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Zur Papierchromatographie der Inhaltsstoffe des Hanfes Cannabis sativa.

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295. Bd.
1962,Nr.I
Zur Palpierchrmtographie der Inhallsstoffe des Hanfea
161
Isothiocyanats reagiehn mit Anilin und alkoholischem Ammoniak unter Bildung von
IV bzw. VI. Das Isothiocyanat kristahierte innerhalb weniger Std. Die Kristalle wurdes
mit Ather gewaschen; Schmp. 148". Miechachmp. mit I: Keine Depression.
Im allgemeinen wurde Verfahren b) angewandt.
4. Thioharnstoffe
Die N-Phenyl-thiohamtoffe wurden durch Umsetzung der entapr. Isothiooyanate in
Ather bei Raumtemperatur dargeatellt.
Im einzelnen wurden umkristalliaiert:
I (Schmp. 1 5 2 O ) aus Athanol/Ather, IV aus w&Br.Athanol, VI aus Benzol/Petrol&ther,
VIII aus Chloroform/Ather, XI am Athanol/&her, XIV am Benzol/Petrol&ther oder
wiiBr. Athanol.
Ansohrift: Prof. Dr. 0.-E. Schultz, Kid, Gutenbergstr. 78.
2075. J. Kol'iek, M. MatiZiB und R. R e p i 6
Zur Papierchromatographie der Inhaltsstoffe des Hanfes
(Cannabis sativa)
Aus dem ehemischen Institut ,,Boris Kid&'', Ljubljana (Jugoslawien)
(Eingegangen am 13. Juni 1961)
Wegen seines Gehaltes an sedativ bzw. antibiotiech wirksamen Stoffen war der
H a d schon ofter Gegenstand von Untersuchungen. Verschiedenen Autoren ist es
gelungen, einige Substanzen aus der Droge zu isolieren und ihre Struktur zu kllren.
Es sei vor allem a d die neueren Arbeiten von Krejai und Mitarb.1) und Schultz und
Haffne.2-4) verwiesen.
Zur Gewinnung der Wirkstoffe aus der Droge wurden die Hanfbliitter zunachst
mit einem geeigneten Losungsmittel extrahiert. Aus dem Rohextrakt konnten die
einzelnen Komponenten anschliel3end durch klassische Methoden (Ausschutteln mit
wal3rigen Laugen) oder durch Siiulenchromatographie an saurem Aluminiumoxyd
getrennt werden. PC Verfahren fuhrten nach Angaben der Autoren2) nicht zu einer
gewunschten Auftrennung. uber pc Trennung von Cannabidiol und Pyrahexyl berichten Asahina und Shiuchi5).
I m Rahmen unserer Untersuchungen des einheimischen Hanfes auf antibiotisch
wirkende Inhaltsstoffe waren wir bemuht, eine geeignete analytische Methode zu
&. KrejEi, M . Horcik und F . iantavy, Pharmazie 14, 349 (1959).
0 . - E . Schultz und a. Hajjner, Arch. Pharmaz. 291, 391 (1958).
8 ) 0 . - E . Schultz und cf. Elaffner, Z. Naturforsch. 14h, 98 (1959).
4, 0 . - E . SchuUz und G. Hajfner, Arch. Pharmaz. 293, 1 (1960).
5) Haruyo Asahina und Yoahihico Shiwhi, Eisei Shikenjo Hokoku 75, 123 (1957); vgl. C. A.
52, 17402 (1958).
1)
2)
162
KolBek, YatiEiE und RepiE
Archiv der
Pharrnszie
schaffen, die einen Einblick in die Zusammensetzung der Droge geben konnte. Eine
gute Auftrennung einzelner Stoffe aus dem Rohextrakt konnten wir gerade mit
Hilfe von pc Methoden erreichen, die sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Auswertung ermoglichten.
Bekanntlich tragen die im Hanf enthaltenen Wirkstoffe phenolische Hydroxylgruppen im Molekiil. Unter diesen befinden sich auch Substanzen, die aul3erdem
noch eine Carboxylgruppe enthalten (z. B. Cannabidiolsaure). Daher konnen die
im Rohextrakt enthaltenen Substanzen durch Ausschiitteln mit NaHC0,-Losung
in zwei Gruppen unterteilt werden. Da durch diese Operation die pc Auftrennung
wesentlich vereinfacht wird, haben wir die beiden Untergruppen (Sauren und Phenole) getrennt untersucht.
Da die im Hanf enthaltenen Substanzen in reinem Zustand praktisch farblos
sind, waren wir bestrebt, eine geeignete Farbreaktion zu finden, die die Sichtbarmachung der Komponenten auf dem Chromatogramm ermoglichen wiirde. Fur
Hanfharz und einige andere Wirkstoffe des Hanfes sind bereits mehrere Farbreaktionen bekannt6) '), von denen der Beam-Test als spezifisch gilt. Diese Farbreaktion
wurde in modifizierter Form auch zur quantitativen Wertbestimmung der Inhaltsstoffe des Hanfes herangezogena). Als weitere Farbreaktion wird auch die mit Eisen(111)-chlorid empfohlen. Diese beiden Farbreaktionen haben sich zur Sichtbarmachung einzelner Komponenten auf dem Chromatogramm wegen ihrer zu geringen
Empfindlichkeit als unbrauchbar erwiesen. Als weitere Reagenzien haben wir das
6Wssche Reagens (2,6-Dibromchinon-4-chlorimid)
und 4-Aminoantipyrin erprobt .
Obwohl auch diese Reagenzien zu diesem Zweck brauchbar sind, gaben wir bei
unserer weiteren Arbeit dem Echtblausalz B ( E . Merck) den Vorrang. Das Reagens
(eine etwa lproz. wal3rige Losung), das nach Moglichkeit stets frisch angesetzt werden 9011, gibt mit den einzelnen Komponenten verschiedene Farbungen - meist
roaarot bis lila - die auf dem Chromatogramm fiir lange Zeit bestandig sind. Die
Empfindlichkeit der Farbreaktion ist grolj, das Anfarben selbst geschieht durch
Bespruhen der Chromatogramme zunachst mit der Reagenzlosung und unmittelbar
darauf mit Sproz. waljriger Sodalosung, wodurch die Farbflecke erheblich an Intensitat gewinnen.
Zur pc Trennung der Inhaltsstoffe des Hanfes haben wir verschiedene FlieBmittelsysteme erprobt. Die besten Ergebnisse konnten auf mit Formamid impragniertem
Papier Ederol 202 *) erzielt werden, als FlieBmittel hat sich vor allem Benzol bewahrt. Die Trennung wurde nach der aufsteigenden Methode durchgefuhrt, da diese
gegeniiber dem absteigenden Verfahren scharfer begrenzte Flecke liefert.
Alle untersuchten Muster unseres einheimischen Hanfes verschiedener Provenienz
hatten annahernd die gleiche Zusammensetzung. Abweichungen zeigten sich in
~
*) Erzeugnis der Pa. J . C. Binzer, Hatzfeld/Eder**).
* *) Fiir die uberlassung der zur Durchfiihrung dieser Arbeit notigen Papiermuster sind wir
der Fa. Binzer zu adrichtigem Dank verpflichtet.
6 , EI. f?chindZer, Arzneimittel-Forsch.2, 291 (1962).
') W.J . Blake, Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 13, 96 (1941).
295.m.
1962,Nr. 2
153
Zur Papierchromatographie der Inhaltsstof f e dea Hanfes
erster Linie im Pehlen der einen oder der anderen Komponente im Rohgemisch bzw.
in verschiedener mengenmadiger Zusammensetzung. Schon die durchgefiihrten
Vorversuohe deuteten darauf hin, daB im Hanf eine meit grodere Anzahl an Komponenten vorhenden ist, als in der Literatur angegeben. Ob alle pc festgestellten Komponenten schon in der Droge als solche auftreten oder ob sie erst durch Spaltung
wahrend der Isolierung gebildet werden, kann zur Zeit noch nicht entschieden werden. Das Ziel unserer Arbeit war nicht die auf pc Wege getrennten Romponenten
zu identifizieren bzw. ihre Struktur zu klaren. Wir begniigten uns damit, die einzelnen Substanzen vom PC zu eluieren und sie auf ihre antibiotische Aktivitat zu
priifen, um hierdurch einen Zusammenhang zwischen der Zusammensetzung des
Rohextraktes und seiner biologischen Wirkung zu gewinnen *). Darz PC der Hydrogencarbonatfraktion isb in Abb. 1 dargestellt.
i a r b e mit
Farbp m i t
Echtblau-
Echtblau sail
e
Nr
Rf
10
096 lilarot
9
0.88 aegeirot
8
068 ziegelrot
7
6
056 lilarot
050 ocker
5
0 . U weinrot
salz I
Rf
Nr
7
095 himbeerrot
0.76 r o s a r o t
6
5a
0.63 hlafl
rosarot
5
QLl rosarot
I
0.30 weinrot
L
026 lilarot
3
0.12 l i l a r o t
3
0.11 orange-
i
OOL weinrot
001 weinrot
2
0.06 /;tarot
1
rosarof
I 0t
Abb. 1. Chromatogramm der Hydrogen-
Abb. 2. Chromatogramm der Phenol-
carbonatfraktion, System Formamid/
Benzol
fraktion, System FormamidjBenzol
Zu Abb. 1 : Nr. 2 fluoresxiert leuchtend blau, Kr. 4 twhwach griinlichblau.
*) Die Teste wurden freundlicherweise vom Dipl.-lng. J. &jmer,
teilung der Zentralhygienischen Anstalt Ljubljana, durchgefiihrt.
Mikrobiologische Ab-
154
KolBek, M a t i d i l und RepiE
Archlv der
Pharmazie
Die PlieBmittelfront war durch Chlorophyll griin gefiirbt und fluoreszierte im
UV-Licht grunlichgelb, dieselbe Fluoreszenz zeigte auch die auf dem Start zuruckgebliebene Zone. Substanz Nr. 6 verfiirbte sich erst einige Stunden nach dem Bespriihen mit dem Reagens.
Eine bessere Auftrennung der in diesem FlieSrnittelsystem langsam wandernden
Komponenten kann man dadurch erreichen, daB man als PlieBmittel ein BenzolChloroform-Gemisch (17 :3) verwendet, wodurch die Rf-Werte samtlicher Komponenten erhoht werden. Dabei konnte noch eine weitere Substanz, die kurz vor der
Hauptkomponente (Nr. 3) wanderte und sich mit dem Spriihreagenz rosarot verfiirbte, festgestellt werden (Fraktion 3a). Das PC der Phenolfraktion ist in Abb. 2
dargestellt .
Wiihrend alle iibrigen Komponenten praktisch farblos waren, war die am schnellsten wandernde Substanz durch farbige Verunreinigungen gelb gefiirbt.
Nachdem eine Auftrennung der im H a d enthaltenen Wirkstoffe gelungen ist,
versuchten wir die einzelnen Fraktionen noch q u a n t i t a t i v zu erfassen. Zu diesem
Zweck hat sich die photometrische Methode alw brauchbar erwiesen, bei welcher
p-Nitrodiazobenzoltetrafluoroborat (p-NDB) als Farbreager,z diente. Dieses liefert
mit skmtlichen Komponenten einen gelben Farbstoff, dessen Absorptionsmaximum
bei 425 mp liegt. Unter den Versuchsbedigungen nimmt die Intensitat der farbigen
Losung noch mehrere Stunden nach der Reagenzzugabe zu, wobei gleichzeitig eine
Verschiebung des Absorptionsmaximums gegen kiirzere Wellenliingen stattfindet.
Aus diesem Grunde fuhrten wir die Messungen eine Stunde nach dem Rengenzzusatz
durch und konnten bei genauem Einhalten der Zeit gut reproduzierbare Werte erhalten. Zur Aufstellung der Eichkurve diente aus Methanol umkristallisiertes,
i. Vak. scharf getrocknetes Cannabidiol*). Dieses liefert mit p-NDB einen gelben
Azofarbstoff mit dem Absorptionsmaximum bei 420 mp. I m Konzentrationsbereich
bis uber 350 pg/50 ml folgt die Farbreaktion dem Beerschen Gesetz (200p g entsprechen E 0,387). Die Messungen wurden in 1 cm-Kiivetten mit dem Beckmanschen Spektralphotometer DU durchgefuhrt.
Die Resultate der Bestimmung der Einzelkomponenten der Saurefraktion - umgerechnet auf Cannabidiol - sind in der Tab. 1 zusammengestellt. Um eine bessere
Auftrennung langsam wandernder Substanzen zu erreichen und die Komponente
3a erfassen zu konnen, entwickelten wir das PC mit dem Benzol-Chloroform-Gemisch. Hierbei liefen die Komponenten 8 und 9 gemeinsam mit der PlieBmittelfront.
In einem zweiten PC, das nur mit Benzol entwickelt wurde, erreichten wir die Auftrennung der Komponenten 8 und 9 und konnten somit auch diese einzeln quantitativ erfassen.
*) Herrn Prof. Dr. 0 . - E . Schultz, Direktor des Pharmazeutischen Institutes der Universitiit
Kiel, danken wir fur die freundliche uberlassung des reinen Cannebidiols recht herzlich.
'2%. Bd.
1 1 2 , Nr.2
Zur Papierchromatographie der Inhaltsstof f e des Hanfes
155
~~
Tabello 1
I
an extrah. Stoffen
Gravimetrische Bestimmung
Photometrische Bestimmung
(ber. als Cannabidiol)
Fraktion
Nr
.
09%
I
1
2
3
3a
4
5+6
7
8
9
10
Gehalt bezogen auf
iesamtshren
Droge
10,60/d
6,7
22,5
8,7
9,2
10,6
995
11,4
499
5.9
0,0006~0
0,0004
0,0014
0,0005
0,0006
0,0006
0,0006
0,0007
0,0003
0,0003
1
I
1
O,63%
Siiuren
G e s a m t m e nge xi
an Siiuren
0,06%
0,006%
I
1
an Phenolen
0,5776
0,43%
P he nole
Fraktion
Nr.
1
2
3
4+5
6
8
11
Gehalt bezogen auf
Gesamtphenole I
Droge
4,0%
118
4,o
34,6
0,020/,
0,Ol
0,02
0,15
0,03
0,Ol
0,07
0.01
Bei unserer Methode wird die am Startfleck aufgetragene Substanzmenge nicht
gemessen, als Ergebnis erhalten wir nur die relativen ,,Gelbwerte" fiir einzelne
Komponenten. Ihr Absolutgehalt wird an Hand einer gesonderten Gehaltsbestimmung der Summe der in der betreffenden Droge enthaltenen Wirkstoffe ermittelt.
Diese Bestimmung fuhrten wir auf gravimetrischem Wege durch, in den so erhaltenen Extrakten bestimmten wir anschlieBend den Gehalt phenolischer Stoffe (umgerechnet auf Cannabidiol) nach der photometrischen Methode.
In ahnlicher Weise wie bei den Sauren fiihrten wir auch die quantitative Bestimmung der Einzelphenole durch. Zu diesem Zweck entwickelten wir das PC mit
Benzol und konnten so die mit 1--6 bezeichneten Komponenten erfassen. Da die
Fraktion 6, wie weiter unten ausfiihrlicher beschrieben ist, ein Gemisch mehrerer
Komponenten darstellt, trennten wir diese im System Dimethylformamid/n-Hexan
und erhielten dadurch noch weitere vier Substanzen (7-lo), von denen die Komponente 9 Cannabidiol enthalt (Tab. 1).
Reines Cannabidiol wandert im System Formamid/Benzol knapp hinter der
PlieBmittelfront. Beim Ausschiitteln des Rohextraktes mit NaHC0,-Losung geht
Cannabidiol nicht in die waBrige Phase iiber, es findet sich demnach in der mit der
PlieBmittelfront wandernden Fraktion der Phenole. Da diese Fraktion auherdem
noch harzige Substanzen und Farbstoffe enthalt, versuchten wir diese Fraktion
noch in einem anderen FlieBmittelsystem weiter zu unterteilen. Das konnten wir
an einem mit 50proz. Dimethylformamid-Losung in Chloroform impragniertem
Papier mit n-Hexan als FlieBmittel erreichen. I n diesem System fand eine Auftrennung in folgende Komponenten statt :
ArcNv der
Pharmazie
K o l J e k , YatiEiE und RepiE
166
Rf -Wert
0,oo
Parbe mit Echtbkusalz B
schmutzig rosarot
dunkel lilarot
0,11
0,33
intensiv himbeerrot
blaB rosarot
0,85
Durch gleichzeitiges Mitlaufenlassen der authentischen Substanz stellten wir fest,
daD die Komponente rnit dem Rf-Wert 0,33 dem Cannabidiol entspricht. Um das
mit voller Sicherheit zu beweisen, extrahierten wir die Substanz vom Papier und
verglichen ihr IR-Spektrum rnit dem des Cannabidiols. Die beiden Spektren waren
fast identisch, der Unterschied zeigte sich darin, daa die unbekannte Substanz nocli
cine Absorptionsbande geringer Intensitat bei 1740 cm-1 aufwies, die Cannabidiol
nicht zeigt. Diese Bande deutete auf die Anwesenheit einer geringen Verunreinigung,
die auderdem die bei 2950 cm-' vorhandene Bande in ihrer Intensitat etwas verstarkte. Nach einmaligem Reinigen der Substanz uber eine kleine Al,O,-Saule
konnte diese Verunreinigung auf eine aul3erst geringe Menge herabgesetzt werden,
so daD wir praktisch identische Spektren rnit dem Cannabidiol erhielten. Die Substanz gibt mit alkoholischer Kalilauge einen positiven Beam-Test, der allerdings fur
Cannabidiol nicht spezifisch ist. Dieselbe Parbreaktion gibt auch die zweite, hinter
dem Cannabidiol wandernde Substanz. Es wird darauf hingewiesen, daS an Hand
des Beam-Testes bei der colorimetrischen Analyse des Hanfes nicht nur Cannabidiol,
sondern auch andere Substanzen miterfaat werden.
Um die auf pc Wege getrennten Substanzen auf ihre a n t i b i o t i s c h e W i r k u n g
zu priifen, wurden die einzelnen Fraktionen durch Eluieren mehrerer PC angereichert und in Konzentrationen, die ca. 0,25 mg Cannabidiol entsprechen, a d Papierscheiben von 10 mm Durchmesser aufgetragen. Die antibiotische Wirksamkeit ist
durch den in mm angegebenen Umkreis, in welchem sich die Bakterienwachstumhemmende Wirkung an Bacillus anthracis bemerkbar machte, angegeben. Wie aus
Tab. 2 hervorgeht, ist die Mehrzahl der im Hanf auftretenden Substanzen mit phenolischen OH-Gruppen im Molekiil antibiotisch aktiv.
Tabelle 2
Antibiotische Wirksamkeit der pc aufgetrennten
Saurefraktionen
Phenolfraktionen
Waktion
Nr
hbstanzmenge
(PLP)
RadG der
Zone (mm)
Waktion
Nr.
1
2
3
4
4
2
3
4
5
6
7
8
9
260
260
114
260
234
260
260
260
210
10
97
.
4
0
0,5
2
13
4
4
4
4
inaktiv
6
7
Radius der
Zone (mm)
260
106
114
260
260
260
inaktiv
inaktiv
inaktiv
260
1
2
4
2
reines
Cannabidiol
295. Bd.
1962,Nr.2
Zur Papierchromatographie der Inhaltastofie des Hanfes
167
Beechmibung der Versuche
Isolierung der Inhaltsstoffe aus der Droge
Die getrockneten und gemahlenen Hanfbliitter werden mit einem organischen Liisungsmittel (Benzol, Chloroform) durch Perkolation bei Raumtemperatur extrahiert, das
Losungsmittel bei miiBiger Temperatur i. Vak. abgetrieben und die Inhaltsstoffe durch
Ausschutteln mit 2proz. Natronlauge entzogen. Nech dem Ansiiuern w i d die Substanz
in Chloroform aufgenommen, nach Verdunsten desselben fiillt eine rotbraune, ziihe Flussigkeit (,,red oil")an, die durch Behandlung mit 5prOZ. NaHC0,-Losung in zwei Fraktionen
unterteilt wird. Diese dienen als Ausgangsmaterial fiir die Durchfiihrung der pc-Untersuchungen.
Durchfiihrung der pc Trennung
Das Papier (Ederol 202) wird durch Tauchen mit einer 4Opmz. Formamid-Losung in
Aceton impriigniert, zwischen zwei Lagen Filtrierpapier abgepreBt und mit einem Fohn
so lange getrocknet, bis der Acetongeruch nicht mehr wahrnehmbar ist. Die Substanz wird
in Chloroform gelost und strichformig auf die Startlinie aufgetragen. Nach erfolgter pc
duftremung wird das FlieBmittel mit warmem Luftstrom (Fohn) entfernt, worauf das J?C
mit der Echtblaumlz B- und Soda-Losungbespriiht wird, um die getrennten Zonen sichtbar
zu machen. Einige dieser Zonen konnen schon beim Betrachten des PC unter der TJVLampe an ihrer Fluoreszenz festgestellt werden.
Q u a n t i t a t i v e Bestimmung einzelner Komponenten auf dem P C
Die Substanz wird zweimrtl strichformig nebeneinander auf die Startlinie des PC aufgetragen. Nach dem Entwickeln mit dem FlieBmittel wird durch Bespriihen einer Chromatogrammhiilfte die Lage der einzelnen Komponenten festgestellt. Die andere Chromatogrammhiilfte wird entsprechend der Lage der Substanzen in Streifen und diem in kleine
Schnitzel zerschnitten. I n einem 25-ml-Erlenmeyerkolben werden dime mit etwa 10 ml
Bthanol unter Schutteln mehrere Std. bei Raumtemperatur extrahiert. AnschlieBend wird
die alkoholische Losung durch einen Wattebausch in ein 25-ml-MeBkOlbchenfiltriert. Die
Papierschnitzel werden so lange mit Athanol ausgewaschen, bis das MeBkolbchen aufgefiilh
ist. Die Konzentration der so erhaltenen Losung wird anschlieBend auf photometrisohem
Wege ermittelt.
Durchfiihrung der photometrischen Bestimmung
Eine etwa 50 bis 200 pg Cannabidiol entsprechende Menge der alkoholischen Liisung des
Hanfextraktes wird in einen 50-ml-MeBkolben abpipettiert. Damit der bei der Reaktion
gebildete Farbstoff bei spiiterem Verdiinnen mit Wasser nicht ausfiillt, werden aus
einer Pipette 5 ml96proz. Athanol zugesetzt. Nach Zugabe von 2 ml einer frisch angesetzten, wiilrigen p-Nitrodiazobenzoltetrafluoroborat-Losung(0,2 g/lOO mi) wird sofort mit
Wasser bis zur Marke aufgefullt und die Extinktion 1 Std. nach dem Reagenzzusatz bei
425 mp gemessen. Als Vergleich dient eine in gleicher Weise bereitete Reagenzlosung.
Anschrift: Dr. Ing. J . KolEek, Keinijski invtitut ,,Boris Kidri:",
l~jubljana/Jugoslavija, Eajdrlhova 19.
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