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Zur Kenntnis der Flavonglykoside von Nerium Oleander L.

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289,161. Bd.
1956, Nr. 11
Zur Kenntnis der Flavonglykoside von Nerium Oleander L.
613
1532. L. Horhammer, H. Wagner und R. Luck
Zur Kenntnis der Flavonglykoside von Nerium Oleander L.*)
Aus dem Institut fiir Pharmazeutische Arzneimittellehre der Universitiit Miinchen
Direktor: Prof. Dr. L. Elirrhurnmer
(Eingegangen am 13. August 1956)
Seitdem bekannt ist, daB die Flavone als sogenannte Vitamin-P-Substanzen die
Gefaflpermeabilitiit herabsetzen und die Diurese beeinflussen, interessiert die
Frage, ob und inwieweit sie an der pharmakologischen Gesamtwirkung von herzwirksamen Drogen bzw. daraus hergestellten Extrakten beteiligt sind. Entsprechende Versuche wurden von A . Clerc und R . Paris1) mit einem ?us Digitalis purpurea isolierten Digitoflavon (Luteolin) durchgefuhrt. Intravenose Injektionen
dieses Flavons fuhrten beim Hund zu einer lang anhaltenden Steigerung der Diurese. Auch N . Mariiun2) konnte zeigen, daS Rutin, das einer Cedilanidlosung zugesetzt wurde, am isolierten Froschherzen eine Tonussteigerung des Herzmuskels
hervorruft .
Aus Nerium Oleander L. wurden bisher nur Steroid-Glykoside und Siiuren isoliert. Eine Zusammenfassung der bisher isolierten Inhaltsstoffe findet sich bei
11.SchindZer3). W . Straub4) weist zum erstenmal darauf hin, daB der wasserige
Oleanderextrakt auderdem ein eisengriinendes Phenolglykosid enthiilt, das die
Wasserloslichkeit der Reinglykoside erhohen soll. Angaben uber Art und Zugehorigkeit dieses Phenolglykosides werden nicht gemacht.
Wir haben dieses Problem in Bearbeitung genommen und papierchromatographsch im methanolischen Extrakt der Bliitter insgesamt vier Flavonderivate mit
den R,-Werten 0,06,0,12, 0,37 und 0,48(System: Essigester-Ameisensaure-Wasser,
10 2 3) nachweisen konnen.
Es gelang, das Hauptglykosid (R, 0,37) mit einer Gegenstromverteilungsapparatur nach E . Hecker, Grode 35)im System Essigester (1)-Wasser (1) von einem
Nebenglykosid und von anderen Begleitstoffen abzutrennen und a h Rutin (Quercetin-3-rbamnoglucosid) zu identifizieren. Rutin hat Konstitution I.
Ein weiteres Glykosid wurde nach der praparativen Papierbogenmethode gewonnen und sein Aglykon- und Zuckeranteil bestimmt. Die Stellung der Zucker
konnte durch partielle Hydrolyse und papierchromatographischen Nachweis der
Spaltprodukte geklart werden. Es handelt sich um ein Kampferol-rhamnoglucosid.
Bei einer Verteilung uber 12 Stufen im System Essigester (1)- 0,15 m Phosphatpufferlosung (1) bei pH 6,48 gibt das Glykosid eine Verteilungskurve, die mit der
von Kampferol-3-rhamnoglucosid (Schmelzpunkt 182-185" C) - isoliert aus den
+ +
*) Alexander T s c h k h zum 100. Geburtstag.
A . Ckrc und R. Paris, C. R. Shances. SOC.
Biol. Filiales Associbes 133, 46, (1940).
z, N . Nurijan, Chem. Zbl. 19, 4400 (1955).
3, H . Schindler, Arzneimittel-Forsch. 5, 362 (1955).
4, W . Straub, Arch. exp. Pathol. Pharmakol. 82, 327 (1918).
5 , E . Hecker, Chemie-1ng.-Techn.25, 505 (1953).
l)
614
H o r h a m m e r , W a g n e r und L u c k ,
AI&V d o
Pharmazle
Bluten von Aesculus Hippocastanum6) - nach Superposition ubereinstimmt. Das
Glykosid hat demnach Konstitution 11. Seine Identitat wurde auBerdem durch
OH\&\/?
It
/OH
OH
/v,\OH
I1 ,il-<w
' a
v/\/\rhamnoglucosid
OH
a&
-/----<OH
\==/
bH
I
d
rhamnoglucosid
I1
Vergleich der Absorptionsspektren von isolierter Substanz und Testsubstanz
bewiesen.
Die beiden anderen masserloslichen Glykoside, die bisher noch nicht kristallin
isoliert werden konnten, liefern nach der Hydrolyse ein gemeinsames Spaltprodukt,
das sich papierchromatographisch keineni der bekannten Aglucone zuordnen laflt.
Ihrem niedrigen Rf-Wert zufolge durfte es sich um Bioside oder Trioside der Flavongruppe handeln.
Um zu priifen, ob die im Handel befindlichen Oleander-Extrakte die beschriebenen Flavonglykoside enthalten, chromatographierten wir solche Auszuge in verschiedenen Losungsmitteln und verglichen sie mit unserem methanolischen
Oleander-Extrakt. Wir fanden, daB das Oleanderpraparat der Firma Knoll (Oleander-Perpurat) die genannten vier Flavonglykoside in annahernd gleicher qualitativer und quantitativer Zusammensetzung enthalt . Auch in der Oleander-Urtinktur
der homoopathischen Firma Dr. W. Schwabe lassen sich diese Flavone nachweisen.
Zusammentassung
Aus den Bllttern von Nerium Oleander konnten zwei Flavonglykoside isoliert
und als Quercetin-3-rhamnoglucosid (Rutin) und Kampferol-3-rhamnoglucosid
identifiziert werden. Da den Plavonen neben der Beeinflussung der GefaBpermeabilitat eine diuretische Wirkung zugeschrieben werden muB, darf angenommen
werden, daB die Flavonglykoside an der pharmakologischen Gesamtwirkung von
Oleanderextrakten beteiligt sind.
Versuchsteil
A. Gewinnung eines Mischkristallisates
Der im Soxhlet hergestellte methanolkche Extrakt von 9Og Folia Oleandri L. (gesammelt in Italien am Gardasee) wurde vom Losungsmittel befreit, in Wasser aufgenommen und nach mehrmaligem Digerieren auf dem Wasserbad vom Chlorophyll abgetrennt.
Urn die in der Droge befindlichen Harze und andere Begleitstoffe weitgehendst zu entfernen, behandelten wir den wilsserigen Extrakt zuntichst mit Petroltither und Chloroform. AnschlieBend schiittelkn wir mit Essigester bis eur Farblosigkeit aus. Da die Essigesterhktion allein kein Krishllisat lieferte, wurde der Riickstand weiter mit einer Mi-
schung von Essigeater (05)-Methtmol(5)behandelt. Erst die vereinigten Essigester-Methrtnol-Ausschiittelungen fiihrten nach dem Konzentrieren eu einem Mischkrktallisat, das
papierchromatographisch nur die beiden Glykoside mit den R,-U'erten 0,37 und 0,48
O)
H . J . Wwmann, Dissertation, Mtinchen 1955.
as9,itil. Bd.
1956, Nr. 11
Bur Kenntnia der Fluvonglykoside von Nerium Oleander L.
615
enthielt. Dabei uberwog das Glykosid 0,37, das als Hauptglykosid anzusehen ist. Der
Niederschhg wurde auf einer Nutsche gesammelt und mit wenig Aceton gewaachen. Die
Ausbeuta betrug 194mg.
B. Isolierung von Glykosid 0 , 3 7 d u r c h m u l t i p l i k a t i v e Verteilung nach
L. C. Craig
Zuniichst suchten wir Glykosid Rf 0,37 zu isolieren. Umkristallisieren fiihrte nicht zum
Ziel, was offenbar auf storende Pflanzensauren zuriickzufiihren war. Wir setzten daher
fiir die Isolierung die multiplikative Verteilung ein und verteilten zunichst im Vorversuch
2 mg Substanz zwischen den Phasen Essigester (1)-Wasser(1) iiber 16 Stufen. Nach
Beendigwg des Verteilungsprozesses bestimmten wir absorptionsphotometrisch den Kurvenverlauf. In Abb. 1 sind die bei
I = 350 mp gemessenen Extinktionen
74
gegendie Anzahlder Verteilungselemente
aufgetragen.
Zur Gewinnung einer groBeren Menge
Substanz verteilten wir noch vier wei- 1 0
tere Male mit je 10 mg Ausgangssub- 3
stanz. Das Mischkristallisat wurde zu 5'
diesem Zweck zunLchst in 0.5ml Me- z o 4
thanol gelost und dann erst mit Essigester gesiittigtem wasser versetzt. A ~ S
den Elementen 0 - 4 der VerteilungsI
I3 IL '5%
apparatur konnten nach dem Entfernen
Nr der Elemente Jo I'
des Losungsmittels insgesamt 20 mg
schmelzpunktsreine Substanz gewonnen Abb. 1. 16stufige Verteilung eines Mischkristcllwerden. Diese Menge genugte, um alle lisates aus den Bliittern von Nerium Oleander
im System: Essigester (1)-Wasser(1) bei
erforderlichen Mikroanalysen zur Identifizierung des Glykosidsdurchzufuhren.
p n = 6,O.
-
C. Identifizierung von Glykosid R, 0,37
Schmp. 1 8 6 1 9 0 " C (kom.), (Rutin Schmp. 186-188" C korr.).
Im Mischschmelzpunkt mit Rutin zeigte die Substanz keine Depression. Die R,-Werb
nnd Absorptionsbande beider Substanzen stimmten uberein.
R,-Wert 0,37 in Essigester-Ameisensiure-Wasser (10 2 3)
R,-Wert 0,34 in Butanol-Eisesstg-Wasser (4 1 5).
Maxima des Absorptionsspektrums :
Bande I 2660 A EEFCZ.
(1 g-' cm-l) = 29,20
Bande 11 3680 A EEpez.
(1 g-l cm-l) = 26,50
Die mit 2n- Schwefelsaure durchgefuhrte, qualitative Hydrolyse ergab daa Aglykon
Quercetin, dessen Identitat durch den Schmelzpunkt (Schmp. = 299-302" C, korr.) und
durch Darstellung des Pentaacetylqucrcetins (Schmp. 187-189" C, korr.) bewiesen werden
konnte.
Die Bestimmung der Zucker erfolgte papierchromatographich. Zur Neutralisation der
nach der Hydrolyse erhaltenen sauren Zuckerlosung verwendeten wir den Ionemustauscher Dowex 2. Im System Butanol-Pyridin-Wasser (2 1 1,5) fanden wir nach
dem Entwickeln mit Anilinphthalatlosung fiir Glucose einen R,-Wert von 0,43 und fiir
Rhamnose einen R,-Wert von 0,31. Diese stimmten mit den Testsubstanzen uberein.
Den quantitativen Zucker- und Aglykonanteil ermittelten wir nach folgendem Verfahren: 2 ml der methanolischen Glykosidlosung und 2 ml 2n Schwefelsiiure wurden
+ +
+
+ +
+
.
+ +
616
Arrhlv
H i i r h a m m e r , W a g n e r und Luck
der
Phamaxh
2 Stdn. am RiickfluBkiihler erhitzt, abgekiihlt und das Methanol auf 10 ml aufgefiillt.
Die Konzentration dea Aglykons liiBt sich spektrophotometrisch mit dem Unicam- Spektrovon Quercetin = 76,O) bephotometer SP 600 bei einer Wellenliinge von 373 mp (EsDrz.
stimmen. Sie betrug 0,0295 mg/ml.
Zur Ermittlung der Zuckerkonzentration verwendeten wir die Anthronmeth~de~).
2 ml
der Zuckerlosung wurden auf dem Wasserbad stark eingedampft und in 6 ml Wasser gelost.
Nach dem Abkiihlen versetzten wir sie mit 10 ml einer frisch bereitaten O,Z%igen Anthronlosung in 96%iger Schwefelsiiure. Nach 15 Minuten konnte die Absorption der
Liisung bei einer Wellenliinge von 620 my gemessen werden. Aus einer fiir das Gemisch.
Glucose-Rhamnose hergestellten Eichkurve errechnete sich ein Zuckergehalt von
0,0317 mg/ml. Somit ist das Verhiiltnis von Aglykon und Zuckerkonzentration des Glykosides = 1 : 1,07. Das aus dem Molekulargewicht fur Rutin berechnete Aglykon-ZuckerVerhaltnis betragt 1: 1,Ol.
D. Isolierung von Glykosid Rf 0 , 4 8
Nach Abb. 1 m a t e sich das Glykosid R, = 0,48 aus den Elementen 9 - 1 4 gewinnen
lassen. Der Versuch fiihrte jedoch zu einer so schwach konzentrierten Glykosidlosung,
dtlB eine Identifizierung auch im mikroanalytischen MaBstab nicht moglich war. Eine
Verteilungsepparatur groBerer Kapazitiit stand nicht zur Verfugung. Wir verwendeten
daher fiir die Isolierung die praparative Papierbogenrnethode.
Die von der Isolierung des Rutins noch iibriggebliebene Menge Mischkristallkat wurde
in'Methano1 gelost, auf 5 Papierbogen Schleicher t Schull Nr. 2043b G1 in Streifen aufgetragen, im System Essigester-Ameisensiiure-Wasser (10 2 3) entwickelt und die
Glykosidzonen nach dem Ausscheiden im Soxhlet mit Methanol eluiert. Das Eluat ergab
kein Kristallisat. Daher benutzten wir die eine Hiilfte der Losung fiir die Bestimmung
des Aglukon- und Zuckeranteils, die andere Hiilfte diente der IdentitiitElpriifung nach der
Verteilungsmethode, sowie fiir absorptionsphotometrische Messungen.
+ +
E. Identifizierung von Glykosid Rf 0 . 4 8
Maxima der Absorptionsspektren von Glykosid 0,48 und Vergleichssubstanz (Gmpferol3-rhamnoglucosid):
Bande I
Bande I1
EzDez.I
Espcz.I1
Glykosid 0,48
authent. Glykosid
265011
2650 A
348011
3460 A
27,3
26,9
22,5*)
22,5
*) Zur Berechnung der uobekannten Glykosidkonzentration in der Losung benutzten
wir die spez. Extinktionskoeffizienten der authent. Substanz. Hieraus lie8 sich ein
quantihtives Absorptionaspektrum von Glykosid 0.48 aufstellcn. Dieses Spektrum
stimmte nach Lage der Banden und in seinem sonstigen Verlauf vollkommen rnit dem
der authentischen Substanz iiberein.
Die Hydrolyse der methanolischen Liisung mit 2n- Schwefelsaure lieferte ein Aglukon,
das nach Schmelzpunkt und im Papierchromatogranim mit Kampferol identisch war.
Schmelzpunkt des isolierten Aglukons = 272-275" C korr. (Schmp. des authent.
Kiimpferols = 271-274" C, korr.). Keine Depression des Mischschmelzpunktes.
R,-Wert 0,90 in Essigester-Ameisensiiure-Wasser (10 2 3)
Rf-Wert 0,78 in Butanol-~Eisessig-W~ser
(4 1 5 ) .
Die A r t der Zuckerbindung wurde durch partielle Hydrolyse und papierchromatographischen Nachweis der Spaltprodukte geklart. Den Abdampfriickstand von 10 nil
+ +
7)
s.
+ +
F. L. Snell und C. T.SneZZ, Colorimetric Methods of Analysis, New York, 1963, Bd. 111,
199.
289,/61. Bd.
1956, Nr. 11
Zur Eenntnis der F’lavonglykoside uon Nerium Oleander
L.
617
Eluat losten wir in 2,5 ml Cyclohexanol durch kurzes Aufkochen auf dem Asbestnetz.
Nach Zugabe von 0,75 ml 97%iger Ameisensiiure wurde die Losung auf 105-107° C
erhitat und diese Temperatur 10 Stdn. lang beibehalten. Das erhalterne Hydrolysat dienta
dem papierchromatographichen Nachweis. Als Vergleichssubstanz verwendeten wir
Liisungen von K&mpferol-3-rhamnosidund Kiimpferol-3-glucosid.
Kiimpferol-3-rhamnosid
Rc = 0,77
Kiimpferol-3-glucosid
RI = 0,64
Spaltprodukt des Glykosids nach partieller Hydrolyse
R,
= 0,64.
Beim Zirkon-Zitronensuretesta) fiihrte das Bespriihen der Farbflecke mit Zitronen.
siiurelosung zum Verschwinden der Gelbfarbung, wodurch eine Verglykosidierung am C,
angeaeigt wurde.
Die zur Auftrennung von Substanzgemischen verwendete Craig-Methode ermoglicht
au8erdem die Identitiitspriifung einer Substanz, wenn authentische Pmben vorhanden
sind, deren Verteilungskurven zum Vergleich herangezogen werden konnen.
Da das Glykosid 0,48 nicht kristallisierte, hofften wir, auf diesem Wege die Identit%
des isolierten Glykosids mit dem authentischen Kampferol-3-rhamnoglucosid beweisen
zu konnen. Zu diesem Zweck losten wir 4 mg authentischen Kampferol-3-rhamnoglykosids
in 10 ml Unterphaae des Systems Essigester (1) - 0,15 m Phosphatpufferlosung (l),
wiederum nach vorlierigem Zusatz von 0,l ml Methanol. Eingefiillt wurde die Losung in
Element 0 der Eleckerschen Verteilungsbatterie. Die methanolische Losung von Glykosid
0,48 brachten wir zur Trockene, den Ruckstand losten wir-in 0,l ml Methanol und ergiinzten mit Unterphase auf 10 ml. Mit dieser Losung wurde Element 13 beschickt. Nun
verteilten wir gemeinsam uber 12 Stufen. Der pH-Wert des Systems, gemessen in der
Unterphase, war vor und nach der Verteilung mit dem Wert 6,48 anniihernd konstant.
Nun wurden die photometrischen Verteilungskurven (Extinktionen bei A = 350 my aufgetragen gegen die Anzahl der Verteilungselemente) aufgestellt und miteinander ver glichen. Nach Gleichung
ist e~ moglich, aus den Maxima der Verteilungskurven den jeweiligen Verteilungskoeffizienten zu errechnen. Die beiden in dieser Weise ermittelten Verteilungskoeffizienten
( V K=
~ 0,230; VK, = 0,236) zeigten gute tfbereinstimmung mit den durch Verteilung
im Scheidetrichter erhaltenen Werten. Die Identitat ist aber erst bewiesen, wenn die beiden
Verteilungskurven in h e m sonstigen Verlauf nicht voneinander abweichen. Da bei dem
Versuch von vorneherein keine gleich starken Konzentrationen eingehalten werden konnten, war ein Vergleich der Kurven erst nach Superposition moglich. Die Superposition,
d. h. das Einpassen der Kurve I in Kurve I1 ist leicht durchzufuhren, wenn siimtliche
Extinktionswerte der Kurve I mit dem entsprechenden Superpositionsfaktor multipliziert
werden. Dieser ergibt sich als der Quotient von Max. I zu Max. 11. Die hierbei erhaltenen
Werte sind zusammen mit den Extinktionen der anderen Kurven in Tabelle 1 einander
gegenubergestellt. Vergleicht man die Kurve I1 mit der durch Superposition erhaltenen
Kurve 111 in Abb. 2, so ergibt sich eine fast vollstiindige Deckung. Die hier angewendete
Methode entspricht der Bestimmung des Mischschmelzpunktes, bei dem keine Depression
eintritt
.
L. Hcjrhmmer und K. H. Niiller, Arrh. Pharmaz. Bcr. dtsch. pharmaz. Ges. 287159,
310 (19.54).
618
Archiv der
Phawazie
H o r h a m m e r , W a g n e r und Luck
Tabelle 1
0
1
2
3
4
5
6
I
0,358
0,822
1,059
0,930
0,539
0,249
0,076
I1
111
0,250
0,672
0,745
0,632
0,407
0,204
0,097
0,252
0,580
0,746
0,650
0,380
0,180
0,064
Vergleich der Verteilungskurven von isoliertem und authentischem Khmpferol-3rhamnoglucosid nach Superposition. System: Essigester (1) - 0,15 m Phosphatpufferlosung (1); pH = 6,48; n =.12.
I = Extinktionswerte der Verteilung : 4 mg authentisches Kilmpferol-3-rhamnoglucosid
iiber 12 Stufen.
I1 = Extinktionswerte der Verteilung einer unbekannten'Mengevon isoliertem Kiimpferol3-rhamnoglucosid.
111 = Verteilungskurve von I nach Superposition. Superpositionsfaktor 0,704 (Extinktion von Element 2 der Verteilungskurve I / Extinktion von Element 2 der Verteilungskurve 11).
Abb. 2.
I : Verteilungskurve von 4 mg authentischem K&mpferol-3-rhamnoglucosid im
System Essigester - 0,16 m Phosphatpufferlosung.
Kurve 11: Verteilungskurve von isolierter Substanz im gleichen System.
Kurve 111: Superpositionskurve (Kurve I in Kurve I1 eingepaBt).
Kurve IV: Verteilungskurve von 1 mg Hyperosid.
Kurve
Anschrift: Prof. Dr. L. E&hammer, Inatitut fUr Pharmazeutische Arzneimittellehre der Univereitiit,
b i b o h e n 38, Menringer Str. 87.
.
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