close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Zur BioverfUgbarkeit von Nitrofurantoin 2. Mitt. Quantitative Bestimmung von Nitrofurantoin im Blutserum

код для вставкиСкачать
Bioverfugbarkeit von Nitrofurantoin
312179
697
Arch. Pharm. (Weinheim) 312,697-703 (1979)
Zur Bioverfiigbarkeit von Nitrofurantoin, 2. Mitt.')
Quantitative Bestimmung von Nitrofurantoin im Blutserum
Siegfried Ebel*)**), Raincr Liedtke, Barbara MiRler, Margret Richter und Peter Surmann
Fachbereich Pharmazie und Lebensmittelchemie der Philipps-Universitat, Marbacher Weg 6, 3550
MarburgiLahn, und Klinische Forschung von Heyden GmbH Regensburg
Eingegangen am 19. Oktober 1978
Zur quantitativen Restimmung von Nitrofurantoin im Blutserum wird ein Aufarbeitungsschema
angegeben, das eine Zersetzung des Nitrofurantoins auch bei einer Zwischenlagerung der Proben im
tiefgefrorenen Zustand weitestgehend ausschlieBt. Durch Kombination der Hochdruckfliissigchromatographie und der differential pulse-polarography wird eine Stijrung durch evtl. Metabolite und
durch Begleitsubstanzen des Rlutserums praktisch ausgeschlossen. Die Wiederfindungsrate liegt bei
der Extraktion bei 87 %, bei der Aufarbeitung uber Extrelut-Saulen bei 9 0 %. Die Genauigkeit der
Methode liegt bei etwa 4.4 %, die Erfassungsgrenze bei Verwendung von 5 ml Serum 0.2 pg ml
(HPLC) bzw. 0.4 pg ml-' (Polarographie) Nitrofurantoin bezogen auf das vorliegende Blutserum.
'
Bioavailibility of Nitrofurantoin; 11: Quantitative Determination of Nitrofurantoin in Blood Serum
A method for the determination of nitrofurantoin in blood serum is described. The method is not
influenced by the degradation of nitrofurantoin by light. The samples to be analyzed may be stored in a
deep freezer. Systematic errors caused by metabolites or the matrix of the sample are eliminated by
using a combination of differential pulse polarography and high pressure liquid chromatography. The
ratio of detection is about 87 % using extraction methods with nitromethane and about 90 70using
commercially available extrelut columns. The accuracy of the method is in the order of 4.4 % and the
detection limit working with 5 ml blood serum is 0.2 (HPLC) or0.4 pg (dp polarography) per ml of the
blood sample.
Nitrofurantoin wird vorwiegend als Chemotherapeutikurn der ableitenden Harnwege
eingesetzt. Aus diesern Grunde besteht die Notwendigkeit, dieDarreichungsform so zu
optirnieren, daB rnoglichst gunstige Urinspiegel-Werte errcicht werden. Von d e r F D A
wird eine Untersuchung d e r Bioverfugbarkeit verlangt, d a keine wirklich zuverlassigen in
vitro-Versuche bekannt sind, die einc cinwandfreie Korrelation Arzneiform/Urinspiegel
zulassen. Eine selektive und sehr genaue Methode zur Bestimmung des Nitrofurantoins in
Urinproben wurde von uns rnitgeteilt'). Wahrend fur cine parameterlose Bioverfiigbarkeitsstudie und ebenso fur eine parameterlose pharmakokinetische Untersuchung cine
rein deskriptive Darstellung der Blutspiegel-Werte ausreichen mag, ist zum wirklichen
O3h.C~233/79!07(17~)697
$02,5010
0 Verlag Chcmie. GmhH. Weinhelm IY7Y
698
Ehel. Liedtke, Mifiler, Richter und Surmann
Arch. Pharm.
Verstandnis d e r Pharmakokinetik u n d z u r Ermittlung der wirklichen Bioverfugbarkeit
eine Kenntnis d e s zeitlichen Verlaufs auch d e r Blutwerte notwendig, d a n u r eine
Korrelation beider GroBen u n d d i e D a t e n d e r zugehorigen P a r a m e t e r wirklich aussagekraftig sind. In d e r Literatur finden sich n u r wenige Arbeiten z u r Analytik d e s
Nitrofurantoins i m Blut, die z. T. widerspruchlich sind u n d a u a e r d e m bezuglich
systematischer Fehler u n d Selektivitat keine n a h e r e n A n g a b e n enthalten. Berucksichtigt
w e r d e n muB auBerdem, daR Nitrofurantoin zu m e h r als 50 % im Organismus a b g e b a u t
wird, wobei allerdings bislang anscheinend keine Metabolite isoliert u n d aufgeklart
~ u r d e n * - ~Die
) . vorliegende Arbeit sol1deshalb eine M e t h o d e beschreiben, die Nitrofurantoin einmal aufgrund d e r Nitrogruppe (hier wiirden folglich k e i n e d e r postulierten
Aminometaboliten erfaRt) und zum a n d e r e n u b e r die Konjugation der beiden Ringsystem e des intakten Molekuls (hier w u r d e n keine Spaltprodukte a n der C = N-Doppelbindung
erfaBt) quantitativ bestimmt und somit hochselektiv ist.
Kolorimetrische Bestimmung
Alle in der Literatur beschriebenen Methoden zur Bestimmung des Nitrofurantoins im Blutserum
bedienen sich kolorimetrischer Bestimmungsverfahren. Das auf B u ~ a r d ‘ . zuruckgehende
~)
Verfahren
verwendet eine Reaktion mit Phenylhydrazin nach saurer Hydrolyse mit nachfolgender Extraktion
und Messung bei 625 nm. Es wurde von M i m i s f o h )zur Bestimmung von Blutspiegelwerten eingesetzt.
Bei diesem Verfahren storen alle Substanzen, die mit oder auch ohne Hydrolyse gefarbte
Phenylhydrazone oder auch Osazone ergeben. AuRerdem schien uns die Methode insgesamt zu
arbeitsaufwendig zu sein. Die von C~nklin’.~)und spater auch von Mattock”’ bzw. Albert9)
angewendete Hyamin-Methode ist ebenfalls sehr storanfallig. Einmal werden alle sauren Verbindungen erfaBt, die mit Hyamin ein extrahierbares Farbsalz bilden, zum anderen ist die praktische
Erfassungsgrenze nicht ausreichend. Es tritt ein zeitabhangiger Blindwert auf’” und weiterhin
bedingen eine ganze Reihe von Begleitstoffen eine hohe Untergrundabsorption bei der MeRwellenlange von 450 nm. Nach unseren Erfahrungen IaRt sich auch die Untergrundabsorption nicht
kompensieren; hinzukommt, daR individuelle und auch tageszeitliche Schwankungen auftreten und
somit Veranderungen eines Referenzserums bewirken konnen.
Hochdruckfliissigchromatographie
Im Gegensatz zur Bestimmung des Nitrofurantoins in Urinproben, bei der eine direkte
polar~graphische’*’~)
oder derivativ-spektralfotometrische’)Messung moglich ist, ist bei der quantitativen selektiven Erfassung in Blutserum ein Abtrennen von Begleitstoffen erforderlich. Es wurde
deshalb eine Methode iiber die Direktauswertung von Dunnschichtchromatogrammen ausgearbeitet”). I m Hinblick auf einen hoheren Probendurchsatz, wie er bei einer Bioverfugbarkeitsstudie
notwendig ist, wurde gleichzeitig eine HPLC-Methode erarbeitet. Allerdings ist die Nachweis- und
Erfassungsgrenze bei einer fotometrischen Detektion hierbei nicht ausreichend, u m Serumproben
direkt aufzugeben. Dies ist bei einer elektrochemischcn Detektion moglich”), doch war bei der
elektrochemischen Reduktion des Nitrofurantoins die Reproduzierbarkeit nicht ausreichend gege-
312/79
Rio verfugharkeit von Nirrofura n toin
699
hen. Infolgedessen mul3te ein Anreicherungsschritt eingefiigt werden. Dieser Anreicherungsschritt
muBte zudem mit einer Ahtrennung der im Serum vorhandenen EiweiRkorper verbunden sein, da
Proteine sowohl die HPLC-Methode als auch die unten angefiihrte polarographische Bestimmung
storen oder beeinflussen konnen.
Fur die chromatographische Trennung erwies sich ein chemisch gehundenes reversed-phase -Material als stationare Phase als hesonders geeignet. Durch Variation der Zusamrnensetzung der mohilen
Phase MethanoVWasser konnte eine einwandfreie Abtrennung des Nitrofurantoins von anderen
leicht gefarbten Substanzen aus der Analysenmatrix erreicht werden. Die Detektion erfolgt im
Ahsorptionsmaximum des Nitrofurantoins bei 368-37 1 nm.
Die Auswertung erfolgte iiber die Peakhohe des registrierten Detektorsignals. Die Genauigkeit
der Aufgahe auf die Saule iiher das Rheodyne-System betrug 1.24 %. Hierzu wurden Konzentrationen von 1-20 pg ml-'jeweilszehnmal injiziert. Da dieser Fehlerim Hinblick auf den Gesamtfehlerdes
Analysenverfahrens vernachlassighar erschien, wurde von dem Zusatz eines internen Standards
abgesehen. Die hei der Vermessung der Aufgabengenauigkeit erhaltenen Werte wurden gleichzeitig
zur Aufstellung der Eichgeraden verwendet. Dies war vor allem deshalh notwendig, weil die
Wiederfindungsrate deutlich unter 100 % lag.
PolarographischeBestimmung
Nitrofurantoin lal3t sich iiber seine Nitrogruppe sehr leicht polarographisch reduzieren16.17).Bei der Ausarbeitung der Bestimmung von Nitrofurantoin in Urinproben w u r d e
von u n s die differential pulse-Polarographie eingesetzt'), die sich durch eine sehr giinstige
Erfassungsgrenze auszeichnet. Diese Methode eignet sich im Zusarnmenhang mit der hier
beschriebenen Aufarbeitung auch zur quantitativen Bestimmung des Nitrofurantoins im
Serum. Eine eingehende Analyse von Blindseren zeigte, dal3 im betrachteten Spannungsbereich zwar eine geneigte Grundlinie vorliegt, aber nicht mit einer systematischen
Storung zu rechnen ist (Abb. 1 B). Die Auswertung kann im einfachsten Fall iiber die
Peakhohe unter entsprechender Korrektur des Verlaufs der Basislinie (vgl. Abb. 1 A)
Nitroflrantoin
I
Abb. 1: Bestimmung dcs Nitrofurantoins im
Blutserum nach Extraktion mit Nitrorncthan
iiber differential pulse Polarographic
A C = 5 pg ml-' Blutserum; B Blindserum
700
Ebel. Liedtke, MiBler. Richter und Surmann
Arch. Pharm.
erfolgen. Dariiberhinaus ist a u c h eine m a t h e m a t i s c h e P e a k a p p r o x i m a t i o n iiber e i n e
Exponentialfunktion") moglich, die v o r allem b e i einer r e c h n e r g e s t e u e r t e n Polarographie") von Vorteil ist u n d cine verbesserte R e p r o d u z i e r b a r k e i t u n d G e n a u i g k e i t mit sich
bringt.
A u f a r b e i t u n g der Serumproben
Fur die polarographische oder hochdruckfliissigchromatographischeBestimmung des Nitrofurantoins im Blutserum ist eine Abtrennung von einer Reihe der Begleitstoffe im Serum und eine
Anreicherung notwendig. Als Extraktionsrnittel kommen vor allem Nitromethan und Essigsauremcthylester in Frage. Die Verteilungsfaktoren wurden mit p = 97 (Nitromethan) bzw. p = 90
(Methylacetat) gegen Wasser als andere Phase bestimmt. Gegeniiber Blutserum liegen die Werte
etwas ungiinstiger, was auf eine gewisse Liisungsvermittlung durch die Serummatrix zuriickzufiihren
sein diirfte. Am geeignetsten erschien uns eine Extraktion mit Nitromethan aus Serum. dem 0.1 M
HCI zugesetzt worden war. Nitromethan besitzt eine relative Dichte von 1.I35gm1-I und bildet somit
bei Zugabe zu Serum die untere Phase. Urn nach dem Zentrifugieren eine Phasenumkehr zu
erreichen, wurden 4 g Natriumchlorid zugesetzt. Nach dem Zentrifugieren ergeben sich drei Phasen.
f
5 0 ml Serum
2 5 r d O1M HCI
15
ml Nitromethan
Phasenumkehr
Ni tromet hanphase
waxhen
100 ml N-phase
LM abziehen
T 6 30"
I 1 0 ml
HPLC direkt vermessen
Polarographie + 5 0 ml h f f e r
Puffer
I
53Z
Abb. 2: Aufarbeitungsschema der Serumproben zur Nitrofurantoin-~cstimmung
312/7Y
Bioverfiigbarkeir von Nitrofurantoin
70 1
da sich zwischen der oberen organischen und der unteren wa13rigen Phase eine Schicht pastiiser
Serumbestandteile abscheidet. Nach dem Abtrennen der organischen Phase mu13 diese noch mit
Petrolether gewaschen werden, falls eine polarographische Bestimmung erfolgt, da die ehenfalls
extrahierten Lipidbestandteile des Serums den Diffusionsvorgang in der Polarographie und damit die
richtige Signalausbildung beeintrachtigen. Bei einer anschlieBenden Anwendung der HPLC kann
diese Operation entfallen. Nitrofurantoin ist in Nitromethan nur bedingt stabil. Aus diesem Grunde
und um gleichzeitig eine Konzentrierung zu erreichen, wird das Nitromethan am Olpumpenvak. bei
einer 30" nicht iiberschreitenden Temperatur abgezogen. Der Ruckstand wird im Britton RobinsonPuffer pH5 aufgenommen und kann anschlieBend direkt vermessen werden.
Sol1 eine Lagerung zwischen Blutentnahme und Analytik vorgenommen werden, so kann das
Blutserum bei -23" tiefgefroren gehalten werden. In tiefgefrorenem Serum tritt innerhalb 4 Wochen
keinerlei Zersetzungein. Normales Serum mu13 dagegen wegen der Empfindlichkeit des Nitrofurantoins innerhalb einer Stunde aufgearbeitet werden.
Wiederfindungsrate, Erfassungsgrenze
Ein wesentliches Problem bei der Bestimmung von Arzneimitteln im Organmaterial oder
Kiirperfliissigkeiten ist die Bestimmung der Wiederfindungsrate. Da eine einfache Zumischmethode
keine wirkliche Aussagekraft besitzt, wurde von einem nitrofurantoinfreien Serum ausgegangen, dem
jeweils definierte Mengen Nitrofurantoin zugesetzt wurden. Nach der gesamten Aufarbeitung nach
dem oben angefiihrten Schema wurde das MeSsignal mit dem einer gleichen Menge Nitrofurantoin in
derselben Pufferlosung direkt verglichen. Um zufillige Fehler auszuschliellen, wurde eine Eichgerade
im gesamten interessierenden Konzentrationsbereich einschlieRlich eines Leerwertes vermessen.
Diese Eichreihe konnte jedoch zusatzlich einen weiteren Fehler aufweisen, der von einem evtl.
vorhandenen Serumbestandteil herruhrt. Deshalb wurden weitere Eichreihen unter Verwendung
jeweils anderer Blindseren anderer Herkunft vermessen. Alle Eichgeraden waren Ursprungsgeraden,
d. h. es lag bei keinem Serum ein additiver systematischer Fehler vor. Alle MeBpunkte ergaben eine
Genauigkeit uber die Gesamtoperation von 4.4 90(als genaherte relative Standardabweichung, n =
54). bei einer Wiederfindungsrate von 87.3 % fur die HPLC (Abb. 3). Bei der Polarographie ist die
Abb. 3: Eichgerade und Wiederfindungsrate von Nitrofurantoin aus
Serumproben (Bestimmung durch
2
3
702
Ehel, Liedtke. MiBler. Richter und Surmann
Arch. Pharm.
Wiederfindungsrate geringfiigig kleiner, da durch noch vorhandene Serumbestandteile, die die
Diffusion an die Elektrode beeinflussen, anscheinend eine schwache Verringerung der Stufenhohe
bzw. der Peakhohe auftritt. Verwendet man Extrelut-Saulen, so betragt die Wiederfindungsrate fast
90 %. Hierbei werden 5 ml Serum mit 5 ml 0.9 proz. NaCI-Losung versetzt und aufgegeben. Die
Elution erfolgt mit insgesamt 25-30 ml Nitromethan. Von Vorteil hei diesem Verfahren ist der
wesentlich geringere Arbeitsaufwand. Die praktische Erfassungsgrenze liegt bei Serumspiegeln van
0.2 pg ml - I (HPLC) bzw. 0.4 pg m1-I (Polarographie). Geht man von 10 ml Serum aus und verwendet
lediglich 0.5 ml (HPLC) bzw. 5 ml Pufferlosung (Polarographie), so ergeben sich Erfassungsgrenzen
von 100 ng ml-' (HPLC) bzw. 200 ng/ml-' (Polarographie). Eine weitere Herabsetzung der
Erfassungsgrenze bei der HPLC ist durch eine Erhijhung des Injektionsvolumens moglich. Prinzipiell
ware somit einc Bestimmung des Nitrofurantoins im Bereich bis herab zu 10 ng m1-I Blutserum
moglich. Bei einer Reihe von Versuchen an verschiedenen Seren ergaben beide Methoden
Ergebnisse, die innerhalb der Fehlergrenze iibereinstimmten, d. h. das gewahlte Verfahren ist selektiv
gegeniiber der zu bestimmenden Substanz.
Dem Bundesminister fur Forschung und Technologie danken wir fur die Unterstiitzung dieser
Arbeiten durch Personal- und Sachmittel; Frl. Nickel fur die Mitarbeit bei der Durchfiihrung der
Analysen und Messungen.
Experimenteller Teil
Hochdruckflussigchromatographie
Gerat: Perkin Elmer PE 1220 mit Rheodyne Aufgahesystem und Detektor PE 55; Stationare Phase:
Hihar-Fertigsaule Lichrosorb RP 18 (E. Merck, Darmstadt); mobile Phase: Methanol/Wasser 50
50 (v/v); Stromungsgeschwindigkeit: 1 ml min-I; Injektionsvol. 10 PI; MeSwellenlange 368 nm.
+
Polarographie
Gerat: Polarecord Metrohm E 506 mit Polarographiestand E 505; Entluftung mit Reinststickstoff;
differential pulse mode.
Reagenzien: Nitromethan, frisch dest.; Extrelut-Saulen (E. Merck, Darmstadt); Methanol p. a.;
Britton Robinson-Puffer pH 5 (0.04M H, PO,, 0.04M CH, COOH. 0.04 M H,BO,, 0.02M NaOH
100 + 100 100 105; dv/v).
+
+
Literntur
** Auszugsweise vorgetragen auf der Tagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft in
Tiibingen 1978.
S. Ebel, R. Liedtke, B. MiSler, M. Richter und P. Surmann, Arch. Pharm. (Weinheim), 312, 689
(1979).
K. H. Beyer, Biotransformation der Arzneimittel, Wissenschaftl. Verlagsges., Stuttgart 1975.
S. Pfeifer, Biotransformation von Arzneimitteln, Bd. 2, S. 257, Verlag Chemie, Weinheim 1977.
I. A. Buzard et al., Antibiot. Chemother. (Basel) 6, 702 (1956).
Pyrazole und Pyrazolo-pyrimidine
312/79
703
N. Nakamura und A. R. Takeda, Res. Labor. Rec. 20, 21 (1961).
P. Mannisto, Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. Toxicol. 16, 223 (1978).
J. D. Conklin und R. D. Hollifield, Clin. Chem. (N. Y.)12, 690 (1966).
J. D. Conklin und F. J. Hailey, Clin. Pharmacol. Ther. 10. 534 (1969).
K.S. Albert et al., J. Clin. Pharmacol. 1 1 . 264 (1974).
G L. Mattock, I. J. Mc Gilveray und C. Charette, Clin. Chem. (N. Y.)16. 820 (1970).
S. Ebel und B. MiBler, unveriiffentlichte Messungen.
R. Griining, Dtsch. Apoth. Ztg. I l X , 13.54 (1978).
P. Surmann, unveroffentlichte Messungen.
S. Ebel, M. Richter und P. Surmann, Fresenius Z . Anal. Chem. (im Druck).
S. Ebel, J. Hocke. M. Richter und P. Surmann, Veroffentlichung in Vorbereitung.
D. E. Cadwallader und H. W. Jun in K. Florey (Hrsg.), Analytical Profiles of Drug Substances 5.
S.34.5, Academic Press, New York 1976.
17 S.Ebel, Handbuch der Arzneimittelanalytik, Verlag Chemie, Weinheim 1977.
(Ph 481
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Arch. Pharm. (Weinheim) 312, 703-707 (1979)
Pyrazoles and Pyrazolo[3,4-d]pyrimidinesas BiologicallyActive
Agents, 11’)
Vishnu Ji Ram* and Hrishikesh Pandey
Department of Chemistry, S. C. College, Ballia (U. P.) India
Eingegangen am 25. Oktober 1978
Pyrazoles with bio-active substituents at different positions are prepared and cyclised to the
corresponding pyrazolo[3,4-d]pyrimidinesin order to establish structure-activity relationships. The
structure of the compounds is established by micro-analyses and spectroscopic studies.
Pyrazole und Pynzolol3,4-d ]pyrimidine nls biologisch aktive Verbindungen, 2. Mitt.
Es werden Pyrazole mit bioaktiven Substituenten in verschiedenen Positionen hergestellt und zu den
entsprechenden Pyrazolo[3,4-d]pyrimidinen
zyklisiert, urn Struktur-Wirkungsbeziehungenaufzustellen. Die Struktur der Verbindungen wird durch Mikroanalysen und spektroskopische Daten gesichert.
The tranquilizing, muscle relaxant, psychoanaleptic’), hypnotic’), anticon~ulsant~~~),
antipyretic6)
and antican~er’~),
activities of pyrazoles prompted the synthesis of 1,3,4,5-tetrasubstitutedpyrazoles.
Recently MetcalP) h a s discussed cholinesterase inhibiting property of such compounds which show
systemic insecticidal activity and related the presence of alkylthiosubstituents in these compounds and
03654233/7Y/07074703 S 02.50/0
0 Verlag Chemie. GmbH. Weinheim 1Y7Y
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
339 Кб
Теги
nitrofurantoin, bestimmung, zur, bioverfugbarkeit, mitte, blutserum, von, quantitative
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа