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Untersuchungen Uber Inhaltsstoffe von Lippia americana 2. Mitt

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Archiv der Pharrnazie
Februar 1980
313. Band
Heft 2
Arch. Pharm. (Weinheim) 313,97-108 (1980)
Untersuchungen iiber Inhaltsstoffe von Lippia americana, 2. Mitt.1)
Richard Neidlein* und Volker Daldrup**
Pharmazeutisch-Chemisches Institut der Universitaten Karlsruhe (TH) und Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 364, D 6900 Heidelberg
Eingegangen am 9. April 1979
Als weitere Inhaltsstoffe von Lippia americana werden die verschiedenen freien Fettsauren, die
Kohlenwasserstoffe, die Fettsauren des Wachses, die Wachsalkohole, die Aminosauren und Cholin
qualitativ nachgewiesen sowie quantitativ bestimmt.
Isolation and Structure of Substances in Lippia Americana, I1
Free fatty acids, carbohydrates, fatty acids of waxes, alcohols of waxes, amino acids and choline were
determined qualitatively and quantitatively.
In der Fortfiihrung unserer Untersuchungen iiber die Inhaltsstoffe von Lippia
americana') wird im folgenden iiber die Ergebnisse der isolierten Substanzen und ihrer
Identifizierung berichtet.
Nach Auftrennung des Chloroformextrakts in seine sauren (Etherextrakt 1)und seine
neutralen Bestandteile (Etherextrakt 2) wird durch mehrmalige saulenchromatographische Reinigung iiber Kieselgel ein Gemisch freier Fettsauren erhalten. Diese werden mit
Diazomethan in die Fettsauremethylester iiberfiihrt und gaschromatographisch untersucht. Neben der qualitativen Zusammensetzung werden mit Hilfe eines Digitalintegrators
durch Peakflachenintegration auch die einzelnen Anteile quantitativ ermittelt.
Die endgiiltige Identifizierung der in Tab. 1nachgewiesenen Fettsauremethylester wird
durch gaschromatographische Trennung in Kopplung mit einem Massenspektrometer
durchgefiihrt; die einzelnen Ester werden durch ihre Molpeaks und ihre charakteristischen
Zerfallsschemata*) identifiziert .
D e r a n Kieselgel saulenchromatographisch aufgetrennte Etherextrakt 2 enthalt in der
entsprechenden Fraktion F 1 die gesattigten n-Paraffin-Kohlenwasserstoffe, die in den
Pflanzen meist als Gemisch ~ o r l i e g e n . ~ ) ~Die
) ~ )Kohlenwasserstoffe
.
werden diinnschicht0365-6233/80/0202405'7 $02.50/0
0 Verlag Chemie, GmbH, Weinheim 1980
98
Neidlein und Daldrup
Arch. Pharm.
Tab. 1: Gaschrornatographische Auftrennung der Fettsaurernethylester
Methylester
der Fettsauren
Zahl der
C-Atome
der Fettsauren
Retentionszeit
in min.
Vdr rel.
m l x 103
Molpeak
m/e
% - Anteil im
Gesam tgemisch
Myristinsaure
Palmitinsaure
tjlsaure
Stearinsaure
Arachinsaure
Behensaure
Lignocerinsaure
14
16
18
18
20
22
24
3.39
5.41
7.21
7.54
9.61
11.57
13.40
0.45
0.72
0.96
1.oo
1.32
1.53
1.78
242
270
296
298
326
354
382
5.3
56.8
5.6
14.2
7.0
8.3
2.8
chromatographisch an Kieselgel-G-Platten - impragniert mit 10proz. Silbernitratlosung nachgewiesen; urn eventuell doch vorhandene, verzweigte Alkane von n-Alkanen
abzutrennen, wird das Kohlenwasserstoffgemisch nach Brieskorn und Feilner6)bzw. nach
Beck’) rnit Hilfe von Molekularsieben fraktioniert. Die n-Alkane werden in Benzol
zunachst vollig an die Molekularsiebe adsorbiert und anschlieBend mit n-Heptan wieder in
Losung gebracht, wodurch in dem Gemisch keine verzweigten Kohlenwasserstoffe mehr
nachgewiesen werden konnten. Der qualitative und quantitative Nachweis der n-Alkane
erfolgt gc, zur Identifizierung dient die Kopplung mit einem Massenspektrometer; als int.
Stand. dient n-Triacontan. Das Gemisch besteht aus den n-Alkanen der homologen Reihe
von n-Pentacosan C25H52bis n-Tritriacontan C33H68.Die n-Alkane rnit ungerader Anzahl
an C-Atomen bilden rnit nahezu 90 YO den Hauptanteil am Gemisch, und dies stimmt
vollkommen rnit den Angaben in ahnlich gelagerten Fallen8)9)iiberein; es iiberwiegen
demnach bei n-Alkanen pflanzlicher Herkunft die Kohlenwasserstoffe mit ungerader
Anzahl an C-Atomen.
Tab. 2: Kohlen wasserstoffein Lippia americana:
n-Alkan
n-Pen tacosan
n-Hexacosan
nHeptacosan
n-Octacosan
n-Nonacosan
n-Triacon tan
n-Hentriacon tan
n-Dotriacon tan
n-Tritriacon tan
Bruttoformel
Retentionszeit
in min.
Vdr rel.
m l x 10
Molpeak
mle
% - Anteil im
Cesamtgemisch
2.43
2.99
3.64
4.37
5.19
6.09
7.23
8.57
10.29
0.40
0.49
0.60
0.72
0.85
1.00
1.19
1.41
1.69
35 2
366
380
394
4 08
422
436
450
4 64
3.9
1.4
12.4
2.3
25.7
4.2
31.4
2.4
16.3
99
Inhaltsstoffe von Lippia americana
313/80
Die das Wachs enthaltende Fraktion wird uber neutralem Aluminiumoxid saulenchromatographisch gereinigt - man erhalt eine wachsartige Substanz, die mit ethanolischer
Kalilauge verseift wird, wobei anschliefiend daraus die Wachssauren erhalten werden.
Sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Bestimmung der Wachssauren werden
diese mit etherischer Diazomethanlosung in die Methylester uberfuhrt; die Auftrennung
erfolgt gaschromatographisch, die Identifizierung geschieht durch Zumischung authentischer Vergleichssubstanzen bzw. durch Vergleich der Retentionszeiten und der relativen
Retentionsvolumina - Stearinsluremethylester wird als int. Stand. verwendet.
Tab. 3: Fettsauren des Wachses
Fettsauren
Retentionszeit
in min.
Vdr rel.
ml x 103
Molpeak
m/e
% - Anteil im
Gesamtgemisch
0.45
0.72
1.00
1.27
1.53
1.77
242
270
298
326
354
382
23.2
27.6
26.1
6.2
11.8
5.1
~
Myristinsaure
Palmitinsaure
S tearineure
Arachinsaure
Behensaure
Lignocerinsaure
3.45
5.50
7.65
9.73
11.69
13.53
~~~
Das Gemisch der Wachsalkoholacetate wird zunachst an mit Silbernitrat impragnierten
Kieselgel-G-Platten mit Benzol als Laufmittel chromatographiert. Die Identifizierung der
Wachsalkohole erfolgt zunachst gaschromatographisch; anschliefiend wurde eine GCMS-Kopplung mit einer O V 101 Saule und dem Massenspektrometer durchgefuhrt.
Tab. 4 Wachsalkohole
n-Alkohol
S tearylalkohol
Eicosanol-(1)
Docosanol-(l)
Tetracosanol-(l)
Hexacosanol-(1)
Octacosanol-(1)
Triacontanol-(1)
Zahl der
C-Atome
Retentionszeit
in min.
18
20
22
24
26
28
30
3.79
5.21
6.65
8.01
9.4 1
11.19
13.90
m/e
M
0.47
0.65
0.83
1.00
1.17
1.40
1.74
-
25 2
280
308
336
364
392
420
60
% - Anteil im
Gesamtgemisch
9.8
2.3
36.8
4.2
38.2
2.8
3.7
Die durch weitere saulenchromatographische Auftrennung des Etherextrakts 2
erhaltene Fraktion erweist sich nach weiterer Reinigung als P-Sitosterin; IR-, 'H-NMRund Massenspektren der isolierten Substanz mit authentischem 0-Sitosterin stimmen vollig
uberein.
100
Neidlein und Daldrup
Arch. Pharrn.
Verschiedene Arbeitskreiselo)ll) hatten festgestellt, daR neben Flavonen, Alkaloiden
und Terpenen auch Aminosauren zur Charakterisierung der Pflanzenfamilien12) herangezogen werden konnen. Die zuvor mit Chloroform perkolierte Droge wird anschlieaend mit
Methanol perkoliert; der methanolische Extrakt wird eingeengt, dann mit Ethylacetat
ausgeschuttelt und aus der wassrigen Phase wird durch Phenol/Chloroformextraktion die
Aminosaurefraktion gewonnen. Zur analytischen Differenzierung des Aminosauregemisches wird die aufsteigende, zweidimensionale Dunnschichtchromatographie auf
C e l l ~ l o s e ' ~ ) ' ~ ) ' ~eingesetzt,
)'~)
wobei als Leitsubstanzen fur die Zuordnung der einzelnen
Aminosauren 0.025 M Testlosungen verschiedener Aminosauren dienen, die zu beiden
Seiten der Platten mitchromatographiert werden. Hinsichtlich der Laufmittelkombinationen wird das Verfahren nach Haworth und Heathcote17) verwendet.
Zur Detektion der in unterschiedlicher Konzentration vorliegenden Aminosauren
werden drei verschiedene Ninhydrinreagentien verwendet; daruberhinaus wird das
Aminosauregemisch derivatisiert und gaschromatographisch untersucht .Von den bekannten M e t h ~ d e n ' * ) - ~setzten
~)
wir diejenigen der N,O-Trifluoracetylaminosaurebutylester
ein - modifiziert nach MetzZ4).- Ein Vergleich der Retentionszeiten der Aminosaureester
mit jenen der authentischen Ester ermoglichte den Nachweis von 14 Aminosauren.
Tab. 5: Retentionszeiten der Aminosauren in der Gaschromatographie und hR,
Aminosauren auf Cellulose
Aminosauren
Alanin
Glycin
Serin
Valin
$Alanin
Leucin
Isoleucin
Asparagin
Prolin
Glutamin
Methionin
Asparaginsaure
Phenylalanin
Glutaminsaure
-
Werte der
Retentionszeiten
GC
Laufmittel
1
Laufmittel
2
13.12
13.99
15.30
16.07
16.66
18.07
18.35
20.20
22.40
24.17
25.5 0
27.30
27.85
30.43
65
51
50
88
58
95
94
32
67
42
86
56
88
65
27
20
29
47
23
65
62
13
34
16
52
8
64
I
AuBer den Aminosauren wurden papier- und dunnschichtchromatographisch Glukose
sowie Fruktose und als Vertreter basischer Substanzen das Cholin eindeutig nachgewiesen
- mit Dragendorff-Reagen~~~s~~),
sowie nach G ~ n e l i n ~und
~ , aufgrund
~~)
von Vergleichen
der IR-Spektren mit authentischem Cholin.
313/80
Znhalfsstoffe von Lippia americana
101
Der BASF Aktiengesellschaft, dem Verband der Chemischen Industrie - Fonds der Chemie sowie der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wir sehr fur besondere Unterstutzung unserer
Untersuchungen. Herrn Dr. A. Hotzel und Herrn F. Beran fur die Massenspektren, den Herren
Dip1.-Chem. W. Kramer und Dipl.-Chem. G. Schafer fur die 'H-NMR- und fur die "C-NMRSpektren, der BAYER A G und der HOECHST A G fur die Lieferung von Chemikalien.
Experimenteller Teil
Schmp.: nicht korr., Schmelzpunktmikroskop Reichert, Wien. - IR-Spektren: Gratin-Infrared-Spektrometer 177 Perkin-Elmer, Uberlingen. - 'H-NMR- und '3C-NMR: Spektrometer HX-90 E mit
Fourier-Einheit Bruker-Physik AG., Karlsruhe, diente zur Aufnahme der 90-MHz-IH- und 22.63
MHz-I3C-NMR-Spektren, TMS als int. Stand. - - Massenspektren: doppelt-fokussierendes
Massenspektrometer MAT 31 1A Varian, Bremen, dessen inverse Nier-Johnson-Geometrie die
Aufnahme der DADI-Spektren ermoglichte. - C, H, N-Analysen: automatischer Mikroanalysator
Heraeus, Hanau. - Drehwerte: Polarimeter LEP A 2 Zeiss, Oberkochen.
Verhaltnisangaben bei Laufmitteln zur Chromatographie beziehen sich auf (V/V); samtliche
Losungsmittel zur DC entsprechen der Qualitat ,,pro analysi" der Fa. Merck AG. Darmstadt.
Extraktion der Droge Lippia americana
1 kg lufttrockene, gemahlene oberirdische Teile von Lippia americana werden 3 d in einem Soxhlet
von 2 1 Fassungsvermogen mit 5 I Chloroform extrahiert; der Extrakt wird bei 45" Badtemp.
eingedampft; als Riickstand verbleibt eine dunkelgriin gefarbte, zahflussige Masse. Ausb. 36 g
(3.6 %). Der Extrakt wird in eine Saure- und eine Neutralstofffraktion getrennt. Zur Isolierungder Fettsauren
wird der Chloroformextrakt in 21 Ether aufgenommen und siebenmal mit je 300ml 5 proz.
Natriumhydrogencarbonatlosung extrahiert. Unter Eiskuhlung wird die wahige Losung mit
2 N-H,SO, auf pH 4 eingestellt und achtmal mit je 250 ml Ether ausgeschuttelt; die vereinigten
Etherphasen werden mit Wasser neutral gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat sicc. getrocknet,
filtriert und im Vak. bei 35" Badtemp. eingedampft. Ausb. 8.7g (0.87 % bez. auf die Droge) Etherextrakt 1. Der die Neutralstoffe enthaltende Etherextrakt 2 wird ebenfalls mit Wasser neutral gewaschen, mit
wasserfreiem Natriumsulfat sicc. getrocknet, filtriert und eingedampft. Ausb. 25.6 g (2.56 % bez. auf
die Droge) - Etherextrakt 2. Fettsauren: sc Trennung des Etherextrakts 1
Auf einer mit 300 g Kieselgel ,,Woelm" 0.05-0.2 m m beschickten Saule (100 cm X 4 cm) werden
8.7 g Etherextrakt 1 chromatographiert [CH,Cl2/CH3OH ( 9 5 : 5 ) ] . Das Eluat wird mit einem
Fraktionssammler aufgefangen und jedes fiinfte Glas (etwa 30 ml pro Glas) dc untersucht.
DC-Bedingungen: Kieselgel G Fertigplatten ,,Merck AG", Schichtdicke: 0.25 m m ; Laufmittel:
Ether; Spriihreagens: Phosphormolybdansaure.
Es wird das noch verunreinigte Fettsauregemisch erhalten; Ausb. 430 mg (4.9 % bez. auf Etherextrakt
1). - Nach erneuter sc Reinigung iiber Kieselgel ,,Merck AG" (Saule 40cm X 1.5cm) mit
CH,CI,/CH3OH (98:2) erhalt man 310 mg einer reinen Fettsaurefraktion; umkristallisiert aus
Ethanol, weiBe Blattchen. Ausb. 210 mg (2.4 % bez. auf Etherextrakt 1); Schmp. 62-65". IR (KBr):
3025,2930,2865 (OH), 1710 (C=O), l235,1215,1197cm-' (C-H). -
102
Neidlein und Daldrup
Arch. Pharm.
Gc Untersuchungen der freien Fettsauren
Es werden die relativen Retentionsvolumina der einzelnen freien Fettsauren mit jenen authentischer
Fettsauren verglichen, wobei als int. Stand. Stearinsaure dient. GC-Bedingungen: Gaschromatograph
2740 mit Flammenionisationsdetektor und A 25 - Kompensationsschreiber Varian, Bremen. Saule:
2 m Stahlsaule, innerer Durchmesser 3 mm; stationare Phase: 10 % DEGS-PS auf Supelcoport
80-100 mesh. Temp. programmiert von 200-250"; Anstiegsrate 6"/min, anschlieRend isotherm bei
250"; Injektor 260"; Detektor 280". Tragergas: Stickstoff reinst. Stromungsgeschwindigkeit:
30ml/min. Papiervorschub 1 cm/min, es werden 2 pl einer 5 proz. etherischen Losung eingespritzt.
Zur gc Untersuchung der Fettsauremethylester werden 50 mg des Fettsauregemisches in iiblicher
Weise mit Diazomethan in Ether methyliert; weiRe Blattchen aus Methanol. Ausb. 40mg (80 %);
Schmp. 43-45", - IR (KBr): 3025, 2940 (C-H), l715,1658cm-' (C=O). G C der Fettsaureme thylester
GC-Bedingungen: Gaschromatograph HP 5830 A mit Flammenionisationsdetektor und GC-Terminal 18850A Hewlett-Packhard, Boblingen, Saule: 1 m Glassaule, innerer Durchmesser 3 m m ;
stationare Phase: 3 % OV 101 auf Chromosorb W HP 100-120mesh. Temp.: programmiert
150-275", Anstiegsrate 8"/min, anschlieRend isotherm bei 275"; Injektor: 270"; Detektor: 300".
Tragergas: Stickstoff reinst. Stromungsgeschwindigkeit: 31 ml/min. Papiervorschub: 1cm/min. Es
werden jeweils 1pl einer 5 proz. etherischen Losung eingespritzt.
Die Charakterisierung der Fettsauremethylester erfolgt durch GC-MS-Kopplung: MAT 44 mit
Jet-Separator Varian-MAT, Bremen. Anregungsenergie: 80 eV. Temp. der Ionenquelle: 200"; Saule:
2 m Glassaule, inn. Durchmesser 3 m m ; stationare Phase: 3 % OB 101 auf Chromosorb W HP
100-120 mesh. Temp.: programmiert 150-275"; Injektor: 270". Tragergas: Helium reinst. Es werden
jeweils 2 p1 einer 5 proz. etherischen Losung eingespritzt.
Neutrals toffe: n-Paraffine, Wachs, B-Sitosterin
15 g Etherextrakt 2 werden auf einer mit 300 g Kieselgel ,,Woelm" (0.05-0.2 mm)beschickten Saule
(100cm X 4 cm) chromatographiert. Zunachst wird mit reinem Petrolether (60-80") und Ethylacetat
wechselnder Zusammensetzung eluiert; mit einem Fraktionssammler werden pro Glas 25 ml
aufgefangen und jedes dritte Glas dc untersucht:
Fraktion 1-20 Petrolether (60-80"), Fraktion 21-90 Petrolether (60-80") /Ethylacetat (98:2),
Fraktion 91-170 Petrolether (60-80") /Ethylacetat (95:5), Fraktion 171-260 Petrolether (60-80")
/Ethylacetat (90: lo), Fraktion 261-300 Petrolether (60-80") /Ethylacetat (80:20), ab Fraktion 301
Ethylacetat
Die dc Kontrolle wird mit folgenden Entwicklungsgemischen vorgenommen: Fraktion 1-90
Chloroform/Methanol (98:2), Fraktion 91-180 Chloroform/Methanol (95:5), ab Fraktion 181
Chloroform/Methanol (90: 10).
Als Sorptionsmittel werden Kieselgel G Fertigplatten ,,Muck" verwendet; die Detektion erfolgt mit
Vanillin/Phosphorsaure oder konz. Schwefelsaure bei 110".
Aufgrund der dc Untersuchungen teilt man die Eluate in 3 Fraktionen ein: F-1: (Reagensglaser
1 0 4 0 ) , F-2: (Reagensglaser 91-155), F-3: (Reagensglaser 190-225).
Die iibrigen Fraktionen stellten komplizierte Gemische dar, die nicht weiter untersucht worden sind.
313/80
lnhaltsstoffevon Lippia americana
103
n-Paraffine
Die Fraktion F-1 wird eingeengt und zur vollstandigen Reinigung erneut iiber Kieselgel ,,Woelm"
0.05-0.2mm - Saule 40cm X 1.5 cm -mit Petrolether (60-80") chromatographiert. Der aus Aceton
umkristallisierte Riickstand besteht aus perlmuttglanzenden Blattchen: Ausb. 850 mg (5.7 % bezogen
auf Etherextrakt 2); Schmp. 64-66". - IR (KBr): 2958 (C-H), 2919 (CH), 2850 (CH), 1380 (C-H),
730 cm-'. AnschlieBend erfolgen dc Untersuchungen der n-Alkane:
Bedingungen: Schicht: Kieselgel G ,,Merck" impragniert mit 10 proz. Silbernitratlosung; Schichtdikke: 0.25 m m ;Laufmittel: Petrolether (60-80"); Spriihreagens: Vanillin/H,PO,, Detektion bei 110".-
Molekularsiebadsorption
Eine Losung von 400 mg n-Alkangemisch in 20 ml wasserfreiem Benzol wird mit 8 g Molekularsieb 5
,,Merck" - KorngroBe: 0.2-0.5 mm - gemischt, unter Ruhren und RuckfluB 4 d .erhitzt. Nach
Filtration des Benzols vom Molekularsieb wird das Filtrat noch nveimal in gleicher Weise mit
Molekularsieb behandelt. Die an das Molekularsieb adsorbierten n-Alkane werden mit n-Heptan 4 d
unter Ruckflub erhitzt und dadurch wieder freigesetzt.
Gc Untersuchungen der n-Paraffine
Zu den analytischen gc Untersuchungen wird die vom Molekularsieb freigesetzte n-Paraffinfraktion in
Benzol gelost und 1pl einer nahezu 10 proz. Losung eingespritzt.
GC-Bedingungen vgl. Fettsauremethylester.
Temp.: programmiert 250-275", Anstiegsrate 5"/min., anschlieBend isotherm bei 275"; Detektor:
300".
Wachs: Wachssauren und Wachsalkohole
Die Fraktion F-2 wird i.Vak. eingeengt und uber neutralem A1,0, ,,Woelm" (Saule 50 X 2 cm)
chromatographiert. Nach Einengung und Umkristallisation aus Ethylacetat/Acetonitril (1 :5) erhalt
man eine weile, wachsartige Substanz. Ausb. 400 mg (2.6 % bez. auf Etherextrakt 2). - IR (KBr):
2925 (C-H), 2858 (C-H), 1750 (C=O), 1175cm-' (C=O). 200 mg Wachs werden mit 20 ml Ethanol und 0.6 g KOH - gelost in 2 ml Wasser- 2 hunter RiickfluB
auf dem Wasserbad erhitzt. Nach Abkiihlung wird der groBte Teil des Ethanols i.Vak. bei 45"entfernt,
der walrige Riickstand mit 20 ml Wasser verdunnt und viermal mit je 25 ml Ether extrahiert.
Die vereinigten Etherextrakte werden mit Wasser gewaschen, iiber wasserfreiem Natriumsulfat sicc.
getrocknet, filtriert, umkristallisiert; weiBe Blattchen. - Ausb. 76 mg Wachsalkohole (38 %); Schmp.:
59-62". - IR (KBr): 3400-3200 (OH), 2920 (C-H), 2858 (C-H), 1468 (C-H), 1064 cm-' (C-0). Die wal3rige Losung der Kaliumsalze der Wachssauren wird mit 5 N H,SO, angesauert, viermal mit je
25 ml Ether extrahiert, die vereinigten Etherphasen mit Wasser neutral gewaschen, iiber Natriumsulfat sicc. getrocknet, filtriert und der Ether abdestilliert. - Ausb. 85 mg saure Bestandteile (42.5 %);
Schmp. 56-60". -1R (KBr): 2930 (C-H), 2868 (C-H), 1700cm-' (C=O). Die Wachssauren werden mit Diazomethan in die Methylester uberfiihrt, deren Identifizierung und
quantitative Ermittlung erfolgte gc mit GC-MS-Kopplung, wobei als int. Stand. Stearinsauremethylester gewahlt worden ist.
104
Neidlein und Daldrup
Arch. Pharm.
Acetylierung der Wachsalkohole
76 mg des Ausgangsgemisches an Wachsalkoholen werden in 5 ml frisch destilliertem Pyridin gelost,
mit 5 ml destilliertem Acetanhydrid versetzt und 24 him Dunkeln bei Raumtemp. stehengelassen. Das
Acetylierungsgemisch tropft man unter Riihren in eine Eis/Wassermischung; der entstandene
Niederschlag wird mit kaltem Wasser gewaschen. Das nach Trocknen iiber Phosphorpentoxid
erhaltene Acetat wird aus Ethanol umkristallisiert, weiBe Blattchen. - Ausb. 65 mg (85 %); Schmp.
52-57",
Gc Untersuchungen der Wachsalkoholacetate
Die Wachsalkoholacetate werden auch gc mit angeschlossener GC-MS-Kopplung analysiert.
GC-Bedingungen: vgl. Fettsauremethylester. Temp.: programmiert 190-275", Anstiegsrate lO"/min,
anschlieBend isotherm bei 275". Injektor: 280"; Detektor: 300". Tragergas: Helium reinst,
Stromungsgeschwindigkeit 31 ml/min. Papiervorschub 1cm/min. Einspritzmenge: 2 pI einer 10 proz.
Losung in Chloroform. GC-MS-Bedingungen: GC-MS-Kopplung MAT 44 mit Jet-Separator
Varian-MAT, Bremen, Anregungsenergie 80 eV; Temp. der Ionenquelle: 200". Saule: 2 m Glassaule,
innerer Durchmesser 3 mm; stationare Phase: 3 % O V 101 auf Chromosorb W HP 100-120 mesh.
Temp.: programmiert 200-275", Anstiegsrate lO"/min, anschlieaend isotherm; Injektor 280".
Tragergas Helium reinst. Einspritzmenge 2 pI einer 10 proz. Losung in Chloroform.
Isolierung von /3-Sitosterin
Die aus den Neutralstoffen erhaltene Fraktion F 3 wird eingeengt und zur nochmaligen Reinigung
iiber 80g neutralem Aluminiumoxid (Saule 80 X 1cm) mit Benzol chromatographiert und derselbe
Vorgang mehrmals wiederholt. Nach Entfernen des Elutionsmittels und nach dreifacher Umkristallisation aus Ethanol verbleiben farblose Kristallnadeln und Blattchen. Schmp. 139"; Ausb. 90 mg
(0.6 %). Dc der Fraktion F 3
Sorptionsmittel: Kieselgel HF,,, ,,Merck"
Laufmittel: a) Benzol/Aceton (95.5143, b) Chloroform/Cyclohexan/Methanol(60/40/10), c)
n-HexadAceton (60/10)
Spriihreagens: a) konz. Schwefelsaure b) 20 g Antimontrichlorid werden in einem Gemisch aus 20 ml
Essigsaure und 60 ml wasserfreiem sowie ethanolfreiem Chloroform gelost. Detektion: 10 min bei
110".
Die Fraktion F 3 wird nach Liebermann-Burchard sowie nach Salkowski bzw. nach Scherrer - auf
Steroide - untersucht.
C,,H,,O (414.39) Ber. C 84.0 H 12.16 Gef. C 83.7 H 12.41.
Molmasse: Ber.: 414.3861 Gef.: 414.3869 (ms); IR(KBr): 3440(OH), 2965 (CH), 2942 (CH), 1465
(CH), 1445 (CH), 1380(CH), 106Ocm-'(C-O).-MS(lOOeV):m/e(%) = 416(1.6),415 (7.1),414
(21.9, M'), 399 (S), 396 (8.9), 381 (6.5), 329 (14.8), 303 (8.3), 255 ( l l . l ) , 231 (8.9), 213 (14.6).
Aminosauren, Zucker, Cholin
Die Aminosauren wurden auf zwei verschiedenen Wegen aus der Droge gewonnen:
Methode 1: 500 mg luftgetrocknete, gemahlene Droge werden in Zentrifugenglasern mit soviel 75
proz. Ethanol versetzt, daB die gesamte Droge bedeckt ist. Die Mischung wird 2 h mit Hilfe einer
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Znhaltsstoffe von Lippia americana
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Schiittelapparatur extrahiert, anschlieBend wird zentrifugiert und dekantiert; dieser Vorgang wird
zweimal wiederholt. Die darauffolgendevierte Extraktion erfolgt mit heiBem Ethanol; die vereinigten
Ausziige werden bei 45" Badtemp. i.Vak. zur Trockne eingeengt und in 30ml Wasser sowie 30ml
Chloroform aufgenommen. Nach Abtrennung der Chloroformphase wird die waBrige Phase in einem
Schiitteltrichter auf eine mit DOWEX WX 4,100-200 mesh, H+-Form, Kationenaustauscher gefiillte
Saule (30 X 1 cm) gegeben. Es wird solange mit Wasser gewaschen bis das Eluat neutral ablauft (Eluat
I: Zuckerfraktion); anschlieaend wird mit 100ml 2 N-NH, eluiert. Das alkalische Eluat wird bei 50"
i.Vak. eingedampft (Eluat 11: Aminosaurefraktion). Es wird erneut mit Wasser neutral gewaschen,
mit 1 N-HCI die Saule wieder aufgeladen und das Saureeluat bei 50" i.Vak. eingedampft (Eluat 111:
Cholinfraktion).
Methode 2: I m AnschluB an die Chloroform-Perkolation wird mit 5 1 90 proz. Methanol weiter
perkoliert. Das Methanol wird bei 50" Badtemp. i.Vak. abgezogen, die zuriickbleibende waBrige
Losung wird so oft mit 500ml Ethylacetat extrahiert bis die organische Phase nur noch schwach gelb
gefarbt ist. Der Ethylacetatextrakt wird verworfen, die waBrige Phase wird mit je 300ml einer
Mischung aus Phenol/Chloroform-( 1:1 Gew. proz.) viermal extrahiert; der Phenol/Chloroform-Extrakt wird unter Riihren bei 0" in ein Gemisch aus 2 1 Petrolether (60-80") und 11Ether, das lOOg
Hyflo-Super-Gel enthalt, getropft. Der Niederschlag wird mit kaltem Ether phenolfrei gewaschen,
der Ruckstand mit Methanol gelost und i.Vak. eingedampft. Ausb. 9 g (1 % bez. auf Drogenmenge).
Der Extrakt wird in lOOml Methanol wieder gelost, die Losung unter Riihren in 11Aceton getropft,
der dabei entstehende Niederschlag iiber P,O, getrocknet. Ausb. 1.7 g (0.2 % Aminosaurefraktion
bezogen auf Drogenmenge). Die in Aceton geloste Phase wird bei 45" Badtemp. i.Vak. eingedampft.
DC der Aminosaurefraktion:
Die zur D C verwendete Cellulose wird vorher wie folgt gereinigt: lOOg Cellulosepulver MN 300
,,Macherey und Nagel" werden in Methanol suspendiert, 2 h geschuttelt, filtriert und mit folgenden
Losungsmitteln der Reihe nach gewaschen und anschlieBend getrocknet:
1) 800 ml Isopropanol/Essigsaure/Wasser(7: 1 :2)
2) 500 ml Aceton/Wasser (8:2)
3) 400 ml Methanol/ 1 N-HCI (1 : 1)
4) 500 ml MethanoUWasser (1 :1)
5) 500 ml Wasser
6) 500 ml Methanol
7) 500 ml Ethanol
Die Diinnschichtplatten werden 30 h bei Raumtemp. getrocknet.
Die nach Methode I gewonnene Aminosaurefraktion wird erneut in 2ml Wasser gelost; davon
werden 20-25 p1 pro Platte in Portionen von 1p1 1.5 cm vom unteren und seitlichen Rand entfernt
aufgetragen. Der Fleckendurchmesser sollte weniger als 3 mm betragen; als Vergleichssubstanzen
dienen 0.025 M Aminosaurelosungen in 10 proz. Isopropanol unter Zusatz von 1 Tropfen 2 N-HC1,
von denen 5 pl aufgetragen werden. Es wird anschlieBend mil einem Kaltluftstrom getrocknet.
Bedingungen fur die zweidimensionale DC:
Laufmittelkombination fur die erste Dimension:
Isopropanol/n-Butanol/l N HCI (60: 15:25). Die Laufrichtung der ersten Dimension sollte immer
mit der Streichrichtung identisch sein. Nach der Entwicklung der Platten in der ersten Dimension
werden diese 15 min im Kaltluftstrom und 15min bei 50" getrocknet.
106
Neidlein und Daldrup
Arch. Pharm.
Laufmittelkombination fur die zweite Dimension:
tert.-Amylalkohol/n-Butanol/Aceton/Methanol/Wasser/waBrige34
proz.
NH,-Losung
(70:28:14:7:21:34); die Platten werden30min beiSO"getrocknet,dieLaufstrecken betragen 13cm.
Nach Entwicklung der zweiten Dimension wird nochmals in der ersten Dimension entwickelt. Zur
Kammersattigung verbleibt jede Laufmittelkombination nach der Entwicklung in der Kammer und
wird erst kurz vor Gebrauch erneuert. Als Detektionsreagenzien werden folgende Gemische
verwendet:
1) Eine Losung von 0.1 g Ninhydrin in 70 ml wasserfreiem Ethanol, 2.9 m12.4.6-Trimethyl-pyridin
und 21 ml Essigsaure: die Detektion der Platten erfolgt bei 90".
2) a) Eine Losung von 0.1 g Ninhydrin in 50 ml wasserfreiem Ethanol, 2 m12.4.6-Trimethyl-pyridin
und 10 ml Essigsaure.
b) Eine Losung von 0.5 g Kupfer(I1)-nitrat in 50 ml wasserfreiem Ethanol.
Die Losungen 2a sowie 2b werden im Verhaltnis 50:3 gemischt, die Detektion der Platten erfolgt bei
90".
3) Zu einer Losung von 0.5 g Cadmium-acetat in 50 ml Wasser werden 10 mi Essigsauregegeben und
mit Aceton zu 500 ml aufgefiillt, anschlieBend werden 200 mg Ninhydrin in 100 ml dieser Mischung
gelost, die Detektion der Platten erfolgt bei 60".
4) 0.2 g Isatin werden zu 4001111 der unter 3) beschriebenen Acetatlosung gegeben.
Gc Untersuchung der Aminosaurefraktion
Zur weiteren Reinigung werden 500 mg Aminosaurefraktion nach Methode 2) mit l 0 m l 1 proz.
Pikrinsaurelosung versetzt, zentrifugiert, der uberstand auf eine Saule (30 X 1cm) mit Kationenaustauscher Amberlite G C 120 I gegeben, mit Wasser wird neutral gewaschen und mit 2 N-NH, eluiert.
Ausb. 75 mg (15 %). Zur Derivatisierung der Aminosauren werden 50 mg des iiber P,O, getrockneten und gereinigten
Aminosauregemisches in einem Reaktionsglaschen (9 X 0.4cm) mit 0.41111 3.5 N-HCI in dest.
n-Butanol 30s mit Ultraschall bestrahlt, 15 min bei 100" gehalten, erneut 30s mit Ultraschall
behandelt und nochmals 15 min bei 100" verestert. Das n-Butanol wird bei 70" unter Stickstoff
entfernt, der Ruckstand wird in 0.2 ml eines Gemisches aus CH,CI, und Trifluoracetanhydrid (5: 1)
aufgenommen, das Reaktionsglaschen zugeschmolzen, 15 s mit Ultraschall behandelt und anschlieBend 10min bei 150" derivatisiert; das Reaktionsgemisch wird unter Stickstoff entfernt, der
Ruckstand in 0.15 ml CH,CI, aufgenommen und 1 PI dieser Losung dann sofort gc untersucht:
GC-Bedingungen: Gaschromatograph HP 5 830 A mit stickstoffspezifischem Detektor und GC-Terminal 18 850 A der Fa. Hewlett-Packard, Boblingen. Saule: 50 m Glaskapillarsaule OV 3; Temp.
programmiert 100-250", Anstiegsrate 5"/min, anschlieBend isotherm bei 250". Injektor: 250";
Detektor: 250", Tragergas: Stickstoff reinst, Stromungsgeschwindigkeit 1ml/min.
Zuckerfraktion: Das Eluat 1 der nach Methode 1 erhaltenen Aminosauren wird bei 50" Badtemp.
i.Vak. eingedampft, in 1ml Wasser aufgenommen und pc sowie dc analysiert.
Bedingungen zur PC
Papier: Macherey und Nagel MN 261; Laufmittel: n-Butanol/Essigsaure/Wasser (4/1/5). Spriihreagens: AniliniPhthalsaure-Losung. Detektion: bei 105". -
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Inhaltsstoffe von Lippia americana
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Bedingungen zur DC
Schicht: Cellulose-Fertigplatten ,,Merck", ohne Fluorescenzindikator, Schichtdicke: 0.10mm;
Laufmittel: n-Butanol/Essigsaure/Wasser (6/2/2).Spriihreagens: Anilin-Phthalsaure-Losung; Detektion: 110".
Testlosung fur PC und DC
1 proz. Losung von Glukose und Fruktose in einem Gemisch aus 96 proz. Ethanol und Wasser (9/1);
Auftragsmenge: jeweils etwa 0.5 pl.
Cholin
Die verschiedenen nach den Methoden 1 sowie 2 erhaltenen Cholinfraktionen werden pc und dc
untersucht.
DC-Bedingungen
Schicht: Cellulose-Fertigplatten ,,Merck", ohne Fluorescenzindikator, Schichtdicke 0.10mm; Laufmittel: Essigsaure/Aceton/Methanol/Benzol(5/5/20/70).
Spriihreagens: Dragendorff-Reagens, Tauchlosung von der Papierchromatographie. -
PC-Bedingungen
Papier: Macherey und Nagel MN 261 ;Laufmittel: n-Butanol/Essigsaure/Wasser (4/1/2),
aufsteigende Methode. Tauchlosung: Dragendorff-Reagens: 2.6 g hasisches Wismutcarbonat, 7 g Natriumjodid
und 25ml Essigsaure werden gemischt und einige min erhitzt. Das Gemisch wird iiber Nacht
stehengelassen, anschlieaend vom ausgefallenen Natriumacetat abfiltriert. 20 ml des Filtrats werden
mit 80ml Ethylacetat gemischt (Stammlosung); anschlieaend werden 20 ml dieser Stammlosung,
50ml Essigsaure und 1201111 Ethylacetat gemischt sowie mit 5 m l Wasser versetzt. Nach der
Entwicklung wird das Chromatogramm mit einem Fohn getrocknet.
Testlosung fur PC und DC. 1 proz. Losung von Choliniumchlorid in Wasser. Auftragsmenge: jeweils
etwa 0.5 pl.
Cholin-Dipikrylaminat: 1 g der Cholinfraktion wird mit einer waarigen Magnesium-dipikrylaminatlosung versetzt, kurz aufgekocht, der Niederschlag nach dem Erkalten dreimal aus Wasser umkristallisiert; feine rote Nadeln. Ausb. 360 mg (9%); Schmp. 232.5-233.5".C,H,,NO C12H,N,0,, (542.4)
Ber. C 37.6 H 3.32N 20.6 Gef. C 37.8 H 3.23 N 20.4.
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Studies on Condensed Triazines as ChemotherapeuticAgents, II”
Synthesis of 1,2,4-Triazin0[5,6-b]indolesand Related Compounds
Vishnu Ji Ram
Department of Chemistry, S. C. College, Ballia (U.P.), India
Eingegangen am 25.April 1979
1,2,4-Triazino[5,6-b]indolesand their derivatives are prepared by the cyclisation of isatin
3-thiosemicarbazone (1) followed by condensation and displacement reactions. Condensations of
3-hydrazino-1,2,4-triazino[5,6-b]indole(4) with ethoxymethylenemalononitrile, ethyl ethoxymethylenecyanoacetate, acetylacetone and methyl bis(methy1mercapto)methylenecyanoacetate yield
0365-6233/80/0202-0108$02.50/0
0 Verlag Chemie, GmbH,Weinheim 1980
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