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Verlauf der Alkaloidbildung durch den Clavicepsstamm von Pennisetum typhoideum Rich. in saprophytischer Kultur. 54. Mitteilung Uber Mutterkornalkaloide

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510
Riati6 und Thomas - B r a c k , B r u n n e r um?K o b e l
Archfv der
mrmaae
2124. S. R i s t i 6 und A. T h o m a s
Zur Kenntnis von Rhynchosia pyramidalis (PEGA PALO)
Vorlirufige Mitteilung
Aus dem Forschungslaboratorium der
S. I. M. 1. U.*)
(Eingegangen am 14. Dezember 1961)
Rhynchosia pyramidalis wiichst reichlich in den Bergen der Dominikanischen
Republik. Die Inhaltsstoffe dieser Pflanze sind chemisch noch nicht erforscht. Da
ihnen aber androgene Wirkung zugeschrieben wird, haben wir die Droge einer
naheren Priifung unterzogen. Aus dem Pflanzenextrakt wurde ein Alkaloid mit
Ather extrahiert. Aus dem &her-Extrakt isolierten wir nach Umkristallisation mit
Alkohol sehr penetrant riechende, gelb gefarbte Kristalle. Diese sind in &her und
Chloroform loslich, in Wasser unloslich. Das mikroskopische Bild zeigt plattenformige, tafelige, rechteckige bis quadratische Formen. Im polarisierten Licht sind
diese stark lichtbrechend. Das Pikrat schmilzt bei 132". Mit Dragendorff's Reagens
erhalt man einen feinkornigen Niederschlag. Die Diinnschichtchromatogramme auf
Kieselgel-Platten mit Isopropylalkohol und 50proz. Essigsaure (10 : 1) als Laufmittel zeigen einen sehr intensiv blau leuchtenden Fleck (Rf: 0,95); Yohimbin (als
Vergleichssubstanz fluoresziert griin (Rf: 0,89).
Die Arheiten zur Identifizierung des Alkaloids werden fortgetsetzt.
*) Societas Internationalis Medicinae Internae et Urologirae.
dnerlirift. DI. S. Itistic, Densberg, Bern. Kbln, Haus Prankenforst.
2125. A. B r a c k , R. B r u n n e r und H. K o b e l
Verlauf der Alkalojdbildung durch den Clavicepsstamni von
Pennisetum typhoideum Rich. in saprophytischer Kultur
54. Mitteilung iiber Mutterkornalkalaide')
Aus dtvn pharmazentisch-chemischen Laboratoriuln der Sandozl Basel, Sichweiz
(Eingegangen am 21. Dezeniber 1961)
Das in saprophytischen Kulturen des Mutterkorn-Stammes von der afrikanischen
Kolbenhirse, P e n n i s e t u m t y p h o i d e u m Rich. neben den Alkaloiden der Clavingruppe2)erstmals entdeckte Chanoclavin3) nimmt strukturell mit seinem offenen
D-Ring des Ergolins eine Sonderstellung unter den Mutterkornalkaloiden ein. Es
ist als Begleitalkaloid in kleinen Mengen spater in verschiedenen Claviceps-Stam33. Mitt.: H . Kobel, R . Brunner und A . Brmb, Experientia 18, 140 (1962).
A . Stall, A . Rrack, H . Kobel, A . Hofmann und R. Brunner, Helv. chim. Acta 37,1815 (1954).
3) A . Hofmann, R . Brunner, H . Kobel und A . Brack, Helv. chim. Acta 40, 1358 (1957).
1)
2)
2%. Ed.
1962, Nr. 7
Verlauf der rllkaloidbildung i n saproph ytischer Kultur
511
men gefunden worden und wurde schon als Zwischenprodukt bei der Rildung des
Ergolinringsystems in Betracht gezogen4).
Wir stellten uns die Aufgabe, den zeitlichen Verlauf der Alkaloidbildung in saprophytischer Kultur zu verfolgen mit derdbsicht, abzuklaren, ob das Chanoclavin am
hnfang oder am Ende der Kulturdauer in grol3erer Menge vorkommt, denn man
konnte sich auch vorstellen, daB dieses Alkaloid erst als sekundares Abbauprodukt
durch Ringoffnung entsteht. Ferner interessierte uns die Frage, ob bei solchen
Versuchen ein Einblick in die Zusammenhange bei der Bildung der ubrigen Clavinalkaloide durch den Pilz gewonnen werden kann. Wir verwendeten.den ClavicepsStamm von P e n n i s e t u m t y p h o i d e u m , der dank seiner Fiihigkeit, in vitro
reichliche Mengen von Alkaloiden zu bilden, verschiedensten Arbeitskreisen als
wertvolles Studienobjekt fur Untersuchungen fiber die Biosynthese der Clavinalkaloide diente5-8).
Wir zuchteten unseren Clavicepsst.amm von Pennisetum typhoideum Rich. Nr. B 36
a!s Oberfliichenkultur bei 24O in Fenbachkolben auf folgender Niihrlosung:
100 g Saccharose, 10 g Ssparagin, 1 g Ca(NO,),, 0,25 g NgSO, * 7 H,O, 0,25 g =,PO,,
0,12 g KCI, 0,83 mg FeSO, * 7 H,O. 0,34 mg ZnSO, 7 H,O, dest,. Wasser ad 1 1, pH 4,2.
-411s einer Serie von 50 Kulturen mit je 500 ml Nahrlosung withlten wir fur den Versuch
14 genau gleich aussehende aus. Im Alter von 14, 17, 20, 27,34, 45 und 60 Tagen w d e u
jeweils 2 Kulturen geerntet (11). Zur Extraktion der Alkaloide aus Mycel und Nahrlosung
wurden die Kulfuren im Turmix homogenisiert. Durch Zugabe von Weinsiiure bis zur
sauren Reaktion und anschlieBender Rxtraktion mit, 2mal 250 ml Ather wurden die Fettstoffe entfernt. Die mit je 50 ml Iproz. U'einsaurelosung gewaschenen Ausziige wurden verworfen, dit sie keine Alkaloide enthielten. AnschlieBend wurden die Kulturen durch Zugabe
von Soda alkalisoh gestellt und durch 3malige Extraktion mit je 11Ather die Hauptmenge
der Alkaloide entzogen. Die letzt,enReste konnten durch 2malige Extraktion mit je 250 ml
Chloroform/Isopropanol-Gemisch 3 : 1 gewonnen werden. Die wlll3rigen Lijsungen, die
keine positive wan Urk-hakt.ion mehr gaben, wurden verworfen. Durch Sbdampfen dea
Lijsungsmittals i . Vak. wurden Alkaloidawziige erhalten, die nach dem Lijsen in wenig
ChloroformjMethanol-Gemisch 1 : 1, Filtrieren durch Talk und anschlieflendem Eindampfen zur Troche kolorimetrisch nach van Urk auf den Gehalt und pc nach der friiher
beschriebenen Methodels) auf die Zusammensetzung analysiert.
E r ge bn i sse
Wie aus Tab. 1 und Abb. 1 ersichtlich ist, steigt der Alkaloidgehalt in den Kulturen des Claviceps-Stammes von P e n n i s e t u m t y p h o i d e u m regelmal3ig an bis
zum 45. Tag und sinkt bis zum 60. Tag deutlich ab, wahrend das Mycelgewicht
zwischen dem 14. und 20. Tag den steilsten Anstieg zeigt und bereits nach dem
34. Tag leicht abnimmt.
H . Rochelmeyer, Pharmaz. Ztg. 103, 1289 (1958).
V . E . Tyler jr., Zusammenfassende ubersicht mit Literatur bis 1'360:J. Pharmac. Sciences
50, 629 (1961).
6, S. Bhattucharji,A . J . Birch, A . Brack, A . Hofrrmnn, If. Kobel, D. C . C . Smith, tl. Smith untl
J . Winter, J. chem. SOC.(London) 1962, 421.
i , R. M.Bader, S. I . Kandel und A. Okony, Chem. and Ind. 1961, 1453.
a) H . Plieninger, R . Fiacher, G . Keilich und H. U . Orth, Liebigs Ann. Chem. 642, 214 (1961).
5,
512
Archiv der
Pharmazie
Brack, Brzcnner und Kobe1
Tabelle 1
Mycelgewichte und Alkaloidgehalt nach Alter rler Kulturen des Claviceps
von Pennisetum typhoideum
Alter der Kulturen
T@iF
14
15
20
27
34
I
I
pH
4,o
4,1
495
64
6,O
594
6,5
45
60
1
i
Mycelgewicht
(feucht)
g/l
1
Total-Alkaloidgehaltin
Mycel Filtrclt
mg/l (MG 250)
+
70
105
140
170
195
180
150
37
112
177
284
379
523
425
PH
7
6
5
4
Y
,
10
20
30 40
Abb. 1
50
60 Tage
Die Zusemmenseteung des gebildeten Alkaloidgemisches in den verschiedenen
Altersstufen ist in Tab. 2 und Abb. 2 dargestellt. (Einige Begleitalkaloide, die in
sehr geringer Menge nachweisbar sind, erwahnen wir hier nicht.)
Tahelle 2
Slkaloide hei verschiedenen Albmstufen in der saprophyt. Kultur
des Claviceps- Stamme8 von Pennisetum typhoideum
Alter der
Kultur
Tage
14
17
20
27
34
45
60
Chanoclavin
in yoder
TotalAlkaloide
1
3
4
12
16
27
17
+
Penni- +
Isopenni-
I
Elymoclavin
mg/l
clavin
Agroclaviii
mg /1
mg/l
SetoIsosetoclavin
mg/l
17
60
105
17B
250
344
272
0
0
0
3
12
27
38
15
41
58
78
78
82
43
4
8
10
15
23
43
43
295. Eld.
1962, Nr.7
613
Verlauf der Alkddbildung in 8aprophhytiScher Kdtur
-
300
I
A
T
Elumoclavin
70
20
30
40
50
60 Tage
Abb. 2
Daraus ist ersichtlich, da13 der Anteil von Chanoclavin am Gesamtakaloidgehalt
iiber die ganze Kulturdauer nur sehr wenig variiert. Nach diesen Befunden bleibt
also die Frage, ob Chanoclavin als Vorstufe bei der Biosynthese der Clavinalkaloide
oder aber als sekundiires Ringoffnungsprodukt anzusehen ist, nach wie vor unbeantwortet.
Am der Tab. 2 ersehen wir ferner, da13 die beiden Hauptalkaloide Elymoclavin
und Agroclavin bis zum 45. Tag zunehmen und nachher wieder abnehmen. Am
27. Tag treten Penni- und Isopenniclavin in Erscheinung, welche d a m standig zunehmen, auch im letzten Kulturabschnitt zwischen dem 45. und 60. Tag. Neben
Agroclavin sind Seto- und Isosetoclavin von Anfang an vorhanden, sie nehmen
bis zum 45. Tag zu und bleiben dann konstant, wahrend Agroclavin bereits wieder
abnimmt. Wird der relative Gehalt an hydroxylierten Alkaloiden in hozenten des
jeweils vorhandenen Elymoclavins bzw. Agroclavins berechnet (Tab. 3 und Abb. 3),
so erhalt man ein instruktives Bild.
Tsbelle 3
Relativer Gehalt an hydroxylierten Alkaloiden beim Clavicep-Stamm
von Pennisetum typhoideum
AlterderKdtur
I
Penni- u. Ieopenniclevin
in yo dea Elymoolavina
14
17
20
0
0
0
27
1,7
34
46
80
498
73
14,O
I
%to- 11. ~ C L e V i n
in%deeAgmolavina
26,7
19,5
17,2
19,2
29,5
52,6
100,o
33
514
Arcbiv der
Brack, Brrnner und Kobe1
700 -
Phamazie
/
1
Pennic/avinl;Iso-/
in % d Elymoclavins
I
10
20
30
40
50
60 Toge
Abb. 3
Sowohl Penniclavin als auch Setoclavin nehmen in der letzten Kulturperiode
vom 45. bis 60. Tag bis auf den doppelten Prozentsatz zu, wahrend die Hauptalkaloide in dieser Zeit bereits deutlich abnehmen, in einem Zeitabschnitt, in dem
bereits Autolyse eintritt, die sich beim Mycelgewicht schon vom 34.Tag an deutlich
abzeichnet.
Es ist interessant, dafi die prozentuale Setoclavin-Kurve in der ersten Zeit absinkt. Der Abfall der Kurve deckt sich zeitlich mit der Periode des steilsten Mycelanstieges zwischen dem 14. und 20. Tag. Das Verhaltnis Setoclavin :Agroclavin
verschiebt sich demnach in dieser Zeit zugunsten von Agroclavin. Dies geschieht
wahrscheinlich in Abhangigkeit vom Redoxpotential in der Nahrlosung, das in der
Phase des steilsten Mycelanstiegs tiefer ist. Mit dem Abflachen der Mycelgewichtskurve steigt auch das Redoxpotential, wie Poigt und Wichmann gezeigt habens),
wieder an, vor allem gegen Ende der Kulturdauer. Damit geht eine starke Verschiebung des Verhaltnisses Setoclavin : Agroclavin zugunsten von Setoclavin parallel.
Aus den vorliegenden Befunden lafit sich nichts iiber die Bedeutung des Chanoclavins schliefien, ebenso kann nichts ausgesagt werden iiber eine denkbare uberfuhrung von Agroclavin in Elymoclavin oder umgekehrt (nach der Hypothese von
AbelO). Aus dem Ansteigen des Gehaltes an Penni- und Isopenniclavin sowie Setound Isosetoclavin bei gleichzeitiger Abnahme von Elymoclavin und Agroclavin
gegen Ende der Kulturdauer konnte vielleicht auf eine sekundare Hydroxylierung
9,
10)
R. VoOigt und D. Wichmann, Pharmazie 16, 369 (1961).
Jf. Abe, T. Yamano, N . Kusomoto, S . Yamuiodani und Y . Kozu, Ann. Rep. Takeda Rep.
Lab. 18, l ( 1 9 5 9 ) .
296. Bd.
1962. Nr. 7
515
a-Matrin aua Sophora rwacroearp Sm.
cler letztgenannten Alkaloide geschlossen werden, was Befunden anderer Autorens)
11) 12) nicht widersprechen wiirde. Eine solche Hydroxyherung in 8-Stellung des
Ergolinsystems konnte von uns mit dem Psilocybe-Pilz nachgewiesen werden13).
~
fiir die Mitarbeit bei der DurchWir danken Frl. Hanni Bisi und Herrn K l a Riiuli
fuhrung der Versuche.
Agurell und &. Ranmtad, Tetrahedron Letters (London)15, 301 (1961).
C. I . Abou-Chanr, D.Gr@w, R. L. Brady,und P. E. Tyler jr., Lloydia, 24, 159 (1961).
Is) A . B r c k , R. Brunner und H . Robel, Helv. chim. Acta 45, 27li (1962).
11) S .
IP)
~
-4nschrift: Dr. A. Brack, Basel (Scliweiz), Sandoz-AG.
2126. M. S i l v a , R. S t i i c k und P. C h a v e z
a-Matrin aus Sophora macrocarpa Sm.*)
Laboratorio de Fitoquimica, Departamento de Botanica-Institute Central de Biologia,
Universidad de Concepci6n (Chile)
(Eingegangen am 19. Dezember 1961)
Aus dem Semen einer in der Provinz Concepci6n (Chile) vorkommenden Pflanze,
Sophora macrooarpa Sm., die zur Familie der Leguminosen gehort, konnte a-Matrin
gewonnen werden.
Diese Pflanze, die auch ,,mayu" genannt wirdl), wachst nur inChile, und zwar
zwischen dem 33. und 38. Breitengrade.
Die Mikroanalysen wurden im Max-Planck-Institut fiir Kohlenforschung von A. Bemhardt ausgefiihrt. Fiir Aufnahme des IR-Spektrunis danken wir H e m R. P. H.Bond,
fiir authentisches a-Matrin Herrn Prof. Lindsay H. Briggs (The University of Auckland).
Wir danken dem British Council fur groI3zugige Unterstutzung.
Beachreibung der Versuche
1370 g trockener und feingemahlener Samen von Sophora macrocarpa wurden rnit
Petroliither in einem Soxhlet-Apparat extrahiert. Nach Verdampfen des 1.osuhgsmittels
blieb ein dunkelgefiirbtes (11 zuriick (370 g), das mit Sproz. Salzsliure extrahiert wurde.
Der Auszug wurde alkalisiert und das Basengemisch mit Chloroform extrahiert. Basenfraktion I.
Der in Petroliither unlosliche Ruckstand wurde mit 2proz. Essigsiiure in Athano1 in
einem Soxhlet-Apparat extrahiert. Nach Entfernung des Alkohols durch Wasserdampfdestillation wurde die wLBrige Phase stark alkalisiert und mit Chloroform extrabiert
(Basenfraktion II)a).
Die PC zeigte, daI3 die Basenfraktionen I und I1 die gleichen zwei Alkaloide enthieltens).
8ie wurden i. Vak. eingedampft und mit Petroliithcr (Sdp. 80--110°) extrahiert. der EX*) Diplomarbeit P. Chuvez, Universidad de Chile, 1961.
A . Pfister und V.Ricardi, Rev. Universitaria, Chile 1, 127 (1946).
z , L. 61. Briggs und J . Ricketta, 6.chem. SOC. (London)2, 1795 (1937).
3) Ch,. W. Roscoe und ,V. A. Hall, J. Amer. pharmac. Assoc. sci. Edit. 49, 110 (1960).
l)
33 *
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