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Der Zeitverlauf der Bindung und Wirkung von Dexetimid an Herzvorhofgewebe unter dem Einflu╤Я der Schlagfrequenz.

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Archiv der Pharrnazie
313. Band
August 1980
Heft 8
Arch. Pharm. (Weinheim) 313, 657-667 (1980)
Der Zeitverlauf der Bindung und Wirkung von Dexetimid an
Herzvorhofgewebe unter dem EinfluB der Schlagfrequenz.
Heinz Liillmann, Gert-Hinrich Reill), Pieter B.M.W.M. Timmermansz) und Albrecht
Ziegler *
Abteilung fur Pharmakologie im Klinikum der Christian- Albrechts-Universitat, HospitalstraRe 4-6,
2300 Kiel
Eingegangen am 24. September 1979
An isolierten Herzvorhofpraparaten des Meerschweinchens wurde sowohl das Einsetzen und das
Abklingen der Wirkung des Parasympatholyticums Dexetimid wie auch die Bindung und Freigabe
dieser Substanz durch das Gewebe bei verschiedenen Schlagfrequenzen untersucht. Der pA2-Wert als
MaS fur die Wirkstarke eines Antagonisten envies sich als von der Schlagfrequenz unabhangig. Bei
rhythmisch kontrahierenden Muskeln erfolgte die Bindung rascher und in einem groReren AusrnaRe
als bei ruhenden Vorhofpraparaten. Bei hoheren Erregungsfrequenzen bildete sich der pharmakologische Effekt rascher aus. Die verrnehrte mechanische Aktivitat des Gewebes wird als Ursache des
beschleunigten und vermehrten Stofftransportes diskutiert.
The Influence of the Beat Frequency on the Time Course of Drug Binding and Pharmacological
Action of Dexetimide in Atrial Muscle.
In isolated guinea pig auricles, the onset and the decline of the antimuscarinic action of dexetimide as
well as binding and release of the compound by the tissue were studied as functions of the beat frequency.
ThepA, value proved to be independent of thebeat frequency. Incomparison toquiescent muscles,the rate
of drug binding and the extent of drug accumulation were found to be increased in beating preparations.
At higher driving frequencies the development of the pharmacological effect was accelerated. The
facilitated and enhanced drug transport is considered to be the consequence of the increased mechanical
activity of the tissue.
Die GesetzmaRigkeiten des Zusammenhanges zwischen der chemischen Struktur und der
biologischen Wirkung zu erkennen, ist eine der Voraussetzungen fur die Entwicklung neuer
interessanter Wirkstoffe. Urn diese GesetzmaSigkeiten aufzudecken, wird versucht, ein oder mehrere
Derzeitige Adresse: Abteilung Kardiologie der Medizinischen Hochschule, Hannover
Derzeitige Adresse: Department of Pharmacy, Division of Pharmacotherapy, University of
Amsterdam, Amsterdam, Holland
')
')
0365-6233/80/0808-0657 $02.50/0
0 Vedag Chemie, GmbH, Weinheim 1980
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Lullmann, Red, Tinimermans und Zieglei-
Arch. Pharm.
chemische Strukturmerkmale bzw. physikochemische Eigenschaften der Wirkstoffmolekule rnit einer
KenngroRe fur die biologische Wirksamkeit zu korrlieren. Als KenngroRe der biologischen
Wirksamkeit werden in der Regel die negativen Logarithmen derjenigen Konzentrationen benutzt,
die zu einem halbmaximalen Effekt fiihren. So wird die Wirksamkeit von Agonisten mit dem
pD,-Wert charakterisiert als dem negativen Logarithmus der halbmaximal wirksamen Konzentration.
Die Effektivitat einer antagonistisch wirksamen Substanz l5Rt sich in der Regel nicht direkt ermitteln,
da der Antagonist als solcher keinen Effekt entfaltet, sondern dieser sich erst in der Abschwachung
bzw. Aufhebung der Wirkung eines Agonisten zeigt. Entsprechend kann die Wirksamkeit eines
Antagonisten durch den PA,-Wert charakterisiert werden, als dem negativen Logarithmus derjenigen
Konzentration des Antagonisten, die eine Verdoppelung der Konzentration des Agonisten
erforderlich macht, um wieder einen Effekt gleicher GroRe zu erzielen.
Mit den vorliegenden Untersuchungen sollte gepruft werden, ob diese Kenngriiljen des
biologischen Effektes Stoffkonstanten sind und als solche mit den die chernische Struktur
charakterisierenden GroBen korreliert werden durfen oder o b diese KenngroBen nicht
vielmehr abhangig sind von den experimentellen Bedingungen, unter denen sie gewonnen
wurden. Die Experimente mit dem Atropin-artig wirksamen Pharmakon Dexetimid
[( +)-3-( l-Benzyl-4-piperidyl)-3-phenylpiperidin-2,6-di(~n] wurden an isolierten Herzvorhofpraparaten ausgefuhrt. Dexetimid wurde gewahlt, weil es zu den wirksamsten
Vertretern seiner Klasse gehort (von Gray und Mitarbeitern') wurde fur den isolierten rnit
3 Hz elektrisch gereizten Meerschweinchenvorhof ein pA2-Wert von 9.82 ermittelt) und
weil diese Verbindung in radioaktiv rnarkierter Form rnit einer genugend hohen
spezifischen Markierung vorlag. Das Herzvorhofpraparat des Meerschweinchens wurde
fur diese Untersuchung gewahlt, weil sich an diesem Praparat die Wirkung des Agonisten
in einer Abnahme der Kontraktionskraft bemerkbar macht, d. h. der hier eigentlich
interessierende Effckt des Antagonisten in einer IJnterdruckung des negativ inotropen
Effekts besteht.
Der Vorteil dieses biologischen Priparates fur eine derartige Untersuchung ist die
Miiglichkeit, uber die Kontraktionskraft des Muskels seinen Funktionszustand standig zu
kontrollieren. Fur die vorliegende Untersuchung war die Verwendung linker Vorhofe von
speziellem Vorteil, da die Kontraktionsfrequenz dieser Muskeln in einem bestimmten
Frequenzbereich frei wahlbar ist und sornit eine Variation der experimentellen Bedingungen moglich ist, ohne dalj eine Anderung der Zusammensetzung des Nahrmediums oder
ein zusatzlicher Wirkstoff erforderlich ware.
An linken Herzvorhofcn von Meerschweinchen, die rnit 1, 2, 3 oder 4 H z elektrisch
stimuliert wurden, wurde der antagonistische Effekt von Dexetimid im Konzentrationsbereich von 3.10-'M bis l W h M untersucht. Als Agonist diente Carbachol. Bei der
niedrigsten Dexetimid-Konzentration muMte die Konzentration von Carbachol um den
Faktor 2, bei der hiichsten untersuchten Dexetimid Konzentration um den Faktor von ca.
600 erhiiht werden, urn cinen negativ inotropen Effekt gegebener Grolje zu erzwingcn. In
der Darstellung von Arunlakshana und Schild2) liegen die bei den verschiedenen
Reizfrequenzen ermittelten Werte fur diesen Faktor DR - um den also die Konzentration
zur Erlangung eines gleich groBen Effektes gesteigert werden rnuB - auf einer Geraden
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Zeitverlauf der Bindung von Dexetimid
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OR - 1
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0
3
/A
/
:I/;
100 :
101
7
,
, ,,,,,,,/
Ab. 1: Zunahme der antagonistischen Wirksamkeit (ausgedruckt als DR, Ordinate
logarithmisch) aufgetragen gegen die Konzentration des Antagonisten (Abszisse, log)
zur graphischen Ermittlung des pAz-Wertes (Schnittpunkt der Geraden mit der
Abszisse). Die Werte, die bei den Schlag-
(Abb. 1). Aus diesem Ergebnis kann gefolgert werden, dal3 Dexetimid am Meerschweinchenvorhof gegenuber Carbachol ein kompetitiver Antagonist ist und dal3 die Variation
der Schlagfrequenz die GroBe des pA2-Wertes (Schnittpunkt der Geraden mit der
Abszisse, Abb. 1) nicht beeinflufit. Dieser Befund ist insofern erstaunlich, als der Zeitgang
mit dem der antagonistische Effekt von Dexetimid einsetzt bzw. wieder abklingt, stark von
der jeweils angewandten Stimulationsfrequenz abhangt. In Abb. 2 ist der Zeitgang des
Einsetzens der antagonistischen Wirksamkeit dargestellt und zwar ausgedruckt als
Abnahme der Konzentration der freien Rezeptoren. Diese von Paton3) eingefuhrte
Darstellungsweise gestattet es fur die Bedingung 4 Hz eine Halbwertszeit von 5,5 Minuten,
fur die Bedingung 1 Hz eine solche von 14 Minuten zu ermitteln.
Abb. 2: Das Einsetzen der antagonistischen Wir-
20
LO
60
80
kung von Dexetirnid (1 W M ) , gemessen an isolierten, linken Meerschweinchenvorhofen, die
mit 1 Hz (V)3 Hz (V) und 1 Hz (0)elektrisch
stimuliert wurden. Das Einsetzen der antagonistischen Wirkung wird als Abnahme der Konzentration an freien Rezeptoren dargestellt. Letztere
(Ordinate, log) wird ermittelt als Differenz aus
den im Gleichgewicht (pJ und zum jeweiligen
aktuellen Zeitpunkt (pJ durch Dexetimid besetzten Rezeptoren. Abszisse: Expositionszeit.
Mittelwerte aus 6 Einzelbestimmungen. Der
mittlere Fehler des Mittelwertes ist durch senkrechte Striche angedeutet. Aus den Steigungen
lassen sich Halbwertszeiten von 5,5 min fur 4 Hz,
7 min fur 3 Hz und 14 min fur 1 Hz errechnen.
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Liillmann, Reil, Timinermans und Ziegler
Arch. Pharm.
Bei den Untersuchungen zur Kinetik des Abklingens der antagonistischen Wirksamkeit von
Dexetimid wurden alle Praparate zunachst bei einer Frequenz von 3 Hz so lange mit dem Wirkstoff
inkubiert, his eine Konstanz des Atropin-artigen Effektes erreicht war und dann wurde - wenn
erforderlich - die Frequenz gewechselt und der Wirkstoff aus dem Bad entfernt. Fur die
Geschwindigkeit der Dissoziation von einmal gebildeten Dexetirnid-Rezeptor-Komplexen, d. h. also
der Freigabe von Rezeptoren und damit dem Wiederauftauchen der ursprunglichen Carbacholempfindlichkeit des Muskels gilt hinsichtlich der Frequenzabhangigkeit prinzipiell das gleiche wie fur die
Rezeptorenbesetzung festgestellt. Die Rezeptorenbesetzung nirnrnt bei den hoheren Reizfrequenzen
deutlich schneller ah als bei den niedrigen (Abb. 3). Die Freigabe der Rezeptoren erfolgt insgesamt
langsamer als ihre Besetzung, sie erfolgt so langsam, daB die Angabe einer Halbwertszeit fur diesen
Vorgang nur unter Vorbehalten erfolgen kann, da die Dauer des Versuches an dem Herzvorhof nicht
auf einen Zeitraum von 3 4 Halbwertszeiten ausgedehnt werden kann, wie das fur die Festlegung der
Halbwertszeit erforderlich wire.
P
__
1Hz
,
.\f,l
lt1,2 =800minl
0 8-
,
05'
,
r m 1
1
30
I
1
60
,
,
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,
,
120
I
,
, I, ,
150
180
Zeit ( m i n l
Abb. 3: Dus Abklingen der untagonistischen Wirksamkeit von Dexetimid.
Isolierte. linke Meerschweinchen-Herzvorhofe wurden bei 3 H z mit Dexetimid
(10-SM) inkubiert bis keine Zunahrne des
antagonistischen Effektes mchr beobachtet werden konnte. Das Dexetimid wurde
aus dem Inkubationsbad entfernt und die
Frequenz auf 4 Hz ( 0 )oder 1 Hz (V)geandert oder bei 3 Hz (7)
belassen. Die
GroBe des jeweiligen antagonistischen
Effektes- ausgedriickt als Rezeptorenbesetzung p (Ordinate log.) - wurde gegen
die Zeit (Abszisse) aufgetragen. Mittelwerte aus sechs Einzelversuchen. Mit
groRen Vorbehalten (s. Text) konnen
Halbwertszeiten von 190min fur 4Hz,
270 min fur 3 Hz und 800 rnin fur 1 Hz aus
der Steigung der Geraden abgeschatzt
werden.
In einem zweiten Ansatz wurde das Abklingen d e r antagonistischen Wirksamkeit
erneut untersucht, ab e r o h n e daR zunachst eine Konstanz des antagonistischen Effektes
abgewartet worden ware. AnlaR z u dieqem Ansatz war die Oberlegung, daR die
Geschwindigkeit des Abklingens d e r antagonistischen Wirksamkeit gar nicht von d er
Dissoziation d e r Dexetimid-Rezeptor-Komplexe bestimmt wird. W u r d e diese Dissoziation der geschwindigkeitsbestimmende Schritt sein, so miiBte der antagonistische Effekt
unabhangig vom anfanglich erreichten AusmaR des Antagonismus abklingen, d. h . bei
sonst unveranderten Bedingungen diirfte die D a u e r d e r vorausgehenden Inkubationsphase keinen EinfluR auf die Geschwindigkeit des Wiederauftauchens d e r Carbachol-Emp-
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Zeitverlauf der Bindung von Dexetimid
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findlichkeit des Muskels haben. Wie in Abb. 4 dargestellt, zieht aber eine Verlangerung der
Inkubationszeit nicht nur eine Zunahme der antagonistischen Wirksamkeit (unterschiedliche Lage des Schnittpunktes der Geraden mit der Ordinate, Abb. 4), sondern auch eine
Verzogerung der Abnahme der Rezeptorenbesetzung nach sich. Dieses Ergebnis bestatigt
die Vermutung, daB die Ursache fur die unterschiedliche Kinetik des Effektes bei einer
Variation der Frequenz nicht alleine auf Rezeptorebene zu suchen ist.
P
120 min
I I l l 2 . 250 m i n i
25 min
110rnml
1
01
5min
I lq/2
I
70rnml
I
30
60
93
120
150
180
IPh179.4/
Zeit ( m i d
Abb. 4: Abklingen der antagonistischen Wirkung von Dexetimid beim Entfernen des Wirkstoffs nach
unterschiedlich Iangen Inkubationszeiten.
Isolierte linke Meerschweinchen-Herzvorhofe wurden bei einer Frequenz von 3 Hz fur 5 rnin (H) ,
25 min (0)und 120 min (0)in einer 10-*M Dexetimid-Liisung inkubiert. Der Wirkstoff wurde
entfernt und die Abnahme der Rezeptorenbesetzung ermittelt. Dargestellt ist die Rezeptorenbesetzung (Ordinate, log) uber der Zeit nach Entfernen des Wirkstoffs aus dem Bad (Abszisse).Mittelwert
i S.E.M. aus mindestens 6 Einzelversuchen.Aus der Neigungder Geraden kann auf Halbwertszeiten
fur die Restitution der Carbacholempfindlichkeit von 250 min nach 120 min Inkubation, von 110 rnin
nach 25 min Inkubation und von 70min bei 5 min Inkubationsdauer geschlossen werden.
Aus Untersuchungen uber die Konzentrationsabhangigkeit der Bindung von Dexetimid
durch Herzvorhofgewebe von Meerschweinchen') wurde geschlossen, dal3 der iiberwiegende Teil der im Gewebe nachweisbaren Menge an Dexetimid unspezifisch gebunden ist.
Es stellt sich die Frage, ob nur die Wechselwirkung von Dexetimid an den Rezeptoren
durch die Frequenz beeinfluBt wird oder ob auch die Kinetik der Sattigung der
unspezifischen Bindungsstellen von einem Frequenzwechsel betroffen ist. U m diese Frage
beantworten zu konnen, wurde die Bindung von 3H-Dexetimid durch isolierte linke
Vorhofe bei 2 und 4 Hz sowie am ruhenden Praparat untersucht. Die Ergebnisse sind in
Abb. 5 dargestellt. Dexetimid wird von kontrahierenden Muskeln schneller und in einem
groBeren AusmaBe gebunden als von ruhenden Vorhofen. Mit 4 H z kontrahierende
Muskeln binden anfanglich mehr Dexetimid als solche, die mit 2 Hz elektrisch gereizt
werden. Dieser Unterschied verschwindet nach einstiindiger Inkubation. Der Unterschied
zwischen den ruhenden und den kontrahierenden Muskeln bleibt wahrend des gesamten
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Gewebe -Medium Quotlent
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5
20
60
r179.51
120
180
2LO
Zeit lmin)
Abb. 5 : Aufnahme von 3H-Dexetirnid durch das Gewehe isolierter linker Meerschweinchenherzvorhofpriparate bei verschiedenen Schlagfrequenzen.
Die Anreicherung von 3H-Dexetirnid( 1V8M),ausgedriickt nls Gewebe-Medium-Quotient (Ordina-
te) wurde nach verschieden langer Expositionszeit (Abszisse) an ruhenden Praparaten (D) und an mit
2 Hz (0)und 4 Hz (A)elektrisch gereizten Vorhofen gemesscn. Mittelwerte 2 S.E.M. aus 6-12
Einzelbestimmungen.
Untersuchungszeitraumes nachweisbar. Auch die Abgabe von 'H-Dexetimid nach
Uberfuhrung der Muskeln in ein wirkstoff-freies Medium erfolgte bei den kontrahierenden Praparaten schneller als bei den ruhenden (Abb. 6).
Der EinfluB der Erregungsfrequenz auf die Bindung von Dexetimid durch Herzvorhofgewebc konnte sowohl auf die haufigeren mechanischen Ereignisse wie auch auf die
dichtere Folge von Depolarisationen der Zellmembran zuruckgefuhrt werden4). Um eine
der beiden moglichen Ursachen auszuschliefien, wurden die Bindungsuntersuchungen fur
Dexetimid bei stark erniedrigter Calcium-lonen-Konzentration wiederholt. Unter dieser
Bedingung kann ein Aktionspotential ausgelost werden, d. h. eine Depolarisation der
Zellmembran erfolgen')), die elektromechanische Kopplung aber ist weitgehend unmoglich, eine effektive Kontraktion kann nicht mehr ausgelost werden. Unter der Bedingung
,,Calcium 0,2 mM" wurde von elektrisch stimulierten und nicht gereizten Praparaten
gleich vie1 Dexetimid gebunden (Abb. 7). Aus diesem Ergebnis wird geschlossen, daB der
rnit der Kontraktion verbundene ,,Ruhreffekt" Ursache fur die unterschiedliche Bindung
von Dexetimid bei verschiedenen Frequcnzen ist. Fur die Erklarung der vorgestellten
Befunde sol1 das in Abb. 8 skizzierte kinetische Modell herangezogen werden.
Aus dern Bad dringt der Wirkstoff zunichst in den Extrazellularraum des Gewebes ein, der ca. ein
Drittel des Muskelvolurnens a ~ s m a c h t ~ , ' ,Der
~ ) . im Extrazellularraurn befindliche Wirkstoff verrnag
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Zeitverlauf der Bindung von Dexetirnid
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%
Abb. 6: Abgabe von 3H-Dexetirnid durch Meerschweinchen-Hezzvorhof-Praparate.
Isolierte linke Vorhofe wurden bei einer Frequenz von 2 Hz fur 2 h in einer 10-8M Dexetimid-Losung
inkubiert. Der Wirkstoff wurde aus dern Bad entfemt und die Reizung der Praparate eingestellt (0 Hz
m ) oder bei 2 Hz (0)belassen. Die Menge von Dexetimid, die 15,30 und 60 min nach der Entfernung
des Wirkstoffs aus dem Bad in den Muskelpraparaten ermittelt wurde, wurde in Proz. des zum
Zeitpunkt 0 (Ende der Inkubationsphase) ermittelten Gehaltes angegeben. Mittelwerte iS.E.M. aus
6 Einzelbestimmungen.
mit den an der AuBenseite der Zellmembran lokalisierten Rezept~ren~"~,")
zu reagieren. Die
Konzentration im Extrazellularraum bestirnmt also jeweils die GroBe des pharmakologischen
Effektes. Dexetimid wird vom Vorhofgewebe sehr stark angereichert. Im Gewebe laBt sicheine bis zu
30fach hohere Konzentration als irn Inkubationsmedium nachweisen. Da im Extrazellularraum keine
Anreicherung des Wirkstoffs erfolgen kann, lassen sich derartig hohe Gewebe-Medium-Quotienten
nur erklaren, wenn Dexetimid die Zellmembran iibenvindet, den Intrazellularraum erreicht und im
Zellinneren Bindungsstellen vorhanden sind. Die physikochemischen Eigenschaften von Dexetimid
(pK,= 8.7; log p 3.55 (OctanoVWasser) laut Produkt-Information des Herstellers von Dexetimid Jansen, Pharmaceuticals, Beerse, Belgien) lassen eine transmembranale Aufnahme dieser Substanz
sicher erscheinen. Mit dem Bindungsexperiment wird die Summe der im Extra- und Intrazellularraum
befindlichen Wirkstoffmenge erfa8t, wobei der im Extrazellularraurn befindliche Teil nur ganz
unerheblich beitragen diirfte, da dieser Ratfm relativ klein ist und in ihm - wie envahnt - keine
Anreicherung des Wirkstoffs erfolgt. Die mechanische Aktivitat des Muskels beschleunigt die
Wirkstoffaufnahme in den Extrazellularraum und damit die Ausbildung des biologischen Effektes.
Doch wird die Konzentration im Extrazellularraum nicht nur von dem Wirkstoffzustrom aus dem Bad,
sondem auch von dern AbfluB in den Intrazellularraum hinein bestimmt. Dieser Aufnahmevorgang in
die Zelle ist - wie aus dem Zeitgang bei den Bindungsexperimenten abzulesen -selbst nach 4 Std. noch
nicht abgeschlossen, so daB sich im Extrazellularraum ein FlieBgleichgewicht ausbilden kann, dessen
Lage vom Verhaltnis aus Zustrom von Wirkstoff aus dem Inkubationsbad in den Extrazelluliirraum
und AbfluB von Wirkstoff aus dem Extrazellularraum in den Intrazellularraum bestimmt wird. Dieses
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Liillmnnn, Reil, Timmermans und Ziegler
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Gewebe-Medium Quotient
2o
1
I
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60
m.7
Zeit lmin)
120
Abb. 7: Anreicherung von "H-Dexetimid durch Meerschweinchenherzvorho~pr~parate
bei niedriger
Calcium-Ionen- Konzentra tion (0,2 mM).
Die Aufnahme von 'H-Dexetimid, ausgedruckt als Gewebe-Medium-Quotient (Ordinate) wurde
nach unterschiedlich langen Expositionszeiten bei ruhenden (m) und rnit 2 Hz elektrisch gereizten (0)
Sorhofpriparaten bestimmt. Mittelwerte i S.E.M. aus 6 Einzelbestimmungen.
frequenz-abhangig
lnkubationsbad
Extrarellularraurn
Zellularraum + unspezifische
Bindungsstellen fur Dexetimid
in der Zelle
p h m l
Abb. 8: Stark vereinfachtes kinetisches Modell, anhand dessen die Zeitverlaufe von biologischem
Effekt und Bindung von Dexetimid am Herzvorhof des Meerschweinchens erlautert werden.
Serhaltnis kann durch die Frequenz, mit der der Muskel kontrahiert, beeinflufit werden, wobei es
nahe liegt anzunehmen, dafi bei hiiheren Frequenzen die Aufnahme von Wirkstoff aus dem Bad in den
Extrazellularraurn beschleunigt ist, wogegen ein EinfluB der Frequenz auf die transmembranale
Aufnahme des Wirkstoffs nicht vorstellbar ist.
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Zeitverlauf der Bindung von Dexetimid
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Mit diesem einfachen kinetischen Ansatz wird
a. die Frequenzabhangigkeit d e r Interaktion von Dexetimid a n den Rezeptoren als Folge
d e r beschleunigten Auffiillung des Extrazellularraumes erklart.
b. D i e Frequenzabhangigkeit d e r Bindung von Dexetimid bzw. seiner Abgabe aus d e m
Gewebe als eine Folge des veranderten Verhaltnisses von Wirkstoffeinstrom in und
Wirkstoffabflulj aus d e m Extrazellularraum erklart,
c. der Einflulj der Inkubationszeit auf das Abklingen des antagonistischen Effektes nach
dem Entfernen des Wirkstoffs aus dem B a d e als Ausdruck eines am Ende d e r Inkubationszeit unterschiedlich weit gefiillten Intrazellularraurnes erklart. Wahrend d e r Auswaschphase
stromt Dexetimid a u s intrazellularen Speichern in den Extrazellularraum und von dort
wird es an das Inkubationsbad abgegeben werden. Auch wahrend d e r Auswaschphase
kann also im Extrazellularraum ein Flieljgleichgewicht aufgebaut werden, dessen Lage
vom Sattigungsgrad der intrazellularen Speicher und d e r Geschwindigkeit d e r Wirkstoffabgabe aus d e m Extrazellularraum an das Inkubationsbad bestimmt wird. D i e Geschwindigkeit des letztgenannten Prozesses ist frequenz-abhangig.
Diese Untersuchungen wurden im Rahmen der Forschungsvorhaben Lu 31/21 und Zi 11714 von
der Deutschen Forschungsgemeinschaft, Bonn-Bad Godesberg, unterstutzt. Fur sachkundige
Mitarbeit mochten wir Frau E. Schrder herzlich danken. Einer von uns (P.B.M.W.M.T.) ist der Alexander-von-Humboldt-Stiftung
fur die Bereitstellung eines Forschungsstipendiums zu groRem Dank
verpflichtet.
Experimenteller Teil
1. Bestimmung des pharmakologischen Effektes
Fur die Untersuchung dienten Meerschweinchen beiderlei Geschlechts von einem Gewicht zwischen
250 und 400g. Die Tiere wurden getotet und uber die groRen HalsgefaRe entblutet. Nach Eroffnung
von Thorax und Pericard wurde das Herz freiprapariert, dem Tier entnommen und in eine mit
oxygenierter Tyrodelbung gefullte Praparierschale uberfuhrt. Vom Herzen wurde der linke
Herzvorhof abgetrennt, an zwei gegenuberliegenden Stellen mit Faden angeschlungen. Der eine
Faden diente zur Fixierung des Muskels an einem Plexiglasorganhalter, der andere Bindfaden wurde
mit der Ose eines Kraft-Weg-Aufnehmers (SG 4, SWEMA, Stockholm, Schweden) verbunden. Das
auf dem Organhalter befestigte Praparat wurde in ein auf 32'temperiertes Organbad uberfuhrt, das
rnit Tyrodeliisung der folgenden Zusammensetzung gefullt war: NaCl 137,O; KCL 2,7; CaC1, 1,8;
MgCI, 1,O; NaHCO, 12,O; NaH,PO, 0,21; Glucose 5,6 (Angaben in mmol) und rnit Wasser auf
1OOOml aufgefullt. Die Badlosung wurde standig mit Carbogen (95 700,und 5 %CO,) durchperlt.
Uber zwei am Organhalter fixierte Platindrahte konnte das Praparat elektrisch stimuliert werden.
Rechteckreize von 3 msec Dauer und doppelter Schwellenspannung wurden von einem Reizgerat
(Stimulator T, Hugo Sachs, Hugstetten) generiert. Die Kontraktionskraft des Muskels wurde nach
Applikation einer Vorspannung von 500 mg von dem Kraft-Weg-Aufnehmer uber einen Verstarker
(TF 19, Hellige, Freiburg) auf einem schnellschreibenden Registriergerat (He 17, Hellige, Freiburg)
auf gezeichnet .
Nach einer Aquilibrierperiode von 30 min wurde fur jeden Muskel zunachst eine Dosis-Wirkungs-Beziehung fur Carbachol ermittelt, dann Dexetimid dem Bad in der gewunschten Konzentration
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Lullmann, Heil, Tinimermans und Ziegler
Arch. Pharni.
zugesetzt und in regelmaBigen Abstanden die Carbacholempfindlichkeit des Muskels getestet, Es
wurde jeweils ermittelt, die wievielfache Konzentration von Carbachol erforderlich war, um eine 50
proz. Unterdruckung der Kontraktionskraft zu erzwingen. Dieser Faktor wird nach P a t d d o a e ratio
(DR) genannt und beschreibt also um das Wievielfache die Dosis-Wirkungs-Kurve des Agonisten
unter dem EinfluB des Antagonisten in hijhere Konzentrationsbereiche verschoben ist. Die
Rezeptorenbesetzung p ergibt sich nach p = (DR-1) . DR-1.
Eine ausfuhrliche Begriindung dieses Ansatzes findet sich bei Paton3).
2. Durchfuhrung der Rindungsexperimenre.
Die Praparation der Meerschweinchenvorhife erfolgte wie unter 1 beschrieben. Beschwert mit einem
Gewicht von 500mg wurden die Praparate in einen Organhalter uberfuhrt, der die gleichzeitige
Stimulierung mehrerer Praparate erlaubte. Fur die Stimulierung wurden Impulse derselben
Charaktcristik wie oben beschrieben benutzt. Als Inkubationsmedium diente Tyrodeliisung (s.o.).
Die Losungen wurden standig mit Carbogen durchperlt. Nach einer Aquilibrierungsperiode von mindcstens 30 min wurde den 500 ml enthaltenden Inkubationsbadern Dexetimid in radioaktiv markierter
Form zugesetzt, wobei die Konzentration des radioaktiv markierten Anteils konstant gehalten wurde und
je nach Bedarf mit inaktivem Dexetimid verschnitten wurde. Zu bestimmten Zeiten nach Applikation
des Wirkstoffs wurden einzelne Muskeln dem Inkubationsbad entnommen, fur 90 s unter leichtem
Druck zwischen Filtrierpapier getrocknct, gewogen und in einem Zahlglaschen mit 1 ml Soluene(')
(Packard Instr. GmbH, Frankfurt) lyophilisiert. Nach vollstandiger Auflijsung des Gewebes wurden
1Om1 Dimilume(R)(Packard Instr. GmbH, Frankfurt) zugesetzt und der Gehalt an Radioaktivitat in
einem Flussigkeits-Szintillations-Zahlgerat (Tri-Carb, Packard Instr., Frankfurt) ermittelt. Eine
Quenchkorrektur wurde durchgefuhrt. Angegeben ist grundsatzlich die Anrcicherung des Wirkstoffs
im Gewebe, ausgedriickt als Gewebe-Medium-Quotient (Radioaktivitat pro g Muskelgewebc,
bezogen auf Radioaktivitat pro g Inkubationsmedium).
Bei den Experimenten mit emiedrigter Calcium-Konzentration wurde der Calciumgehalt der
Tyrodelijsung von 1,s auf 0,2 mM gesenkt.
Bei den Bindungsexperimenten mit ruhenden Herzvorhofen wurde besonders darauf geachtet, daR
die wenigen Praparate, die von vornherein oder im Laufe des Experimentes spontan kontrahierten,
nicht mit in die Auswertung einbezogen wurden.
Bei den Abgabeexperimenten wurden die Muskeln zunachst 1 h mit dem radioaktiv markierten
Dexetimid beladen, dann in wirkstoff-freie Bader uberfuhrt und zu bestimmten Zeiten nach der
Uberfuhrung der Gehalt an im Muskel vcrbliebener Radioaktivitat ermittelt.
Das rnit Tritium uniform markierte Dexetimid wurde von Radioactive Centre, Briissel, Belgien,
bezogen. Die spezifische Aktivitat betrug 17 Ci/mmol.
Literatur
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H. Lullmann und T. Peters, Eur. J. Pharmacol. 2, 106 (1967).
[Ph 1791
Arch. Pharm. (Weinheim) 313, 667-674 (1980)
Ober Anilide, Aminoethylether und Acetylierungsprodukte von
6-Amino-4-methyl-salicylsaureestern')
Horst Bohme* und Jorg Nehne
Pharmazeutisch-Chemisches Institut der Philipps-Universitat, Marbacher Weg 6, D-3550 Marburgi
Lahn
Eingegangen am 26. September 1979
Aus 6-Dialkylamino-4-methyl-salicylsaureestern1 entstehen beim Erhitzen mit substituierten
Anilinen die Carbonsaureanilide 2. a e r sein Phenolat laSt sich 4-Methyl-6-morpholino-salicylsauremethylester (4) rnit (fi-Chlorethy1)dialkylaminenzu Dialkylaminoethylphenylethern 3 umsetZen. - Der 6-Monoalkylamino-4-methyl-salicylsaureester8c liefert mit der aquimolaren Menge
Acetanhydrid das N-Acylderivat Sd, rnit der doppeltmolaren die N,O-Diacylverbindung 8e; gleiches
6c und 7c.
gilt fur die 3-Amino-4-methyl-6-morpholino-salicylsaureester
Anilides, Aminoethyl Ethers and Acetylation Products of 6-Amino-4-methylsalicylates1)
6-Dialkylamino-4-methylsalicylates1 yield the anilides 2 on heating with substituted anilines. Methyl
4-methyl-6-morpholinosalicylate (4), after conversion into the phenolate, undergoes condensation
with (fi-chloroethyl)dialkylaminesto give dialkylaminoethylphenylethersof type 3. The 6-monoalkylamino-4-methylsalicylate 8c is acylated with an equimolar amount of acetic anhydride to give the
N-acyl derivative 8d, whereas two equivalents afford the N,Odiacyl derivative 8e. Analogous results
have been obtained for the 3-amino-4-methyl-6-morpholinosalicylates
6c and 7c.
Da im Anilidteil substituierte 2,6-Dihydroxybenzoesaureanilidedurch gute anthelmintische Wirkung charakterisiert sind2), lag es nahe, analoge Derivate d e r durch Selbstkondensation von (p-Alkoxycarbonyl-alkyliden)ammoniumsalzen leicht z ~ g a n g l i c h e n ~ )
4-Alkyl-6-amino-2-hydroxybenzoesaureester
darzustellen. Zaitsev, Shestaeva und Zagorevskii4) haben bereits die durch Verseifung von 6-Anilino-4-methyl-salicylsaureester
erhaltene freie Saure uber ihr Chlorid mit 5 % Ausbeute in das Anilid uberfuhren konnen.
Sehr vie1 bessere Ergebnisse werden erhalten, wenn m a n Ester 1 und Anilin in geringem
UberschuB einige Zeit auf 180-200" erhitzt; beim Erkalten kristallisiert das Anilid d a n n
0365-6233/80/0808-667
$02.5010
0 Verlag Chemie, GmhH, Weinheim 1980
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