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Schwierigkeiten beim Saponinnachweis mittels der Blutgelatinemethode und deren Behebung.

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Schwierigkeiten beim Saponinnachweis
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851. R. Jaretzky und W. Lindner:
Schwierigkeiten beim Saponinnachweis
mittels der Blutgelatinemethode und deren Behebung.
(Aus dem Pharmakognostischen Institut der Technischen Hochschule,
Braunschweig.)
Eingegangen am 18. Oktober 1938.
Zum qualitativen Saponinnachweis in Pflanzen bedient man sich
heute allgemein der von L u f t (1926) eingefuhrten, von F i s c h e r
(1928) vervollkommneten Blutgelatinemethode. Man legt das zu
untersuchende Pflanzenmaterial, Pulver oder Schnittpraparate, in gepufferte Blutgelatine und beobachtet, ob und in welcher Zeit Hamolyse in den das Untersuchungsmaterial einhullenden Schichten auftritt. Bleibt eine Hiimolyse selbst nach 12 und 24 Stunden aus, so
wird das Fehlen von Saponin angenommen, ist hingegen eine mehr
oder weniger starke Hamolyse eingetreten, so mu8 in weiteren Untersuchungen gepruft werden, ob die Hamolyse durch ein Saponin oder
durch irgendeinen anderen hamolysierenden Pflanzeninhaltsstoff
(z. B. atherisches 01) hervorgerufen wird. Dieser Prufung liegt die
Erfahrungstatsache zugrunde, da8 Saponine Neigung haben, mit
Cholesterin eine Additionsverbindung einzugehen, die nicht mehr zu
hamolysieren vermag, und da8 diese nichthamolysierende Additionsverbindung durch Kochen mit Xylol in die beiden Komponenten gespalten wird. Legt man das mit einer Cholesterinlosung behandelte
Pflanzenmaterial in Blutgelatine ein, so darf bei Vorliegen eines Saponins Hamolyse nicht mehr auftreten, die Hamolyse mu8 aber wieder
in Erscheinung treten, wenn das mit Cholesterin behandelte Material
mit Xylol gekocht wird, wobei das Saponincholesterid gespalten und
das Cholesterin gelost wird, wlhrend das freie Saponin ungelost im
Zellverband zuruckbleibt. F i s c h e r empfiehlt, schwach hamolysierende Pflanzenteile mit einer Ather-Cholesterin-Losung zu kochen,
stark und sehr stark hamolysierende Pflanzenteile mit einer Athylalkohol-Ather- oder Athylalkohol-Cholesterin-Losung.
Wir haben die hier kurz skizzierte, im Innsbrucker Pharmakognostischen Institut erprobte und in vielen anderen Instituten vielfach bewahrte Methode zum qualitativen Nachweis von Saponinen
benutzt, dabei aber die Erfahrung machen mussen, da8 sie uns nicht
in allen Fallen eindeutige Resultate liefert. Im Zuge unserer systematischen Bearbeitung der Leguminosen stellten wir bei zahlreichen
Medicagoarten in nahezu allen Organteilen hamolysierende Substanzen fest. Die hamolysierende Kraft dieser Substanzen war in einigen
Fallen, vor allem in den Blattern und Wurzeln, so gro8, dai3 die
Hamolyse in weniger als einer Minute deutlich zu erkennen war und
sich allmahlich ,,Hofe" von groBer Dimension bildeten. Da nach Behandlungen des Pflanzenmaterials mit einer Ather-, Athylalkoholoder Ather-Athylalkohol-Cholesterin-Losungdie Hamolyse in unverSnderter Starke auftrat, hatten wir, einer allgemeinen Gepflogenheit
folgend, den Saponincharakter der hamolysierenden Substanz leugnen
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R. J a r e t z k y und W. L i n d n e r
inussen. Nun ist aber von B o a s und S t e u d e (1937) das Vorkommen von Saponin in Medicago falcata L. eindeutig bewiesen worden.
Die Autoren isolierten aus 200 g lufttrockenem Kraut 0.11 g saures
und 0.06 g neutrales Kohsaponin mit den hamolytischen Indizes 3000
bzw. 1350. Da zudem die von uns zur Identifizierung der hamolysierenden Substanz angewandte Reaktion von V a m w a k a s (1907)
positive Ergebnisse lieferte, waren wir geneigt, das Vorkommen von
Saponin in Medicagoarten anzunehmen und fur den negativen Ausgang des Hamolyscversuches irgendwelche noch unbekannten Umstande vcrantwortlich zu machen. Wir dachten hierbei in erster Linie
an die Moglichkeit, da8 das Medicagosaponin mit dem Cholesterin
keine Additionsverbindung einzugehen vermag. Wir versuchten,
tliese Frage durch eine systematische Bearbeitung des Materials zu
klaren. Zunachst pruftcn wir die Loslichkeit der hamolysierenden
Substanz in verschiedenen Solventien. In Ather ist sie praktisch unloslich, in Athyl- und Methylalkohol ein wenig loslich, desgleichen in
lraltem und warmem Wasser, vollstandig dagegen in alkalischen Medien wie KaOH-Losung und ammoniakalischem Wasser. LaBt man
auf Medicagoblatter ein Gemisch von 10 ccm Wasser und 4 ccm Ammoniak 12 Stunden lang bei gelegentlichem Umschutteln einwirken,
so verlieren diese ihre hamolytische Wirksamkeit. Die hamolysierende Substanz verhalt sich also wie ein saures Saponin. Nunmehr
stellten wir uns eine konzentriertere Losung des Ilamolytikums her,
indem wir 2.0 g eines 5 Stunden bei looo und anschliefiend 1 Stunde
bei 50" getrockneten Blattpulvers von Med. sativa L. mit einem Gemisch r o n 25 ccm Wasser und 2 ccm Ammoniak uber 24 Stunden
extrahierten. In den schwach alkalischen Auszug hangten wir einen
2 cm breiten und 30 cm langen, mit einer 3 cm hohen Cholesterinschranke versehenen Filtrierpapierstreifen so ein, daB die Schranke
sich 0.5 his 1 cm uber dem Flussigkeitsspiegel befand. Nach
48 Stunden wurden die Streifen herausgenommen und an der Sonne
getrocknet. Ein abgetrenntcr Langsstreifen der Cholesterinschranke
von 2 mm Breite erzeugte in Blutgelatine keine Hamolyse, dagegen
lief ein zweiter, mit Xylol langere Zeit (2 Stunden) gekochter Langsstreifen starke Hamolyse hervor. Dieser Versuch wurde wiederholt
mit dem gleichen Erfolg durchgefuhrt. Damit war bewiesen, da8
Medicago sativa in den Blattern e i n S a p o n i n f u h r t , d a s m i t
Cholesterin eine mit heifiem X y l o l wieder s p a l t b a r e A d d i t i o n s v e r b i n d u n g e i n g e h t . Es war nur noch
x u prufen, warum die ubliche Versuchsmethodik versagte. Zu diesem
Zwecke wurden von uns schmale Langsstreifen der Cholesterinschrankc vor dem Einbetten in Blutgelatine folgender Behandlung
unterworfen:
1. erhitzt uber direkter Flamme auf dem Objekttrager,
2 . gewaschen mit 90%igem Athylalkohol (6 Stunden),
3. gewaschen mit Chloroform (6 Stunden),
4. gewaschen mit kaltem Xylol (6 Stunden),
5. gewaschen mit Ather (30 Minuten),
6. gewaschcn mit Methylalkohol (6 Stunden),
7. cingelegt in 1596ige Salzsaure (15 Minuten).
Schwierigkeiten beim Saponinnachweis
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Da Versuch 1 ergeben hatte, dai3 selbst starkes Erhitzen der
Streifen auf dem Objekttrager nicht zu einer Spaltung oder Verlinderung des Saponincholesterids fuhrt, wurden die Streifen der
Versuche 2 bis 7 zur Vertreibung der anhaftenden Flussigkeit vor
dem Einlegen in Blutgelatine uber freier Flamme erhitzt. Die Streifen
der Versuche 2, 3, 4 und 5 erzeugten Hamolyse, die Streifen 6 und 7
dagegen nicht. Damit ist bewiesen, daO das M e d i c a g o s a p o n i n Cholesterid durch Ather, Athylalkohol, Chlorof o r m u n d X y l o l b e r e i t s i n d e r K a l t e g e s p a l t e n wird.
Dieser Umstand gibt uns auch eine Erklarung fur den negativen
Ausgang des Cholesterinversuchs nach dem bisher ublichen Saponinnachweisverfahren.
Da der Saponinnachweis mittels der Cholesterinschranke sehr
umstandlich ist und vie1 Zeit beansprucht, was bei grofieren Reihenversuchen, wie wir sic zurzeit durchfuhren, nicht gerade angenehm
empfunden wird, wurde versucht, die bisher gebrauchliche Methode
zum Saponinnachweis dadurch fur unseren Spezialfall geeignet zu
machen, daO wir als Losungsmittel fur das Cholesterin statt Ather
oder Athylalkohol Methylalkohol verwandten. Das Material wurde
mit einer 10 % igen Anschuttelung von Cholesterin in MethylalkohoI
(beim Sieden klare Losung) auf dem Wasserbade erhitzt, dann wurde
dreimal mit kaltem Methylalkohol gewaschen und schliefilich zur
Entfernung der letzten Cholesterinreste 5 Minuten mit reinem Methylalkohol gekocht. Bei geringen Saponinmengen geniigte eine kurzere Kochdauer (5 bis 20 Minuten), bei stark hamolysierenden Blattern ist gelegentlich eine langere Kochdauer (90 Minuten) erforderlich. Die Sprengung des Saponincholesterids kann mit Ather vorgenommen werden, doch kommt man rascher zum Ziel, wenn man
in der ublichen Weise mit Xylol kocht.
Mit der von uns abgeanderten Methode ist es uns moglich gewesen, in den Blattern sowie einigen anderen Organteilen von 25
verschiedenen Medicagoarten eindeutig Saponin nachzuweisen. Ahnlich wie bei Medicago liegen die Verhaltnisse bei Gleditschia. Es
erscheint uns geboten, e i n e m i i 3 l u n g e n e C h o l e s t e r i n b i n dung in jedem Falle m i t a n d c r e n M i t t e l n zu wiederholen, bevor man den Saponincharakter der
h a m o 1 y s i e r e n d e n S u b s t a n z 1 e u g n e t.
Es schien uns auf Grund dicser Erfahrungen nutzlich, die von
K o f 1 e r und S t e i d 1 (1934) bereits untersuchten Folia Gymnemae
erneut einer Prufung zu unterziehen. K o f 1 e r und S t e i d 1 erhielten mit Gymnemablattern eine starke Hamolyse in Blutgelatine,
allein diese Ilamolyse trat in gleicher Starke nach der Cholesterinbehandlung auf, so daD nicht auf das Vorliegen eines Saponins geschlossen werden konnte. Wir haben Gymnemablatter der Jnstitutssammlung, welche gleichfalls eine starke Hamolyse in Blutgelatine
hervorriefen, mit einer Losung von Cholesterin in Methylalkohol gekocht. Derartig behandelte Blattstuckchen vermochten Blut nicht
mehr zu hamolysieren, zeigten aber nach dem Abkochen mit Xylol
rrneut hamolytische Wirkung. Damit ist von uns der Nachweis
eines Saponins in Fol. Gymnemae erbracht. Das Gymnemasaponin
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R. J a r e t z k y und W. L i n d n e r
zeigt aber keineswegs das gleiche Verhalten wie das oder die Medicagosaponine. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dac das
Gymnemasaponin auch in einer Losung von Cholesterin in Athylalkohol in eine nicht hamolysierende Additionsverbindung ubergefuhrt wird, nicht aber in einer Losung von Cholesterin in Ather oder
in einem Gemisch aus gleichen Teilen absolutem Alkohol und Ather.
Bei der Prufung von Pflanzenteilen auf Vorkommen oder Fehlen
yon Saponin mittels der Blutgelatinemethode ist bei einem negativen
Ausgang des Versuches noch keineswegs mit Sicherheit auf die Abwesenheit von Saponin zu schliefien, man mul3 vielmehr mit der
Moglichkeit rechnen, dal3 nur s e h r g e r i n g e M e n g e n e i n e s
auflerst schwach hamolysierenden Saponins v o r liegen, welche mit der Blutgelatinemethode nicht
e r f a 13 t w e r d e n. Dies gilt z. B. fur die Sojabohne. K o j i 0 k a n o
und I w a o 0 h a r a (1933) haben aus der Sojabohne unlangst neben
nichthamolysierenden auch hamolysierende Saponine nachgewiesen.
Man sollte auf Grund dieser Feststellung erwarten, dal3 Organteile
der Sojabohne in Blutgelatine Hamolyse hervorrufen. Dies ist aber
nicht der Fall, wie wir uns in unzahligen Versuchen uberzeugen
konnten. Da wir keinen AnlaiJ hatten, die Angaben der japanischen
Forscher zu bezweifeln, haben wir uns bemuht, Konzentrate der
hamolysierenden Substanzen herzustellen und zu prufen. Von der
Ueberlegung ausgehend, dal3 Saponine im allgemeinen in Methylalkohol mehr oder weniger leicht loslich sind und aus dieser Losung
durch Ather gefallt werden, haben wir fein gepulverte Samen
der Sojabohne uber 1 Stunde mit der funffachen Menge Methylalkohol gekocht. Die heiiJ filtrierte Fliissigkeit wurde auf dem
Wasserbade etwas eingeengt und nach dem Erkalten mit reichlichen
Mengen Ather versetzt. Der bei 60° getrocknete Niederschlag hamolysierte Blutgelatine. Die hamolysierende Substanz gab mit Cholesterin eine nicht hamolysierende Additionsverbindung, welche durch
Xylol in der Warme gespalten wurde. Ahnlich wie bei der Sojabohne liegen die Verhaltnisse bei vielen anderen Arten. Samenteile
von Astragalus baeticus L. und Astr. galegiformis L. erzeugen in
Blutgelatine keinen hamolytischen Hof; versetzt man jedoch den
methylalkoholischen Samenauszug mit Ather, so erhalt man einen
Niederschlag, der die Eigenschaften eines Saponins zeigt. Die krautigen Teile von Trifolium pratense L. rufen in Blutgelatine keine
Hamolyse hervor; die Atherfallung eines methylalkoholischen Auszuges besitzt dagegen Saponineigenschaften. Auf Grund der hier
mitgeteilten Befunde w i r d e s s i c h e m p f e h l e n , i n a l l e n
Fallen, wo d e r Saponinnachweis d u r c h E i n l e g e n
von Pflanzenteilen in Blutgelatine negativ ausgefallen ist, das Vorkommen von Saponin a b e r aus
i r g e n d e i n e m G r u n d e v e r m u t e t w e r d e n mul3, d i e
Xtherfallung des methylalkoholischen Auszuges
zu prufen.
Noch in einem ganz anders gelagerten Fall kann der iibliche
Saponinnachweis mittels Blutgelatine zu einem Fehlurteil fuhren,
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Schwierigkeiten beim Saponinnachweis
namlich dann, wenn die Saponine in der Pflanze an Sterine gebunden
sind.
Es ist bekannt, daf3 Saponine nicht nur mit Cholesterin, sondern
auch mit Phytosterinen nichthamolysierende Additionsverbindungen
eingehen konnen. Phytosterine sind aber im Pflanzenreich allgemein
verbreitet. In grof3eren Mengen sind sie vor allem in fettreichen
Samen anzutreffen. Sollte man da nicht mit der Moglichkeit rechnen,
dai3 in den fettreichen Leguminosensamen solche ,,verkappten" Saponine, nichthamolysierende Saponinsteride vorliegen? In der Annahme, daf3 die evtl. vorhandenen Saponinphytosteride durch siedendes Xylol in gleicher Weise in die beiden Bausteine gespalten werden
wie die Saponincholesteride, haben wir Samenschnittpraparate von
70 Arten aus verschiedenen Gattungen der Leguminosen vor und
nach einer Xylolkochung in Blutgelatine eingelegt. Hier interessieren
nur die mit den Samen von O r m o s i a d a s y c a r p a Jacks. gewonnenen Ergebnisse, weil sie das Vorliegen e i n e s ,,v e r k a p p t e n " S a p o n i n s beweisen und auf das Vorliegen eines Saponinphytosterids hindeuten. Zur Untersuchung standen die etwa zwei
bis drei Jahrzehnte alten Samen aus der karpologischen Sammlung
des Braunschweiger Instituts zur Verfugung. Die Samen wurden
halbiert und jeweils homologe Teile aus beiden Halften gepruft.
Die unbehandelten Stucke erzeugten in keinem
Falle Hamolyse, die mit Xylol gekochten Stucke
h i i m o l y s i e r t e n d a g e g e n r e c h t s t a r k . Behandelt man die
mit Xylol gekochten Samenteile mit einer Ather-Cholesterin-Losung,
so vermogen sie nicht mehr zu hamolysieren, erhalten aber ihr
Hiimolysevermogen zuruck, wenn man sie erneut mit Xylol kocht.
Diese Feststellung sollte uns bei der Auswertung eines negativen
Hiimolysebefundes zur Vorsicht gemahnen. Erst dann hat das
Fehlen von Saponin in einer Pflanze oder einem Pflanzenteil als erwiesen zu gelten, wenn der Hamolyseversuch auch nach dem Kochen
des Pflanzenmaterials mit Xylol negativ ausgefallen ist.
S c h r i f t t u m.
B o a s und S t e u d e , Angew. Botanik, 1936, Heft 1.
R. F i s c h e r , Uber den Nachweis Ides Saponingehaltes mit Blutgdatine.
Pharmaz. Monatshefte 9, 1 (1928) nach den Sitzungsberichten der Akademie
der Wissenschaften, Math.-naturw. Klasse, Abt. I, 139, 321.
K o f 1 e r unld S t e i d 1 , Arch. Pharmaz. Ber. Dtsch. Pharmax. Ges. 1934,
S. 301.
K o j 0 k a n o und I w a o 0 h a r a , Bull. agr. SOC. Japan 1933, S. 177
bis 180 (zit. nach Chem. Ztrbl. 1934, 11, 2537).
G. v. L u f t , Sitzungsberichte der Akad. d. Wiss., Wien, Math.-naturw.
Klasse, Abt. I, 135, 259 (1926).
J. V a m w a k a s , Ann. chim. analyt. appl. 11, 161 ~(1906)und 12, 58 und
139 (1907).
Archiv und Eerichte 1939
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