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Thermofraktographie zur Kennzeichnung von Anthracen-Derivaten und der entsprechenden Drogen.

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58
Stah I u n d Bro mbeer
Arch. Pharm.
8-Cyanacetyl- 7-methoxy-4-methylcumarin( 2 0
Von dem aus 2a nach der oben angegebenen Bromierungsvorschrift erhaltenen 8-Bromacetyl7-methoxy-4methylcumarin wurde 1 g mit 200 mg Natriumcyanid (getrocknet) in 10 ml
wasserfreiem DMSO (Calciumhydrid) gelost und 4 h bei 40' belassen. Nachdem die vollstandige Umsetzung gesehen wurde, gab man langsam unter Ruhren in die 5fache Menge 10proz.
HCI. Gelbe Flocken, mit Wasser und Ather gut waschen. 2f ist thermolabiL Schmp. 163O
(Zers.). - IR (KBr): 3020, 2840, 2260 (schwach), 1720, 1595, 1490, 1380, 1290, 1175,
1090, 885 cm-'. -l H-NMR (CDC13/D20): 6 (ppm) = 7,74 (d, J = 9Hz, l H , C-S), 7,OO (d,
J = 9 Hz, l H , C-6), 6,20 (4, J = lHz, l H , C-3), 4,OO (s, 3H, OCH3), 3,97 (s, 2H, austb., CH2).
2,43 (d, J = lHz, 3H, CH3). - blS (70 eV): m/e = 257 (19 %, M'), 217 (loo), 189 (211, 174
(21).
Anschrift: Prof. Dr. K. Rehse, Konigin-Luise-Strafie 2-4, 1 Berlin 33.
[Ph 8191
Arch. Pharm. (Weinheim) 311,58-72 (1978)
Egon Stahl und Joachim Brombeer
Thermofraktographie zur Kennzeichnung von Anthracen-Derivaten und
der entsprechenden Drogen
Aus dem Institut fiir Pharmakognosie und Analytische Phytochemie der Universitat des Saarlandes
(Eingegangen am 22. Februar 1977)
Wie die Thermofraktographie (TFG) zeigt, sind zahlreiche pflanzliche Anthrachinonderivate unzersetzt fluchtig. Sie lassen sich somit direkt auf die DC-Schicht transferieren. Die monomeren
Anthrachinon-0-glykoside spalten sich in definierter Weise. Die nichtfliichtigen Dimerisierungsprodukte und die Glykosylderivate konnen mittels einer sauren oder basischen Oxidation mit
Wasserstoffperoxid gespalten werden. Auf diesem Wege lassen sich auch die Anthron- und Anthranolderivate in die entsprechenden Anthrachinone iiberfuhren. Es wird gezeigt, d& dieses
Verfahren auch direkt auf pflanzliche Drogen iibertragbar ist. Die Thermofraktogramme von
nicht-oxidierten und oxidierten Drogen von Frangulae und Rhamni pursh. Cort., Rhei Rad.,
Sennae Fol. und Fruct. sowie von Aloe werden erkutert.
Thermofractography of Anthraquinone Derivatives and Related Natural Drugs
As thermofractography shows, numerous vegetable anthraquinone derivatives are volatile
without being decomposed and can be transferred directly onto the TLC layer. The monomericanthra-
a v e r l a g Chcmie, GmbH, Weinheim 1978
311 f78
Thermofraktographie
59
quinone 0-glycosides are split in a definite manner. The nonvolatile dimerization products and
the glycosyl derivatives can be split by acidic or basic oxidation with hydrogen peroxide. In
this way, anthrone and anthranol derivatives can be converted into anthraquinones It is shown
that this procedure can be applied directly to vegetable drugs. The thermofractograms of nonoxidized and oxidized drugs of Frangula bark, Cascara, Rhubarb, Senna leaf and Tinnevelly
Senna pods and Aloe are interpreted.
1. Einleitung
Seit langem ist die Mikrosublimation als einfache und schnelle Nachweismethode fur einige Anthraglykosid-Drogen bekannt’ -3). Wenn jedoch keine kristallinen Sublimate auftreten, bleibt
deren Identifiizierung durch die kristalloptische Analyse offen. Mit dem TAS-Verfahren4”) ist
das Ziel verwirklicht, ein thermisches Abtrennverfahren mit einer leistungsfahgen Trenn- und
Nachweismethode, wie sie die DiinnschichtChromatographiedarstellt, zu kombinieren. Einen
tieferen Einblick in den Ablauf einer Thermomikroextraktion erhalt man mit der Thermofraktographie (TFG)6y7),bei der die Droge im Temperaturgradient erhitzt wird und die jeweils auftretenden Produkte fraktioniert aufgefangen werden.
Probleme treten jedoch beim Vorliegen von Glykosiden und Dimerisationsprodukten auf.
Hinzu kommt, dai3 die Anthracenderivate in unterschiedlichen Oxidationsstufen auftreten. Aufgrund unserer friiheren Arbeiten uber die Moglichkeit einer thermischen Spaltung von Glykosidenap9)war es naheliegend, dal3 auch hier entsprechende Untersuchungen zum Erfolg fiihren.
Zunachst muaten wir jedoch einen tiberblick iiber die Fliichtigkeit und Stabilitat der Anthracen-Aglyka im Temperaturgradient von 50-450° erhalten. Erst danach schienen Versuche
sinnvoll, durch geeignete Zusitze letztendlich zu den Grundanthrachinonen zu gelangen.
2. Verhalten der Aglyka hn Temperaturgradient (TFG-Bedingungen)
Die Thermofraktographie der redoxamphoteren Formen des Anthrachinons - das
sind Anthrone bzw. Anthranole, Dianthrone und Anthrachinone - zeigt, daB alle
untersuchten monomeren Verbindungen unzersetzt und fraktioniert auf die DCSchicht transferiert werden konnen. Das Fehlen jeglicher Spaltprodukte im TFG
erklart sich aus dem mesomeriestabilisierten n-Elektronensystem der Anthracenderivate. Dieser energetisch giinstige Zustand erhoht die thermische Stabilitat der Substanzen gegen Fragmentierungen und laBt unter den vorgegebenen Thermolysebedingungen lediglich deren Sublimation zu. Das wird in der Bestandigkeit der Carbo1 L. Kofler und A. Kofler, Handbuch der mikrochemischen Methoden, Vol. I/1 S.99 f. (Hrsg.
F. Hecht und K. Zacherl), Springer-Verlag Wien 1954.
2 D. Markovic, Mikrochemie 36/37, 1158 (1951).
3 D. Markovic, Mikrochemie 38, 419 (1951).
4 E. Stahl, J. Chromatog. 37, 99 (1968).
5 E. Stahl, Analyst (London) 94, 723 (1969).
6 E. Stahl, Z. Anal. Chem. 261, 11 (1972).
7 E. Stahl, Acc.Chem. Res. 9, 75 (1976).
8 E. Stahl und J. Brombeer, Sci. Pharm. 41, 133 (1973).
9 E. Stahl und 3. Brombeer, Pharm. Acta Helv. 50,385 (1975).
60
Stahl und Brom beer
Arch. Pharm.
xylgruppe im Rhein, einer 1,8-Dihydroxyanthrachinon-3-carbons;iure,
in eindrucksvoller Weise dokumentiert. Dagegen unterbleibt der Transfer der durch Dimerisierung
energetisch besonders begiinstigten Dianthrone mittels Tragergassublimation. Die Ergebnisse sind in Tab. 1 zusammengefafit; hierin ist nur der Be inn der TFG-Zonen
angegeben, da die Zonenlange von der Einwaage abhingig ist 87 .
Tab. 1: Thermisches Verhalten naturlicher Anlvka
Aglykon
Schmp.O TFG-Zoonen- DCbeginn[
Methode"
l+
A. Anthrachinone
An thrachinon
Tectochinon
(2-Methylanthrachinon)
1-Hydroxyanthrachinon
Alizarin
286
176
105
75
I
I
194
90
290
145
I
I
263
165
I
196
210
223-224
25 5
110
155
150
I1
I1
I
I
(1,2-Dihydroxyanthrachinon)
Purpurin
(1,2,4-Trihydroxyanthrachinon)
B. 1,8-Dihydroxyanthrachinone
Chrysophanol
Physcio n
Aloeemodin
Frangulaemodin
(syn. Rheumemodin)
Rhein
180
310-321 215
I
60
1
178-180 80
1
207
I1
C. Anthrone bzw. Anthranole
Anthrarobin
(1.2-Dihydroxy-9-anthron)
Anthralin
(1,8-Dihydroxy-9anthron)
Chrysarobin
(Chrysophanol-9-anthon)
149-151
115
Einwaage jeweils 50 fig
Schicht in allen Fallen Kieselgel H F z g
FlieOmittel: I ToIuol-bithylformiat-Ameisensaure(wasserfrei) (60 + 38 + 2)bei KS, 1 x 10 cm.
I1 Petrolather (40-60°)-Essigsaureathylester-Ameisensaure (wasserfrei) (75 + 24 + 1) bei KS.
1 x 10 cm.
+
++
Bemerkenswert ist die thermische Stabilitat der eingesetzten Anthrone bzw. Anthranole, die als Reduktionsprodukte des Anthrachinons unzersetzt transferierbar sind.
Durch Zugabe aquivalenter Mengen konzentrierter Wasserstoffperoxid-Lijsungzur
311178
Thermofraktographie
61
Probe vor der TFG gelingt die Oxidation dieser Substanzen. Die entstehenden Anthrachinone lassen sich dann mittels der TFG-Tragergassublimation auf die DCSchicht bringen und chromatographisch nachweisen. Wie spater gezeigt wird, lafit
sich dieses Verfahren auch direkt auf Drogenmaterial ubertragen.
3. Tragergassublimation reiner Anthraglykoside
Bei der TFG-Untersuchung der Glykoside ergibt sich der bemerkenswerte Befund,
dafi die durch Glykosidspaltung entstandenen Anthrachinone vielfach im gleichen
Temperaturbereich ab 150" auf die DC-Schicht ubergehen wie die freien Verbindungen. Hierdurch ist die Unterscheidung, o b ein Aglykon oder Glykosid vorliegt, zumeist nicht moglich. Aber hier ergibt die TFG der Zuckerkomponenten gute Hinweise zur Kennzeichnung der glykosidischen Verbindungen. Das Auftreten zahlreicher Bruchstucke im Bereich ab 200" zeigt die quantitative Spaltung der Zuckermolekule an. Aus dem mengenmafiigen Vorkommen bestimmter charakteristischer Fragmente lassen sich zudem Informationen uber Zahl und Art der gebundenen Saccharide erhalten.
Die Thermofraktographie von Glykosidverbindungen verschiedener Oxidationsstufen und Bindungsarten verdeutlicht die Zusammenhange zwischen Struktur und
thermischer Stabilitat.
3.1
Thermolyseverhalten monomerer 0-Glykoside
Unter den vorgegebenen TFG-Bedingungen lassen sich 0-glykosidisch gebundene
monomere Anthracenderivate in gezielter Weise in ihre Aglyka spalten. Als Hauptkomponente tritt erwartungsgemiifi das entsprechende Aglykon auf (Tab. 2). Analog zu den Untersuchungen an a-Pyronglykosiden') fuhrt die thermische Glykosidspaltung zu geringen Mengen der um eine Hydroxylgruppe armeren Verbindung. Das
vergleichsweise geringe Auftreten dieser Nebenkomponente gegenuber der des Hauptspaltproduktes und der nahezu ubereinstimmende Thermolysebeginn lassen die Annahme zweier unterschiedlich begiinstigter Spaltungsmechanismen zu. Die bevorzugte Bildung des erwarteten Aglykons kann mit dem Vorliegen vinyloger Carbonsaureester-Strukturen") erklart werden. Danach erfolgt der thermische Bindungsbruch
aufgrund der grofieren Labilitat der glykosidischen Bindung uberwiegend an dieser
Stelle. Die entsprechenden Thermolyseprodukte sind aus der Tab. 2 ersichtlich.
10 B. Eistert, Tautomerie und Mesomerie, Ferd. Enke Verlag, Stuttgart 1938.
62
Stahl und Brombeer
Arch. Pharm.
Tab 2: Thermisches Verhalten von Anthraglykosiden
Glykosid
Schmp.'
TFG-Zonenbeginn
des gebildeten
Anthrachinons bei
Einwaagen von
500 l.(g
TFG-Zonenbeginn
des Nebenproduktes
DCMethode'
185 Pachybasin
180 Phomarin-6met hylather
185 1-HYC~IOXY-3hydroxyme thylanthrachinon
190 Chrysophanol
IV
IV
IV
185
IV
["I
["I
Anthrachinonglykoside
Chrysophanein
Physcionin
246-248
2 35
185
180
Chrysophanol
Physcion
Aloeemodin-8-monoglucosid
222
175
Aloeemodin
Frangulin A
228- 230
185
Glucofrangulin A
215
180
Frangulaemodin
Frangulaemodin
Chrysophanol
und
Phomarin
190
I11
Dianthronglykoside
Sennosid A
Sennosid B
200
180- 84
230
215
Rhein"
Rhein"
147- 49
233
150
160
Aloeemodin'"
Aloeemodin"'
nicht nachweisbar
nicht nachweisbar
IV. V
IV. V
C-Glykoside
Barbaloin
Aloinosid B
-
-
111, VI
111, VI
Schicht in allen Fallen Kieselgel H F m
Fliefimittel: 111 Petrolather (40-6O0)-Essigsaureathylester-Ameisensaure(wasserfrei) (75 + 24 + 1)
bei KS, 1 x 10 cm. IV Petrolather (4O-6O0)-Essigsaureathylester-Ameisensaure(wasserfrei)
(75 + 24 + 1 ) bei KS, 2 x 10 cm. V n-Propanol-Essigsaureathylester-Wasser(40 + 40 + 30) bei
KS, 1 x 5 cm, Toluol-Athylformiat-Ameisensaure(wasserfrei) (75 + 24 + 1) bei KS, 1 x 12 cm.
VI Essigsaureathylester-Methanol-Wasser(77 + 1 3 + 10) bei KS, 1 x 5 cm, Toluol-bithylformiatAmeisensaure (wasserfrei) (75 + 24 + 1 ) bei KS, 1 x 10 cm.
nach saurer oxidativer Spaltung bei Einwaagen von 1,s mg
+*nach basischer oxidativer Spaltung bei Einwaagen von 1 mg.
+
++
3.2
Zur Erfassung dimerisierter Anthraglykoside
Bei den Untersuchungen dimerer 0-Glykoside bestatigen sich die Beobachtungen an
freien Dianthronen, nach denen Dimerisationsprodukte unter den vorgegebenen
TFG-Bedingungen nicht transferierbar sind. Deshalb wird versucht, ein oxidatives,
hydrolytisches AufschluBverfahren mit der Thermofraktographie zu kombinieren.
311178
Thermofraktographie
63
Die erforderlichen chemischen Umsetzungen der Substanzen im Mikromal3stab werden vor der Aufnahme eines TFG in einem Reaktionsschiffchen durchgefiihrt. Dabei
erweist sich das Versetzen der Probe mit einem sauren Oxidationsmittel wie verdunnter Schwefelsaure und konzentrierter Wasserstoffperoxid-lijsung als optimal. Die
gebildeten monomeren, fluchtigen Anthrachinone werden anschliefiend mittels Tragergassublimation auf die DC-Schicht transferiert und im entwickelten Chromatogramm nachgewiesen (Tab. 2).
3.3 Zur thennischen Glykosidspaltung von C-Glykosiden (Glykosylverbindungen)
In gleicher Weise erfordert die TFG der nichtfluchtigen und saurehydrolytisch schwer
spaltbaren C-Glykoside (Glykosylverbindungen) einen oxidativen AufschluB. Die
Umsetzungen der Substanzen mit basischen Reaktionspartnem wie methanolischer
Kaliumhydroxid-Losung unter Zusatz konzentrierter Waserstoffperoxid-losung f ~ ren zum Bruch der C-C-Bindung und zur Bildung fluchtiger Oxidationsprodukte, die
mittels der Tragergassublimation auf die DC-Schicht transferiert werden; der Nachweis der oxidierten Aglyka zeigt die vollzogene Glykosidspaltung an. Entsprechend
der Struktur der C-Glykoside ist nur ein Spaltungsschritt moglich, der zum jeweiligen
Anthrachinonderivat uber die Anthronform fhhrt (Tab. 2).
Wie weitergehende Versuche zeigen, bewirkt ein Basenuberschufi zur Probe die
U b e r f ~ r u n gder gebildeten Aglyka in ihre Phenolate, deren Transfer mittels der
TFG erwartungsgemaB nicht gelingt.
Diese Befunde uber das thermische Verhalten reiner Glykosidverbindungen geben
nicht nur den EinfluB der Strukturgegebenheiten auf die thermische Glykosidspaltung
wieder, sondern zeigen auch die Moglichkeiten auf, die TFG durch Kombination mit
chemischen AufschluBverfahren zur Kennzeichnung nicht transferierbarer Substanzen
anzuwenden. Zudem gestattet die Methode die Anwendung von Sauerstoff als Tragergas, der die Reaktionsablaufe im sauren und basischen Milieu fordert und oxidativ
zur vermehrten Bildung von Thermolyseprodukten beitragt.
4. Zur Thermofraktographie von Drogen mit Anthracenderivaten
a e r das Thermolyseverhalten der Anthraglykoside niedriger Oxidationsstufe liegen
bisher fur Drogen keine Erfahrungen vor. Daher wird vergleichsweise versucht, alle
reduzierten Formen durch Zusatze von Oxidationsmitteln zu den Drogenpulvern
moglichst quantitativ in die entsprechenden oxidierten Formen iiberzuffiren und
diese mittels TFG auf die DC-Schicht zu transferieren. Dieses Vorgehen verlangt
die Klamng der Frage, ob sich in diesen TFG Unterschiede in Zahl, Menge, Ausbildung und Thermolysebeginn der Anthrachinon-Zonen im Vergleich zu denen von
nicht vorbehandeltem Drogenmaterial ergeben.
64
Stahl und Brombeer
Arch. Pharm.
Zur Optimiemng des Nachweises von Frangula-Wirkstoffenmittels TFG
4.1
Fur die gelagerte Droge werden die Aglyka Frangulaemodin, Chrysophanol und
Physcion und die 0-Glykoside Glucofrangulin A und B, Frangulin A und B, Emodinglucosid B, Chrysophanein und Physcionin beschrieben.
Das TFG von Frangulae Cortex (Abb. 1A) zeigt als Hauptkomponente erwartungsgema5 Frangulaemodin im Temperaturbereich ab 185". In ubereinstimmung mit
den Beobachtungen bei der Thermolyse reiner Anthraglykoside steht das gleichzeitige Auftreten einer schwacher polaren Aglykon-Nebenzone, bei der es sich um Chrysophanol handelt. Der dc Nachweis dieses Derivates wird durch die Bildung weiterer
Substanzmengen verstarkt, die als Folge der einsetzenden Glykosidspaltung des
genuin vorliegenden Chrysophaneins zu Chrysophanol entstehen. Ab 190" tritt als
weiteres Aglykon Physcion auf; sein Entstehen bei relativ hohen Temperaturen erklart sich aus der thermischen Spaltung des entsprechenden Glykosids.
hRf'
80
-- A
60
-
LO
-
20
-
U rotviolett
- B
EZZ3 g e l b
rot
=
blou
Abb. I: TFG von Frangulae Cort. (A) und einer gleichartigen Probe nach Zugabe von 50 p1konz.
Wasserstoffperoxid-Lsg. (B).Die vermehrte Bildung von Anthrachinonen unter oxidativen Reaktionsbedingungen ist an dem friihzeitigen Sublimationsbeginn der doppelspindelformigen Zonen von Chrysophanol(1) und Physcion (2) sowie an der Verdickung der Frangulaemodin-Zone
( 3 ) zu erkennen.
T = 3-Farbstoff-Testgemisch;VA = Vergleichsanthrachinongemisch; 1 Chrysophanol; 2 Physcion;
3 Frangulaemodin;4 Rhein; 5 Aloeemodin.
Das TFG einer gleichartigen Drogenprobe ergibt auffallenderweise bei Vorbehandlung mit wenigen Mikrolitern konzentrierter Wasserstoffperoxid-L8sungeine breitere und langere Zonierung des Aglykon Frangulaemodin (Abb. 1B). Bemerkenswert
ist der friihzeitige Sublimationsbeginn des Chrysophanols; sein Auftreten im Bereich
ab 115" setzt das Vorhandensein der freien Verbindung voraus, die unter den gewahl-
311/78
T h e m ofraktographie
65
ten Bedingungen aus ihren Vorstufen entsteht. Im hoheren Temperaturbereich wird
weiteres Chrysophanol als Nebenprodukt bei der Glykosidspaltung von Frangulin
und Glucofrangulin gebildet ;das wird in der abgeschwachten Doppelspindelform
dieser Aglykon-Zone im TFG deutlich. Eine gleichartige Veranderung der PhyscionZone zeigt die zusatzliche Bildung des freien Anthrachinons an.
Diese Befunde unterstreichen, d d durch Zugabe von Wasserstoffperoxid-Losung
zur Probe bei der anschlieaenden Thermolyse vermehrt Produkte hoherer Oxidationsstufe auf die DCSchicht gelangen. Damit ist eine Oxidation genuin vorliegender
reduzierter Verbindungen aus Drogenmaterial mittels TFG moglich.
4.2 TFG yon Rhamni purshianae Cortex; Vergleich hydrolytisch vorbehandelte unbehandelte Droge
Die Rinde des Amerikanischen Faulbaums enthdt ein sehr komplexes Gemisch von
uber 20 Anthracenderivaten. Neben den Aglyka Chrysophanol, Physcion, Frangulaemodin, Aloeemodin und deren Monoglucosiden sind bisher mehrere Dianthron- und
Oxanthronglykoside sowie die C-Glykoside Barbaloin und 1 1-Desoxyaloin und deren entsprechende Glucoside Cascarosid A, B,C und D nachgewiesen worden.
Bei der TFG von Rhamni purshianae Cortex (Cascarae sagradae Cortex) werden
nur die frei vorliegenden und 0-glykosidisch gebundenen monomeren Anthrachinone
erfa5t und mittels Tragergassublimation bzw. -destillation zur DC-Schicht transferiert.
Die thermisch stabilisierte Struktur der Cascaroside, Aloine und Dianthrone mach t
zur Aufnahme des TFG die vorhergehende oxidative Spaltung erforderlich. Unter
den gewahlten Versuchsbedingungen erweist sich ein basenhydrolytischer AufschluB
mit anschlieaender Oxidation der Hydrolyseprodukte als am besten geeignet. Nach
Befeuchten der Probe mit Mikromengen methanolischer Kalilauge und konzentrierhRf
80
- B
-- A
LO 60
20
I
Abb. 2: Vergleich des TFG einer unbehandelten Probe von Rhamni pursh. Cort. (A) mit dem
einer gleichartigen Probe nach basischer oxidativer Vorbehandlung (B). Auffallend der verstlkte Transfer von Chrysophanol ( 1 ) und Aloeemodin (5) nach hydrolytischer und oxidativer Spaltung genuiner, nichtfliichtiger Verbindungen im TFG (B). Benennungen s. Abb. 1
66
Stahl und Brom beer
Arch. Pharm.
ter Wasserstoffperoxid-Losung wird die Thermolyse entsprechend den Untersuchungsbedingungen fur reine C-Glykoside (vgl. 3.3) d u r c h g e f i r t .
Bei den Abb. 2 A und 2 B wird das TFG der unbehandelten Droge dem einer gleichartigen, entsprechend vorbehandelten Probe gegeniibergestellt. Auf beiden Chromatogrammen lassen sich vier Anthrachinon-Zonen erkennen, von denen Chrysophanol
jeweils als Hauptthennolyseprodukt erscheint. I m TFG der in bekannter Weise thermolysierten Droge tritt diese Verbindung in Form einer angedeuteten Doppelspindel
auf; unter den Bedingungen einer basenhydrolytischen Glykosidspaltung erfahrt
der Bereich der ersten Einzelspindel eine sehr starke Zunahme an freiem Chrysophanol, das der gesamten Zone eine langgestreckte A-Keulenform verleiht.
Auch ein Vergleich der Zonenausbildung von Aloeemodin verdeutlicht die in
Menge und Form signifikanten Unterschiede. Das nach hydrolytischer Vorbehandlung des Drogenmaterials aufgenommene TFG gibt die in den niedrigeren Temperaturbereich hineinreichende, vergroBerte A-keulenformige Zone wieder; aus dem fruhzeitigen Sublimationsbeginn von 150" kann auf die vermehrte Bildung von freiem
Aloeemodin als Oxidationsprodukt der Glykosylverbindungen geschlossen werden.
Dagegen differieren die in beiden TFG erscheinenden Aglyka Physcion und Frangulaemodin weder im Zonenbeginn noch in der Zonenausbildung. Diese Befunde bestatigen, daB eine oxidative Basenhydrolyse die C-Glykosidspaltung der genuin vorliegenden Cascaroside und Aloine ermoglicht.
4.3
TFG von Rhei Radix
Bekannt sind in dieser Droge die Aglyka Rhein, Aloeemodin, Frangulaemodin (syn.
Rheumemodin), Chrysophanol und Physcion, die sowohl mono- und diglucosidisch
als auch in Form der Dianthronglykoside Sennosid A, B, C und D in der gelagerten
Droge vorliegen.
4.3.1 Zur Kennzeichnung von Rhei Radix mittels TFG
Das TFG der in bekannter Weise thermolysierten Droge (Abb. 3 A) wird durch die
auffallende Doppelspindelform der Chrysophanol-Zone gekennzeichnet; dieses Zonenbild verdeutlicht eindrucksvoll die un terschiedlichen ubergangstemperaturen des
freien vom urspriinglich glykosidisch gebundenen Aglykon. Die ab 180" eintretende
Glykosidspaltung f&rt zur vermehrten Bildung dieser Substanz und damit zur Verdickung der zweiten Spindel. Ebenso zeigt das bei 210" in Menge und Form ausgepragteste Zonenbild des Anthrachinons Physcion, daf3 dieses Aglykon uberwiegend
durch Glykosidspaltung des genuin vorliegenden Physcionins gebildet wird. In gleicher Weise ergibt sich aus dem Zonenanfang von Aloeemodin dessen Natur als Spaltprodukt der entsprechenden Glucoside. Dagegen laf3t der Sublimationsbeginn von
Frangulaemodin keine Unterscheidung zwischen freiem und durch Glykosidspaltung
entstandenem Aglykon zu.
311/78
67
Thennofraktographie
Uberraschenderweise la5t sich im TFG von Rhei Radix kein Rhein auffinden. Der
Befind, dal3 alle bisher untersuchten monameren Anthrachinon-Aglyka aus Drogenmaterial transferierbar sind, legt die Vermutung nahe, daf3 die Carboxylgruppe im
Rhein die Abtrennung hemmt. Literaturangaben zufolge") sol1 die Substanz in der
Droge groatenteils nicht in ihrer freien Form, sondern als Carboxylat-Anion vorliegen. Vergleichende Untersuchungen von unbehandeltem und mit Mineralsaure vorbehandeltem Pflanzenmaterial zeigen, dai3 Rhein erst nach dem Ansauern der Probe
als deutlich erkennbare Zone im erwarteten Sublimationsbereich auftritt (Abb. 3 A,
umstrichelt gezeichnete Zone). Die zur weiteren Absicherung durchgefiihrten Modellexperimente mit Rhein bestiitigen, d& das Kaliumsalz der TFG nicht zugiinglich ist, wahrend es nach Zugabe aquivalenter Sauremengen wie o-Phosphorsaure
wieder transferierbar wird.
hRf'
- A
80 -
- B
60 40
-
20
-
0 5
T VA
Abb. 3: TFG von Rhei Rad. (A); zum Nachweis des Rheins (4) ist eine vorherige Zugabe von
30 p l o-Phosphorsaure erforderlich (umstrichelt gezeichnete Zone). - TFG von Rhei Rad. nach
saurer oxidativer Vorbehandlung der Probe (B). Im Vergleich zu (A) erkennt man in (B) deutlich
die stiirker ausgebildeten, A-keulenformigen Zonen von Physcion (2) und Rhein (4)sowie den
fruhzeitigen Sublimationsbeginn der Aloeemodin-Zone ( 5 ) . Benennungen s. Abb. 1
Diese Ergebnisse lassen den SchluB zu, dai3 die Alkali- und Erdalkali-Ionen in der
Droge zur Carboxylatbildung f ~ r e und
n sich Rhein somit in dieser Form dem Nachweis mittels TFG entzieht.
4.3.2 Erfassung der Dianthrone in Rhei Radix mittels TFG
Analog zu den Untersuchungen iiber dimere Anthraglykoside (vgl. 3.2) gelingt die
oxidative Spaltung der Rheum-Dianthrone bei der Vorbehandlung der Drogenprobe
mit Mikromengen verdiinnter Schwefelsaure und konzentrierter WasserstoffperoxidLosung. Nach Durchfuhrung der Thermolyse unter reinem Sauerstoff als Tragergas
lafit sich im TFG (Abb. 3 B) ab 220" eine stark ausgebildete Rhein-Zone erkennen.
11 G. Schneider, Pharmazeutische Biologie, S. 111, Bibliograph. Institut, Mannheim-WienZurich 1975.
68
Stahl und Brombeer
Arch. Pharm.
Die Thermolysezonen von Chrysophanol, Physcion und Frangulaemodin zeigen
in beiden TFG weitgehende Ubereinstimmung in Menge und Sublimationsbeginn.
Interessanterweise kann dabei die Umkehrung der Zonenform beobachtet werden;
die auftretenden A-Keulenfomen bzw. die starkere Ausbildung der ersten Spindel
der Chrysophanol-Zone zeigen den vermehrten Transfer freier Anthrachinone an, die
durch die einleitende hydrolytische Glykosidspaltung entstanden sind. Ebenso verdeutlicht die ab 155" beginnende Sublimation des Aloeemodins die verstarkte Bildung des freien Aglykons.
Diese Befunde bestatigen die Untersuchungsergebnisse uber das Thermolyseverhalten reiner Dianthronglykoside; damit ergibt sich fur die TFG eine Moglichkeit
zur Erfassung nichtfluchtiger Anthracenderivate aus Drogenmaterial.
TFC von Sennae Folium und Fructus angustifoliae(Tinnevelly-Droge)
4.4
Die beiden Drogen enthalten die Anthracenderivate Chrysophanol, Aloeemodin und
Rhein in freier und 0-glykosidisch gebundener Form. Weiterhin wird uber das Vorkommen von Physcion und dessen Glykosid Physcionin berichtet. Als wichtigste Inhaltsstoffe werden die Dianthronglykoside Sennosid A, B, C und D genannt.
Aus unseren Untersuchungen uber das thermische Verhalten der Sennoside ergibt
sich die Forderung nach einem einleitenden saurehydrolytischen Aufschlufi der Probe mit anschliefiender Oxidation der Hydrolyseprodukte. Die vollzogene Spaltung
der dimeren Hauptwirkstoffe wird durch den Nachweis des Aglykons Rhein angezeigt.
hRf
- A
80 60
- B
-
LO
-
20
-
t
9
0
0
0
0
0
0
L
Abb. 4: TFG von Sennae Fol.; Probe im sauren Milieu oxidativ vorbehandelt (A). Charakteristisch ist die stark ausgebildete Rhein-Zone (4). TFG von Sennae Fruct. angustifoliae nach saurer oxidative1 Vorbehandlung der Probe (B). Die beiden Drogen konnen an der doppelspindelfijrmigen Physcion-Zone (2) unterschieden werden. Benennungen s. Abb. 1
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Thermofraktographie
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Im TFG von Sennae Folium (Abb. 4 A) tritt Rhein als langgestreckte, E-keulenformige Hauptzone im Bereich ab 205" auf. Es stellt nicht nur das in die oxidierte Form
ubergefihrte monomere Aglykon der Sennoside A und B dar, sondern ist zusatzlich
bei der 0-glykosidischen Spaltung genuiner Rheinmono- und -diglykoside und als
eines der beiden Oxidationsprodukte verschiedener Heterodianthronglykoside entstanden. Bei dem anderen Partner dimerer Heteroverbindungen handelt es sich zumeist um Aloeemodinanthron; unter den vorgegebenen Reaktionsbedingungen wird
es zum entsprechenden Anthrachinon oxidiert und bildet gemeinsam mit freien und
aus 0-glykosidischer Bindung gespaltenen Anteilen die deutliche, bei 160" beginnende
Aloeemodin-Zone.
Der fruhzeitige Sublimationsbeginn (120") von Chrysophanol erklart sich aus der
bereits durch das AufschluSverfahren eingeleiteten Glykosidspaltung des Chrysophaneins; dadurch wird im TFG genuin vorliegendes, freies Dihydroxyanthrachinon
vorgetausch t.
Bei der Gegenuberstellung der TFG von hydrolytisch und oxidativ vorbehandelten
Tinnevelly-Sennesblattern (Abb. 4 A) und -friichten (Abb. 4 B) zeigt sich weitgehende Ubereinstimmung in Menge, Form und Entstehungstemperatur der nachweisbaren
Anthrachinon-Zonen Chrysophanol, Rhein und Aloeemodin. Dennoch ist eine Unterscheidung der beiden Pflanzenorgane auf thermischem Wege an dem Auftreten der
schwach ausgebildeten, doppelspindelformigen Zone von Physcion im TFG von
Sennae Fructus moglich. Bedingt durch die erforderliche Probenvorbehandlung,
durch die bereits eine hydrolytische Spaltung des glykosidisch gebundenen Physcions
eintritt, erscheint dieses Derivat im relativ niedrigen Temperaturbereich, d. h. ab
155".
4.5
Zum Nachweis der C-Glykoside (Glykosylverbindungen) in Aloe capensis
Hauptbestandteile des Anthraglykosidkomplexes der Kap-Aloe sind das C-Glykosid
Barbaloin und dessen 1 1-0-Rhamnoside Aloinosid A und B. Als weitere Anthracenderivate werden Aloeemodin und Chrysophanol in freier und 0-glykosidisch gebundener Form beschrieben.
Bei der TFG einer Aloe-Probe (Abb. 5 A) werden ausschlieBlich die in der Droge vorliegenden freien und zuvor 0-glykosidisch gebundenen monomeren Anthrachinone
erfaBt. Die schwach ausgebildete Aloeemodin-Zone zeigt den geringen Aglykon- und
0-Glykosidgehalt im Untersuchungsrnaterial; dadurch tritt Chrysophanol als uncharakteristische Hauptkomponente auf. Die bei 2 10" ausgepragteste Zonenform zeigt
dessen uberwiegendes Entstehen durch Glykosidspaltung an.
Zum Nachweis des wichtigsten Wirkstoffes, des Barbaloins, wird das Drogenpulver vor der Aufnahme eines TFG mit wenig methanolischer Kaliumhydroxid-Losung
und konzentrierter Wasserstoffperoxid-Losung versetzt. Die Durchfuhrung dieser ba-
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Stahl und Brombeer
Arch. Pharm.
Abb. 5 : TFG von unbehandelter Aloe (A) und einer Probe nach basischer, oxidative1 Vorbehandlung (B). Die Verdickung der beiden Zonen Chrysophanol(1) und Aloeemodin (5) im niedrigen
Temperaturbereich zeigt die Spaltung nichtfliichtiger Verbindungen und deren Oxidation in die
entsprechende Anthachinonform an. Benennungen s. Abb. 1
sischen Oxidation mit nachfolgender Tragergassublimation mit Sauerstoff erfolgt
analog zu den Untersuchungen iiber die Thermolyse reiner C-Glykoside (vgl. 3.3).
Im TFG der offizinellen Kap-Aloe (Abb. 5 B) erscheint das aus Barbaloin oxidativ
entstandene Aglykon Aloeemodin als stark ausgebildete, A-keulenformige Zone im
Bereich ab 160". Die Entstehungstemperatur entspricht der der freien Verbindung.
Strukturell bedingt ist das Fehlen des hydroxylarmeren Derivates.
Die in der Droge vorliegenden Glykosylverbindungen Aloinosid A und B sollten
aufgrund ihrer saurehydrolytischen Spaltbarkeit zu Aloeemodin") auch unter unseren modifizierten TFG-Bedingungen zu ihrem Aglykon abgebaut werden. In der Einzeluntersuchung des nach Horhammer und Mitarb.") isolierten Aloinosids B gelingt
der Nachweis von Aloeemodin durch basenhydroyltische oxidative Glykosidspaltung. Aus diesem Befund kann geschlossen werden, daf3 die beiden Aloin- 11-0-glykoside zur Verstarkung der Aloeemodin-Zone im TFG beitragen.
Zusatzlich erlaubt es unser Verfahren, anhand der Menge und Form dieser Aglykon-Zone Hinweise zur Unterscheidung der beiden Kap-Aloe-Typen A (aloinosidhaltig) und B (aloinosidfrei) zu erhaltenl3>I4).
Als weiteres Anthrachinon tritt ab 115" Chrysophanol auf; sein verstarkter Transfer im niedrigen Temperaturbereich ist auf das vorgeschaltete Aufschlufiverfahren
zuriickzufuhren, durch das bereits eine hydrolytische Glykosidspaltung erfolgt.
Die Arbeit wurde im Rahmen des SFB 5 2 ,,Analytik" in dankenswerter Weise gefordert.
12 L. Horhammer, H. Wagner und G. Bittner, Z. Naturforsch. 19 b, 222 (1964).
13 L . Horhammer, H . Wagner und G . Bittner, Pharm. Ztg. 108, 259 (1963).
14 L . Horhammer, H. Wagner und G . Bittner, Arzneim.-Forsck I S , 537 (1963).
311/78
Thermofraktographie
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Experimenteller Teil
DC-Bedingungen
Es wurde unter Standardbedingungen”) auf Kieselgel60 HF254Schichten mit Petrolather
(40-60°)-Essigsaureathylester -Ameisensaure(wasserfrei) (75 + 24 + 1) 1 x 10 cm oder mit
Toluol-Kthylformiat-Ameisensaure (wasserfrei) (60 + 38 + 1 ) 1 x 10 cm bei Kammersattigung
chromatographiert.
Nachweis
Nach vollstandigem Abdampfen des Fliefimittels wurden im Tageslicht die Farben der Substanz-
zonen betrachtet, dann im langwelligen UV-Licht (366 nm) die Fluoreszenzen der Zonen markiert und anschlieaend im kurzwelligen W-Licht (254 nm) die fluoreszenzmindernden Zonen
gekennzeichnet. Durch Bespriihen der DCSchicht mit 5proz. Kaliumhydroxid-Losung in 5oproz.
Methanol und anschliefiendem 10 min Erhitzen auf 105’ erschienen die Fluoreszenzfarben der
1,8-Dihydroxyanthrachinoneintensiv orange- bis rotviolett.
Zum Nachweis der Zuckerfragmente wurde 5proz. w a r i g e Echtblausalz B-Losung auf das
losungsmittelfreie Chromatogramm gespruht; nach dem Trocknen der Schicht wurde schwach
mit Ammoniak bedampft und sogleich mit wenig konzentrierter Salzsaure nachgespriiht16). In
speziellen Faillen wurde auf die so vorbehandelte Schicht eine ca. loproz. o-Dianisidin-Losung
in Eisessig gebracht und leicht e r w l m t .
Vergleichslosungen
Von den Anthrachinon-Aglyka Chrysophanol, Physcion, Frangulaemodin, Aloeemodin und
Rhein wurden j e 10 mg in 1 ml Dioxan gelost und von diesem Gemisch 1 p1 punkfformig aufgetragen. Von Glucofrangulin A, Frangulin A, Aloin und Sennosid A und B wurden von lproz.
Losungen in Methanol bzw. Tetrahydrofuran jeweils 2 pl punktformig aufgegeben. Je 10 mg
Furfural und 5-Hydroxymethylfurfural wurden in 1 ml Methanol gelost, die Auftragemenge betrug 5 pl punktformig.
Drogenmaterial
Die Drogenproben wurden von der Firma Caesar und Loretz, Hilden-Rhld., bezogen und entsprachen den Anforderungen des DAB 7 bzw. der Ph. Eur. Sie wurden im lufttrockenen Zustand in
frisch gepulverter Form (180) verwendet.
TFG-Bedingungen
Gerat: TASOMAT mit Steuergerat (Hersteller Fa. Desaga, Heidelberg). Die Aufheizrate betrug
4’/min, linear von 50-450’, mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 2,8 mm/min (Stufe 1).
Der Abstand von der Patronenspitze zur DC-Schicht wurde auf ca.0,5 m m eingestellt. TrBgergas: reiner Stickstoff 15-20 ml/min.
15 E. Stahl (Hrsg.), DiinnschichtChromatographie, ein Laboratoriumshandbuch, 2. A d . , Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1967.
1 6 F. Karig, Dissertation Saarbriicken 1973.
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Stahl und Brombeer
Arch. Pharm.
TFC der Anthracendenvate und der entsprechenden Drogen
Fiir die Analysen wurden jeweils 0,05-1,s mg Substanz in 0,l proz. Losung auf gereinigte Quarzwolle aufgegeben bzw. 12 mg Drogenpulver eingewogen, in eine Aluminiumhiilse eingeschoben,
in die TASPatrone eingefuhrt und diese in den Ofen gesteckt.
Oxidative Spaltung nich tfluchtiger Anthracenderivate mittels TFG
Zur sauren oxidativen Spaltung wurden zu 12 mg der Proben 50 pl einer frisch bereiteten Mischung aus 3 N H 2 S 0 4 und 30proz. Wasserstoffperoxid-Losung im Verhaltnis 2 : l gegeben. Die
basische oxidative Spaltung wurde rnit 30 pl einer frisch bereiteten Mischung aus 30proz. Wasserstoffperoxid-Losung und l0proz. methanolischer Kaliumhydroxid-Losung im Verhdtnis 2 : 1
durchgefuhrt.
TFG vorbehandelter Drogen
Die frisch gepulverten Drogen wurden in ein Reaktionsschiffchen (OJ5 mm dickes Nickelblech
oder V2A Stahlblech 8 x 30 mm) gegeben und mittels Mikroliterspritze mit 30-50 pl der sauren oder basischen Reaktionsmittelmischung gut durchfeuchtet. Die Fliissigkeit mui3 vollsttindig
vom Drogenpulver aufgesogen sein, bevor die Probe in eine TAS-Patrone geschoben und der
TFG zugefiihrt wird.
IR -Spektren
Zur Aufnahme der IRSpektren von Zonen wurde die Substanz in KBr transferiert und nach der
MikropreOtechnik") weiterverarbeitet.
Gerat: IRGitterspektrophotometer Modell 257 (Perkin-Elmer, iiberlingen-Bodensee) unter Verwendung des Linsen-Mikroilluminators.
17 E. Stahl und W. Schild, J. Chromatogr. 53, 387 (1970).
Anschrift: Prof. Dr. Dr. h. c. E. Stahl, Im Stadtwald, 66 Saarbrucken.
[Ph 8201
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