bewirkt, die einem dem MeBergebnis entsprechenden
Starkeabbau aquivalent ist. Dadurch wird es moglich, quantitative Vergleiche zwischen
verschiedenen Praparaten oder Prilparaten und Standard vorzunehmen.
Um Vergleiche mit Reduktionsbestimmungsmethoden z u ermoglichen, wurde der Zu sammenhang zwischen Starkeabbau und Reduktionsvermogen der Spaltprodukte fur CT Amylase ermittelt. Aus der folgenden Tabelle geht hervor, daB sich Starkespaltung und
Zunahme des Reduktionsvermogens (ausgedriickt in Maltoseaquivalenten) im Bereich der
Anfangsaktivitat linear proportional verhalten. Hier gilt die Beziehung : Maltose (in 7;
d. Th.) = 1,98 x Starkeabbau (in yo des Ansatzes).
Tabelle
Starkeabbau und Reduktionsvermogen der Spaltprodukte
Starkeabbau 111 :/o
(2Omg
=
100%)
04
6,ti
l”9
18,5
33,6
27,95
31,7
Maltoseiiquivalente in yo
(21,lO mg = lOOo/,)
020
13,l
25,6
36,9
46,2
53,6
56,9
Maltose&quivalente/
Starkeabbau
1,99
1,98
1,99
1,96
1,92
1,79
R e p r o d uz i e r b a r kei t
Die Streuung der Abbauwerte ergab sich bei 15 Bestimmungen einer Konzentration
desselben Fermentpraparates an verschiedenen Tagen zu & 0,9% des Ansatzes (Standardabweichung s).
Diskussion:
Das Absorptionsmaximum weicht von dem anderer Untersucher ab, die bei
620 m p (15, 17) bzw. mit Filter S 70 (5) messen. Das ist jedoch nicht iiberraschend,
da die Farbe vom Substrat und wohl auch vom JodlSubstrat-Verhaltnis abhangig
ist. Hopkins und JelineP) zeigen in ihren Untersuchungen, daB je nach Kettenlange des Substrates Absorptionsmaxima zwischen 470 und 680 mp gefunden
werden.
Die Konstanthaltung der Temperatur wahrend des MeBvorganges hat sich angesichts der Warmeempfindlichkeit der Farbe als notwendig erwiesen. Dieser Punkt
hat bei den bisherigen Methoden zu wenig Beachtung gefunden.
243.65. Bd.
1960, N r . ia
Verfahren zur Buiyluscbestirnwmng in Pernrentpraparaten
896
Eine Inaktivierung von &-Amylasein waBriger Liisung wird u. a. auch von Meyer
et. al.7) beschrieben. Er stellte fest, daB ungereinigtes Enzym im Verlauf von 24 h
bei 2” C bis zu ‘70% seiner Aklivitiit verlieren kann. Bei einem allgeniein anerkannten Fermentpraparat u urde in eigenen Versuchen iiber Nacht ein Aktivitatsverlust
von 9196 bei Zimmertemperatur festges tellt. Durch Losen in glycerinhaltigeni
Phosphatpuffer laBt sich die Inaktivierung niclit vollig aufheben. Sie wird jedoch
nuf em solches MaB reduziert, da13 sie wahrend der fiir die Ferinentbestimmung
erforderlichen Zeit vernachlassigt werden kann.
SclilieBlich sei noch ermalint, daB fiir die Durchfiihrnng des Haupt- und Leerversuches von eineni geiibten Untersucber etwa 30 Minuten benotigt werden.
Zusammenfassung
Es wird eine Methode znr Amylasebestimmnng in pharmazeutischen Fermentpriiparaten niitgeteilt und ihre Reproduzierharkeit anpegeben. Aueerdeni werden
Vorversuche dargelegt, auf welchen die Methode basiert.
Fraulein Sigrid Stobe danken wir fur die Mitarbeit.
Literatur
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IVulther, zit. nath 19).
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11)
Aiischrift: Prof. Dr. K. Zipf, Inat. f. Pliarinakologie, Toxikolofie u. Pharmazie der: TierPrztl. Fakultat
der Universitat 3Iiinuhm.
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