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Untersuchungen zur mammatumorhemmenden Wirkung von cis-BisglycylglycinethylesterplatinIIchlorid.

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314181
Mammatumorhemmende Wirkung von Pr(I1)-Komplexen
955
Arch. Pharm. (Weinheim) 314,955%7 (1981)
Untersuchungen zur mammatumorhemmenden Wirkung
von cis-Bis(glycylglycinethylester)platin(II)chlorid
Horst Seidenberger, Gerhard Kranzfelder, Beate Wappes und Helmut
Schbnenberger*)**)***)
Institut N r Pharmazie der Universitat Regensburg, Universitatsstralk 31, D-8400 Regensburg
Wolfgang Beck und Michael Girnth
Institut fur Anorganische Chemie der Universitat Miinchen, Meiserstrak 1, D-8OOO Munchen 2
Eingegangen am 5 . Februar 1981
cis-Diammin-platin(I1)chlorid(1) und cis-Bis(glycylglycinethylester)platin(II)chlorid (2) verunachen in vivo eine Hemmung des DMBA-induzierten, hormonabhangigen Marnmacarcinoms der
SD-Ratte. In vitro ist eine ausgepragte Wirkung auf die DNA-Synthese bei Marnmaturnorzellkulfeststellbar. Als Wirkungsursache
turen und eine Hemmung der 3H-~-Rezeptor-Wechselbeziehung
werden eine Bindung an die DNA und eine Hemmung des proliferationsstimulierenden Effekts
endogener Ostrogene durch Blockierung der Hormonrezeptoren diskutiert.
Studies on the Mammuy tom^ Inhibiting Effect of
ds.Dkhlorobis(glycyIglycinethyl#rter)pla~nm(ll)
In vivo, cis-dichlorodiammineplatinurn(I1) (1) and cis-dichlorobis(g1ycylglycinethylester)platinum(I1) (2) inhibit the DMBA-induced hormone dependent mammary carcinoma of the SD rat. In
vitro, a marked effect on the DNA synthesis of mammary tumor cells and an inhibition of the 'H-E,
receptor interaction can be. demonstrated. A binding to DNA and an inhibition of the proliferation
stimulating effect of endogenous estrogens by blocking the hormone receptors are discussed as modes
of action.
Untersuchungen iiber antineoplastische cb-[PtA,X,]-Komplexe (A: Aminligand, X:
anionischer Ligand) mit a-Aminosauren oder Oligopeptiden als Carrierligand A fiihrten
zur Auffindung der neuen Antitumorverbindung cis-Pt(GlyGlyOEt),C1, (2)12),
fiir die wir
im Vergleich zu cis-Diammin-platin(1I)chlorid (1) eine verstarkte Aufnahme durch
Tumonellen nachweisen konnten3).
c1,
,NHS
/TNHs
C1
1
C1, HZN-CHZ-CO-NH-CH2-COOEt
,Pf:
C1
H2N-CHz-CO-NH-CH2-COOEt
2
--
** H e m Professor Dr. H. Oelschlliger zum 60.Geburtstag gewidmet.
*** Der Wilhelm Sander-Stiftung danken wir fur die Forderung dieser Untersuchungen.
03656233/81/1111-0955S U2.sM)
6 Vcrlag Chemie GmbH, Weinheim 1981
956
Scbnenberger u. Mitarb.
Arch. Pharm.
In dieser Arbeit wird uber die Wirkung von 1 und 2 am DMBA-induzierten,
hormonabhtingigen Mammacarcinom der SD-Ratte und uber wirkungsmechanistische
Untersuchungen berichtet.
Tab. I:Hemmung des DMBA-induzierten hormonabhangigen Mammacarcinoms der SD-Ratte durch
1und2
Doria
Verb.
Nr.
mdkg
Tumor
uhl
X)
(-
Tierznhl
Tiagcwichtr
F n d e r u m in %
Wikung
100%)
VT
nxx) %
TT
n
%
TumorflachcnPndrmn~in %
NT
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n
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n
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10
40xxx)
10
4OxXx)
+11.0
+I00
+416.6
~~
-
Kom
10
27
2
1
3,7
24
88.9
3
11.1
+2.0
4+4
10
10
24
29
I1
3
45 8 10
10.4 17
41.7
58.6
3
9
12.5
-
-
-7.5
-
4.0
- 24.0
-45,s
31.0
+l.O
+
6.5
+ 10.0
+ 79.0
60+60
10
29
40+40
10
31
12
2
41.4
6.5
51.7
58,O
2
6.9
+2.5
+ 1.0
+ 7.5
- 20,2
35.5
-
-2.5
11
- 50,4
+ 90.5
7.4
trolle
I
6t6
I
15
18
~
-
+ 20.5
ip. Applikation, Versuchstag 0 und 24 (wal3r. Us.);
n: Anzahl der beeinflu6ten bzw.
nichtbeeinflusten Tumore; ’”) Mittelwert am 10. bzw. 40.Versuchstag.
x,
600
500
0)
r
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m
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0
400
5
c
,300
d
0 7
L
5200
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:5
loo
s.
0
-100
10
0
20
30
50
40
60
Tage
15
Abb.1: DMBA-induziertes, hor10
5
0
-5
10
n
[IhlzI;D-
1
0
m
3 .. 0
Tage
4
o
%
m
._
monabhangiges Mammacarcinom
der SD-Ratte. Beeinflussung der
Tumorflache und des KGrpergewichts bei Behandlung mit 1
Therapie: x-x-x:
6 m g / k g Versuchstag
0 und 24;
Therapie: 0-0-0: 4 mg/kg Versuchstag
0 und 24:
Therapie: * - 0 - 0 : Kontrolle;
Mammaturnorhemmende Wirkung von Pt(I1)-Komplexen
314181
957
Obereinstimmend mit den Ergebnissen von Wehch'' wird unter der Therapie mit 1die
Ausgangsflache und Zahl der Mammatumoren merklich vemngert (Abb. 1, Tab. 1). Die
damit verbundene, zeitlich begrenzte Abnahme des Korpergewichts der Versuchstiere
deutet auf toxische Nebenwirkungen von 1 im wirksamen Dosisbereich hin.
Vergleichbare Effekte konnten mit 2 am hormonabhangigen Mammacarcinom erst bei
Applikation der 10fachen Dosis erzielt werden (Abb. 2, Tab. 1). Dagegen waren die
Gewichte der mit 2 therapierten Tiere gegenuber denen der Kontrolltiere nur wenig
erniedrigt. Wiederholungsexperimente rnit 2 unter Verwendung veranderter Versuchsbedingungen und eines hohere Tumorausbeuten liefernden SD-Stammes') ergaben eine
geringere Beeinflussung des Tumorwachstums** * *).
11.1
Wiederholungsversuch 1mit Verb. Nr. 2 - Applikation: je 80 mgkg sc- Versuchstag 1und 14.
Tierzahl: Therapie und Kontrolle je 8 Tiere; %-Anderung der Tumorflache und Totalremission bei
x/y Tumoren Versuchstag 28: 246 % (Kontrolle 638 %, s.p. < 0.05), 5/42 = 12 %.
Wiederholungsversuch 2 mit Verb. Nr. 2- Applikation: je 30 mgkg sc- Versuchstage 1- 5 ; Tierzahl:
Therapie und Kontrolle je 5 Tiere; %-Anderung der Tumorflache und Totalremission bei x/y
Tumoren - Versuchstag 28: 234 % (Kontrolle 485 %, ns. p > 0.05), 2/27 = 7 %.
-
-100I
0
I
1 0
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I
0
I
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1
Tage
4
0
5
0
6
Abb. 2 DMBA-induziertes, hormonabhangiges
Mammacarcinom
der SD-Ratte. Beeinflussung der
Tumorflache und des KBrpergewichts bei Behandlung mit 2
Therapie: x-x-x:
60 mgkg
Versuchstag
0 und 24;
Therapie: 0-0-0: 40 mg/kg
Versuchstag
0
0 und 24;
Therapie: o-o-o:
Kontrolle
958
Schonenberger u. Mitarb.
Arch. Pharm.
Tab.2: Hemmung der DNA-, RNA- und Proteinbwsynthese des DMBA-induzierten hormonabhangigen Mammacarcinoms der S D - R a d in vitro durch 1 und 2
Verb. Nr. Konzentration
(moU1)
% Hemmung
ED^^- x 10-7
* * E D ~ * 10-7
*x
DNA
1
i,o x 1 0 4
3.3 x 10-5
i,o x 10-5
3,3 x 10-6
3,3 x 10-7
98,4 f 2,2
95,s f 2,6
86,2 f 3,8
74,9 i 4,l
39.5 f 2,o
7-0
150
2
1.0 x
i,7 x
i,o x
1,7 x
i,7 x
104
10-5
10-5
10-6
10-7
96,l f 6,2
88,l f 3,4
81,9 t 3.2
5 6 3 f 2,9
23.1 t 2,2
11
260
1
i,o x
3,3 x
i,o x
3,3 x
3,3 x
104
10-5
10-5
10-6
10-7
RNA
76,4 f 4,O
65,s f 2,9
50,8 f 2,4
31,3 t 3,2
14,2 t 1,8
2
1.0 x
1,7 x
i,o x
1,7 x
i,7 x
104
10-5
10-5
10-6
10-7
71,s f
48,3 f
39,s f
18,O f
4,6 f
1
i,o x 1 0 4
10-5
10-5
10-6
10-7
Protein
64,s f 3 3
55,s f 2,8
44,2 f 2,9
37,l f 1.9
21,s 3 2,2
i,o x 1 0 4
I , ~ X10-5
i,o x 10-5
1,7 x 10-6
i,7 x 10-7
61.5 f 2,4
50.2 f 4,l
44.5 t 3,7
34.6 t 2,s
21,s f 1,9
3,3 x
1.0 x
3,3 x
3,3 x
2
3,7
3,8
3,8
1,s
1,2
97
5 200
220
7100
1500
74000
1700
330000
+) Eine dreistundige Vorinkubationvon Mammacarcinomzellsuspensionrnit E2(
moM) erh6hte
die DNA-Synthese (2 h-Inkubation mit 3H-Thymidin)signifikanturn 45 % gegenuber der Kontrolle.
Die gleichzeitigeAnwesenheit von NafoxididR)( l e 6 . ’moVI) hob den stimulierenden Effekt von &
praktisch auf (5 ISteigerung der DNA-Synthese, n.s.). Lippman und Bo&n6)konnten bei der
MCF-7-Mammacarcinom-Zcllkultur
ebenfalls eine Steigcrung der DNA-Synthese durch & (10-8
moM) feststellen.
l @ s s
959
Mnmmnrumorhemrnende Wirkung von Pt(II)-Kornplexen
314181
An Zellsuspensionen des DMBA-induzierten, hormonabhangigen Mammacarcinoms
der SD-Ratte ist unter Einwirkung von 1 und 2 eine starke dosisabhangige Hemmung des
'H-Thymidin-Einbaus in die saurefallbare Fraktion feststellbar. Die RNA- und Proteinsynthese wird im Gegensatz zur DNA-Synthese vergleichsweise wenig beeinfluot (Tab. 2).
Diese fiir 1 (allerdings bei anderen Tumorzellkulturen) schon friiher beschriebene
spezifische DNA-Synthese-Hemmung wird als mogliche Ursache der Antitumorwirkung
von cis-[PtA,X2]-Komplexen angesehen (vgl.')).
Tab.3: Hemmung der DNA-Synthese der hormonunabhangigen menschlichen MDA-Mammatumor-Zellinie in vitro durch 1 und 2
~~
% Hemmung
"EDSO"(mol/l)
1 x 10-5
10-6
10-6
10-7
10-7
88,7 * 0,4
85,2 f 1,6
54,6 i 8,6
35,4 f 5,0
10.5 2 11,o
a,o x 10-7
5x
1x
5x
1x
1 x 10-4
10-5
1 x 10-5
s x 10-5
1 x 10-6
91,7 i 0,4
87,l f 1,8
3 9 3 i 2,7
15,9 i 10.0
8,5 i 7,8
i,45 x 10-5
Verb. Nr. Konzentration
(mol/l)
1
2
s
~
Mammatumorhemmende Eigenschaften konnten fiir 1 und 2 auch an der hormonunabhangigen menschlichen MDA-Mammatumor-Zellinie nachgewiesen werden (Tab. 3). Bei
diesen Versuchen waren zur Erzielung vergleichbarer Effekte auf die DNA-Synthese von
2 jedoch hohere Konzentrationen erforderlich. Als Ursache der starkeren Wirkung gegen
hormonabhangige Mammatumorzellen diskutieren wir eine Hemmung des proliferationsstimulierenden Effekts endogener Ostrogene.
Ein solcher Eingriff in den Stoffwechsel des hormonabhangigen Mammacarcinoms wird fur die
tumorhemmende Wirkung von Antiostrogenen verantwortlich gemacht". Nachgewiesen wurde eine
Hemmung der &-Rezeptor-Wechselbeziehung. Die am Beispiel homologer 1.2-DialkyL1,2-bis(3'-hydroxyphenyl)cthane fur Antihtrogene festgestellte Korrelation zwischen Affinitat
zum 5-Rezeptor und Wirkung am hormonabhangigen Mammacarcinom favorisiert diesen Eingriff
als molekularen Wirkungsmechanismus".
Nach Vatnetsova et aL9)ist die Hormonabhangigkeit des Mammacarcinoms der Ratte dem %-Anteil
an freien, reaktiven SH-Gruppierungen im Tumorhomogenat direkt proportional. Die Anwesenheit
von freien SH-Gruppen im Rezeptorprotein scheint eine wesentliche Voraussetzung fur die
Rezeptorbindung der Ostrogene zu sein; darauf weisen in vitro-Versuche verschiedener Arbeitskreise hin'""). So verhindert die Behandlung von Uterusgewebe mit SH-Blockern vor der &-Exposition
die spezifische Hormonaufnahme, umgekehrt verursachen diese Verbindungen bei in vitro und in
vivo mit E, vorbehandelten Uteri eine rapide Freigabe des Hormons'"). Thiol-blockierende
Verbindungen wie pChlormercuribenzoat oder N-Athylmaleinimid hemmen auch die &-Rezeptor-Wechselbeziehung im Mammagewebe'J1. Gardener und Wirrliff6)zeigten durch Saccharose-Dich-
9M
Arch. Pharm.
Schonenberner u. Mitarb.
tegradientenzentrifugation. daB die Inkubation mit p-Chlormercuribenzoat die Menge spezifisch
gebundenen 3H Ez am cytoplasmatischen Ostradiolrezeptor des DMBA-induzierten Mammacarcinoms und der laktierenden Mamma von Ratten reduziert. 4-Mercuri-17a-Ostradi01, ein ,,affinity
labeling steroid", verursacht im Vergleich zum Antiostrogen 17a-Ostradiol nach intraluminaler
Applikation in den Uterus kastrierter Ratten und anschlieBender intrauteriner Gabe von & eine
gleich starke, aber vermutlich auf Grund der irreversiblen Inhibitor-Rezeptor-Bindung erheblich
langere antiostrogene Wirkung").
-
Es ist denkbar, daB auch cis-[RA,X,]-Komplexe, die zu einer Reaktion mit
SH-Verbindungen befahigt sind, die E,-Rezeptor-Wechselbeziehungantagonisieren und
durch diesen und andere Eingriffe in den Stoffwechsel der hormonabhangigen Mammaturnorzelle (z. B. Angriff an der DNA) proliferationshemmend wirken.
Urn diese Vorgange abzuklaren, untersuchten wir unter Verwendung von Kalbsuteruscytosol als Rezeptorquelle die Kinetik der 3H-E,-Rezeptorbindung unter der Einwirkung
der Platinkoordinationskomplexe 1und 2 (Abb. 3, 4, 6 und 7). Solche Untersuchungen
wurden bisher mit cis-(PtA,X,]-Komplexen nicht durchgefiihrt, obwohl ausgepragte
Wirkungen an verschiedenen hormonabhangigen Geschwiilsten beschrieben ~ i n d ' ~ . ' ~ ) .
m
I
1
60
40
0
Abb. 3: Hemmung der Ostradiol-Rezeptor-Wechselbeziehungdurch 1
Lineweaver-Burk-Diagramm;
Substrat: 'H-E2. Rezeptorquelle: Kalbsuterus;
Inkubationsdauer: 20 h bei 2"; Hemmstoffkonzentration: 1 5 x 10-4 mol/l, 1' 5 x lO-' moyl;
Abszisse:
Ordinate:
I
freies 3H-E?
1
gebundenes 3H-E2
961
Mammatumorhemmende Wirkung von Pt(I1)-Komplexen
314/81
80
1
I
t
Abb. 4: Hemmung der 6stradiol-Rezeptor-Wechselbeziehungdurch 2
Lineweaver-Burk-Diagrarnm;
Substrat: 3H-E2; Rezeptorquelle: Kalbsuterus;
Inkubationsdauer: 20 h bei 2”; Hemmstoffkonzentration: 2 5 x 10-4 moV1; 2’ 5 x lo-’ mol/l:
Abszisse:
Ordinate:
1
freies 3H-Ez
1
gebundenes 3H-Ez
Es ist anzunehmen, daO cis-[PtA2X2]-Kornplexe auf Grund ihres Reaktionsverhaltens unter
physiologischen Bedingungen weitgehend irreversibel an freie SH-Gruppen der htradiolrezeptoren
gebunden werden und d d die gebildeten PtA,-Rezeptorkomplexe nicht mehr zur Bindung von
E2-Molekiilen befahigt sind. Die Kinetik der 3H-E2-Rezeptor-Wechselbeziehungunter
cis-[PtAzX2]-Einwirkungmii6te daher derjenigen bei Anwesenheit eines bekannten irreversiblen
SH-Blockers wie N-Athylmaleinimid oder N-Bromsuccinimid entsprechen. Bei Venvendung eines
Inhibitoruberschusses und bei ausreichend langer lnkubationsdauer sollte ein irreversibel blockierendes SH-Reagens eine annahernd 100proz. Hemmung der Ez-Rezeptor-Bindung verursachen”’:
bei unvollstandigem Umsatz sollte die Kinetik dem nichtkompetitiven Hemmtyp enzymatischer
Reaktionen entsprechen2”’ * * *).
Die Beeinflussung der 3H-E2-Rezeptor-Wechselbeziehung
durch 1 und 2 wurde bei Inhibitorkonzentrationen von 5.0 x 10-4 mol/l und 5.0 x lo-’ mol/l untersucht (Abb. 3 und 4). Zu
Vergleichszwecken wurden analoge Untersuchungen mit N-Bromsuccinirnid (3, Inhibitorkonzentra-
* * * * * Nach Rodbardz2’wird bei unvollstandiger Gleichgewichtseinstellung keine Abweichung von
der Linearitat im Scatchard plot beobachtet; die scheinbare Affinitatskonstante des Inhibitors ist
stark erniedrigt.
962
Schdnenberger u. Mitarb.
1 1
T'X.
108)
mm
Arch. Pharm.
-
AM.5: Hemmung der Ostradiol-Rezeptor-Wechselbeziehungdurch N-Brbmsuccinimid (3)
Lineweaver-Burk-Diagramm:
Substrat: 3H-E2;Rezeptorquelle: Kalbsuterus;
Inkubationsdauer: 20 h bei 2"; Hemmstoffkonzentration. 3 5 x l@ moUl;
Abszisse:
1
freies 3H-Ez
Ordinate:
1
gebundenes 3H-Ez
mom) durchgefiihrt (Abb. 5 ) . ErwartungsgemiiS wird die Kinetik der 'H-J+Rezep
tor-Wechselbeziehung durch 1 und 2 in der gleichen Art beeinfldt wie durch den irreversiblen
SH-Blocker N-Bromsuccinimid(3). Unter 1-,2- und 3-Einwirkung wird die Dissoziationskonstante
des %-&-Rezeptor-Komplexes (K',: 1: 4,29 f 0,4 x I@'', bzw. 4,18 ? 0,6 x lo-''; 2: 434 f 0,8 x
lo-'', bzw. 4,41 5 0,7 x lo-''; 3: 4.24 f 0,7 x lo-''; &: & = 4,20 f 0,4 x 10-'0) nicht verandert, die
&-Bindungskapazitat (4) des vorgelegten Cytosols jedoch gleichzeitig stark reduziert.
tion 5,O x 1@
Die Lineweaver-Burk-Darstellung der Mekgebnisse ergibt Kurvenverlaufe, die
einem nichtkompetitiven Hemmtyp in der Enzymkinetik entsprechen (Abb. 3-5). Die
Erzielung variabler q-Werte bei konstantem K', erklart sich mit der Inaktivierung eines
Teils der Rezeptormolekule. Durch die Reaktion der Inhibitormolekule mit den
SH-Gruppen der Rezeptormolekiile werden die letzteren so veriindert, daI3 sie nicht mehr
zu einer Bindung von E,-Molekulen befahigt sind. Die E,-Bindungskinetik der
verbleibenden Rezeptormolekiile wird durch die inaktiven Rezeptoren nicht beeinflufit
(konst. K'J, die Zahl an bindungsftihigen Rezeptoren (4)nimmt aber naturgemaD ab,
woraus schliefllich ein Lineweaver-Burk-Diagamm resultiert, das dem der nichtkompetitiven Hemmung bei enzymatischen Reaktionen entspricht.
Mammatumorhemmende Wirkunn von PI(I1)-Kornvlexen
314181
963
a
Abb. 6 Reversibilitat der Rezeptor-Bindung von 1, 2 und 3
Rezeptorquelle: Kalbsuterus; 0: Kontrolle;
3H-&-Konzentration: 5,O x l@ mom;
Inhibitorkonzentration: 5,O x lV5moV1;
( ): %-Anteil Inhibitor-Rezeptorkomplex
a. : Inkubation mit Inhibitor, 60 min bei 0";
a. : Inkubation mit 3H-E2,145 rnin bei 0";
b. : Inkubation mit Inhibitor, 60 rnin bei 00;
b. : Entfernung des nichtgebundenen Inhibitors;
b. : Inkubation mit 3H-E260 min bei 0", anschl. 25 rnin bei 25" und 60 rnin bei 0";
Abszisse: Nummem der Verbindungen;
Ordinate: %-Anteil 5-Rezeptor-Komplex;
Die %-Angaben sind Mittelwerte aus zwei unabhangigen Versuchen mit je drei Werten pro
Inhibitorkonzentration.
Da die fiir irreversible SH-Blocker zu fordernde 100proz. Hemmung trotz der grol3en
Inhibitorkonzentrationenunter den gewahlten Versuchsbedingungen nicht zu beobachten
war, wurden Reversibilitatsversuche unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens
nach Rochefort und Capony') unternommen (Abb. 6 und 7).
Aus Abb. 6 ergibt sich, daf3 sich alle drei Verbindungen praktisch irreversibel an den
Rezeptor binden. In einem Paralleltest wurde die Reversibilitat der Rezeptorbindung von
1 und 2 im Langzeitinkubationstest bestimrnt; die Ergebnisse (Abb. 7) sind praktisch
Schonenberner u. Mirarb.
964
-
74
100 -00
4
A
4
Arch. Pharm.
0
.U
2
I
'i 3 5 - g
Ln
50
w
c
U
3
n
01
m
0.''
Abb. 7: Langzeitinkubation zur Bestimmung der Reversibilitat der Ostradiolrezeptor-Inhibitorbindung
I
I
Tab. 4 EinfluD von 1 und 2 auf das Wachstum E,-stimulierrer Ureri juveniler Mause.
Nr.
Dosis
pro Tier
El
0.3 2 figX)
Verb.
Losungsrnittel
1
2
x,
'Ix)
Tienahl
8 mg+)
2 mg
80 rng
20 mg
Wirkungxx)
% Hemmungxxx)
11.7 i 1,l
14.1 i 1.7
38,s i 2,9
10,9i 1,5
-
12,8 *
14.9 i
13,2i
12,4i
30.1 i
36,2 i
28,2 i
35,O r
Korpergewicht
(g)
10
10
10
10
10
10
0.9
1.5
1,6
1,2
2,7
3,6
2,4
1,9
30,4*)
8,4*+)
35,4++)
12,7++)
Gesamtdosis pro Tier und Versuch;
Uterustrockengewicht (mg)
Korpergewicht (9)
x 100;
xxx)
% Hemmung = 100
)
- ( w s , ~ w o100
(Ws-Wo)
Ws = Wirkung El-Standard; W,,
= Wirkung des Standards bei gleichzeitiger Gabe der
Testsubstanz; W, = Wirkung des LLisunmnittels. +) Dosis in mdkg pro Tag; ++) signifikant
(P<O,OS); +++) nicht signifikant (P 0,OS).
314181
Mammarumorhemmende Wirkung von Pt(l1)-Komplexen
965
Die Platinkoordinationskomplexe 1 und 2 wurden auch auf eine mogliche ostrogenantagonistische Wirkung in vivo gepriift. Beide Verbindungen hemmen in hoher Dosierung
das E,-stimulierte Uteruswachstum juveniler Mause (Tab. 4).
Dabei ist neben einer Inaktivierung von E,-Rezeptoren eine Beteiligung cytotoxischer
(d. h. allgemein wachstumshemmender)Effekte an der antiuterotropen Wirkung von 1
und 2 nicht auszuschlieflen.
Die Antitumorwirkung der cis-[PtA2X2]-Kornplexewird auf Grund wirkungsmechanistischer UntersuchungenZ8)durch eine selektive Hemmung der DNA-Synthese hervorgerufen. Neueren U n t e r s u c h ~ n g e n ~an
~ ~Bakteriophagen
’’
DNA (PM- 2 DNA) zufolge
werden Platin(I1)-Koordinationskomplexeunter Eliminierung der Abgangsgruppe bevorzugt an Guaninbasen der DNA gebunden. Dieser Vorgang ist von einer lokalen
Denaturierung der Helix und ,,micro-loop“-Bildung begleitet. Beim hormonabhangigen
Mammacarcinom wird dieser Vorgang wahrscheinlich durch eine Hemmung der
E,-Rezeptor-Wechselbeziehung verstarkt.
Experhenteller Teil
Prufung am DMBA-induzierten, hormonabhangigen Mammacarcinom der SD-Ratte
Weiblichen SD-Ratten eigener Zucht (Tierdiat: Altromin R, Wasser ad libitum) werden am 50., 53.
und 56. Lebenstag jeweils 2 mg DMBA in 0.05 ml DMSO gelost in die Schwanzvene appliziert”’. Das
Auftreten der Tumoren wird durch wochentiiches Abtasten der Tiere verfolgt. Fur die Therapie
werden Versuchstiere verwendot, die zwischen dem 50. und 120. Tag nach der DMBA-Applikation
Tumore mit einer Mindestflache von 140 mm2 aufweisen (ca. 50 % der Versuchstiere). Die
Tumorflache wird mittels einer modifizierten Schublehre percutan gemessen und ergibt sich aus dem
groeten und kleinsten Durchmesser der Ge~chwulst’~’.
Die Versuchsgruppen werden so zusammengestellt, dal3 die Tumore bezuglich Ausgangsflache (1900 bis 2400 mm2/10 Tiere) und Alter
annahernd vergleichbar sind.
Zur Beurteilung der Tumorhemmung werden folgende Kriterien gewahlt:
1. Das Wachstumsverhalten der Tumore von Behandlungs- und Kontrollgruppe
a) Tumore, die sich wahrend der Behandlung vollig zuriickbilden (VH = vollige Hemmung)
b) Tumore, deren Flache wahrend des Versuchs kleiner wurde oder keine Veranderungzeigte (TH =
teilweisc Hemmung)
c) Tumore ohne offensichtliche Wachstumshemmung (KH = keine Hemmung)
d) Tumore, die wahrend des Versuchs neu auftreten (NT = neu auftretende Tumore)
2. Die Mittelwerte der prozentualen Tumorflachenanderung aller Tiere einer Versuchsgruppe am
Versuchsende gegeniiber der Tumorflache zu Therapiebeginn, berechnet nach
Tumorflache - Versuchsende
Tumorflache - Therapiebeginn
-
Hemmung der DNA-, RNA- und Proteinsynihese des DMBA-induzierten, hormonabhangigen
Mammacarcinoms der SD-Raite in vitro”.
Fur die Herstellung der Zellsuspension aus soliden Tumoren wurden abweichend von der in ”
angegebenen Vorschrift als Spaltenzyme Collagenase (ca. 40 Ulml. 0,Zproz. Losung) und Pronase
(ca. 90U/ml, 0,Zproz. Losung) verwendet. Die Ausbeute an Zellen pro g Feuchtgewebe betrapt 2 1 2 7
x 106.
966
Schdnenberger u. Mitarb.
Arch. Pharm.
Hemmung der DNA-Synrhese der hormonunabhangigen, menschlichen
MDA-MB231-Mammatumor Zellinie.
Die Versuchsanordnung entspricht der von Lippman, Monaco und Bolan') fiir die MCF-7 Zellinie
beschriebenen. Als Nahrmedium wurde wlhrend des ganzen Versuchs McCoy 5a mit einem Zusatz
von 5 % ,,newborn calf serum" und Gentamycin (40 @ml) venvendet.
Hemmung der 3H-E2-Rezeptor-Wechselbeziehung in vitro (,, Dextran Coated
Charcoal-Methode")3ss'
Besrimmung der Reversibilitat der Rezeptor-Inhibitor-Bindung
a) ,,hot chase"-Verfahren").
b) Langzeitinkubation
Je 0,s ml Kalbsuteruscytosolwerden mit 0.2 ml HemmstofflBsung (Endkonzentration in 1bzw. 2 5 x
lW5moM) bzw. mit 0,2 ml Tris-Puffer (pH 7 3 , Kontrolle) 3 h bei 4" inkubiert. Anschlieknd werden
beide Ansatze mit 0,s ml Kohlesuspension bei 4" 20 min behandelt, die Kohlepartikel abzentrifugiert
(SO00 Upm, 4", 3 min) und die Ubersthde bei 4" aufbewahrt. Aus den Inkubationsansltzen werden
jeweils 100pLAliquotsnach 0,1,8,18 und 28 h entnommen und 3 h mit 3H-Ez(Endkonzentration 5 x
l@ moM) inkubiert. Mit Kohlesuspension wird das iiberschiissige3H-& entfernt und das gebundene
'H-E2 nach Zugabe von 10 ml Szintillationsfliissigkeit(5,O g PPO, 0,3 g Dimethyl-POPOP, 400 ml
Triton X 100, 600 ml Toluol) im Beckman-Szintillationszahler LS 133 bestimmt.
Priifing auf antiuterotrope Wirkun$'
A bkdrzungen:
DMBA: 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen;SD-Ratte: Sprague-Dawley Ratte; El:
17fLOstradiol;DMSO: Dimethylsulfoxid.
Ostron;
&:
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[Ph 3751
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