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Die Isolierung hochgereinigter Mitochondrienprparationen fUr Untersuchungen zur Biotransformation von Arzneistoffen.

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Archiv der Pharrnazie
312. Band
Juli 1979
Heft 7
Arch. Pharm. (Weinheim) 312,561 5 7 2 (1979)
Die Isolierung hochgereinigter Mitochondrienpraparationen fiir
Untersuchungen zur Biotransformation von Arzneistoffen
Henning Blume
Institut fur Pharmazcutische Chemie dcr Johann Wolfgang Goethe-Universitat, Georg-Voigt-Str. 14,
6 Frankfurt am Main
Eingegangen am 31. Juli 1978
Hochgereinigte Mitochondrien zur Untersuchung der Biotransformation von Arzneistoffen werden
durch Differentialzentrifupation und Dichtegradientenzentrifugationgewonnen. Dabei ist Percollm
als Gradientenmaterial besonders geeignet, da es cine hohe Trennscharfe unter nahezu physiologischen Bedingungen ermoglicht. Die Reinheit der isolierten Praparationen wird durch Leitenzymbestimmungen sowie elektronenmikroskopische Untersuchungen uberpriift. Die hochgereinigten
Mitochondrien sind praktisch frei von adsorbierten Mikrosomen und daher fur die Untersuchung des
Arzneistoffmetabolisrnus durch Mitochondrien gut geeignet.
Isolation of Highly Purified Rat Liver Mitochondria for the Study of the Biotransformationof Drug
Highly purified rat liver mitochondria werc isolated by combined differential and density gradient
centrifugation. Percollm is a new density gradient material and is suitable for selective separations
under almost physiological conditions. The purity of the isolated preparations is established by the
determination of marker enzymes and by electronmicroscopic investigations. Mitochondria so
purified are free of adsorbed microsomes and therefore well suited for investigating the presence of
drug metabolizing enzymes in this fraction.
Die Biotransformation von Arzneistoffen erfolgt iiberwiegend in der Leber, wihrend andere
Organe, wie z. B. die Niere, Lunge, Darmmukosa und Haut, in weitaus geringerem MaRe beteiligt
sind’). Die verschicdenen Reaktionen werden dabei insbesondere durch die Enzyme des endoplasmatischen Retikulums ( E R ) sowie durch die gelosten Enzyme aus dem Cytosol katalysiert*! Die
Moglichkeit einer Bcteiligung anderer Zellorganelle an diesen Umsetzungen ist bisher wenig
diskutiert worden. Allerdings erscheinen auch z. B. die Mitochondrien aufgrund ihrer speziellen
Enzymausstattung” (z. B. Enzyme des Citratcyclus, der Atmungskette und des Fettsaurestoffwechsels) und der im allgemeinen hohen Substratspezifitat dieser Systeme a priori fur die Biotransformationsreaktionen der Pharmaka nicht besonders geeignet, obwohl inzwischen auch in den Mitochondrien Enzymc geringerer S ~ e z i f i t a t ~ ) ’aufgcfunden
)~)
worden sind.
O 3 6 5 ~ , 2 3 3 i 7 Y / 0 7 0 7 - 0 5 6 1 S 02.50/0
0 Verlag Chemie. GrnbH. Weinheirn IY7Y
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Blume
Arch. Pharm.
Dariiber hinaus stellt die Doppelmembran der Mitochondrien cine erhebliche Permeationsschranke
fur vide Substanzen dar, indem die innere irn Gegensatzzu der allgemein leicht durchlassigen CuBeren
Membran nur von wenigen Stoffen passiert werden kann'). Dennoch sind einige der mitochondrialen
Enzyme auch fur Arzneistoffe oder andere Fremdsubstanzen relativ leicht zugangig, z. B. die
Monoaminoxidase in der auL3eren Membran.
Die zur Untersuchung einer moglichen Beteiligung d e r Mitochondrien a n d e n
Biotransformationsprozessen benotigten h o c h g c r c i n i g t e n Mitochondrienpraparationen miissen zwei wesentliche Anforderungen erfullen:
1. Sie diirfen kein adsorbiertes E R enthalten, d a dieses eine Katalyse verschiedener
Biotransformationsreaktionen durch die Mitochondrien vortauschen konnte.
2. Die Membransysteme d e r isolierten Organelle mussen weitgehend unversehrt und
voll funktionsfahig sein, damit nahezu reale in-vivo-Verhaltnisse (ausgepragte Permeationsbarriere) vorliegen.
Die lsolierung von Mitochondrien aus Leberzellhomogenaten erfolgt nach d e n heute
ublichen V e r f a h r e d ) durch Differentialzentrifugation.Dabei werden zunachst bei 6 0 0 x g
die Zellkerne sowie noch enthaltene, gr6Rere Zellfragmente abgeschleudert, und
anschliefiend die Mitochondrien bei 10000-12OOOxg sedimentiert. Nach d e n Untersuchungen von Baudhuin') sind die so gewonnenen rohen Praparationen noch weitgehend
mit kleineren Zellorganellen (z. B. Lysosomen, Peroxysomen und Mikrosomen) kontaminiert. Auch einige d e r im Cytosol gelosten Enzyme kiinnen adsorbiert und mitsedirnentiert
werden. D a s Ausmafi d e r Verunreinigungen ist dabei in starkem Mal3e von den
experimentellen Parametern (2.B. Sedimentationsgeschwindigkeit)abhangig"). D a h e r
k a n n die Kontaminationsquote durch Erniedrigung d e r bei d e r Isolierung angewendeten
g-Werte und wiederholte Waschprozesse z.T. wesentlich gesenkt werden. Die A b t r e n n u n g
von mitsedimentierten Lysosomen und Peroxysomen kann schliealich nach DeDuve")
durch Zentrifugation in einen kontinuierlichen Saccharosegradienten erreicht werden.
Aufgrund dieser Ergebnisse werden zur Gewinnung hochgereinigter Mitochondrien aus den
Leberhomogenaten rnoglichst rnilde Zentrifugationsbedingungengewahlt, darnit die Kontaminationen
von vornherein auf ein Minimum reduziert sind. Allerdings miissen dabei fur die hohere Reinheit der
Praparationen niedrigere Ausheuten in Kauf genommen werden. Weiterhin werden alle Prozesse bei
Temperaturen unter 5" durchgefuhrt. um warmebedingte Veranderungen der empfindlichen
Mitochondrien zu verhindern. Die verwendeten Puffer sind isotonisch gestellt und enthalten zur
Stabilisierung 0.470EDTE.
Die Resuspendierung der sedimentierten Mitochondrienpellets fur die einzelnen Reinigungsschritte
muB ebenfalls mit besonderer Sorgfalt erfolgen, da z. B. die Verwendung schnell rotierender
Homogenisatoren eine partielle Zerstorung der PuBeren Mitochondrienmernbran hervorrufen kann.
Bei den verschiedenen Waschprozessen werden schrittweise reduzierte Zentrifugenbeschleunigungswerte angewendet, um bei ausreichend guten Sauberungseffekten gleichzeitigeine optimale Stabilitat
der Praparationen zu gewahrleisten. Die anschlieBende Zentrifugation in den Dichtegradienten
errnoglicht eine saubere Abtrennung letzter noch anhaftender mikrosomaler Bestandteile. Eine
Vereinfachung und Verbesserung gegeniiber dem konventionellen Verfahren mit einem Saccharosegradienten bietet die Verwendungeines neuen, speziell praparierten Materials aus kolloidem Silicagel
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Mitochondrienpraparationen
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und Polyvinylpyrrolidon (PercollTM,Pharmacia Fine-Chemicals, Uppsala, Schweden). Dieses kann
namlich durch Verdiinnen mit 0,25MSaccharoselosung (1 1) auf eine fur die Mitochondrienisolierung optimale Ausgangsdichte (d2: 1 , l O ) eingestellt und durch Zumischen von 0,IT. 2,5M
Saccharoseliisung den normalen physiologischen Bedingungen im Inneren der zu trennenden
Organelle (280-320 mOs/kg Wasser) gut angepaOt werden.
+
Die Mischung der Suspension der zu reinigenden Zellorganelle mit der vorbereiteten
Percollosung (1 : 10) wird in einem Festwinkelrotor zentrifugiert, wobei sich infolge der
langsamen Sedimentation des Gradientenmaterials wahrend der Zentrifugation direkt in
den Glasern der Dichtegradient (Dichtebereich ca. d:' 1,06-d2: 1,14) ausbildet. Die
Mitochondrien und die verunreinigenden Zellorganelle sind dann in den ihrer Eigendichte
entsprechenden Bereichen aufzufinden. Besonders giinstig ist dabei, daB die Zunahme der
Gradientendichte innerhalb der Zentrifugenrohrchen nicht exakt linear sondern entsprechend einer sigmoidalen Funktion erfolgt, so daB im mittleren Bereich infolge der
verlangsamten Zunahme der Dichte eine hohe Trennscharfe selbst bei nur geringen
Dichteunterschieden erreicht wird. Es gelingt dadurch, verunreinigende Mikrosomen, die
bis auf den Boden des Rohrchens sedimentieren, sowie Lysosomen und Peroxysomen
praktisch quantitativ aus den Mitochondrienpraparationen zu entfernen. Auch evtl.
vorhandene Bruchstucke von Mitochondrien, die durch partielle Zerstorung der CuSeren
Membran entstanden sind, konnen so leicht abgetrennt werden. AbschlieBend werden
Reste des Gradientenmaterials aus den Praparationen durch zweimaliges Waschen
entfernt und die hochgereinigten Mitochondrien in isotonischer Saccharoselosung
aufgenommen.
Fur spezielle Experimente, in denen die Lokalisierung der einzelnen Enzymaktivitaten
innerhalb des Mitochondriums gepruft werden SOH, werden besondere Praparationen
benotigt, in denen die aul3ere Membran der Mitochondrien selektiv abgetrennt worden ist
(,,stripped mitochondria"). Diese werden nach Schnaifman'2)durch Vorinkubation mit
verdiinnter Digitoninlosung (1,5-2,0 mg Digitonin pro 10 mg Mitochondrienprotein)
gewonnen. Der Zustand der inneren Membran hangt dabei wesentlich von den
Inkubationsbedingungen ab, da sowohl eine Erhohung der relativen Digitoninmengen als
auch eine Verlangerung der Inkubationsdauer eine fortschreitende Zerstorung bewirkt.
Die Reinheit der hochgereinigten Mitochondrien kann durch enzymatische Testverfahren sowie elektronenmikroskopische Untersuchungen iiberpriift und ihre Eignung fur die
Untersuchung des Arzneistoffmetabolismus, die bisher nicht getestet worden ist, bewiesen
werden20).Auch der fir die Hochreinigung der Organelle benutzte Dichtegradient kann als
ein analytisches Diagnostikum zum Nachweis moglicher Verunreinigungen oder einer
partiellen Zerstorung der Membranen herangezogen werden. SchlieBlich ist ein Beweis der
Effektivitat der beschriebenen Reinigungsprozesse noch durch das Experiment einer
gezielten Kontamination mit isoliertem E R moglich.
Die enzymatischen Testverfahren basieren im wesentlichen auf der Bestimmung der
Aktivitat bestimmter Leitenzyme. Dabei handelt es sich um Enzymsysteme, die
ausschlieBlich oder zumindest bevorzugt in bestimmten Zellorganellen lokalisiert sind.
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Arch. Pharrn.
Nach den Untersuchungen von S~hnaitrnan’~)
uber die Enzymverteilung innerhalb der
Mitochondrien stellt die Monoaminoxidase (MAO) das Leitenzyrn der PuBeren und die
Succinat-Cytochrom-c-Reduktasedas Leitenzym der inneren Mernbran dar. Die analytische Bestirnmungdieser Enzyme, die nach Taborl4)(MAO)bzw. Takesue”)(Cyt.-c-Red.)
durchgefiihrt wird, dient vornehrnlich der Beurteilung des morphologisch intakten
Zustands der isolierten Organelle sowie der Reinheit der Praparationen, die nach gezielter
Abtrennung der auBeren Membran erhalten werden. Die in Tab. 1 aufgefiihrten
Ergebnisse verdeutlichen, daB mit einer sorgfaltig durchgefuhrten Digitonininkubation
eine sehr saubere Auftrennung moglich ist. Die nach dem Waschen resultierenden
Praparationen der inneren und der auBeren Mitochondrienrnembran sind praktisch frei
von nennenswerten Verunreinigungen.
Tab. 1: uberprufung der Fragmentierung der Mitochondrien in Praparationen der auBeren und der
inneren Membran durch Leitenzymbestimmungen
Praparation
intakte
Mitochondr.
Aktivitat der
Monoaminoxidase
(nM/mg/rnin)
Aktivitat der
Succ.Cyt.-c-Red.
(nM/mg/min)
24,8
363.3
adere
Membran
196,3
39.3
innere
Membran
1,s
456,3
Das AusmaB der moglichen Kontamination hochgereinigter Mitochondrien mit
anderen Zellorganellen kann uber die Analyse der Glucose-6-Phosphatase als Leitenzym
des ER (Mikrosomen) nach Swanson’6) sowie der Uratoxidase als einem Leitenzym der
Peroxysornen nach Kalckar”) beurteilt werden. Das besondere Augenrnerk gilt dabei der
Glu-6-Pase. da von ihrer Restaktivitat auf eine evtl. mikrosomale Kontamination
riickgeschlossen werden kann.
Die in Tab. 2 aufgelisteten Ergebnisse zeigen, daB die Verunreinigungen mit ER schon
in der ersten, rohen Mitochondrienpraparation relativ gering sind. Die Wirksamkeit der
einzelnen Reinigungsschritte auBert sich in einer weiteren Abnahme der Werte. Dabei ist
anfangs eine starke, bei den weiteren Waxhprozessen aber weniger ausgepragte
Absenkung der Aktivitat feststellbar, die schlieBlich vom 5 . Waschen an vernachlassigbar
klein wird. Die resultierenden Restaktivitaten von ca. 10-12 % der Ausgangswerte lassen
sich dann mit Hilfe der anschlieBenden Dichtegradientenzentrifugationnoch weiter bis auf
ca. 6 % absenken.
Die Untersuchung der Kontamination mit Peroxysomen uber Bestimmung der
Restaktivitat der Uratoxidase zeigt, daB durch vier Waschxhritte nur eine unvollstandige
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Mitochondrienprapararionen
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Tab. 2: Verfolgung der Reinigung der Mitochondrien durch Bestimmung des Leitenzyms des ER
Praparation
Ce$arntleberhomogenat
,,rohe Mitochondrien"
1 x gewaxh. Mitoch.
2 x gewasch. Mitoch.
3 x gewasch. Mitoch.
4 x gewasch. Mitoch.
,,hochgerein. Mitoch."
,,gectrippte Mitoch."
77 10 xg-lfberstand
Aktivitat der
Glu-6-Pase
(nM/rng/rnin)
80,8
26,s
13,7
11,o
8,8
5.1
unter 1
133,3
relat. Aktiv.
(172)
100,o
32,U
16,9
13,s
10,9
6,3
..
165.0
Reinigung (ca. 50 %) rnoglich ist (s. Abb. I). Erst die Dichtegradientenzentrifugation
erreicht eine relativ selektive AbtrennungIR),die sich xhlieRlich in einer drastischen
Senkung der Restaktivitat auf 5-8 % PuRert.
I-
d/
X t
L2-LL.L
0
rn Reinigungsschritte a-E
-
Abb. 1: Entfernung von Peroxysomen aus den Mitochondrienpraparationen (Kontrolle durch Leitenzymbest.)
a d : Reinigung durch Waschen
E: Reinigung durch Dichtegradientenzentrifugation
Die besondere Eignung der beschriebenen Isolationsmethode zur Gewinnung hochgereinigter Mitochondrien kann weiterhin durch das Experiment einer gezielten Kontamination mit isolierten Mikrosomen bewiesen werden. Zu diesern Zweck wird die hochgerei-
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nigte Mitochondrienpraparation mit isolierten Mikrosomen (gleiche Proteinkonzentrationen) gemischt und anschlieBend eine analoge Reinigung wie bei der rohen Mitochondrienfraktion durchgefuhrt. Die Kontrolle der Effektivitat der Reinigung durch Bestimmung
der Glu-6-Pase (s. Tab. 3) zeigt, daB die zugefiigten Mikrosomen praktisch vollstandig
wieder entfernt worden sind, so daB erneut nur eine Restaktivitat von ca. 6 % fur die
Glu-6-Pase verbleibt. Bei dieser Restaktivitat scheint es sich daher um eine direkt in den
Mitochondrien lokalisierte, also mitochondrienspezifische Aktivitat zu handelnlg), die erst
nach Abtrennung der auBeren Membran praktisch vollstandig verschwindet. Sie ist
demnach innerhalb der Mitochondrien in der auReren Membran lokalisiert.
Tab. 3: Verfolgungder Reinigung der Mitochondrien nach gezielter Kontamination mit Mikrosomen
durch Leitenzymbestimmung des ER
haparation
relative Aktivitat
der Glu-6-Pase
rohe Mitochondrien I
gezielte Kontaminat.
rohe Mitochondrien I1
4 x gewasch Mitoch.
hochgerein Mitoch.
100,O
84,5
-
100,O
53,l
8,3
43
62,9
93
5,7
Abb. 2: Vergleich der Aktivitatsanderungen der Glu-6Pase (a' -<') und der N-Oxidreduktase (a-<)wahrend
I
ma
,
I
Reinigungsschritte a-5-
4
der Reinigung der Mitochondrien
a-6: Reinigung durch Waschen
E: Reinigung durch Dichtegradientenzentrifugation
5: Wert nach Abtrennen der auBeren Membran
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Mitochondrienpraparationen
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Die Effektivitat des Reinigungsverfahrens wird aul3erdern durch einen Vergleich der
Veranderungen der Aktivitatswerte eines Mitochondrienenzyrns rnit den Xnderungen der
Glu-6-Pase wahrend der einzelnen Schritte dokurnentiert. Hierfur habe ich eine von uns in
den Mitochondrien gefundene Enzyrnaktivitat, die fur die Reduktion des N-Oxids des
Oberflachenanasthetikums Fornocain (1) zu dern entsprechenden tertiaren Amin verantwortlich ist2u),,ausgewahlt. Diese N-Oxid-Reduktaseaktivitat unterliegt bei der Reinigung
nur Schwankungen innerhalb statistischer Grenzen, wahrend die Aktivitat des ER-Leitenzyrns signifikant abfallt (s. Abb. 2).
1
Die Sauberkeit der einzelnen Praparationen ist abschlieDend durch elektronenmikroskopische Untersuchungen uberpruft worden. Wahrend die rohe Mitochondrienfraktion
noch relativ stark durch E R verunreinigt ist, sind die Mikrosornen in der Fraktion der
gewaschenen Mitochondrien (s. Abb. 3a) schon weitgehend entfernt worden. Bei den
hochgereinigten Mitochondrien (s. Abb. 3b) sind entsprechende Kontarninationen nicht
rnehr nachzuweisen.
Abb. 30: Elektronenmikroskopisches Bild der gewaschenen Mitochondrien ( IOOOOfache VergroBerung, ER = endoplasmatisches Retikulum. Lys = Lysosomen)
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Arch. Pharm.
AM. 3 b Elektronenmikroskopisches Bild der hochgereinigten Mitochondrien (20000fache VergroBerung)
Die Ergebnisse der enzymatischen Tests und d e r morphologischen Untersuchungen
haben gezeigt, daR die mit der modifizierten Methode isolierten Mitochondrien praktisch
frei von Kontaminationen durch adsorbiertes ER oder Peroxysomen sind. Aus diesem
Grund sind die Praparationen f i r die Untersuchungen einer Beteiligung von Mitochondrien am Arzneistoffmetabolismus besonders gut geeignet.
Ich danke Herm Prof. Dr. H. Oebchluger. Direktor des Instituts fiir Pharmazeutische Chemie der
Universitat FrankfudM., fur die Unterstiitzungbei der Durchfiihrungvorliegender Arbeit und Herrn
Prof. Dr. Dr. H. Fasold,Direktor des Instituts fur Biochemie der Universitat Frankfurt/M., fur die
uberlassung eines Arbeitsplatzes in seinem lnstitut und fruchtbare Diskussionen.
ExperimentellerTeil
1. Isolierung hochgereinigter Mitochondrien (vgl. Abb. 4)
Mannliche SIV-Ratten, die zwischen 200 und 400g wiegen, werden vor der Praparation fur 24h
niichtern gestellt und durch Genickbruch getotet. Ihre Leber wird umgehend herausprapariert und mit
eisgekuhlter, isotonischer Saccharoselosung perfundiert. Alle weiteren Prozesse werden bei einer
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Mitochondrienpraparationen
LE BE R
I
zerschneiden
homogenisieren
(0.25 m Saccharoselsg.)
Homogenat 1
(1 g Frischleber/2 ml)
600 x g/ 10 min
(Zellframente,
Kerne, etc.)
2
1
1
7710 x g/10 min
Riickstand
uberstand
(Mikrosomen etc.)
Homogenat I1
lnkubation mit 4
Digitoninlsg.
Coo, 20 min)
I
4 x waschen mit
Saccharoselsg.
(7350 xg, 6450 xg, 5 5 8 0 xg,
5050 xg je 1 0 min)
Homogenat 111
(gewaschene Mitochondrien)
Mischen mit verd.
Percollosung und
Dichtegrad. zentr.
,,gestrippte"
Mitochondrien
aufiere
Membran
c
Homogenat 111
(gewaschcne Mitochondrien)
innere
Membran
Abb. 4: Schema zur Gewinnung hochgereinigter Mitochondrien und der ,,stripped mitochondria"
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Arch. Pharm.
Temp. unter 5" durchgefuhrt. Die gewogene Lcber wird in kleine Stucke geschnitten und unter
Anwendung moglichst niedriger Umdrehungszahlen mit einem Porzellanhomogenisator (S-273, B.
Braun, Mclsungen) in so vie1 Saccharosepuffer homogenisiert, daR 10g I x h e r 30-40 ml Homogenat
ergeben.
Die in der Suspension enthaltenen Zellkerne sowie noch vorhandene groBere Zellbruchstiicke werden
zunachst bei 600xg( 1Omin) sedimentiert und der dekantierte uberstand unter gleichen Bedingungen
noch einmal rezentrifugiert. Eine erste, rohe Mitochondrienfraktion wird aus dem Oherstand durch
Abschleudern bei 7710 xg (10 min) erhalten.
Zur Entfernung anhaftender Mikrosomen wird das Pellet viermal im Puffer vorsichtig resuspendiert
und hei jeweils schrittweise reduzierten g-Werten (7350, 6450, 5580, 5050 xg) zentrifugiert, wobei
die uherstehenden Waschfliissigkeiten verworfen werden. Die erhaltenen Pellets werden in
Saccharoselosung mit einer 10-ml-MeBpipette aufgeriihrt und diese groben Suspensionen anschlieRend durch mehrmaliges Aufsaugen in die Pipette (- IOmal) ,,homogenisicrt".
Zur Hochreinigung der Mitochondrien wird eine Mischung von 1,8 ml2.5 M Saccharoseliisung, 16 ml
PercollTM,10 ml0,25 M Saccharoseliisungsowie 5 ml der Suspension der gewaschenen Mitochondrien
hergestellt und in die Zentrifugenrohrchen (Beckman) eingebracht. Die Gradientenzentrifugation
erfolgt anschlieoend in einem Festwinkelrotor 60 TI (Beckman) bei 37000 rpm (100000 xg/45
min/0"). Die Gradientenfraktion, in der die Mitochondrien enthalten sind, wird abgetrennt und zur
Ruckisolierung der Organelle mit Saccharoselosung verdiinnt (1 :5 ) . Die anschlieRende Zentrifugation bei 7000 xg fiihrt zu einer Sedimentation der Mitochondrien, die zur Entfernung restlichen
Gradientenmaterials noch zweimal gewaschen werden. AnschlieBend werden sie in einem Puffer
resuspendiert, so dab 1 ml der Suspension die Mitochondrien aus l g Leber enthalt.
Zur speziellen Abtrennung von Mikrosomen kann intolge ihres relativ hohen Dichteunterschieds zu
den Mitochondrien die Ausgangsdichte der Percollsuspension auch so gewahlt werden (d2! 1,13), daR
bei der Zentrifugation die Mikrosomen bis fast zum Boden sedimentiert werden, wahrend die
Mitochondrien in den oberen Schichten des Gradienten verbleiben (s. Abb. 5 ) . Die Peroxysomen und
Lysosomen, die bei den geplanten Untersuchungen nicht storen, konnen dabei allerdings nirht
quantitativ abgetrennt werden.
1
Mitochondrien f
B
Mitochondrien
Abb. 5: Hochreinigung der Mitochondrien durch Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll
a) Ausgangsdichte d2! 1,10
b) Ausgangsdichte d': 1.13.
312/79
Mitochondrienpraparationcn
57 1
2. Abtrennung der auBeren Membran (stripped mitochondria)
Die auDere Mitochondrienmembran kann durch Inkubation mit einer Digitoninlosung ahgetrennt
werden”). Die Zproz. Stammliisungdes Digitonins in Saccharosepuffer wird bei 0”mit einem gleichen
Vol. der Mitochondriensuspension, die ca. 100 mg P r o t e i n h l enthalt, gemischt und unter schwachem
Ruhren 20 min inkubiert. AnschlieDend wird mit Saccharoscliisung verdijnnt ( 1 :4) und die innere
Mernbranfraktion bei YO00 xg (10 min) sedimentiert. Die Fragmente der BuReren Membran werden
durch Abschleudern bei 144000 xg (60 min) als Pellet erhalten. Beide Praparationen werden zur
Entfernung von adsorbiertem Digitonin jeweils noch zweimal gewaschen und in berechneten Vol.
suspendiert, so daD die aus 1g Frischleber isolierten Partikel in 1 ml Suspension enthalten sind.
3. Gezielte Kontamination der hochgereinigten Mitochondrienpraparation mit ER und erneute
Reinigung
Die Isolierung der benotigtcn gewaschenen Mikrosomen erfolgt nach Gorrod2‘).Die Mikrosomcnsuspension (10 mg Protcin/ml) wird mit dcm gleichen Vol. der hochgereinigten Mitochondriensuspension (10 mg Protein/ml) gemischt und die enthaltenen Mitochondrien erneut isoliert und
hochgereinigt. SchlieRlich resultiert eine Suspension, die die aus I g Leber stammcnden Mitochondrien in I mi enthalt.
4. Enzymbestimmungen
Die Reinheit der einzelnen Praparationen wird durch quantitative Bestimmungen der Aktivitat der
relevanten Leitenzyme uberpruft. Die Analyse der Glu-6-Pase erfolgt nach SwansonJ6),wobei das
durch enzyrnatische Hydrolyse freigesetzte Phosphat nach Amrnoniummolybdatreagenzzusatz in
einem Technicon-AutoAnalyzer quantitativ erfaRt wjrd.
Die Urat-oxidase wird nach Kalckar”) durch Bestimmung der Adsorptionsabnahme bei 292 nm
analysiert. Die Messung der Aktivitat der Succinat-Cyt.-c-Red. und der M A 0 erfolgt nach Takesue15)
bzw. Tabor’“).
Die Reduktion von Fomocain-N-oxid zu dem tertiaren Amin kann, nach quantitativer Extraktion des
Reduktionsproduktes mit Pentan, uber gc-Analyse und Vergleich mit einem inneren Standard22J
bestimmt werden.
Der Proteingehalt der verschiedenen Praparationen wird spektralphotometrixh nach L0wryZ3’
analysiert.
5. Elektronenmikroskopische Untersuchungen
*’
Zur Vorbereitung der isolierten Praparationen fur die Elektronenmikroskopie werden die erhaltenen
Pellets mit einer 2.5 proz. Glutaraldehydlosung vorfixiert (10 min) und anschlieRend mit 1 proz.
Osmiumtetroxidlijsung (10 min) nachfixiert. Die Praparate werden entwassert, in Vestopal-W to
eingebettet und in ultradunne Schnitte zerlegt. Die Untersuchung der mit Bleiacetat- und
Uranylacetatliisung angefarbten Schnitte erfolgt in einem Siemens-EM 101-Elektronenrnikroskop.
*) Ich danke Herrn Dr. M. Schneider. Patholog. lnst. der Universitit Frankfurt/M., fur die
Durchfiihrung der Untersuchungen.
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Arch. Pharm.
Litentur
1 B. Testa und P. Jenner, Drug Metabolism, S . 419, Marcel Dekker Inc., Basel 1976.
2 H. Uehleke, Fortschr. Arzneimittelforsch. 15, 147 (1971).
3 P. Karlson, Kurzes Lehrbuch der Biochemie, 10. Aufl., S . 229, Georg Thieme Verlag, Stuttgart
1977.
4 T.J. Mantle, M.D. Houslay, N.J. Garrett und K.F. Tipton, J. Pharm. Pharmacol. 28,667 (1976).
5 T. Koivula, Life Sci. 16, 1563 (1975).
6 €3. Tabakoff, R. Anderson und G.A. Alivisatos, Mol. Pharmacol. 9, 428 (1973).
7 J.M. Tager, S. Papa, E. Quagliariello und E.C. Slater, Regulation of Metabolic Processes in
Mitochondria, S. 86, Elsevier Publishing Co., London 1966.
8 G.H. Hogeboom, W.C. Schneider und G.E. Pallade, J. Bid. Chem. 172,619 (1948).
9 P. Baudhuin und H. Beaufay, Arch. Int. Physiol. Biochim. 71, 119 (1963).
10 N. Harada und T. Sato, Agric. Biol. Chem. 39, 899 (1975).
11 C. DeDuve, J. Berthet und H. Beaufay. Progr. Biophys. Biophys. Chem. Y. 325 (1959).
12 C. Schnaitman und J.W. Greenawalt, J. Cell Biol. 38, 158 (1968).
13 C. Schnaitman, V.G. Erwin und J.W. Greenawalt, J. Cell Biol. 32, 719 (1967).
14 C.W. Tabor, H. Tabor und S.M. Rosenthal, J. Biol. Chem. 208,645 (1954).
15 S. Takesuc und T. Omura, Biochem. Biophys. Res. Commun. 40, 396 (1970).
16 M.A. Swanson, J. Biol. Chem. 184,647 (1950).
17 H.M. Kalckar. J. Biol. Chem. 167,429 (1947).
18 F. Leighton, B. Poole, H. Beaufay, J.W. Coffey, S . Fowler und C . DeDuve, J. Cell Biol. 37.482
(1 968).
19 G. Brunner und F.L. Bygrave, Eur. J. Biochem. 8,530 (1969).
20 H. Blume und H. Oelschlager, Arzneim. Forsch. 28, 956 (1978).
21 J.W. Gorrod, D.J. Temple und A.H. Beckett, Xenobiotica 5.453 (1975).
22 D.J. Temple, Arch. Pharm. (Weinheim), 310, 579 (1977).
23 H.O. Lowry. N.J. Rosebrough. A.L. Farr und R.J. Randall, J. Biol. Chcm. l Y 3 , 265 (195 I).
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