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Thermofraktographie von Chinarinde und der entsprechenden Alkaloide.

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Thermofrakrographie von China-Alkaloide
925
1-Isobutyl-2,4,5-triphenyl-imidazo
I (5 i)
Analog 5a aus Benzaldehyd, Benzil und Isobutylamin; Schnip. 133O (Benzol/Ligroin), Ausb.:
35 % d. Th. C x H % N 2 (352,s). Ber.: C 85,19; H 6 3 6 ; N 7.95. Gef.: C 85,02; H 7.10; N 7.91
I ?hen yl-2-cyclohex yl-4,S-diphenyl-imidazol(5j)
Analog 5a aus Cyclohexylcarbaldehyd, Benzil und Anilin. I>as Kohprodukt wyrde in Ather gclost, wobei 6a zuruckblieb. Nach Abdampfen des Athers und Auflosez des Ruckstandes in
siedendem Athanol kristallisierte 5j beim Erkalten. Schmp. 207-208 (Athanol), Ausb.: 25 %
d. Th. C27H26N2 ( 3 7 8 5 ) . Ber.: C 85,68; H 6,92; N 7.40.Gef.: C 85,78; H 6.78; N 7.25.
2-Cyclohexyl-4,5diphenyl-imidazol(6a)
Nebenprodukt bei der Darstellung von Sj. Schmp. 244O ( 1 2 ) 244O) (Athanollbither), Ausb.: 20 %
d . Th.
1 2 H. Schubert, J. prakt. Chem. 3. 146 (1956).
Anschrift: Prof. Dr. W. Schunaek, 65 Mainz, Saarstr. 21
[Ph 4161
E. Stahl und W.Schmitt
Thermofraktographievon Chinarinde und der entsprechenden Alkaloide
lnstitut f i r Pharmakognosie und Analytische Phytochemie der Universitat des Saarlandes,
6 6 Saarbriieken 11
(Eingegangen am 23. November 1973)
Chinin, Chinidin sowie Cinchonin und Cinchonidin sublimieren unter den Bedingungen der
Thermofraktographie (TFG) unzersetzt ab 180'. Die entsprechenden Salze, wie 2.B. die Sulfate
und Tannate spalten sich hierbei im Temperaturbereich uber 220' zu cbenfalls blau fluoreszierenden Chinolinderivaten. Diese Spaltprodukte erhalt man auch beim Erhitzen der Droge
(GRAHE'sche Teerprobe). Im einzelnen entstehen aus Cinchonin- und Cinchonidinsalzen Chinolin
und Lepidin als Hauptprodukte neben wenig 4-Athylchinolin und 4-Propylchinolin. Aus Chininund Chinidinsalzen bilden sich hauptsachlich 6-Methoxychinolin und 6-Methoxylepidin neben
geringen Mengen der entsprechcnden 6-Hydroxyderivate. Im Vergleich zur T F G erhalt man bci
der Fragmcntierung im Massenspektromcter mit 7 0 e V keines dieser charakteristischen Chinolinderivate.
Thermofractography of Red Cinchona Bark and its Alkaloids
Quinine and quinidine as well as cinchonine and cinchonidine sublimate under the conditions
of Thermofractography (TFG) without decomposition above 180'. The corresponding salts, e.g.
sulfates and tannates split a t a temperature range of above 220' into likewise blue fluorecent
derivatives. These fission products are also obtained on heating the drug (GRAHE's tar test). Quino-
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Stahl und Schmitt
Arch. Pharmaz.
line and lepidinc are formed in particular as main products from cinchonine and cinchonidine
salts besides small amounts of 4-ethylquinoline and Cpropylquinoline. Mainly 6-mcthoxyquinoline and 6-methoxylepidine are yielded,and minor amounts of the corresponding 6-hydroxyderivatives from quinine- and quinidine salts. None of these characteristic quinoline derivatives IS obtained through fragmcntation with 70 eV in a mass spectrograph.
Schon vor mehr als 100 Jaliren war man bestrebt, Drogen auf einfachem chemischanalytischem Weg zu charakterisieren. Ein Beispiel hierfur ist die sogenannte
GRAIlE’sche Teerprobe zur schnellen Unterscheidung alkaloidhaltiger von alkaloidfreien Chinarinden’). Sie findet sich seit dieser Zeit in verschiedenen Arzneibiichern
und wird auch in das neue Europaische Arzneibuch (Vol. 111) mit folgendem Text
aufge nommen:
Identification reactions
A. Carefully heat 0,s g of the powdered drug in a test tube over an open flame. Blood.
red drops condense o n the side of the tube. AUow t o cool and dissolve the drops
in 10 ml of alcohol (70 per cent v/v). The solution shows a blue fluorescence in
ultra-violet light at 365 nm.
Es stand bislang offen, welche Substanzen fur die charakteristische blaue Fluoreszenz der alkoholischen Teerlosung verantwortlich sind. Es konnen die Chinaalkaloide selbst sein, aber auch andere Inhaltsstoffe der Droge oder eventuell Pyrolyseprodukte.
Mit den Erfahrungen auf dem Gebiet der Thermomikroabtrenn- und Fraktionierungsverfahren schienen uns die offenstehenden Fragen experimentell losbar zu sein.
Als besonders gceignetes Hilfsmittel zur Verfolgung der thermischen Vorgange bot
sich die Thermofraktographie (TFG)’) an.
Bei der Thermofraktographie werden normalerweise MilligrammMengen einer Probe
in einer entsprechenden Glaspatrone linear ansteigend von Zimmertemperatur auf
max. 450’ erhitzt. Die dabei auftretenden destillierbaren bzw. sublimierbaren oder
auch thermolytisch entstehenden Produkte werden mittels eines Tragergasstromes
aus der Patrone direkt auf die DC-Auffangschicht transportiert. Die DC-Schicht bewegt sich mit steigender Temperatur langsam vorwarts. Nach Beendigung dieses
Fraktionierungsvorganges wird in ublicher Weise mit einem geeigneten FlieBmittel
entwickelt und danach die Substanzen nachgewiesen.
1 F. Grahe, C.3, 97 (1858).
2 E. Stahl, Z.analyt.Chem. 261, 11 (1972).
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Thermofroktogrophievon Chino-Alkoloiden
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In friiheren Arbeiten wurde diese neue Methode zur Schnellanalyse von Kohlenhydraten3), Ligninen4) und von Gerbstoffens) angewandt, sowie zur Fragmentierung
von cr-Pyronglykosiden6).
Im Rahmer. dieser Untersuchungen wurde zunachst das Verhalten der entsprechenden Alkaloidbasen im Temperaturgradient untersucht. Dabei zeigte sich, daB ChininChinidin und Cinchonin-Cinchonidin im Temperaturbereich ab 180" unzersetzt auf
die DC-Schicht sublimieren. merraschend war nun, daB diese Alkaloide nicht in
gleicher Weise aug der Droge abtrennbar waren. Das TFG der Chinarinde zeigt in der
entsprechenden Hohe nicht die crwarteten Alkaloidzonen; dafur aber irn hRf-Bereich
zwischen 80-100 und zwischen 220-400" zwei stark fluoreszierende Zonen (Abb. 1).
Offenbar werden die in der Droge gebunden vorliegenden Alkaloide zu anderen eben-
hAf
80
m 8laufirbung mit lodoplatinat-Reagens
hellblaue Fluoreszenz im langwelligen UVJb5-Licht
Rotfarbung mit Echtblausalz - B - Reagens
Thermolyseprodukte d e s Orogenmaterials.
Abb. 1: Thermofraktograrnm von 20 mg Chinarindc DAB 7. Es treten keine Chinaalkaloide auf,
sondern nur die beiden blau fluoreszierenden Zonen im hRf-Bereich 80 - 100 zwischen 220---400".
Die Bezeichnungen 1-6 beziehen sich auf die spater isolierten Chinolinderivate. V = mitchromatographierte Vergleichslosung.
3 F. Karig, Dissertation Saarbrucken 1973.
4 E. StaN, F. Karig, U. Brogmann, H. Nimz und H. Becker, Holzforschung 27, 89 (1973).
5 E. Stahl und F. Karig, Z.ana1yt.Chem. 265, 81 (1973).
6 E. Stahl und J. Brombeer, Sci.pharmac. 41, 133 (1973).
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Arch. Pharmaz.
falls fluoreszierenden, aber weniger polaren Verbindungen fragmentiert. In kleinen
Mengen treten im Ternperaturbereich zwischen 320 und 400" noch starker polare
Substanzen auf. Nun wurden die entsprechenden Tannate und Sulfate des Chinins
und Cinchonins thermolysiert. Sie ergaben nur in geringen Mengen die freien Basen,
der Hauptteil fragmentierte zu den bereits aus der Droge erhaltenen fluoreszierenden
Thermolyseprodukten. Mit entsprechenden FlieBmitteln gelang es spater, die Thermolyseprodukte des Chinins und Cinchonins so aufzutrennen, daB letztlich vier schwacher polare (1-4) und zwei stark polare Fragmentierungsprodukte (5 und 6) zur
ldentifizierung anstanden. Diese sechs Verbindungen liefien sich sowohl im T h e n n o
fraktogramrn der Chinarinde als auch im roten Thermolysat der GRAHE'schen Teerprobe erkennen (Abb. 2).
h Rf
60
~
FK
1
200
30 0
400
'c
Abb. 2 Vergleich des roten Teers (T), wie er nach der GRAHE'schen Teerprobe erhalten wird,
mit dem 'IFG 200-400" aus 20 mg Chinarinde. Man erkennt die weitgehende hxeinstimmung
der Lonen 1 6. Die DC erfolgte bereits mit dem speziell fur Chinolmderivate entwickelten
System I.
Praparative Abtrennung und Identifizierung der einzelnen Verbindungen:
a ) Praparative Gewinnung: Fur praparative Zwecke wurde nach dem Prinzip des TASOfens ein entsprechcnd groBeres Gerat entwickelt (Jumbo-TAS-Ofen). Das Fassungsvolumen der Patrone wurde hierbei von ca. 2 ml auf 1000 ml vergrofiert und so konnten in einem Arbeitsgang bis 150 g der gepulverten Droge verarbeitet werden. Anstelle
der Auffangsschicht wurde u. a. eine Elektrokiihlfalle zum Sammeln des Thermolysats eingesetzt. Aus 500 g Droge konnten ca. 160 g Therrnolysat erhalten werden.
Hieraus wurden auf dem Wege der Wasserdampfdestillation 5,8 g schwach braunlich
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Thermofraktographie von China-Alkaloiden
gefarbte, olige Basen gewonnen. Wie ein entsprechender DC-Vergleich zeigte, sind
die Hauptbestandteile mit den TFG-Produkten 1-6 (Abb. 2 ) identisch.
b) Chromatographische Bedingungen: Nachdem bereits die Lage im Chromatogramm
(Abb. l), die Fluoreszenz, der Geruch sowie entsprechende Uberlegungen dazu fuhrten, dai3 hier wohl verschiedene Chinolinderivate vorliegen konnten, wurden die
dunnschicht-chromatographischenBedingungen hierfur ausgearbeitet. Die in Tab. I
aufgefuhrten Substanzen waren mit Ausnahme der Isochinoline als Thermolysepre
dukte zu erwarten. Auf Kieselgelschichten konnte bei einer Zweifachentwicklung
mit Benzol-Aceton (90 t 10) eine gute Trennung der Chinolinderivate erhalten werden. Zur Auswertung eignet sich die Fluoreszenzfarbe im langwelligen UV-Licht und
eine Sichtbarmachung mit dem Jodoplatinat-Reagenz (Tab. 1).
T a b e k 1: DC von Chinolin- und lsochinolinderivatcn
Substanz
hRf-Werte
1
41- 5 0
4 2 45
43-45
35-31
6-Hydrox ychinolin 13-15
Chinolin
Lepidin
6-Met hox ychinolin
CMethoxylepidin
Nachweise
UV,,
H 2 S 0 4 JodoplatinatFluorcszcnz
Reagens
I1
40-45
30-35
25-30
15-20
0
6-Hydroxylcpidin 10-12
0
8-Hydroxychinolin 34- 36** *) 0
13-15
lsochinolin
25-30
6,7-Dirncthoxyisochinolin
I
I1
*)
**)
***)
13 -15
5-10
dunkelbhu
dunkelblau
hellblau
hellblau
rotlich**)
schwach
hellgelb**)
-
dunkelblau
schwach
-
blau
bbdU
blauviolctt*)
blauviolctt*)
blau*)
EchtblausalzB-Reagens
-
-
rot
blau*)
blau
blau
rot
braunlich
blau
-
-.
Kiesclgel CFzq. Bcnzol-Aceton (90 + lo), 2 x 15 cm, KS
Aluminiumoxid basisch, Benzol, 2 x 10cm, KS
konzcntrationsabhangig; bei den iiblichen Mengcn von 1 p g kcinc odcr nur schwache
Reakt io n
im langwelligcn UVx5-Licht vor dem Bcspruhen mit methanol. Schwefelsaurc
starke Schwanzbildung
c ) Identifizierung der entstehenden Chinolinderivate: Nachdem nun einerseits genugend Basengemisch zur Verfugung stand und andererseits die optimalen chromatographischen Trennbedingungen erarbeitet waren, wurden die Thermolyseversuche
mit den Reinalkaloidsalzen wiederholt. Aus Chininsulfat entstanden die stark hellblau fluoreszierenden Produkte 3 und 4 mit den hRf-Werten von 6-Methoxychinolin
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Stahl und Schmitt
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und 6-Methoxylepidin. Ferner fanden sich in kleinen Mengen zwei starker polare
Verbindungen, die mit Echtblausalz B-Reagenz kuppeln und phenolischen Charakter
aufweisen. Die schwach rotlich fluoreszierende Verbindung 5 zeigte den hRf-Wert
des 6-Hydroxychinolins und die hellgelb fluoreszierende 6 den des Hydroxylepidins.
Aus Cinchoninsulfat entstanden nur zwei schwach blau fluoreszierende Verbindungen (1 und 2). Nach den hRf-Werten handelt es sich um Chinolin (1) und Lepidin(2).
Im nachstehenden Schema sind die erhaltenen Ergebnisse und einige weitere zusammenge fa8t .
Die bei der GRAHE'schen Teerprobe und der TFG entstchenden Chinolinderivate:
r
CinchoninCinchonidin-
t
y ' b
C h i n i d i n s al z e
Chinolin R = -H(l)
Lepidin R = -CH3(2)
Kryptidin R = -CHz-CH3
Pr o p y l ch i n o l i n
R = -CHz-CHz-CH3
H
&
O
6-Methoxychinolin R = -H(3)
6-Methoxylepidin R = -CH3(4)
d
H
d
6-Hydroxychinolin I3 = -H(5)
6-Hydrorylepidin H = -CH3(6)
Zur Absicherung der Resultate wurde das praparativ gewonnene Basengemisch aufgearbeitet und zunachst die Phenole durch Ausschutteln mit Alkali entfernt. Das Gemisch enthielt nur noch die Basen 1-4. Nun wurde eine Atherspaltung nach ZEISEL7)
durchgefuhrt und die entstandenen Phenole abgetrennt. Das so erhaltene Basengemisch bestand nur noch aus Chinolin (1) und Lepidin (2). Sowohl diese als auch die
Phenolfraktion wurden chromatographisch aufgetrennt und die erhaltenen Einzelverbindungen massenspektronietrisch i d e n t i f i ~ i e r t ~ )Da
~ ) .in den Massenspektren immer
noch Verunreinigungen durch die begleitenden Substanzen zu erkennen waren, erfolgte die endgiiltige Trennung und Identifizierung durch direkte Kopplung von GCMS. So konnten auch die nur in sehr geringer Menge auftretenden hoheren Homologen des Lepidins, nanilich Kryptidin und 4-Propylchinolin identifiziert werden.
Ubertragung der Ergebnisse aiif das TAS-Verfahren
Fur die praktischen Belange der Drogen-Schnellanalyse'O) lieDen sich nun in einfacher
Weise die TFG-Bedingungen auf das TAS-Verfahren ubertragen. Da im letzteren Falle
7 Gattcrmann-Wicland, Dic Praxis des org. Chcmikcrs, 42. Aufl. Walther de Gruytcr, Berlin
1962, S. 74 f.
8 D.M. Clugston and D.B. Mac Lean, Canad.J.Chem. 44, 781 (1966).
9 P.M. Draper and D.B. Mac Lean, Canad.J.Chem. 46, 1487 (1968).
10 E. Stahl (Herausgeber), Chromatographische und mikroskopische Analyse von Drogen, G.
Fischer Vcrlag, Stuttgart 1970.
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Therrnofraktograph ie von China-Alkalo iden
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nur das punktformige Auftragen moglich ist, mufi man die Drogeneinwaage auf 5 mg
reduzieren, um Uberladungen zu vermeiden. Bei einer Ofentemperatur von 330-350"
genugt eine Verweilzeit von 90 sec. Cute Resultate erhalt man auf einer basischen
Aluminiumoxidschicht und einer Zweifachentwicklung mit Benzol bei Kammergttigung (Tab. 1). Fur das Vorliegen alkaloidhaltiger Chinarinde DAB 7 sprechen dann
die beiden hellblau fluoreszierenden Chinolinderivate mit Methoxylgruppen ( 3 und 4)
und die zwei schwach blau fluoreszierenden Spaltprodukte Chinolin (1) und Lepidin
(2).
Da in diesem Temperaturbereich auch das Drogenmaterial einer weitgehenden
Thermolyse unterworfen wird, konimt es infolge der offensichtlich sauren Therrnolyseprodukte zu einer enormen Uberladung der Schicht und damit zu einer starken
Beeintrachtigung der Auftrennung. Dies lafit sich jedoch vermeiden, indern man die
entstehenden Produkte durch eine Schicht aus kornigem Bariumhydroxyd leitet und
so die sauren Verbindungen abfangt (Abb. 3). Auf diese Weise erhdlt man auch auf
Kieselgel CFz5.,-Schichten mit Benzol-Aceton (90 t 10) (I) sehr Hare Chromatograrnme. Bewahrt hat sich diese Methode auch bei der Thermofraktographie der Droge
(Abb. 3).
Vergleich TFC - Massenspektrometrie
Es erscheint nun interessant, die Fragmentierung der 0.a. Verfahren zu vergleichen.
Die aufgenommenen Massenspektren des Chinins und Cinchonins sowie der entsprechenden Sulfate zeigten, daA hier keine Chinolinderivate auftreten; dafur erhalt man ein
Spaltprodukt der Massenzahl 136. Es stammt aus dem Chinuklidinring und wurde
Abb. 3: Langsschnitt durch eine gefullte TAS-Patrone.
Kaniile ZUI N2-Einleitung
Silicon-Dichtungsmembran
Patrone aus Pyrex-Glas
Quarzwolle
Drogenpulver
Bariurnhydroxidschicht
Spitze des Ofenblocks
DC-Schich t
DC-Tragerplatt e
932
Stahl u nd Sch mitt
bereits von Spiteller-Friedmann'')I2)
Arch.
Pharmaz.
wie folgt formuliert:
Zwei weitere, von den gleichen Autoren interpretierte Fragrnentierungsprodukte rnit
den Massenzahlen 159 und 143 unterschieden sich ebenfalls grundsatzlich von den
Produkten der TFG:
H
Man erkennt also, dafi durch die sehr vie1 hoherer Energiezufuhr von ca. 70-80 eV
in der Ionenqueue des Massenspektrometers eine ganz andersartige Fragrnentierung
erfolgt als bei der sehr schonenden TFG. Wenn man von der Information des Molckulargewichts absieht, die von der Massenspektrometrie rnitgeliefert wird, ist der
lnformationsgehalt der TFG fur eine Strukturaufklarung in diesem Fall erheblich
grofier.
Mittels der TFG wird es nun kiinftig auch rnoglich sein, aus unbekannten Drogen
analog gebaute Chinolinalkaloide bereits am Auftreten von Chinolinderivaten im
Thermofraktograrnm zu erkennen. Man ersieht ferner, ob in der Droge auch nicht
gebundene Chinolinderivate vorkornrnen, da sie im TFG bereits im unteren Ternperaturbereich erschienen.
Beschreibungder Versuche
Drogenmuteriul: Chinae Cortcx plv. gross. der Fa. Cacsar und Loretz, Hilden, Alkaloidgehalt
7,8 70(Methode DAB 7).
DC-Bedingungen
Nach der Standardmcthodclo) fur Chinaalkaloide wurdc auf Kieselgcl GF2s-Schichten mit Benzol-Ather-Dilthylamin ( 5 5 + 35 + 10) 2 x 10 cm mit 10 min. Zwischentrocknung bei Kammerdttigung entwickclt.
I: Auf Kieselgel GF2s-Schichtcn wurde mit Renzol-.Aceton (90 + 10) 2 x 1 5 cm mit 10 min.
Zwischcntrocknung bei Kammcrsittigung cntwickelt, oder
11 G. Spiteller und M. Spiteller-Priedmann, Tetrahedron Letters (London) 1963, 153.
1 2 H. Budzikiewicz, F.C. Djcrassi und D. Williams, Structure Elucidation of Natural Products by
Mass Spectrometry, Vol. 1: Alcaloids, Holden-Day INC., San Francisco 1964, S. 2 2 0 - 2 2 .
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Thermofroktogrophie yon Chino-Alkoloiden
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11: auf Schichten aus basischem Aluminiumoxid zur DC-Woelm wurde 2 x 1 0 cm rnit Benzol
bei Karnmersattigung entwickelt.
Wie entsprechcnde Versuche zeigten, l a t sich hier das Benzol nur auf Kostcn einer schlechteren
Trennung durch aequieluotrope Fliebmittel ersetzen.
Nachweis: Nach Abdampfen der Fliebmittel wurde die Fluoreszenzminderung irn UV2s-Licht
markiert. Die Betrachtung im langwelligen UVm-Licht erfolgte VOT und nach dem Bespriihen
mit Methanol - konz. Schwefelsiure (90 + 1 0 v/v). Anschliehnd wurde mit Jodoplatinat-Rcagenz (Nr. 42 inlo)) nachgespriiht. Zum Nachweis der Hydroxychinoline wurde l p r o z w ar i g e
Echtblausalz B-Losung auf das losungsmittelfreie Chromatogramm gespruht und anschliebend
mit Ammoniak bedampft; wenig spater wurde vorsichtig konz. Salzdure nachg~spriiht~).
Vergleichslosungen: Sowohl von den Chinaalkaloiden als auch von den Chinolin- und Isochinolinderivaten wurden 0,lproz. Lijsungen in Methanol hergestelit. Die Auftragemenge betrug jeweils 1-2pg.
TFG-Bedingungen
Gerat: TASOMAT (Fa. Desaga, Heidelberg). Einwaagen: Droge: 20 mg; frcie Basen: 20 pg, Sulfate, Tannate: 50 pi in methanolischer Losung auf Quarzwolle. Gerateeinstellungen: Aufheizrate 16'/min, zumeist von 100-400'; Vorschub 6 mm/min, Tragergas: Stickstoff rein, 30 ml/
min.
Jumbo-TAS: Einwaage lOOg, Temperatur: 350-370°, Verweilzeit: ca. 2 Std., Tragergas: Stickstoff 250-300 mllmin.
Die Wasserdampfdestillation zur Gewinnung der Chinoline wurde mit der Karlsruher A p p a r a t ~ ' ~ )
durchgefuhrt.
Kopplung GC- MS
Gerate: Varian 2700; CH 7 Massenspektrometer. Saule: 1,8 m;3 % SE 30 auf Chromosorb W-AW,
DMCS 60-80 mesh. Injector: 230', Saulenofen: 120', Detektorofen: 200'. 20 ml Helium/
min. Detektor: FID, 30 rnl Hl/min, 300 rnl Luft/rnin. Zwischenheizung, Heliumtrenner: 190'.
Schubstange: 140', Ionenquelle: 150'. Elektronenenergie: 70 eV, Kathodenstrom: 300 p A.
Die Arbeit wurde im Rahmen des SFB 52 ,,Analytik" in dankenswerter Weise gefordert.
13 E. Stahl. Microchimica Acta 40, 367 (1953).
Anschrift: Rof. Dr.Dr.h.c Egon Stahl, Universitat des Saarlandes, 66 Saarbriicken 11 [Ph 3841
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