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Untersuchungen zur Biosynthese der Aloine in Aloe arborescens Mill.

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Biosynthese der Aloine
315182
23 1
Arch. Pharm. (Weinheim) 315, 231-241 (1982)
Untersuchungen zur Biosynthese der Aloine in Aloe arborescens
Mill. * *
Michael Griin und Gerhard Franz*
Lehrstuhl fur Pharmazeutische Biologie, Fachbereich Chemie und Pharmazie, UniversitatsstraRe
31, Universitat Regensburg, 8400 Regensburg
Eingegangen am 23. Marz 1981
Die Bildung der natiirlich vorkommenden diastereomeren Aloine A und B wurde an Aloe
arborescens Mill. mit Hilfe von 14C-Markiemgsexperimentenuntersucht. Aloin B wird von der
Pflanze aktiv synthetisiert, wahrend Isomer A sekundar durch Umwandlung aus B entsteht.
Futterungsversuche verschiedener 14C-Substratean Blattscheiben zeigten, daR 2-14C-Acetatbevorzugt in den Aglyconanteil des Aloins eingebaut wird, wahrend 14C-Glucose sowohl in den
C-gebundenen Zuckeranteil als auch in das Aglycon inkorporiert wird. Die Einbaurate laRt sich in
Anwesenheit von Aloeemodinanthron, dem hypothetischen C-Glucosyl-Acceptor, wesentlich
steigern.
Studies on the Biosynthesis of Aloins in Aloe Arborescens Mill.
The formation of the naturally occuring diastereomeric aloins A and B was investigated in Aloe
arborescens Mill. using 14C-labeledcompounds. Aloin B is actively synthesized by the plant and
transformed in part into aloin A. Feeding experiments with leaf disks proved the preferential
incorporation of 2-14C-acetateinto the aglycon moiety of aloin, while 14C-glucoseis incorporated into
the aglycon and sugar moieties. The rate of incorporation of 14C-glucoseincreases in the presence of
aloe emodin anthrone, which is considered to be the C-glucosyl acceptor.
Die laxierende Wirkung der offizinellen Aloe-Drogen (Axapensis Ph. Eur.; A. barbadensis Ph.
Eur.) beruht hauptsachlich auf dem Anthrachinonderivat Aloin (Barbaloin Ph. Eur.). Die
C-Glycosyl-Verbindung Aloin fallt bei der chemischen Synthese in zwei diastereomeren Formen A
und B an') und laRt sich auch aus Pflanzenmaterial und Droge als Isomerenpaar isolieren2).
Ausgehend von diesen Feststellungen untersuchten wir die Bildung der beiden Diastereomere A und
B in A.arborescens Mill. (Liliaceae) sowie deren Biogenese in vivo.
Untersuchungen zur Bildungsform des Aloins
Bei der HPLC-Analyse der Handelsdroge Aloe capensis Ph. Eur. I11 lassen sich die
Aloine A und B in annahernd gleicher Menge nachweisen (Abb. 1). Berucksichtigt man
die teilweise recht drastischen Bedingungen, die bei der Gewinnung der Droge Aloe zur
Anwendung gelangen, so stellt sich die Frage, ob beide Isomere in der Pflanze gebildet
** Herrn Prof. Dr. H . Oelschliiger zum 60. Geburtstag gewidmet.
0365-6233/82/03034231 $02.50/0
Q Verlag Chemie GmbH, Weinheim 1982
232
Griin und Franz
Arch. Pharm.
0,OL
6
Aloin
W
0 A
0.02
0
1
10
i?ma
t tminl
Abb. 1: HPLC-Trennung der Inhaltsstoffe von Aloe
capensis Ph. Eur. 111.
-'--
I
.
_
Reihenfolge
der Blatter
Abb. 2: RelativesVerhaltnis (a)
der Aloine A und B in Abhangigkeit der Blattentwicklungvon Aloe
arborescens. (1:jungstes Blatt; 20:altestes Blatt).
233
Biosynthese der Aloine
315182
werden. Das Auftreten beider Diastereomere laljt sich ja auch durch die nachgewiesene
Umwandlung von A + B bzw. B+A2), ausgehend von jeweils einer Verbindung der
beiden Isomere, erklaren.
Das relative Verhaltnis beider Aloine in methanolischen Extrakten des Frischsaftes
verschiedener Blatter einer A. arborescens-Pflanze wurde durch Vergleich der Peakflachen der HPLC-getrennten Substanzen A und B bestimmt. Abb. 2 zeigt die Variationen
des relativen Verhaltnisses des Isomerenpaares A und B in Blattern verschiedener
Entwicklungsstadien. In jungen Blattern liegt zu etwa 66 % die Form B vor, wahrend Aim
Laufe der Blattentwicklung stetig zunimmt. Altere Blatter weisen 53 % A und 47 % B am
Gesamtaloin auf.
Nach Inkubation von A.arborescens-Blattstuckchenmit 14C02ist Isomer B zu Beginn
eines feststellbaren 14C-Einbausin die Aloine um ein Vielfaches hoher markiert als A
(Abb. 3). Bei allen Markierungsversuchen mit verschiedenen 14C-Substraten- auch mit
Material von alteren Blattern - findet sich im Diastereomer B stets eine hohere spezifische
Radioaktivitat als in A. Da beide C-Glycosyl-Verbindungen in alteren Blattern in
annahernd gleicher Menge vorliegen, mulj das Auftreten von Isomer A durch
Umwandlung aus dem primar gebildeten Isomer B bis zu einem Gleichgewichtszustand
erklart werden.
Die gegenseitige Umwandlung von A B konnte enzymatisch oder nicht-enzymatisch
erfolgen. Es ist durchaus vorstellbar , dalj dies ohne Einwirkung von Enzymen unter
physiologischen Bedingungen geschieht. In Phosphatpuffer pH 4,8 wurde jeweils A bzw.
B gelost und nach Reaktion bei Raumtemperatur unter Lichtausschlulj zu verschiedenen
Zeiten analysiert (Abb. 4). Beide Diastereomere wandeln sich ineinander um, bis unter
diesen Reaktionsbedingungen nach ca. 6 Tagen ein Gleichgewichtszustand erreicht ist.
- - -
Licht Ounkel
c
0
Iph71631
10
20
30
40
50
75
100
Reuktionsdauer [ h I
Abb.3: Bildung von 14C-AloinA und B in Blattstuckchen von Aloe arborescens nach ''C02-Inkubation (2,5 h) und nachfolgender Kultur unter Normalbedingungen.
234
Arch. Pharm.
Griin und Franz
Emm
t
[ d l
Abb.4 Umwandlung der isomeren Aloine A und B in Phosphatpuffer (pH 4,8; 100 mM).
Untersuchungen zur Biogenese der Aloine in vivo
1. Um festzustellen, welche Substanzen als mogliche Vorstufen fur den Aglycon- bzw.
Zuckeranteil der Aloine wahrend deren Biosynthese gebraucht werden, wurden
verschiedene 14C-Substrate an Blattstuckchen von A.arborescens verfuttert. Von den
isolierten markierten Aloinen wurde jeweils das Isomer B mit FeCl,/HCl zu Aloeemodin
oxidativ abgebaut3).
Das Verhaltnis der spezifischen Radioaktivitat des erhaltenen Emodins (15 C-Atome)
zu der des zugehorigen Aloins B (21 C-Atome), ergibt bei statistischer Verteilung der
14C-Markierung im gesamten
Aloinmolekul
einen
theoretischen
Wert
x = 15 :21 = 0,71.
Bei Vergleich der Substrate I4CO2, Natrium-2-I4C-Acetat, ''C-Glucose und
UDP-'4C-Glucose ergibt sich fiir I4CO2ein solcher Wert nach 48 h Inkubation, wahrend
Natrium-2-14C-Acetatbevorzugt in den Aloeemodinanthronanteil des Aloins eingebaut
wurde (Tab. 1).Die Radioaktivitat aus markierter Glucose und Zuckernucleotid ist auf
Grund der durch die Inkubationsdauer bedingten Randomisierung nur unwesentlich mehr
in der Zuckerhalfte des Aloins zu finden.
2. Da eine gleichmaaige Applikation der interessierenden 14C-Substrate auf die
Schnittflachen von Blattstiickchen nur schwierig zu erreichen ist, wurde nach einem
geeigneten Medium gesucht ,aus dem Blattsegmente markierte Verbindungen aufnehmen
und umsetzen konnen. In 50 mM Phosphatpuffer pH 6,8 enthaltend 1mM Dithioerythrit,
ergibt sich ein zeitabhangiger 14C-Einbauaus 14C-Glucosein Aloin A und B bei konstanter
Temperatur und Dauerlicht (Abb. 5).
315182
235
Biosynthese der Aloine
Tab. 1: Vergleich der spezijkchen Radioaktivitdten in Aloin A und B resp. Aloeemodin nach Fiitterung
verschiedener 14C-Substrate an Blattscheiben von Aloe arborescens
. Einbau in
Aloin B
(A)
Idpm/clmoll
14-C-Substrate
48 h Inkubation
Aloeemodin
aus Aloin B
[dpml~moll
Verhaltnis der
spez. Radioaktivitat
von Aloeemodin:
Aloin B
14c02
7260
(1 820)
5400
0.74
l4C-Glucose
5860
3460
0,59
(1400)
UDP-U-14CGlucose
5290
(1210)
3140
0,59
Natrium-214C-Acetat
5710
(1840)
6070
1,06
10
.
.
0
-
0 0- L
5
iFmm
10
20
30
LO
Inkubationsdauer
Ih 1
Abb. 5: 14C-Glucose-Einbauin Aloin A und B (Blattscheiben in Phosphatpuffer pH 63).
3, Aus dieser Versuchsanordnung wahlten wir einen Bereich von 20 - 30 h
Inkubationsdauer fiir die folgenden Versuche, da nach dieser Zeit die Aloine einerseits
genugend spezifischeRadioaktivitat aufwiesen, andererseits die Zersetzung des Aloins im
Medium und den Blattstuckchen noch nicht zu weit fortgeschritten war.
Abb. 6 zeigt, welchen EinfluB die Parameter Dauerlicht/Dauerdunkel sowie der Zusatz
verschiedener potentieller Prakursoren f i r den Aglyconanteil auf den Einbau von 14Cin
Aloin A und B bei Futterung von 14C-Glucoseausuben.
236
Arch. Pharm.
Griin und Franz
10 MM
I-)
1,O MM
AEA:
0,052
TRITON X l O O
0 25dl
AEA
NA-ACETAT
0.05%
10 Mfl
1.0 MM
TRITON X 100
NA-ACETAT
(DUNKELKONTROLLE)
AEA
n
i
.-: : 2
=a
N
n
0
Emm
20/30h
30h
20/30h
30h
20/30h
0ALoin A
20/30h
30 h
BIII]I Aloin B
Abb.6: ''C-Glucose-Einbau in Aloin A und B (Blattscheiben in Phosphatpuffer pH 6,8) mit
verschiedenen Zusatzen im Inkubationsmedium (s. Angaben uber den Saulen). Die jeweilige
Inkubationsdauer ist unterhalb der Saulen angegeben. Die %-Wertein den Saulen beziehen sich auf
die gefundene Radioaktivitat in den Aloeemodinen nach Abbau des jeweiligen Aloin B (spezif.
Radioaktivitat Aloeemodin [dpdp moll: spezif. Radioaktivitat Aloin B [dpm/pmol]x 100 %).
Aus theoretischen Uberlegungen in Analogie zu4), war auf Grund des Substitutionsmusters in den Ringen A, B, C des Aloeemodinanthrons anzunehmen, dal3 dieses uber
den Acetat-Malonat-Weg mit einer hypothetischen Polyketosaure als Zwischenprodukt
synthetisiert wird. Im Medium mit 10mM Natriumacetat ist bei ''C-Glucosefiitterung
gegeniiber den Kontrollansatzen eine vermehrte Aloinmarkierung zu beobachten; im
Dauerdunkel ist dabei nach 30 h nur ca. 25 % des 14C-Einbausim Dauerlicht festzustellen .
Da Aloeemodinanthron (AEA) als moglicher C-Glucosyl-Acceptor f i r die Biogenese
des Aloins anzusehen ist, wurde untersucht, ob seine Anwesenheit in der Inkubationsfliissigkeit den Einbau von ''C-Glucose in die entsprechenden C-Glucosylanthrone
erhoht. Durch Ultraschall suspendiertes AEA bewirkte einen signifikant gesteigerten
Einbau von 14Cin die Aloine. Oberflachenaktives Triton x 100, das versuchsweise zur
Verbesserung der Loslichkeit des suspendierten A E A angewendet wurde, brachte keine
weitere wesentliche Steigerung der Einbaurate. Schon allein in 0,OSproz. Konzentration
im Puffer beeinfluBte es den 14C-Einbauinbeide Isomere. Die beobachtete Erhohung der
spezifischen Radioaktivitat von A und B laat sich nur durch unspezifische Effekte des
Detergens auf die Membranpermeabilitat erklaren.
4. Die Zugabe von AEA erhohte auch bei Futterung von Natri~m-2-'~C-Acetatdie
Markierung in den isolierten Aloinen.
315182
u5za
Biosynthese der AZoine
c]AloinA
0.256
1.0 14
AEA
AEA
AloinE
237
Abb. 7: 2-lOC-Acetat-Einbauin Aloin A und B (Blattscheiben in Phosphatpuffer pH 6,s) bei verschiedenen
Konz. von AEA im Inkubationsmedium. Inkubationszeit: 24 h.
Bei Konkurrenz der beiden Substrate Natrium-2-14C-Acetatund AEA um den Einbau
in die Aglyconhalfte der Aloine ist ein entgegengesetzter Effekt zu erwarten. Der Abbau
von Aloin B, das durch 14C-Glucosein Gegenwart von AEA markiert war, lieferte
Aloeemodine, die etwa ebensoviel Radioaktivitat enthielten wie die entsprechenden
0,25 Mfl 1,o Mfl
1.8-01 HYDROXY-9-ANTHRON
c
c
:0
.->
E
.-0
.o
2 3
S
0
._
0
c
I
w
Q
0
Abb. 8: 2-14C-Acetat-Einbauin Aloin A und B (Blattscheiben in Phosphatpuffer pH 6,s) bei verschiedenen
Konz. von 1,S-Dihydroxy-9-anthronim Inkubationsmedium. Inkubationszeit: 24 h.
238
Griin und Frant
Arch. Pharm.
Anthrachinone aus Aloin B der Kontrollversuche (Abb. 6). Bei Verbesserung des
14C-Einbausin die Aloine A und B in Gegenwart von exogenen AEA, das als moglicher
C-Glucosyl-Acceptorfungiert ,hatte der Aglyconanteil weniger Radioaktivitat aufweisen
miissen. Diese Befunde deuteten darauf hin, daB AEA die Inkorporation von 14Caus den
Substraten Glucose und Acetat in Aloin A und B im in vivo-System, zumindest teilweise,
auf Grund unbekannter Effekte verbessern kann.
5. Die oberpriifung dieser Vermutung ergab, daB auch das dem AEA entsprechende
unphysiologische Anthronderivat ohne 3-Hydroxymethyl-Gruppe (1,8-Dihydroxy-9-anthron) bei Zusatz im Inkubationspuffer ahnliche Auswirkungen zeigt (Abb. 8).
Durch das beschriebene in vivo-System waren keine naheren Aussagen uber die
Knupfung der C-C-Bindung im Aloin und die Rolle des AEA als moglicher C-Glucosyl-Acceptor zu gewinnen. Weitere Untersuchungen wurden rnit zellfreien Extrakten und
AEA durchgefiihrt, bei dem eine C-Glucosylierung mit dem Nucleosiddiphosphatzucker
UDP-Glucose erreicht werden konnte5).
Dem Fonds der Chemischen Industrie wird fur eine Sachspende gedankt.
Experhenteller Teil
I. HochdruckjWsigkeitschromatographie:
1.1 anatytische HPLC: Gerate: Knauer HPLC Pumpe 5200 mit Rheodyne Injektor 71-20 und
Detektor Varichrom bei 360nm.
1.1.1 stationare Phase: Hibar Fertigsaule Lichrosorb RP 18 7 pm 250x4 mm (E. Merck,
55 (v/v); Stromungsgeschwindigkeit: 2,O ml
Darmstadt); mobile Phase: Methanowasser, 45
min-I; Injektionsvol.: 20 pl 0,05% Droge Aloe cap. (Caelo) gelost in der mobilen Phase (fur
Abb. 1).
1.1.2 stationare Phase: Knauer Fertigsaule Lichrorsorb RP 18 10 pm 250x4,6 mm (Knauer KG,
Berlin); mobile Phase: MethanoyWasser, 42 + 58 (v/v); Stromungsgeschwindigkeit: 2,O ml min-’;
Injektionsvol.: 2 0 ~ (fur
1 Abb.2 und 4).
Die quantitative Auswertung der Chromatogramme erfolgte durch Berechnung der Peakflachen von
Aloin A und B (Hohe X Halbwertsbreite) sowie durch Auswerte-System Varian CDS 111
(Peakintegration).
1.2 halbpraparative HPLC: Gerate: Altex Pumpe 110 mit Rheodyne Injektor 71-25 und Detektor
LKB Uvicord S bei 254 nm; stationare Phase: Knauer halbpraparative Fertigsaule Lichrosorb RP
18 10 pm 250x8 mm (Knauer KG, Berlin); mobile Phase: MethanoYWasser, 3 7 3 + 62,5 (v/v);
Stromungsgeschwindigkeit: 6,0-6,5 ml min-I; Injektionsvol.: 200 p1.
+
2. Urnwandlung der Aloine in Phosphatpuffer
Ca. 1mg reines Aloin A oder B (Isolierungsvorschnft’))wurde jeweils in 10,Oml Natriumphosphatpuffer 100mM pH 4,8 gelost und unter Lichtausschlua bei Raumtemp. geruhrt. Zu verschiedenen
Zeiten wurde aus jedem Ansatz ein Aliquot von 1,Oml entnommen, rnit 9,Oml Wasser verdiinnt und
rnit 4 X 10 ml Ethylacetat ausgeschiittelt. Die vereinigten organischen Phasen wurden iiber Na2S0,
getrocknet, i. Vak. abgezogen und in 100-300 pl Methanol fur die HPLC-Untersuchung nach 1.1.2
aufgenommen.
315182
Biosynthese der Aloine
239
3. Bestimmung des relativen Verhaltnisses von Aloin A und B in verschiedenen Blattern von A .
arborescens.
Ca. 0,5 g Blattmaterial wurde in Scheiben geschnitten, der ausgetretene Saft mehrmals in Methanol
aufgenommen und nach 15 min Kuhlung im Eisfach (Ausflockung der hohermolekularen
Bestandteile) filtriert. Das Filtrat diente als Untersuchungslosung nach 1.1.2.
4. ''C-Markierungsexperi'mente
Pflanzenmaterial: Aloe arborescens Mill. Das Blattmaterial fur eine Versuchsreihe wurde jeweils
statistisch auf die einzelnen Versuchsansatze verteilt.
4.1 14C02-Puls-Markierung:Blattmaterial: 2 Blatter (3,79 g; 3,30 g); je 7 Blattscheiben 2-2,5 cm. Die
Blattabschnitte wurden ineinem Glaszylindermit Schliff (Hohe 8cm, 0 6 cm) aufgestelltund fur 2,5 h
bei 15000 Lux mit I4CO2inkubiert (Reaktion von 50 pCi NaH14C03und 1Tropfen Milchsaure nach
VerschlieBen des Standzylinders). Noch unverbrauchtes 14C02wurde durch Einblasen von Luft
vertrieben und die Inkubation im Licht-Dunkelrhythmus fortgesetzt (Abb. 3). Zu verschiedenen
Zeiten wurde je 1 Blattabschnitt von jedem Blatt nach 5. aufgearbeitet.
4.2 Inkubation von Blattscheiben: Blattmaterial: 2 Seitentriebe (1,98g mit 5 Blattern; 1,16g mit 3
Blattern); Blattscheiben 3-6 mm (4 Ansatze je 0,42452 g Blattmaterial). Die Blattscheiben wurden
auf einen Objekttrager in eine Petrischale mit angefeuchtetem Filterpapier gelegt bzw. in ein
Schliffwageglas(Hohe 2,5 cm, 0 2,5 cm) eingebracht. Die radioaktiven Substrate wurden in einem
Vol. von 50 pl(1 mM, 2,5 pCi) auf die Blattscheiben aufgetragen, die Petrischalen verschlossen und
im Licht/Dunkelrhythmus 48 h inkubiert. Ein Ansatz (Wageglas) wurde mit I4CO, aus 2,5 pCi
NaH14C03 ebenso lange inkubiert. Die Aufarbeitung der Blattstuckchen erfolgte nach 5.
(Tab. 1).
4.3 Inkubation von Blattscheiben in Phosphatpuffer
4.3.1 Zeitabhangiger 14C-Einbauaus 14C-Glucose:Blattmaterial: Seitentrieb (4,15 g mit 4 Blattern)
und 1Blatt (1,218); 2-4 mm lange Querschnitte (je Ansatz 0,48-0,51g). Die Blattstuckchen wurden
in 300 pl Inkubationsmedium in ein Wageglas (vgl. 4.2) eingebracht. Inkubationsmeaium: 50 mM
KH2POJK2HP04-Puffer pH 6,8, 1mM 1,4-Dithioerythrit (DTE) und 10mM Natriumacetat. Nach
Applikation von 5 pCi ''C-Glucose (5 pl, 1mM) wurden die Ansatze im Wasserbadschuttler bei
Dauerlicht (10000 Lux) und konstanter Temp. (32') inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten wurde
jeweils ein Ansatz nach 5 . aufgearbeitet (Abb. 5).
4.3.2 I4C-Einbauaus ''C-Glucose rnit verschiedenen Zusatzen im Medium: Blattmaterial: Seitentrieb (17,87g mit 7 Blattern) und 2 Blatter (0,23g; 1,53g); Querschnitte 4-8mm (je Ansatz
0,524,589). Inkubationspuffer: 495 pl50 mM NaHzP04/K,HP04-Puffer pH 6,8,2 mM DTE, 1mM
Glucose. Zugabe von 5 pl 14C-Glucose(5 pCi; 295 mCi/mmol); Inkubation 20 bzw. 30 h wie 4.3.1;
Dunkelkontrolle. Die angegebenen Zusatze wurden vorher im Puffer gelost bzw. mit Ultraschall fein
suspendiert (AEA). Aufarbeitung nach 5 . (Abb. 6).
4.3.3 14C-Einbauaus Natrium-2-I4C-Acetatmit AEA-Zusatz im Medium: Blattmaterial: Seitentrieb
(2,58gmit 5 Blattern) und2Blatter (0,52g;0,74g); (jeAnsatz0,414),44g).Inkubationspuffer: 480 pl
50mM NaH2P04/K2HP04-PufferpH 6,8, 2mM DTE, 1mM Glucose und 2mM Natriumacetat.
Zugabe von 20pl Natrium-2-14C-Acetat (5 pCi; 59 mCi/mmol); Inkubation wie 4.3.1 24 h.
Aufarbeitung nach 5 . (Abb. 7).
4.3.4 14C-Einbau aus Natri~m-2-'~C-Acetatrnit 1,8-Dihydroxy-9-anthron-Zusatzim Medium:
Blattmaterial: 3 Blatter (0,79g; 0,86g; 2,08g); (je Ansatz 0,51-0,53 9 ) . Inkubationspuffer: 480 pl
50mM NaHzPO4/K2HPO4-PufferpH6,8, 2mM DTE, 5mM Glucose und 1mM Natriumacetat.
Zugabe von 20pl Natrium-2-14C-Acetat (5 pCi; 59 mcitmmol). 1,8-Dihydroxy-9-anthron wurde
vorher im Medium durch Ultraschall suspendiert. Inkubation wie 4.3.1 24 h. Aufarbeitung nach 5 .
(Abb. 8).
240
Grun und Franz
Arch. Pharm.
5. Isolierung der markierten Aloine
Das Blattmaterial (je Ansatz zwischen 0,3-1,0g) und Inkubationsmedium wurden 5 min im
Omnimixer rnit 15 ml Methanol extrahiert. Der Methanolextrakt wurde i. Vak. abgezogen (T < 40°),
der verbliebene Riickstand in 10ml Wasser und 0,2ml 1N-HCI aufgenommen und rnit 4 X 12ml
Ethylacetat ausgeschiittelt.Die vereinigten Ethylacetatphasen wurden mit 10 ml Wasser gewaschen,
iiber Na2S04getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde abgezogen, der Ruckstand in 0,5 ml Methanol
aufgenommen und iiber eine Lichroprep RP 18 Saule vorgereinigt: 50 x 10mm; 0,8 g Lichroprep
RP18 25-40pm (E. Merck, Darmstadt), aquilibriert rnit Methanol. Die Aloine wurden rnit 2,5ml
Methanol eluiert, durch ein Membranfilter (Sartorius Type SM, PorengroBe 0,45, Format 25) filtriert
und i. Vak. vom Losungsmittel befreit. Der Riickstand wurde quantitativ in HPLC-Eluens
aufgenommen und nach 1.2 getrennt. Die Eluate von Aloin A und B wurden getrennt aufgefangen
und i. Vak. zur Trockne gebracht. Zur weiteren Reinigung von Aloin A und B wurden die
Riickstande mehrmals in Methanol aufgenommen und auf Alufolien Kieselgel 60 (E. Merck,
Darmstadt) bandformig 2,5-4,5 cm aufgetragen (Camag Linomat 111). Nach Entwicklung in den
Flieamitteln Ethylacetat/Methanol/Wasser,100 + 16,5 + 13,5 (v/v) bzw. ChlorofordMethanol, 60 +
40 (vIv), (Laufhohe 10-12cm) wurden die Aloinzonen bei 365 nm detektiert, ausgeschnitten und rnit
3-5 ml Methanol eluiert.
6. FeC131HC1-Abbau des Aloins und Isolierung des Aloeemodim
Der FeCI,/HCI-Abbau erfolgte nach’). Das Aloeemodin aus der CC14-Ausschuttelungdes Reaktionsansatzes wurde dc gereinigt. Hierzu wurden das Losungsmittel am Rotationsverdampfer
entfernt, die Riickstande in Aceton aufgenommenund auf Alufolien Kieselgel60 bandformig 7,5 cm
aufgetragen. Nach Entwicklung mit BenzoYMethanol, 90 + 10 (v/v), (Laufhohe 15cm) wurden die
Aloeemodinzonen bei 365 nm detektiert, ausgeschnitten und mit 5 ml Methanol eluiert.
7. Bestimmung der spezifuchen Radioaktivitat der isolierten Aloine und des Aloeemodins
7.1 AIoine: Der Gehalt der Methanoleluate an Aloin A bzw. B wurde spektrophotometrisch bei
360 nrn nach6)bestimmt. Die Radioaktivitat wurde in einem Aliquot nach Entfernung des Methanols
im Nz-Strom’in NaphthalidPPOIDioxan-Szintillator(100 g + 5 g/l) bestimmt (Packard Tri-Carb
Liquid Scintillation Spectrophotometer, Model 2405).
7.2 Aloeemodin: Die Gehaltsbestirnmungerfolgte nach’). Ein Aliquot der Methanoleluate (vgl. 6 )
wurde mit N, abgeblasen, in 1,OO oder 2,OOml N-NaOH aufgenommen und bei 500nm gegen
N-NaOH gemessen. Aus der El?, = 310 IaBt sich der Gehalt an Aloeemodin berechnen. Die
Radioaktivitat eines Aliquots wurde nach Entfernung des Methanols durch N, in PPOIPOPOPIToluol-Szintillator (5,O g + 0,5 g/l) bestimmt. Alle cpm-Werte wurden mittels geeigneter Quenchkurven
(Externe Standard-Kanal-Verhaltnis-Methode)
in dpm umgerechnet.
8. Chemikalien und Radiochemikalien
Alle Losungsmittel und Chemikalien p. A. (E. Merck, Darmstadt); Triton X 100 fur Szintillationsmessungen, 1,4-Dithioerythrit f. biochem. Zwecke (E. Merck, Darmstadt), UDP-Glucose Dinatriumsalz f. biochem. Zwecke (Boehringer, Mannheim); 1,8-Dihydroxy-9-anthronDithranola Bayer
umkrist. aus HexadToluol; AEA wurde nach der VorschriftE)hergestellt; Aloin SynochernQdiente
als Vergleichssubstanz; Aloeemodin wurde nach der Vorschrift9)gewonnen.
U-’4C-Glucose (295 rnCi/mmol), UDP-U-’4C-Glucose (240mCi/mmol), Natrium-2-I4C-Acetat
(59 mCilmmol) und NaHI4C03 (57,5 mCilmmo1) wurden von Amersham Buchier (Braunschweig)
bezogen.
315182
Lactone
24 1
Literatur
H. Auterhoff, E. Graf, G. Eurisch und M. Alexa, Arch.Pharm. (Weinheim) 313, 113 (1980).
M. Griin und G. Franz, Pharmazie 34, 669 (1979).
J. W. Fairbairn und S. Simic, J. Pharm. Pharmacol. 15, 325 (1963).
T.A. Geissman (Herausg.), Biosynthesis, Vol. 1, S.156, The Chemical Society, Burlington
House, London 1972.
M. Grun und G. Franz, in Vorbereitung.
H. Muhlemann und 0. Tatrai, Pharm.Acta Helv. 42, 717 (1967).
H. Bohme und K. Hartke, Europ. Arzneibuch, Bd. 111, Kommentar, S. 271, Wissenschaftliche
Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart 1979.
H. Bohme und J. Bertram, Arch.Pharm.Ber.Dtsch.Pharm.Ges.
288, 510 (1955).
Dissertation B. Ball, Wurzburg 1954.
[Ph420]
Arch. Pharm. (Weinheim) 315, 241-249 (1982)
Lactone, 1. Mitt.
Synthese dihydroxylierter Diphenylethylamine iiber
a-Amino-y -1actone
Jochen Lehmann*)
Pharmazeutisches Institut der Universitat Bonn, Kreuzbergweg 26, 5300 Bonn 1
Eingegangen am 24. Marz 1981
Die Umsetzung entsprechender a-Amino-y-lactone mit Phenyllithium fiihrt zu den 2-Amino-l,l-diphenyl-alkan-l,4-diolen
2a-f, die auch als dihydroxylierte Diphenylethylamine aufgefaat
werden konnen.
Lactones, i: Synthesis of Dihydroxylated Diphenylethanamines via a-Amino-y-iactones
Treatment of a-amino-y-lactoneswith phenyllithiumyields the 2-amino-1,l-diphenylalkane-1,4-diols
2a-f which can be classified as dihydroxylated diphenylethanamines.
Unter den zahlreichen Wirkstoffen vom Diarylalkylamin-Typ findet man auch
monohydroxylierte Vertreter mit Diphenylethylamin-Struktur,z.B. das zentrale Stimulans Pipradol und das Antitussivum Diphephanol.
Vergleichbare Diphenylethylamine mit zwei oder mehr Hydroxylgruppen sind unseres
Wissens bisher nicht in der Literatur beschrieben.
*)
Herrn Prof. Dr. H. Oelschldger zum 60.Geburtstag gewidmet.
0365-6233182103034?.?41 $02.5010
0 Verlag Chemie GmbH, Weinheim 1982
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