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Die Einwirkung von Phenoloxydasen auf Substratgemische von einfachen Phenolen Mitteilung Uber Phenoloxydasen.

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616
Promminy
Archiv dsr
Pharmazie
1629. K a r l - H e i n z P r o m m i n g
Die Einwirkung von Phenoloxydasen auf Substratgemische
von einfachen Phenolen
1. Mitteilung iiber Phenoloxydasen*)
Aus dern Pharmazeutischen Institut der Freien Universitdt Berlin
(Eingegangen am 4. Juli 1957)
Phenoloxydasen sind nicht nur gegenuber einem einzigen Substrat spezifisch,
sondern vermijgen eine groaere Anzahl von phenolischen Stoffen, die zum Teil auch
in Pflanzen und Tieren vorkommen, zu oxydieren. Es liegt die Vermutung nahe,
tXaB diese Fermente bisweilen auch in der pflanzlichen Zelle nicht nur auf e i n
Substrat, sondern auf Substratgemische treffen. Es durfte fur die Pflanze nicht
problematisch sein, Zusammensetzung und Konzentration dieser Gemische zu
variieren und so vielleicht eine Steuerung der oxydativen Vorgange vorzunehmen.
Zum anderen konnen Fermente auf derartige Substratgemisehe auch bei der Aufarbeitung fermenthaltiger Pflanzenteile treffen, sofern diese Aufarbeitung mit
einer mechanischen Zerstorung des Gewebes verbunden und keine A4btotungder
Permente erfolgt ist.
Es wurde fur wesentlich gehalten, systematisch die Einwirkung von Phenoloxydasen auf Substratgemische zu untersuchen. In die Untersuchungen sollen die jenigen Pflanzenstoffe einbezogen werden, die den Phenoloxydasen als Substrate
dienen konnen. Dies sind einfache Phenole, Plavonole, Gerbstoffe, Oxyeuniarine
u. a. Daneben soll jedoch auch einigen Pflanzenstoffen, die in der Pharmazie verwendet und erst durch Mitwirken eines der angegebenen phenolischen Stoffe oxydiert werden, eine besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden.
Bisher befaaten sich lediglich Roberts und Wood1)2)sowie Kursariow und Xayro.metow3) im Rahmen ihrer Arbeiten uber die Teefermentation mit dieser Frage.
Roberts und Wood kominen zu dem Ergebnis, daR bei der Einwirkung einer Teeoxydase auf Gemische von Polyphenolen bei optimalen Substratkonzentrationen
die Oxydationsgeschwindigkeit, gemessen durch den pro Stunde aufgenommenen
Sauerstoff, gleich der Reaktionsgeschwindigkeit des schneller oxydierbaren Substrates ist. Es erschien den Autoren folgerichtig, aus diesen Ergebnissen den SchluD
zu ziehen, daD zunachst allein das am schnellsten oxydierbare Substrat angegriffen
wird ; die Oxydation der beiden Substrate soll also nacheinander erfolgen, wobei
betriichtliche Uberlappungen nicht ausgeschlossen werden. Kursanow und Sapronzetowi berichten in ihren Untersuchungen, da13 ein Gemisch yon L-Epicatechin
*) Zugleirh 10. Mitteilung uber die enzymatische und nichtenzymatische Oxydation von
therapeutisch wirksamen Pflanzenstoffcn.
l) E. A. H . Roberts und D . J. Wood, Biochem. J. 47, 175 (1950).
2, E. A. H . Robert8 und D.J . Wood, Nature 167, 608 (1951).
3, A. L. Kur8anow und M. N . &rprometow, Biochimija 17, 230 (1952); cit. in ,,Die Kulturpflanze", Beih. 1 (1956).
290.j62. Bd.
1957, Nr.12
Jhe
Einwirhng ?)on Phenoloxydusen ciuf Substratgemische
617
und L-Epigallocatechin schneller oxydiert wird als die beiden Substrate allein.
Sie kommen dadurch zu der Auffassung, daB das naturliche Gemisch der Catechine,
das sogen. ,,Teetannin", nicht als eine einfache Summe von Stoffen, sondern als
ein kompliziertes Redoxsystem angesehen werden mull, dessen quantitative Zusammensetzung Umfang und Reihenfolge der oxydativen Umwandlungen und das
MaB der sekundaren Reaktionen zwischen den gebildeten Chinonen und den
Begleitstoffen bestimmt.
In der vorliegenden Arbeit wird die Einwirkung einer Phenoloxydase auf Substratgemische von einfacher gebauten Phenolen untersucht. Hierzu werden 1Tyrosin, 3,4-Dioxyphenylalanin, Brenzkatechin, Kaffeesaure, Chlorogensaure und
Gallussaure herangezogen. Von diesen Stoffen sind vor allem Kaffee- und Chlorogensiiure im Pflanzenreich weitverbreitet.
-41s Fermentextrakt wurde eine Kartoffelpraparation nach Kubowitz4) verwendet.
I% konnten in ihr papierchromatographisch keine phenolischen Stoffe nachgewiesen werden. 1ml der Praparation hatte ein Trockengewicht von 2,78 mg.
Das Verhaltnis der Cresolase- zur Catecholase-Aktivitat betrug nach Beendigung
cler Fermentdarstellung 14,8 : 51,O Einheiten; das sind 5,3 Cresolase-Einheiten
und 18,3Catecholase-Einheiten pro mg Trockengewicht. Unter 1 Cresolase-Einheit
ist die Permentmenge zu verstehen, die bei 25" C gegeniiber optimalen Mengen
p-Cresol bei optimalem pH eine 0,-Aufnahme von 10 mm3/min bewirkt, wahrend
1 Catecholase-Einheit die gleiche 0,-A4ufnahme gegenuber optimalen Mengen
Brenzkatechin verursacht. Wegen der starken Fermentinaktivierung bei der Oxyclation des Brenzkatechins wurden bci der Bestimmung der Catecholase-Einheiten
nur die in den ersten 3 Minuten verbrauchten 0,-Mengen beriicksichtigt.
Die Zusammensetzung der Substratgemische wurde derart vorgenommen, daB
der eine Reaktionspartner - meist handelte es sich um den am schnellsten oxydierten - in optimaler Konzentration vorlag, wahrend der andere Reaktionspartner in wechselnden Mengen zugesetzt wurde. Als optimale Substratkonzentration wurden folgende Losungen verwendet :
Chlorogensaure
Kaffeesaure
DOPA
Brenzkatechin
Gallussaure
Tyrosin
3,2 mg/ml Reaktionslosung
1,0 mg/ml
6,4 mg/ml
>
1,6 mg/ml
,>
16,O mg/ml
0,4 mg/ml
>,
3,
3,
Die Bestimmung der optimalen Konzentration geschah in der Weise, da13 gleiche
Fermentmengen unter gleichen Bedingungen - p h 6, 25" C - auf wechselnde
Substratmengen einwirkten. Die optimalen Substratkonzentrationen zeigten
wahrend des linearen Reaktionsverlaufes maximalen Sauerstoffverbrauch.
Im einzelnen konnten folgende Ergebnisse erhalten werden :
4,
F. Kubowitz, Biochem. 2. 292, 221 (1937); 299, 32 (19%).
618
A I " der
Pharmazie
Fromming
1. DOPA / Kaffeesiiure
Die Reaktionsgeschwindigkeit dieses Substratgemischea ist gleich der Geschwindigkeit
des Reaktionspartners, der als Einzelsubstrat am starksten oxydiert wird. Bei Vorliegen
kleiner Mengen KaffeesfLure neben optimalen DOPA-Konzentrationen iihnelt die Reaktionskurve des Gemisches voEg der des DOPA als dem bei diesem Mengenverhliltnis am
schnellsten oxydierten Substrat (Abb. la). Wird die Kaffeesiiuremenge bis zu optimalen
.50
I
I
Abb. l a
Abb. l b
Abb. 1. Oxydation des Substratgemisches DOPA/Kaffeesaure
Abb. l a : L-- --a
0- -0
x
Abb. lb:
Y
DOPA
0,8mg (=
mol.)
Kaffeesiiure 1,0 mg (= 6,6
mol.)
- x DOPA
0,8 mg jKaffeesaure 1,O mg
A----A
0- -0
x--
4,O .
DOPA
6,4 mg :( 3,2
mol.)
Kaffessiinre 0,l mg (= 5,6
mol.)
DOPA
6,4 mg /Kaffeesiiure 0,l mg
.
(Slintliche Mengenangaben beziehen sich auf den Gehalt pro ml Reaktionsansatz)
Konzentrationen vergroBert, so nimmt die Reaktionskurve des Gemisches die Gestalt der
Oxydationskurve der Kaffeesaure an, da diese jetzt schneller oxydiert wird. Dies wird
noch deutlicher, wenn die DOPA-Konzentration gesenkt wird, so daB nicht mehr das
DOPA, sondern nur noch die Kaffeesiiure in optimalen Mengen vorliegt (Abb. lb). Ein
Gemisch von DOPA und Kaffeesiiure verhiilt sich also nach der von Roberts und Wood
aufgestellten Regel fiir Substratgemische. Hiermit sol1 jedoch nicht gesagt werden, daB
das am schnellsten oxydierbare Substrat im Gemisch zu Beginn der Reaktion allein
oxydiert wird.
2. Chlorogensiiure / Kaffeesiiure
Kaffeesiiure iibt auf die Chlorogensaureoxydation eine Hemmung aus. Bci Vorliegen
von etwa iiquimolaren Mengen beider Substrate (Abb. 2a) ahnelt die Oxydationskurve
des Gemisches weitgehend der Reaktionskurve der Kaffeesiiure. Zugabe von Chlorogensaure zu optimalen Kaffeesauremengen zeigt lreine Hemmwirkung der Chlorogensaure
gegenuber der Kaffeesaure (Abb. 2b).
3. Chlorogensaure / DOPA
Lie@ die Chlorogensaure in Mengen iiber 0,2 mg pro m1 Reaktionslosung vor, YO erfolgt die Oxydation dieser Siiure mit einer grofieren Reaktionsgeschwindigkeit als die
Oxydation optimaler DOPA-Mengen. Obwohl folglioh das DOPA in den Mischungen
290./62. Bd.
19.957,N ~12
.
Die Einwirhng von Phenoloxydasen auf Substratgemische
6 19
Abb. 2b
Abb. 2. Oxydation des Substratgemischea
Chlorogensiiure /Kaffeesiiure
Abb. 2a
Abb. 2a:
-n
.
.
Chlorogensilure 0,2 mg (= 5,7 . 10-4 mol.)
Kaffeesilure
1,0 mg (= 5,6 - 10-8 mol.)
Chlorogensiiure 3,2 mg (= 9,0 10-8 mol.)
Kaffeeaaure
2,O mg (= 1,l 10-2 rnol.)
x - --x Chlorogensiiure 3,2 mg /KaffeeBciure 2,O mg
0O--O
Abb. 2b: LI----o
0--0
x- -x
Chlorogensiiure 0,2 mg /Kaffeesciure 1,o mg
(Kaffeesilure in Konzentrationen von 2,O mg/ml lost sich nicht mehr vollstiindig)
durchweg in weitaus groBerer Menge vorliegt, wird keine Hemmung der Reaktionsgeschwindigkeit der Chlorogensiiure festgestellt ;die Reaktionskurve dea Gemisches iihnelt
jeweils weitgehend der Reaktionskurve der Chlorogensiiure. Bisweilen wird sogm eine
geringe Aktivitiitssteigerung beobachtet (Abb. 3).
Abb. 3. Oxydation des Substratgemisches
Chlorogensaure/DOPA
n- -S Chlorogensiiure 1,6 mg
DOPA
(= 3,2 -
(= 4,5
A--A
x-x
mol.)
6,4 mg
mol.)
Chlorogensiiure 1,6 mg /
DOPA 6,4mg
4. Brenzkatechin / Chlorogensiiure; Brenzkatechin / Kaffeesilure; Brenzkatechin / DOPA
Brenzkatechin besitzt wie die anschlieBend zu besprechende Gallussilure die Fiihigkeit,
die Oxydation verschiedener Substrate zu hemmen. Ein Zusatz von steigenden Mengen
Brenzkatechin zu optimalen Mengen Chlorogensiiurezeigt bereits bei aquimolaren Mengen
eine sehr starke Hemmung der Chlorogensiiureoxydation; bei groBerem Brenzkatechinzusatz ahnelt die Kurve des Gemiches vollig der Oxydationskurve des Brenzkahchins
(Abb. 4). Bei dem Gemisch Brenzkatechin / Kaffeesaure nimmt die Reaktionskurve bei
einem Zusatz von 0,4 mg Brenzkatechin (= 3,7 10-3 mol.) zu 1,0 mg KaffeesLure
-
620
Archiv der
Pharmazie
Prornming
I
Abb. 4.
Oxydation des Substratgemisches
BrenzkatechinlChlorogensiiure
Chlorogensaure
Brenzkatechin
x Chlorogensaure
o Cldorogensaurc
+ Chlorogensaure
-U
-LI
v- -V
x
-
0-
+
.
3,2 mg (= 9,0 10-3 mol.)
0,smg (= 7,3 10-3 mol.)
3,2 mg/Brenzkatechin 0,2 mg : ( 9,0
3,2 mg /Brenzkatechin 0,smg
3,2 mg/Brenzkatechin 12,8mg (= 9,0
-
1 , s . 10-3 mol.)
-
/ 1,2 10-1 mol.)
+
(0,2 mg und 12,smg Brenekatechin weisen keinen hoheren 0,-Verbrauch als 0,8 mg
Brenzkatechin auf)
.
(= 5,6 10-3 mol.) weitgehend die Form der Oxydationskurvc des Brenzkatechins an
(Abb. 6).
Abh. 5. Oxydation des Substratgemisches
Brenzkatechin/Kaffeesilure
0- -0
KaffeesSluro
(= 5,6
v'-:
1,O mg
mol.)
Brenzkatechin 0,4 mg
mol.)
(= 3,7
+--
.
.
Kaffeesaure
1,0 mg /
Brenzkatechin 0,4mg
Zu bemerken ist, daB auch die Kaffeesaure einen gewissen EinfluB auf die Oxgdation
des Brenzkatechins ausubt, und zwar derart, daB die Gemischkurve zu Beginn einen etwas
flacheren Anstieg als die Reaktionskurve des Brenzkatechins rtufweist. I m Gemisch
Brenzkatechin / DOPA hemmt das Brenzkatechin ebenfalls die Oxydationsgeschtvindigkeit des DOPA (Abb. 6 4 . Sind die DOPA-Mengen so gering, daB die anfangliche Reaktionsgeschwindigkeit des DOPA kleiner als die des Brenzkatechins ist, so iihnelt die
Oxydationskurve des Gemisches der des Brenzkatechins. Dies kann so gedeutet werden,
daB durch das DOPA die Oxydation des Rrenzkatechins nicht beeinflu& wird (Abh. 61)).
290.162. Bd.
1957, Nr.12
70
Die Einwirkung vow luhenoloxydasen auf Substratgemische
621
YO
I
4
h
U
20
20
0
t
70
0
k
5
75 tfmin] 20
I0
Abb. 6a
Abh. 6a:
A--A
7-
--A
7- -V
o
Abb. 6. Oxydation des Substratgemisches
Brenzkatechin/DOPA
--
DOPA
6,4 mg (= 3,2
mol.)
Brenzkatechin 1,6 mg (= 1,5
mol.)
DOPA
6,4 mg /Brenzkatechin 1,6 mg
-V
0--0
Abb. 6b:
Abb. 6b
DOPA
0,s mg (= 4,O
mol.)
Brenzkatechin 1,6 mg (= 1,5 lop2 mol.)
o DOPA
0,8 mg /Brenzkatechin 1,6 mg
-
5 . Gallussiiure / Chlorogensiiure; Gallussiiure / Brenzkatechin; Gallussaure / Tyrosin;
Gallussiiure / Kaffeesiiure; Gallussiiure / DOPA
Gallussiiure wird von den verwendeten Substraten bei gleichen Fermentkonzentrationen
am langsamsten oxydiert. Sie iibt auf die Oxydationsgeschwhdigkeit samtlicher Substrate'
einschliel3lich Brenzkatechin, eine starke Hemmung aus. In Abb. 7 wird die Hemmung
hbb. 7. Oxydation des Substratgemisches
Gallussiiure/Chlorogensaure
0- -n Chlorogensaure 3,2 mg
(= 9,0
mol.)
x
x Chlorogensiiure 3,2 mg / Gallussiiure 50
O,Smg(= 9,O. 10-s/4,1. 10-smol.)
o --o Chlorogensiiure 3,2 mg / Galluss&ure
4,Omg (= 9,0
/ 2,4 10-2 mol.)
i---+
Chlorogensiiure 3,Zmgj Gallussiiure
9,4
mol.
16,O mg (= 9,0
-
-
-
-
(Gallussiiure zeigte bei den verwendeten Fermentkonzentrationen keinen 0,-Verbrauch)
der Oxydation der Chlorogensiiure durch die Gallussiiure gezeigt,. Ahnlich liegen die VerIdtnisse bei den Gemischen Gallussiiure / Kaffeesaure und Gallussiiure / Brenzkatechin.
Die Oxydation des DOPA wird bereits von 4 mg Gallussaure / ml Reaktionslosung weitgehend gehemmt. Die Versuchsreihe Gallusskure / Tyrosin mul3te iiber einen langeren
Zeitraum beobachtet werden, da bei Verwendung von Moiiooxyphenolen als Substrat der
0,-Verbrauch / niin llinger konstant bleibt als bei Verwendung van Dioxy- und PO~YOXYphenolen. Die Oxydation von Tyrosin erfiihrt bei Zusatz wachsender Mengen Gallussaure
ebenfalls eine Hemmung (Abb. 8a nnd 8b). Die Oxydation optimaler Mengen Gallusseure
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300t
300
4
m250i
x
$
250
11
ZOO
150
100
50
Abb. 8b
Abb. 8a
306
4
LUG
/'
Abb. 8. Oxydation des Substratgemisches
Gallussiiure /Tyrosin
Tyrosin
O,4 mg
(= 2,2 10-3 mol.)
Gallussaure 0,2 mg
(= 1,2
mol.)
-
Abb. 8a: x--x
256
t--+
-
200
o
150
-
0,4 mg I
Gallussaure 0,2 mg
o Tyrosin
~
Abb. 8b: x---x
i - -~
100
o
50
Abb. Sc: x --x
I
50
I
Abb. Sc
0,4 mg
Gallussiiure
0,8 mg
(= 4,7 10-5 rnol.)
-
0,4mg I
Gallusskure 0,8 mg
Tyrosin
0,4 mg
Gallussaure 16,O mg
(= 9,4 10-2 mol.)
a
I
Too t(min15'50
Tyrosin
o Tyrosin
+- -+
6
+-
o
094 mg I
Gallussaure 16,O mg
o Tyrosin
wird durch einen Tyrosinzusata nicht veriindert (Abb. 8 c ) . Es mu13 allerdings bemerkt
werden, daB ein groSerer Tyrosinzusatz als 0,4 mg/ml wegen der geringen Liislichkrit
des Tyrosins nicht f u r sinnvoll gehalten wurde.
6. Tyrosin 1 Brenzkaterhin; Tyrosin / Kaffcesiiure; Tyrosin / DOPA; Tyrosin / Chlorogensiure
Tyrosin ubt auf die Oxydation yon Substraten, die bei gleichen Fermentkonzentrationen
mit einer groSeren Reaktionsgeschwindigkeit oxydiert werden als das Tyrosin, keine Hemmung BUS. Abb. 9 zeigt dies fur das Gemisch Tyrosin / Kaffeesaure. Das gleiche Verhalten
konnte bei den Gemischen des Tyrosins mit Brenzkatechin, DOPA und Chlorogensaure
beobachtet wcrden.
290.162. Bd.
1957, Nr. 12
Die Einwirhung von Phenoloxydasen auf Substratgemkche
623
Abb. 9.
Oxydation des Substratgemisches
Tyrosin/Kaffmsiiure
Kaffeesaure 1,0 mg (= 5,6 10-3 mol.)
Tyrosin
0,4mg (= 2,2 10-3 mol.)
+- ---+ Kaffeesiiure 1,0 mg /Tyrosin O,O4 mg (5,6 lop3mol. / 2,2 10-4 mol.)
a- -0 Kaffeesiiure 1,0 mg /Tyrosin 0,2 mg (= 5,6 10-3 mol. I 1 , l 10-3 mol.)
A-----A
Kaffeesaure 1,0 mgl Tyrosin 0,4 mg
0--0
x-
-x
-
-
.
.
Von den verwendeten Substraten ubt Gallussaure die starkste Hemmung auf
die Oxydationsgeschwindgkeit anderer Substrate aus. Dies konnte fiir den oxydativen Abbau von Chlorogensaure, Kaffeesaure, DOPA, Tyrosin und Brenzkatechin gezeigt werden. Brenzkatechin konnte die Oxydation von DOPA, Chlorogensaure und Kaffeesiiure hemmen, wahrend Tyrosin und DOPA keinen Einflu13 auf die Oxydationsgeschwindigkeit der anderen Substrate besitzen. Kaffeesaure hemmt die Chlorogensaureoxydation. uber den Reaktionsmechanismus der
Oxydation von Substratgemischen kann bisher soviel gesagt werden, da13 sich
die Reaktionsgeschwindigkeit der untersuchten Gemische nicht durchweg nach
der Geschwindigkeit des bei gleichen Fermentkonzentrationen am schnellsten oxydierten Substrates richtet. Dies ist nur der Pall, sofern keine Hemmung zu beobachten ist, d. h. bei den Gemischen DOPA/Kaffeesaure, Chlorogensaure/DOPA,
Kaffeesaure /Tyrosin, Chlorogensaure/Tyrosin und DOPA/Tyrosin. ober die
Kinetik des Oxydationsverlaufs in Substratgemischen sind weitere Untersuchungen
im Gang. fiber sie wird zu einem spateren Zeitpunkt berichtet.
Beschreibung der Versuche
1. Darstellung der Fermentpriiparation
Zur Darstellung der Fermentpriiparation werden 10 kg moglichst junge Kartoffeln mit
Wasser gewaschen. Mit Hilfe einer Reibe aus Kunststoff werden die Schalen mit den angrenzenden Rindenteilen so abgerieben, dab das Reibgut in einen Glasbehalter mit etwa
1.8 Liter eiskaltem Wasser fallt. Von den 10 kg Kartoffeln werden etwa 5 kg Rindenteile erhalten. Der Kartoffelbrei wird durch ein festes Koliertuch geseiht und mit Hilfe einer
Porzellanpresse ausgeprebt. Die erhaltene braune Losung wird als ,,Ausgangsextrakt" bezeichnet. Dieser Extrakt wird mit soviel Azeton versetzt, daD dessen Endkonzentration
37% betragt. Der Niederschlag wird in einer Zentrifuge rnit 5000 U/min abzentrifugiert
und verworfen. Zu der klaren uberstehenden Losung wird weiterhin Azeton bis zu einer
Gesamtkonzentration von 55% gegeben. Der ausgefallene Niederschlag, der das Ferment
enthalt, wird abzentrifugiert und in Wasser gelost; die Wassermenge betriigt 1/30 des Volumens des ,,Ausgangsextraktes". Die triibe Lijsung wird bei 0' C zentrifugiert. Zu der
624
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klaren iiberstehenden Fliissigkeit wird soviel gesattigte Ammonsulfatlosung gegeben, dall
der Sattigungsgrad an Ammonsulfat 0,42 betragt. Der ausgefallene Niederschlag wird abzentrifugiert und verworfen. Zu der iiberstehenden Losung wird weiterhin gesattigte
Ammonsulfatlosung bis zum Sattigungsgrad 0,68 gegeben. Der ausgefallene Niederschlap
wird abzentrifugiert und in Wasser gelost; die Wassermenge betrligt
des Volumens
des ,,Ausgangsextraktes". Die so erhaltene fermenthaltige Losung wird bei 0' C 2-3 Tage
dialysiert. Der braune Niederschlag wird abzentrifugiert und verworfen. Die erhaltene
Fliissigkeit wird in einer braunen Flasche bei 0' C aufbewahrt;. Samtliche Arbeitsgange
werden bei '
0 c! ausgefiihrt.
3. Messung der F e r m e n t a k t i v i t a t
Die Aktivitiitsmrssungen werden in einein Warburg- Gerat, bei 25' C vorgenomnim.
Der Reaktionsansatz besteht aus 1 ml Substratlosung, 1 ml Pufferlosung CitronensaurePhosphatpuffer nach Nc Iloaine pH 6 und I/, ml Fermentverdiinnung. Sofern die verwendeten Substratkonzentrationen in 1 ml Wasser nicht niehr loslich sind, werden sie in
die ReaktionsgefaSe eingewogen. Die Fernientverdunnungen befinden sich wahrend des
Temperaturausgleiches in dem Seitenansatz der ReaktionsgefliBe. Nach zehnminiitigem
Temperaturausgleich werdcn Ferment und Substrat zusanimengegeben. I n dem Einsatzraum der ReaktionsgefaSe befinden sich jeweils 0,l ml lOO/bige Natronlauge uncl ein damit
gesilttigtes Stiickchen Filtrierpapier, um etwa entstehendes C0, en binden. Die Ablesungen der einzelnen Manometer werden in Abstanden von 1 Minute vorgenommen.
(Bei dem Substratgemisch Gallussaure/Tyrosin, sowie bei cler Bestimmung der CresolaseEinheiten betragen die Abstande 5 Minuten). Die Schiittelfrequene liegt bei 140 Schwingungen/miu. Die Fermentverdiinnungen muBten infolge des unterschiedlichen O,-Verbrauches der einzelnen Substrate bei den verschiedenen Substratkonzentrationen sehr
stark variiert werden; sie wurden so vorgenommen, daB der 0,-Verbrauch pro Minute 8 pl
nicht ubersteigt. Es wurde als ausreichend erachtet, in den graphischen Darstellungen nur
den Reaktionsverlauf wiihrend der ersten 20 Minuten darzulegen, da iniierhalb dieser Zeit
samtliche Substrate auBer Tyrosin ihre optimale Reaktionsgeschwindigkeit erreichen.
Eine Ausnahme wurde bei dem Gemisch GallussLure/Tyrosin gemacht .
3. Papierchromatographische Untersuchung der Ferment'priiparation
0,05 nil der unverdiinnten Fermentpriiparation wurden mit 16yoiger Escligsiiure auf
Whatman-Papier (Nr. 1) absteigend chromahgraphiert Der getrocknete Bogen wurde
mit folgenden Reagentien bespriiht : a) Iyoige methanolische FeCl,-Losung; b) Nitritreagens nach Herrmann5); c ) B%ige alkohol. PhosphormolybdiinsBurelosung 0,5 nmethanol. Kalilauge;d) Reagenr,nach Polin-Ciocalteu; e) diaz. Rulfanilstiure ; f ) ammonialralische Silbernitratlomng.
.
+
Zusammenfassung
Es wird uber die Einwirkung einer Phenoloxydase aus Eartoffeln auf Substratgemische von Chlorogensaure, Kaffeesaure, Rrenzkatechin, Gallussaure, Dioxyphenylalanin (DOPA) und Tyrosin berichtet. Gallussaure und Brenzkatechin uben
hierbei auf die Oxydation der anderen Substrate ejne Henimung a m , wahrend
DOPA und Tyrosin keine Inhibitorwirkung zeigen.
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danke ich fur die Unterstutzung der Arbeit
durch Bewilligung einer Sachbeihilfe.
j)
K . Herrmann, Pharmaz. Zentralhalle Deutschland 95, 56 (1956).
Ansehrift: Dr. XarZ-Hek Pi-6mming, Pharmazent. Institut
Lube-Str. 2-4.
der FU. Berlin, Berlin-Dahlem, Konfgin-
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