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Zur Biogenese des Peganins.

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293.165. Bd.
Zur Biogenese des Peganins
1960, Nr. 12
1049
1940. D. Groger und K. Mothes
Zur Biogenese des Peganins*)
Aus dem Institut fur Biochemie der Pflanzen in Halle/S.
der Deutschen Akademie der Wissenschaften
(Eingegangcn am 15. August 1960)
I n der Steppenraute P e g a n u m h a r m a l a L. finden sich neben Carbolinbasen,
den Harmanabkommlingen, no& Vertreter eines anderen Alkaloidtyps, dessen
Biogenese bisher noch wenig untersucht worden ist. Es sind dies Chinazolinalkaloide, deren bekanntester Vertreter das Peganin ist.
Das Peganin oder Vasicin wurde im Jahre 1888 erstmalig im Pflanzenreich in
einer indischen A c a n t h a c e e A d h a t o d a v a s i c a N. von D. Hooperl) aufgefunden und spater durch die indischen Chemiker S e n und Ghose2) naher charakterisiert.
Um 1930 wurde bei der Firma E. Merck, Darmstadt, in den Mutterlaugen, die
bei der technischen Gewinnung von Harmanalkaloiden aus den Samen der Steppenraute anfielen, ein neues Alkaloid gefunden, welches von E . Spath naher untersucht wurde. I n einer Reihe von Arbeiten, die sich iiber rnehrere Jahre erstreckten,
gelang es E . Spiith und seiner Schule, die Identitat dieses neuen Alkaloids mit dem
Vasicin nachz~weisen~)
4). Von derselben Arbeitsgruppe wurde das Peganin erstmalig totalsynthetisch aufgebaut und somit endgultig seine Struktur geklart.5)
Rosenfeld und Kolesnikov6) berichteten 1936 iiber Arbeiten, die sie irn Jahre 1932
durchgefuhrt haben und die damals zur Isolation von L-Peganin a m den Bluten
und Stengeln der Steppenraute fuhrten.
Nach Pallares') entsteht bei der Saurehydrolyse des in der Rinde von ,, S a n g r e
d e d r a g o " vorkommenden Farbstoffes ebenfalls L-Peganin.
Erst in den letzten Jahren wurden andere Alkaloide in der Natur aufgefunden,
die sich vom Pegan ableiten. Koretzkaja und Utkins) 9, gemTannen 1957 aus den
oberirdischen Teilen von P e g a n u m h a r m a l a , die wahrend der Bliitein Kirgisien
gesammelt worden waren, Alkaloide in einer Ausbeute von 1,87y0. 1,33% erwiesen
sich als Peganin, walirend aus dem restlichen Material zwei neue Alkaloide isoliert
werden konnten: Alkaloid 1 = 2,3-Trimethylenchinazolon-(4) und Alkaloid
2 = L-2,3-(a-)Hydroxytrimethylenchinazolon-(4).
* ) Herrn Professor Dr. H . Kaiser, Stuttgart, aus AnlaIJ der 70. Wiederkehr seines Geburtstages in Verehrung gewidmet.
1) D. Hooper, Pharmac. J. 18, 841 (1888).
2 , I . N . S e n u. T . P. Chose, Quart. J., Indian chem. Soc. I , 315 (1924).
3, E. Bputh u. F. Kuffner, Ber. dtsch. chem. Ges. 67, 868 (1034).
4, E . Spah u. 3'. Kuffner, Ber. dtsch. chem. Ges. 68, 497 (1935).
5, E . Spath, 3'. Kujjner u. N . Platzer, Ber. dtsch. chem. Gee. 68, 699 (1935).
6 ) A. D.Rosenfeld u. D. G. Kolesnikov, Ber. dtsch. chem. Ges. 69, 2022 (1936).
7 ) E . S . Pallares, Arch. Biochemistry 10, 233 (1046).
8 ) N . J. Koretzkaja, 3 . allg. Chemie (russ.) 27, 3361 (1957).
g, N . J. Koretzkaja u. L. M . Utkin, J. allg. Chemie (russ.) 28, 1087 (1958).
Archiv 293./65, Heft 12
67
1050
Archiv cler
Pharmazie
@ r o g e r und M o t k e s
H"
Pegan
Doppelbindung in 9,10-Stellung
Pegen-(9) oder Desoxyvasicin
0
Pegen-(9)-on-(8)-
Peganin
0
2,3-((I-oxy-Trimethylen)-chinazolon-4
2,3-Trimethylenchinazolon-4
Kiirzlich konnten Amim und Mehlalo) ebenfalls das 2,3-Trimethylenchinazolon-(4) aus den Blattern von A d h a t o d a v a s i c a isolieren. Sie nanntenihr Alkaloid
Vasicinon. Dieses Alkaloid war bereits friiher totalsynthetisch von zwei Arbeitsgruppen aufgebaut wordenll) 12).
In Indien werden die Blatter von A d h a t o d a als Hustenmittel und zur Behandlung des Asthmas verwendet. Nach Amin und Mehta soll die bronchodilatorische
Wirkung auf dem Vasicinon beruhen, das in der Droge in kleinen Blengen enthalten
ist oder durch Autoxidation des Vasicins leicht entstehen kann. Dem Vasicin selbst
soll keine Wirkung in dieser Richtung zukommen. Nach russischen Autoren13)
soll das Peganin die Cholinesterasewirkungen hemmen und auf die glatte Muskulatur des Uterus und des Darmes starke Reizwirkungen ausiiben.
uber die Biosynthese des Peganins liegen bis auf die klassischen Arbeiten von
Schbpf und OechZer14) keine weiteren Untersuchungen vor. Xchopf versuchte unter
,,zellmoglichen Bedingungen" Peganin zu synthetisieren. Wenn dies auch nicht
gelang, so konnte er doch den Grundkorper, das Desoxyvasicin aufbauen: 0Aminobenzaldehyd kondensiert sich mit y-Aminobutyraldehyd bei pH 5 zum
2,3-Trimethylen-l,2-dihydrochinazoliumhydroxyd.
Schuttelt man eine Losung
dieses Stoffes mit Palladium unter Wasserstoff, so verschiebt sich die Doppelbindung von der 1,2- in die 3,4-Stellung und man erhalt das Desoxyvasicin in einer
Ausbeute von etwa 18%. C. Schopf nimmt auf Grund seiner Versuche an, da8 in
der pflanzlichen Zelle das Peganin aus o-Aminobenzaldehyd - welcher miiglicherweise aus dem Tryptophan entsteht - und dem bis j e t z t noch nicht bekannten
a-Oxy-y-aminobutyraldehyd aufgebaut werden konnte.
R0binsonl5) vertritt die Vorstellung, dal3 Anthranilsaure und Prolin die Vorstufen des Peganins sind.
lo)
11)
lZ)
13)
14)
15)
A . H . Amin u. I). R. Nehta, liature 184, 1317 (1969).
X o r r i s , Hanford, Adams, J. Amer. chem. Soc. 57, 951 (1935).
E . Spiith u. N . Plutzer, Ber. dtsch. chem. Ges. 68, 2221 (1935).
I . X. Scharupow, Pharmakol. u. Toxikol. (russ.) 22, 69 (195.9).
G. Schopj u. P.Oechler, Liehigs Ann. Chem. 523, 1 (1936).
R . Robinson, ,,The structural relations of natural products " Oxford 1955, S. 150.
293.165. Bd.
i w , Nr. 12
1051
Zur Biogenese des Peganins
Anthranilsaure hat eine int>eressante Position im primaren und sekundaren
Stoffwechsel. Sie kann Vorstufe wie auch Abbauprodukt des Tryptophans sein,
dessen Beziehung zu den Alkaloiden voin Ergolin-Typ, wie zu den Carbolinen vom
Typ der Harman-Alkaloide von uns untersucht worden ist16). Die Anthranilsaure
hat aber auch formale Beziehungen zum Damascenin und vor allem zu einer Reihe
von Chinolinderivaten. Wenn diese zum Teil auch uber Kynurenin aus Tryptophan
entstehen durften, \vie das im tierischen Stoffwechsel fur das Kynurin und die
Kynurensaure gezeigt worden ist, so ist auch eine Eondensation der Anthranilsaure mit anderen Bausteinen zu Chinolinverbindungen sehr wahrscheinlich. Dieser
Fragenkomplex ist in unserem Arbeitskreis aufgegriffen worden. Hier werden erste
Versuche mitgeteilt uber die Inkorporation der Radioaktivitat in Peganin bei der
Verfutterung von Anthranil~aure-[~~COOH]
an steril aufgezogene PeganumPflanzen.
E x p e r i m e n t elle s : Samen von P e g a n u m h a r m a1a (Herkunft : Ashkabad-Sowjetunion) wurden 15 Min. rnit O,lqoiger Silbernitratlosung geschuttelt, einige Male mit
sterilem Wasser gewaschen und in sterilen Petrischalen, die mit angefeuchtetem Zellstoff
ausgelegt waren, zum Keimen gebracht. Nach 6 Tagen wurden die Keimlinge in Reagenzglaser (LLnge 37 cm; lichte Weite 4 cm) umgesetzt. Sie waren vor dem Sterilisieren mit
Xahrlosung nach Zinzadze I (1/2 Konzentration mit vollem Stickstoff) beschickt worden.
ifber der Oberflache der Nahrlosung war in den Reagenzglasern eiii mil Mull bespannter
Ring befestigt worden, auf dem der Keimling ausgelegt wurde.
Nach 5 Wochen wurde zu acht gut entwickelten Pflanzen je 1 ml sterile Anthranilsaurelijsung ( = 0,3 mg Anthranilsaure) hinzugegeben und der Versuch nach dreiwochiger
Inkubation abgeerntet. Am Ende des Versuches waren samtliche Nahrlosungen frei von
Bakterien, so daR eine Zersetzung des precursors durch Mikroorganismen im Nahrmedium
wahrend der Inkubation ausgeschlosseii erscheint.
Die eingesetzte h t h r a n i l ~ a u r e - [ ~ ~ C O Obesal3
H ] unter unseren MeBbedingungen eine
s ~ e z Aktivitat
.
von 8.45 lo8 Ipm. Xlle Praparate wurden stets in unendlich dunner
Schicht im Methan-DurchfluBzLhlrohr von Friesecke und Hopofner gemessen.
Die Pflanzen wurden in SproR und Wurzel zerlegt und bei 70' getrocknet. Die Trockengewichte betrugen: 65 mg Wurzeln und 470 mg SproB. Zur Extraktion der Alkaloide
wurden 65 mg Wurzelmasse bzw. 100 mg Sprossmasse mit 2 Tropfen 10°/oigem Ammoniak verrieben und dreimal je zwei Stunden mit 10 ml einer Mischung von Chloroform : Isopropylalkohol (3 : 1) geschiittelt. Die Extrakte wurden vereinigt und dann
in 2 ml Methanol aufgenommen.
I s o l a t i o n d e s P e g a n i n s : Es gelang uns nicht, mittels Papierchromatographie das
Peganin von den Harmana.llraloiden, die besonders in der Vl'urzel in sehr groBer Menge
vorhanden sind, abzutrennen. I n den gepriiften Losungsmitteln hatte Peganin fast immer
den gleichen Rf-Wert wie Harmalol. Wir reinigten deshalb die Extrakte mittels Dunnschichtchromatographie und arbeitet'en nach dem von Klohrl') angegebenen Verfahren.
Als mobile Phase benutzten wir Chloroform : dthanol (1 : 1). Wir erreichten damit eine
einwandfreie Abtrennung des Peganins VOA den Harmanalkalojden, die in diesem System
hohere Rf-Werte besitzen. Die Zone mit dem Peganin wurde von der Glasplatte abgekratzt und mit Methanol p. a. auf dem Wasserbad extrahiert. Dieser Extrakt wurde
nun vorsichtig eingeengt und auf Schleicher-u.-Schull-Papier2043 bgl, welches mit
McIlvaine-Puffer vom plr 7 , 2 impragniert worden war, aufgetragen. Zur Entwicklung
benutzten wir wassergesiittigtes n-Butanol. Vom Papierchromatogramm wurde das
-
16)
li)
I). Croyer u. H . Sirnon (im Druck).
R. Rlohr, Dissertation, Martin-Luther-Universitat Halle-Wittenberg 1957.
67 *
1052
Archiv der
Pharmazie
Groger und Mothes
Peganin erneut mit Methanol p. a. eluiert und in genau 5 ml Methanol aufgenommen.
Von dieser Losung wurde nun ein aliquoter Teil entnommen zur Aktivitatsbestimmung
und der Rest zur quantitativen Bestimmung verwendet. Die Losung wurde im Spektrophotometer (russ. Model1 SF 4) bei 290 mp gemessen und die Werte einer Eichkurve entnommen, die mit reinom Peganin unter gleichen Bedingungen aufgestellt worden war.
Es hat sich gezeigt, daB man zu diesem Zweck das Chromatographiepapier vor dem Auftragen der Substanz und dem Impragnieren 50 Stunden mit Methanol waschen muB, da,
von ungewaschenem Papier mit Methanol Substanzen eluiert werden, die bei 290 mp
eine starke Absorption zeigen. Durch die Aufnahme des UV-Absorptionsspektrums wurde
gleichzeitig nochmals die Reinheit des Peganins kontrolliert.
E r g e b ni s s e : Uber die Ergebnisse unterrichtet die Tabelle 1. Die spez. Einbauraten der Anthranilsaure des in den Wurzeln gebildeten Peganins betrugen 235 yo
und die des in den Stengeln gebildeten Peganins 0,55%. In den in den Wurzeln
gebildeten Harmanalkaloiden konnt'e keine Aktivitat nachgewiesen werden. Das
durch Radioautographie nachgewiesene aktive Peganin zeigte hinsichtlich der
Rf-Werte und Farbung nach Muizier die gleichen Eigenschaften wie inaktives
Peganin.
Es ist somit wahrscheinlich, da8 die Anthranilsaure als eine der Vorstufen des
Peganins angesehen werden kann.
Tabelle 1
Der Einbau von $nthranilsa~re-[~~COOH]
in Peganin
Spez. Aktivitat
(Ipm/rnM)
Ant~ranilsaure-L14UUOHl
Peganin aus der Wurzel
Peganin aus dem SproB
Spez. Einbaurate
8,45 * lo8
2,03 10'
4,7 * 108
2,55%
065%
Es ist wahrscheinlicli, daB auch im normalen Stoffwechsel vonPeganumAnthrani1saure die Vorstufe des Peganins ist, doch ist unentschiedeu, woher sie stammt.
Ihre Beziehungen Zuni Tryptophan und damit zur anderen Gruppe der PeganumAlkaloide, zu den Hnrman-Alkaloiden, wurde schon erwahnt. Vielleicht spaltet
sich der Tryptophan-Stoffmechsel der Steppenraute. Und es ware interessant zu
wissen, ob die beiden Alkaloidtypen in verschiedenen Geweben entstehen : Peganin
findet sich in allen Teilen der Pflanze, die Harma,n-Alkaloide vor allem im Samen
und in den WurzeSn, wahrend sie in1 SproD stark zurucktreten. Das Vorkommen
sagt jedoch nichts uber den Bildungsort aus. Interessanter ist, daB das ,,WurzeSPeganin" eine grol3ere Einbaurate zeigt als das ,,SproB-Peganin". Die Kultur
isolierter Organe konnte hier woiterfiihren.
Der zweite Baustein des Peganins konnte Hydroxyprolin sein oder die entsprechende Hydroxypyrrolin-Verbindung. Diesbeziigliche radioalrtive Markierungen sind in Arbeit.
Wir danken Herrn Prof. Dr. Dr. h. c. CZ. Schopf, Darmstadt, fur die freundliche uberlassung von Peganin, fur kollegiale Hilfe Fraulein Dr. Engelbrech,t bei den sterilen Kulturen und Herrn Dr. Schiitte bei der Markierung der Anthranilsaure.
Ariscfirift: Dr. D. Griiger, Institiit, f. Biocliemie der Pflansen, Halle/Saale.
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