449 Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel. E. H e r t e 1, Ztsch. physikal. Chem., BodensteinsFestband, S. 267 (1931). R. F i s c h e r und A. K o f 1 e r , Arch. Pharmaz. u. Ber. Dtsch. Pharmaz. Ges. 270, 207 (1932). W. H a a s , Mikrochemie, EmichzFestschrift, S. 83 (1930). 5) 6) L. K o f 1 e r und H. H i 1b c k , Mikrochemie 8, 38 (1931). 7 ) L. K O f I e r , Arch. Pharmaz. u. Rer. Dtsch. Pharmaz. Ges. 270, 293 (1932). 8) I. H e r z o g , Apoth.sZtg. 37, 415 (1922). 9) E. S t a r k e n s t e i n , Therapeut. Halbmonatsh. 35, 629 (1921). 10) E. H e r t e 1, Ztschr. physikal. Chem. 11, 279 (1930). 3) 4) * Z u r Tafel. A b b. 1 bis 4. Vakuumsublimat der Molekulverbindung, Schmelzvorgang. A b b. 1: bei Zimmertem eratur. A b b. 2: bei 1170. Die fristalle vollkommen geschmolzen. In einzelnen Tropfen beginnen sich bereits Veronalkristalle zu bilden. A b b. 3: bei etwa 1200. Die Veronalkristalle in den Tropfen sind bereits gewachsen und haben sich vermehrt. Uber Schmelztropfen, die das Deckglas nicht beruhren, groRere Sublimationstropfen. A b b. 4: bei etwa 1250. Ein Teil der Tropfen ist durch seitliches Abs flieRen aus dem Gesichtsfeld verschwunden. Die Spuren sind frei von Sublis mationstropfen. Die ubriggebliebenen Schmelztropfen encheinen auf der Photographie deshalb dunkler. weil sie in Wirklichkeit eine gelbe Farbe an5 genommen haben. A b b. 5: ein glasig erstarrter Schmelztropfen der Molekulverbindun bei Zimmertemperatur. Darin vorwiegend Tafelchen von rechteckigem Urnriff, die aus der triklinen Form des Veronals bestehen. A b b. 6: Schmelztropfen der Molekulverbindung bei etwa 1250. Vorr wiegend monokline, jedoch such trigonale Veronalkristalle sichtbar. 487. Julius August Muller: Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel, Viscum album L. Auszug aus der Habilitationsschreift. (Mitteilung aus dem Institut fur Pharmazie und Nahrungsmittelchemie der Universitat Halle. Direktor: Prof. Dr. C. A. R o j a h n.) Eingegangen am 22. Juli 1932. Die der Familie der Loranthazeen angehorende w e i I3 f r ii c h 5 t i g e oder n o r d i s c h e M i s t e l , V i s c u m a l b u m L., wird seit Jahrhun,derten in der Volksmedizin gebraucht. Nachdem in neuerer Zeit zuerst G a u t i e r I) die Aufmerksamkeit der wissenschaftlichen Medizin auf diese Pflanze gelenkt hatte, ist die Mistel haufiger Gegen: stand pharmakologischer Untersuchungen gewesen. Die von G a u : t i e r bei Verwendung der frischen Pflanze beobachtete Blutdrucks I) Semaine medicale 1907, 513; Gazette des hbpitaux 1907, Nr. 119; Nous veaux rembdes, Nr. 23, 529. Arehiv und Berichts 1932. 30 450 Julius August Miiller senkung wurde dabei von einigen Forschern bestatigtl). Andere Untersucher3) aber konnten keine blutdrucksenkende Wirkung finden; sie stellten jedoch eine digitalisartige Wirkung fest. Uber die Chemie der Mistel ist wenig bekannt. Nachdem P. R e i n s c h 4) sich mit dem Klebstoff der Mistel beschaftigt hatte, untersuchte M. L e r i n c e 6) den Halb arasit eingehender. Er fand K auBer den von R e i n s c beschriebenen Stolen - Viscin, Viscautschin. Viscinsaure - ein Alkaloid, ein Glukosid und einen Harzkorper, welche Produkte er alle als ,.aktiv" bezeichnete; aber nur uber die Gewinnung des Alkaloides, einer fliichtigen Base von der Formel CaHllN, machte er nahere Angaben. T a n r e t 8 ) isolierte i.Inosit und rac. Inosit, E. J. v a n I t a 11 i e 7 ) Urson. Zuletzt wurde die Mistel von Josef E i n 1e g e r , Jolantha F i s c h e r und Julius 2 e 11 n e r 8) eingehender untersucht; sie fanden einen wachsr artigen Stoff, Schmp. 55 bis 600, Fettsauren, einen amorphen Harzkorper und einen kristallinen Harzalkohol, Visciresinol, Schmp. 274 bis 2760, ClaH280Z, ferner Glukose, Cholin und ein pektinartiges Kohlenhydrat. Sie konnten weder Saponine noch Gerbstoffe nachweisen und auch die von L e p r i n c e beschriebene Base nicht wiederfinden. Es schien mir nun von allgemeinem Interesse, uber die Inhalts5 stoffe der nordischen Mistel, insbesondere aber uber die Natur jener Stoffe, die die beobachtete Blutdrucksenkung bewirkten, mehr zu erfahren. Ich habe daher, einer Anrcgung von Herrn Prof. Dr. C. A. R o j a h no) folgend, die Untersuchung der Mistel von neuem in Angriff genommen. Fur meine Untersuchungen standen die PreBsafte zweier verr schiedener Ernten'O) - der Jahre 1928129 und 1929130 - von auf Apfelbaumen gewachsenen Misteln zur Vcrfugung, die durch gutige Vermittelung von Herrq Prof. R o j a h n von der Firma Johannes B u r g e r in Wernigerode geliefert worden warenl'). Der Grundgedanke, der meine Untersuchungen vorherrschend beeinflufite, war, den oder die blutdrucksenkenden Stoffe anzureis E. A. F u b i n i und L. A n t o n i n i , Arch. Farmacol sperim. 12, 450 2) $1911). - 0. B a r b i e r i , ebenda 14, 30 (1912). - J. N o 11 e , Arch. exp. athol. Pharmakol. 158, 90 (1930). s) E b s t e r und J a r i s c h , ebenda 145, 295 (1929). 4) Chem. Ztrbl. 1861, I, 148. 8) Compt. rend. Acad. Sciences 145, 940 (1907). 6 ) Ebenda 145, 1196 (1907). 7 ) Pharmac. Weekbl. 58, 824 (1921). 8 ) Monatsh. Chem. 44, 277 (1924). 0 ) Es ist mir eine angenehme Pflicht, Herrn Prof. Dr. C. A. R o j a h n fur die Uberlassung dieser Arbeit und fur das, Interesse, das er an ihr ges nommen hat, meinen herzlichsten Dank auch an dieser Stelle zum Ausdruck zu bringen. 10) In folgendem mit Saft I und Saft I1 bezeichnet; sie werden getrennt behendelt, da sich bei der Aufarbeitung bemerkenswerte Unterschiede gezeigt haben. 11) Auch an dieser Stelle mochte ich nicht unterlassen, der Firma Johannes B ii r g e r , Ysatfabrik, G. m. b. H. in Wernigerode (Harz), fur die Uberlassung der MistelpreBsLfte, sowie fur die Bereitstellung groBerer Gelds mittel, die die Durchfuhrung der Arbeit ermoglicht haben, herzlichst zu danken. 45 1 Z u r Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel. chern, zu isolieren und, wenn moglich, zu identifizieren. Die Frage nach dem wirksamen Prinzip der Mistel konnte aber nur dann be5 antwortet werden, wenn meinen Arbeiten pharmakologische Unters suchungen parallel liefenO*).Zu diesem Zwecke wurden die aus dem PreBsaft gewonnenen Fraktionen und Niederschlage mit physiolos gischer Kochsalzlosung auf eine dem ursprunglichen Saft ensprechende Konzentration gebracht und fur den Tierversuch verwendet. Im ganzen wurden etwa 90 Praparate pharmakologisch gcpruft. Sowohl Saft I als auch Saft I1 bewirkten eine erhebliche B l u t drucksenkung, zeigten aber zugleich auch eine Herzschadigung, die oft zum Tode des Tieres fuhrte. Beim Kaninchen betrug die dosis letalis 0.01 ccm/kg Tier (intravenos), 0.05 ccm/kg Tier (subkutan), die eben den Blutdruck - urn etwa 10% senkende Gabe 0.001 ccm/kg Tier (intraven6~)'~). Bei dem Bestreben. die Toxizitat zu verringern, wurde schliel3lich eine Fraktion, F. A. 8113, erhalten, deren ,,dosis letalis minima 2.5 ccm/kg bei intravenoser Darreichung"1J) be5 trug. ,,Subkutan wurden noch 10 ccm/kg gut vertragen. Die dosis efficax im Blutdruckversuch betragt 0.001 bis 0.0025 ccm/kg"l6). Die Aufarbeitung des Mistelprekaftes bereitete erst einige Schwierigkeiten, da g r o k Mengen - 57 kg Saft I und 50 kg Saft I1 eines wasserigen Pflanzensaftes verarbeitet werden mufiten, der noch alle naturlichen Inhaltsstoffe enthielt. Wesentlich schien es .mir dahcr, zunachst die recht hohen Trockenriickstande der Safte Saft I: 11.55% Trockenruckstand, 1.31% Asche; Saft 11: 13.53% bzw. 1.09% - zu vermindern, ohne ,dabei die physiologisch wirksamen Bestandteile, die schon durch einfaches Erhitzen zerstort werden, zu schadigen. Orientierende Versuche, die Wirkstoffe mit orgas nischen, mit Wasser nicht mischbaren Losungsmitteln auszuschutteln, fuhrten zu keinem Ergebnis, und der Gedanke, etwa mit MethanoI oder Athanol die Hauptmenge der Salze, EiweiBstoffe usw. nieders zuschlagen, hatte wenig Verlockendes fur sich, d a hierzu ungeheure Mengen dieser Alkohole notwendig gewesen waren. Ich habe daher den Mistelsaft zuerst bei sehr niedriger Temperatur im Vakuum bis zur Konsistenz eines dicken Sirups eingedampft und den erhaltenen Ruckstand 1 mit Methanol sowie Athanol behandelt. Ergebnis der Aufarbeitung des Saftes I (Ernte 1928/29). Der von Saft I gewonnene Ruckstand 1 war nicht mehr toxisch; aus ihm wurde durch zur vollstandigen Fallung ungenugende Mengen 1 2 1 Herr Prof. Dr. med. M. K o c h m a n n hatte die Freundlichkeit, diese ntersuchungen durchzufuhren; er hat daruber im Arch. exp. Pathol. Pharmakol. 161, 553 (1931) bereits berichtet. Ich mochte nicht verfehlcn Herrn Prof. Dr. K o e h m a n n fur seine Ratschliige und fur seine mannigr fachen Anregungen, die mir wahrend unserer engen Zusammenarbeit zugute gekommen sind, meinen aufrichtigen Dank auch an dieser Stelle auszusprechen. 13) K o c h m a n n , Arch. exp. Pathol. Pharmakol. 161, 558 (1931). Diese Zahlen gelten fur Saft 11. 14) Es war das 81. Praparat, das untersucht wurde; F.A.sFiltrat von Aluminiumhydroxyd und Alkoholfiillung (siehe spiiter). 15) K o c h m a n n , 1. c. 30' 452 Julius August Miiller Methanol 3.16% eines braunen, physiologisch unwirksamcn Nieders schlages (Fallung 1) erhalten. Durch weiteren, nunmehr zur volls standigen Fallung ausreichenden Zusatz von Methanol zum Filtrat fie1 noch 0.386%als braunes Pulvcr (Fallung 2) aus, das blutdrucksenkend wirkte, wenn auch bcdeutend schwacher als der ursprungliche Saft. Etwa die gleiche Wirkung zeigte das Filtrat von Fallung 2, das nach Entfernung des Methanols mit Athanol versetzt wurdc. Der hierbei gcwonnene sirupose Niederschlag (Fallung 3) war wirksam, das Filtrat (Restfiltrat) hicrvon ganzlich unwirksam. Versuche, aus den Fallungen 2 und 3 die wirksamen Stoffe oder auch andcre chemisch charakterisierbare Korper zu gewinnen, fuhrten mcist zu amorphen, oft hygroskopischen Produktcn, die keine physio; logische Wirkung mehr hatten. Ebcnsowcnig lieBen sich Stoffe alkas loidischer Natur isolieren. Nun gibt K o b e r t in einer brieflichen Mitteilung an v. T u b e u f 18) an, da8 in der Mistel zwei Saponine enthalten seien, und K o f 1 e r 17) fiihrt ein saures und ein neutrales Saponin an. B a r b i eri18) hat durch Fallung mit neutralem und mit basischem Bleiazetat zwei weiRe amorphe Produkte ers halten, von denen er aber ausdriicklich sagt, da8 dieselben keine Saponine seien. Um diese Widerspriiche zu klaren, habe ich zunachst den Saft auf hamolytische Wirkung untersucht. Das Ergebnis war negativ. Darauf habe ich die mit neutralem und mit basischem Bleiazetat ers haltenen Niederschlage nach dem Entbleien erst mit Methanol, dann mit Wasser extrahiert. Die getrennt untersuchten Ausziige zeigten keinerlei hamolytischc Wirkung. Auch Fische, die gegen Saponine recht empfindlich sind, reagierten in keiner Weise, wenn man sie in Wasser brachte, dem diese Auszuge, selbst in groBerer Menge, zur gesctzt waren. Die von B a r b i e r i erhaltenen Produkte sollen, wie er angibt, stark wirksam gewesen sein. Demgegenuber waren aber die von mir erhaltenen Extrakte, desgleichen das von den Bleiniederschlagen ers haltene Filtrat wirkungslos. Wenn nun auch in den wirksamen Fraktionen die blutdruckr senkenden Stoffe wesentlich angereichert worden waren - in Fallung 2 auf das etwa 300fache -, so waren doch alle Versuche, dieselben zu isolieren, fehlgeschlagen. Immerhin hatten die sehr zeitraubenden Arbeiten gelehrt, da8 die Wirkstoffe hochst unbestandig sein mufiten; denn schon durch einfaches Erhitzen, sowie bei noch so schwachem Alkalischmachen mit Soda, selbst in der Kalte, geht die physiologischc Wirksamkeit verloren. Diese Beobachtungen stimmen mit denen B a r b i e r i s lo) iiberein. Ganz ohne Ergebnis waren die Arbeiten mit Saft I jedoch nicht verlaufen. Nach dem Einengen des Filtrates von Fallung 1 schicden sich bei einr bis zweiwochigem Stehen kleine nadelf ormige Kristalle 16) Karl Freiherr v. T u b e u f , Monographie Berlin, 1923, 43. 17) Die Saponine, Wien 1927, 24. 18) 1. c. 19) 1. c. der Mistel, Miinchens Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel. 453 aus, die als das Magnesiumsalz der inaktiven Athylidenmilchsaure20) erkannt wurden. Bei der Art der Gewinnungzl) des Magnesiumlaktates kann kein Zweifel sein, d a 8 dieses Salz nicht etwa erst sekundar bei der Aufarbeitung entstanden ist, sondern d a 8 e s als solchcs schon im Mistelsaft vorliegt. AuRer diesem Magnesiumsalz wurde noch drMannit isoliert, der bei mehrwochigem Stehen des eingedampften ,,Restfiltrates" in Ger stalt langgestreckter, sechscckigcr Blattchen auskristallisiertea*). E r g e b n i s d e r A u f a r b e i t u n g d e s S a f t e s I1 (E r n t e 1929130). Ebenso wie Saft I wurde auch Saft I1 zunachst im Vakuum mogs lichst weit eingedampft. Nun war schon bei Saft I beobachtet worden, da8. die zuletzt ubergehenden, wasserigen Anteile sauer reagierten. Damals war die nahere Untersuchung des Destillates unterblieben; sie wurde jetzt nachgeholt. Das zum Neutralisieren dienende Bariumkarbonat loste sich auf, so da13 wahrscheinlich eine einbasische Saure vorlagZJ). Beim Eindampfen der filtrierten Losung erhielt man das Bariumsalz in Form nadeligcr Kristalle, die ein Mol. Kristallwasser enthielten. Es wurde als Bariumazetat erkannt. D e r M i s t e l s a f t e n t h a l t d e m s nach freie Essigsaure. Wie friiher bei Saft I wurde auch bei der Aufarbeitung von Saft I1 mit ungenugenden Mengen Methanol Fallung 1 erhalten, dic, wie ers wartet, physiologisch unwirksam war. Weiterhin wurde der Gang der Aufarbeitung aber dahin abgeandert, d a 8 der Abdampfruckstand von Fallung 1 sofort mit Athanol behandelt wurde. Dadurch wurden Fallung P)und 3 vereint gewonnen, in denen nach der mit Saft I gemachten Erfahrung die gcsamten physiologisch wirksamen Stoffe enthalten sein sollten. U b e r r a s c h e n d e r w e i s e t r a f d i e s e E r w a r t u n g n i c h t z u . Die Fallung war vielmehr t o x i s c h und erzcugtc im Tierversuch uberhaupt k e i n e Blutdrucksenkung. D a r fur war aber jetzt das Filtrat von den Fallungen s e h r w i r k s a m . Ein Grund fur dieses auffalligc Verhaltcn des Saftcs 11, das zu dem des Saftes I in striktem Gegensatz stand, war nicht crkcnnbar. Es mu8 noch erwahnt werden, dai3 in dem ebcn bezeichneten Filtrat sich noch eine merkliche Toxizitat feststellen liei3. Auch hier zcigte Saft I1 ein anderes Verhalten als Saft I, bei dem nach dem Eindampfen die toxischen Eigenschaften vollig vers schwunden waren. -0) Uber das Vorkommen von inaktiver Milchsaure in hoheren Pflanzen; vgl. Hartwig F r a n z e n und Emmi S t e r n , Ztschr. physiol. Chem. 115, 270. 21) Siehe Versuchsteil. Siehe Versuchsteil. 23) Nach Ernst W e i t z und Hellmuth S t a mm . Ber. Dtsch. Chem.. Ges.~ 61, ilk, besteht die ,,sonst allgemein giiltige Kegei", da8 Bariumsalze einr basischer Sauren in Wasser lijslich, solche mehrbasischer Sauren aber schwers oder unloslich sind. Auch die organischen Sauren ordnen sich, allerdings mit Ausnahmen, dieser ,,BariumsalzrRegel" unter. 24) Fallung 2 war in Xthanol auch unloslich. 22j . 454 Julius August Miiller Durch Behandeln des ursprunglichen Saftes mit frisch gefalltem, neutralem Aluminiumhydroxyd lie8 sich die Toxizitat erheblich ver. mindern, und durch darauf folgende Fallung mit Xthanol ging sie noch weiter zuruck. In dem Filtrate von dieser letzten FaIlung hatten wir nun einen weitgehend gereinigten Saft in Handen, der fast frei war von toxischen Nebenwirkungen. Diese mit ,,F.A. 81"z5) be9 zeichnete Fraktion ergab im Blutdruckversuch eine Kurve, die einer solchen gleich war, wic man sie nach Injektionen von Azetylcholin oder anderen Cholinderivaten erhalt. DaB die Mistel Cholin enthalt, haben schon E i n l e g e r , F i s c h e r und 2 e 11 n e r festgestellt. Dieser Befund konnte be. statigt werden; er uberrascht nicht, da Cholin ein unspezifischer und in der ganzcn organischen Natur verbreiteter Stoff ist. Nun setzt auch Cholin den Blutdruck herab; man hatte also wohl daran denken konnen, diesem Stoff die pharmakologische Wirkung zuzuschreiben. Nach L e H e u x 2 7 ) wird die Wirkung des Cholins aber erst bei sehr groi3en Gabcn erkennbar, wahrend 'die Ester desselben (besonders Azetylcholin) schon in auBerst geringen Mengen auf den Kreislauf einwirken. Cholin selbst konnte daher fur die beobachtete physiologische Wirkung nicht in Frage kommen. Auch Histamin schied aus, da die Blutdrucksenkung durch Atropin aufgehoben werden konnte, was wohl bei Cholin und seinen Derivaten, nicht aber bei Histamin moglich istZ7). Aus diesen Grunden muate es sich um Dcrivate des Cholins, vielleicht urn Azetylcholin handeln. Azetylcholin, in Pflanzen nur sehr selten angetroffen, hatte Arthur James E w i n s 1909 im MutterkornZB) beobachtet; 1921 hatten es H. B o r u t t a u und H. C a p e n b e r g 2 9 im Hirtentaschelkraut gefunden. Letztere e n hielten unter xnlehnung an eine von E w i n s beschriebene Methodeso) iiber die Quecksilberdoppelsalze zuletzt ein Gemenge von Cholin. und Azetyl, cholinbitartrat, aus dem letzteres durch Ausziehen mit absolutem Alkohol gewonnen wurde. Auch ich habe zunachst diesen Arbeitsgang - nach Abtrennung eines mit Schwefelsaure erhaltenen aus Kaliums und Ammonium. su!fat bestehenden Niederschlagcs - befolgt, erhielt aber zuletzt mit Platinchloridchlorwasserstoff in dem alkoholischen Auszuge der Bi: tartrate eine Fallung, die nach der Kristallform und Analyse nur aus Cholinhcxachloroplatinat bestand. Die aus Alkohol erhaltenen Kristalle waren optisch isotrop, gchorten also dem regularen Kristall. system an; aus Wasser kristallisierten doppelbrechende Kristalle. Dieser Dimorphismus ist nach V o r 1 a n d e r und K a u f m a n n sl) fur das Cholinchloroplatinat charakteristisch. Azetylcholin oder ein anderes Cholinderivat wurde bei Einhaltung dieses Arbeitsganges nicht gefunden. *,) Siehe FuBnote 14 auf S. 451. 26) 27) 28 201 so) $1) 1. c. Pfliigers Arch. Physiol. 190, 298 (1921). Journ. chem. SOC.London 95, 1123 (1909). Arch. Pharmaz. 259, 33 (1921). Biochemical Journ. 8, 44 (1914). Ber. Dtsch. Chem. Ges. 43, 2737. Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel. 455 Da offensichtlich hierbei ,die wirksamen Cholinderivate zerstort worden waren, so suchte ich nach einem anderen, schonenderen Weg, der die Isolierung der wirksamen Substanz ermoglichen sollte. Nach langeren Versuchen wurde ReineckecSalz als brauchbares Fallungss mittel, das zum Ziele fuhren konnte, erkannt. In dem weitgehend gereinigten und mit absolutem Alkohol aufr genommenen Extrakt aus dem Mistelsaft erhielt ich mit diesem Salz eine aus regelmafligen oder auch etwas gestreckten sechseckigen Kristallblattchen bestehende Fallung. Oft bestanden diese Kristalle aber auch nur aus viers (dann Xsformig) bis sechsstrahligen Sternen, wie man sie auch erhalt, wenn man alkoholische Cholinchloridlosung mit einer alkoholischen Losung von ReineckezSalz versetzt. Weshalb die Fallung von so verschiedenem Aussehen erhalten wurde, konnte mit Sicherheit nicht festgestellt werden; vielleicht sind hierfur Kons zentrationsverhaltnisse sowie die Zeit verantwortlich zu machen. Durch Uberschichten der ziemlich weit eingedampften, aber noch dunnflussigen, von ,,Ballaststoffen" weitgehend befreiten Extraktlosung des Mistelsaftes mit einer gesattigten Losung von ReineckecSalz und Umschwenken erst nach 24stiindigem ruhigen Stehen erhielt ich die erwiihnten regelmanigen sechseckigen Blattchen. Von dieser Fallung habe ich aus dem noch zur Verfugung stehenden Extrakte 1.2 g erhalten. Durch wiederholtes fraktioniertes Losen und Umkristallisieren der Fallung aus AzetonzAthanolz oder AzetonsWassergemischen lieBen sich schlieBlich zwei 'Hauptf raktionen gewinnen, von denen die erste - Ausbeute 800 mg - aus C h o 1 i n s R e i n e c k a t bestand. Die Elementaranalyse der zweiten Fraktion - 120 mg - machte das Vorliegen von PropionylcholinzReineckat wahrscheinlich. Ber.: C 30.09, H 5.06, N 20.49, Cr 10.87. Gef.: C 29.78, H 5.79, N 19.94, Cr 10.98. Die Aussicht, mit dieser geringen Menge die Konstitution zu ermitteln, war nicht sehr gunstig. Gleichwohl wurden 100 mg des Keineckats, in dem etwa 33 mg auf den Cholinbasenrest entfielen, fur den H o f m a n n schen Abbau geopfert, nachdem zuvor das Reineckat in das Chlorid ubergefuhrt worden wars2). An Spaltstucken konnte zunachst einwandfrei Trimethylamin festgestellt werden, das als Chloroplatinat Ber.: Pt 37.13. Gef.: Pt 36.96. identifiziert wurde. Man darf hieraus schlieoen, da13 tatsachlich ein Cholinderivat vorlag. AuBerdem wurde beim Aufarbeitcn des Reaks tionsproduktes eine niedere, der Fettsaurereihe angehorende Saure festgestellt; dem Geruche nach konnte Propionsaure vorliegen. Die hiervon erhaltene Menge war aber so gering, daf3 nur qualitative mikrochemische Reaktionen angestellt werden konnten, die abcr fiir Propionsaure negativ ausfielen. Das Vorliegen dieser Saure und das mit vom Propionylcholin ist daher wohl wahrscheinlich gemacht, aber 32) Siehe Versuchsteil. 456 Julius August Miiller nicht sicher bewiesen. Die Arbeiten in dieser Richtung werden fort. gesetzt, sobald aus der neuen Ernte wieder frischer Mistelsaft zur Verfugung steht. In sehr geringcr Menge erhielt ich aus der ReineckesSalzsFallung noch eine dritte Fraktion - etwa 12 mg - in Form langgestreckter Rhomben. Die aus der Elementaranalyse dieser Verbindung gewons nenen Zahlen paBtcn sehr gut auf Azetylcholin. Ber.: C 28.42, H 4.77, N 21.12, Cr 11.20. Gef.: C 28.32, H 5.11, N 21.20, C r 11.56. Wenn nun mit dieser einzigen Verbrennung, und da mit der ubrigs geblicbenen winzigen Materialmenge irgendwelche andere Reaktionen nicht angestellt werden konnten, auch keine endgiiltige Aussage uber das Vorhan,densein von Azetylcholin in der Mistel gemacht werden kann, so darf man dies immerbin in den Bereich der Mags lichkeit ziehen. Vielleicht wird man aber auch mit dem Vorkommcn noch anderer Cholinderivate rechncn mussen. O b diese Vermutung zutrifft, werden erst weitere Untersuchungen zeigen. Als sicher darf jedoch schon jetzt ausgesprochen werden, daR die blutdrucksenkende Wirkung des Mistelprensaftes durch den Ges halt an Azylderivaten des Cholins verursacht wird. Nach AbschluB meiner Arbeit wurde ich auf ein Referat im Chemischen Zentralblatt33) uber eine Publikation yon C. B i s c h o f f , W. G r a b und J. K a p f h a m m e r 34). die im Rinderblut Azetylcholin gefunden haben, aufs merksamss). Sie beschreiben das Reineckat dieser Verbindung ski langs gestreckte Rhomben, die bei 1730 schmelzen, wahrend Cholinreineckat sechss seitige Tafeln bildet, die bis 2500 nicht schmelzen. Soweit sich diese Angaben auf die Schmelzpunkte der genannten Stoffe beziehen, kann ich dieselben nicht bestatigen. Wohl schmelzen die in Rede stehenden Reineckate bei geniigend hohem Erhitzen unter Zersetzung - dies la& sich bei der mikrochemischen Elementaranalyse schon beobachten -, doch ist die Ermittlung des Schmelzpunktes im Rohrchen nicht genau festr zustellen. Jedenfalls ist die Schmelze nicht so diinnfliissig, dal3 es zur Am5 bildung eines Meniskus kommt ; dadurch wird der FlieBpunkt unscharf und ist als Reinheitskriterium nicht brauchbar. V e r su che. Aus den friiher angefuhrten Griinden wird die Aufarbeitung der MistelpreDsafte - aus Ernte 1928/29 = Saft I, aus Ernte 1929/30 = Saft I1 stammend - getrennt bcschrieben. A. S a f t I ( E r n t e 1928/29). Zur Verfugung standen 50 kg Prefisaft, der nach Angaben der Firma Johannes B u r g e r , Ysatfabrik in Wernigerode, aus 100 kg 33) Chem. Ztrbl. 1931, 11, 2631. 3 9 Ztschr. physiol. Chem. 200, 153 (1931). 8 6 ) H. H. D a l e u. H. W. D u d l e y , Ztschr. physiol. Chem. 198, 85 (1931) konnte diese Angabe nicht bestatigen. Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel. 457 frischer Mistel gewonnen war; ihm waren zur Haltbarmachung 7,5kg %%iger Weingeist zugesetzt worden. Der in diesem Zustandc in mcine Hande gelangte Saft war trube, setzte bei ruhigem Stehen aber rasch ab. Die iiber dem Bodensatz stehende Flussigkeit war dunkel: braun, sie reagiertc schwach sauer - PH = 5.4 - und hatte ein spezifisches Gewicht D K = 1.0247. Der Bodensatz war von olivs griinem Aussehen. Tro ck en r u c k s t a n d , Asche. 62.40 g filtrierter Saft hinterliekn nach dem Trocknen bei 105O (Toluolbad) 6.2697 g, dieser Ruckstand 0.6135 g Asche. Berechnet: 10.05% Trockenruckstand, 0.983% Asche. Auf alkoholfreien Saft berechnct: 11.56% Trockenriickstand, 1.130% Aschese). Prufung auf Gerbstoffe. J. E i n l e g e r , J. F i s c h e r und J. Z e l l n e r s 7 ) waren auf einen Stoff gestofien, dessen Reaktionen mit Blcii und mit Kupferazetat (Fallungen), sowie mit Ferrichloridlosung (Olivfarbung) auf Phlobai phene hindeutete, sie konnten aber keine Gerbstoffe, aus denen ja Phlobaphcne entstehen, in der Mistel nachweisen. Auch von mir an: gestellte qualitative Proben auf Gerbstoffe waren negativ ausgcfallcn; trotzdem habe ich zwei Gerbstoffbestimmungen nach dem ,,Hauts pulververfahren" durchgefuhrt. Die dabei erhaltenen Werte waren aber so klein - 0.4% bzw. 0.11% -, daO ich das Resultat als negativ und den Mistelsaft als gerbstofffrei ansehen mochtc. K u p f e r z a h Is8) d e s M i s t e 1 s a f t e s. Die Kupferzahl, abgekurzt CuZ., ist definiert als diejenige Anzahl Milligramm Kupfer, die der beim Kochen von 1 g einer Substanz mit F e h 1 i n g schcr Losung entstandenen Kupfer: oxgdulmenge entspricht. Sie ist gekennzeichnet durch die Gleichung Milligramm Cu CuZ = Gramm noge.a. sum.Die beim Kochen des Saftes mit F e h 1i n g : scher Losung entstandene Menge CUZOwurde nach A. B e r t r a n d se) bestimmt. Das Prinzip der Methode besteht darin, dai3 Cup0 mit Ferrisulfat in schwefelsaurcr Losung umgesetzt und das entstandene Fcrrosulfat mit Permanganatlosung titrimetrisch bestimmt wird (1 ccm n / i ~KMnO, = 6.357 mg Cu). ") 57.5 Teile mit Alkohol konservierter Saft entsprechen 50 Teiien 57.5 alkoholfreiem Prensaft ; also Umrechnungsquotient 50. 8 7 ) Monstsh. Chem. 44, 281 (1924). 8 8 ) Vgl. Jul. Aug. M u l l e r , Uber neue Kennzahlen fur Drogen und Galenika. 1. Mitt. Kupferzahlen einiger Drogen. Pharmaz. Zentralhalle 73, 450 (1932). so) Bull. SOC.chim. 35, 1285. 458 Julius August Miiller 7.8038 g filtrierter Saft I wurden auf 100 ccm auf efiillt. Von dieser Vers diinnung wurden jedesmal 10 ccm ( ~ 0 . 7 8 0 3 8g Safty fur den Versuch verr wendet. Dns Ergebnis ist aus nachstehender Tabelle ersichtlich. T a b e l l e 1. I Angew. Menge Saft (= a) in g Zur Ox dation des FeSO, verbraucht nllo I?Mn04 (ac) in ccm . . . . CuZ=- je 0.78038 5.60 c.6.357 a Daraus ergibt sich als Mittelwert: CuZ = 45.535 fur den alkohob haltigen, fur den alkoholfreien Saft also: CuZ = 52.36. Durch Behandeln des Saftes mit Salzsaure - 10 ccm der Verdunnung blieben mit 15 Tropfen konzentrierter Salzsaure 16 Stunden be1 etwa 300 stehen - erhoht sich die CuZ nur wenig. Erhitzen mit verdunnter Salzs oder Schwefelsaure andert nichts an dem Ergebnis'o). - T a b e l l e 2. - -_ I -4ngew. Menge Saft (= a) in g Zur Ox dation desFeS04 verbraucht nflo ZMnO, (=c) in ccm . . . . CuZr = C-6.357 ......... I-I je 0.78038 I 5.85 47.65 I 1 5.91 ~ 48.14 5.86_ _ - 47.74 Mittelwert fur alkoholhaltigen Saft: C u Z = 47.84, fur alkoholr freien Saft: CUZI = 55.03. Aus den beiden Kupferzahlen errechnet sich der Kupferzahlene 55.03 quotient, cuz, mit 52.30 = 1.051. cm, Zur Neutralisation des NHS vernllo HCl in. ccm . . . . -_ brauchte - _Berechnet: N in Ol0 . . .. ~ . . . 14.66 0.2816 1 1 15.48 0.2854 I 1 ~~ 40) Vgl. J. A. M u l l e r , 1. c., ,,Inversionskupferzahl", CUZI. 15.97 0.2848 459 Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel. Bei halbstundigem Erhitzen des PreBsaftes auf dem siedenden Wasserbade trubte er sich; nach kurzem Stehen setzte sich ein brauner Niederschlag ab. Dieser sowie das Filtrat hiervon waren vollkommen unwirksam; auch die toxischen Eigenschaften waren verlorengegangen. A u f a r b e i t u n g d e s S a f t e s Pi). Zunachst wurde die uber dem oben erwahnten olivgriinen Bodenr satz stehende klare Flussigkeit mit dem Heber abgezogen. Von dem Bodensatz lieB man den Saft in Leinenbeuteln freiwillig abi tropfen; danach wurde der Ruckstand in der Hebelpresse ausgepreat und filtriert. Ausbeute 52 kg (= 45.22 kg alkoholfreier Saft). Der gtrocknete Bodensatz wog 1.230 kg. Der filtrierte Saft wurde auf 500 erwarmt, wodurch eine physioi logisch unwirksame ,,Ausflockung" - 75 g - abgetrennt werden konnte, die, wie die Stickstoffbestimmung nach K j e 1,d a h 1 ergab, uber der Halfte aus EiweiBstoffen bestand. 0.4168 g Sbst.: 28 ccm n Gel.: Mittelwert: EiweiB, ber.: HCI. - 0.2421 g Sbst.: 16.21 ccm N 9.41, 9.379. N 9.395. 6.25 9.395 = 58.72%. nllo HCl. Das Filtrat von der Ausflockung wurde nun im Kupferapparat bei Wasserstrahlpumpenvakuum eingedampft mit der Vorsicht, dal3 die Temperatur des ubergehenden Dampfes 300 nicht uberstieg. Der Abdampfruckstand (= Ruckstand l), 8.5 kg, stellte eine dunkelbraune Masse dar von der Konsistenz eines dunnen Extraktes, dem zur Konservierung 800 g Methanol zugesetzt wurden. Fallungen m i t Methanol. 1000 g Ruckstand 1 liei3 ich in 2OOO g Methanol einlaufen; der entstandene Niederschlag (= Fallung 1) wurde mit Methanol g e waschen. Erneuter Zusatz von Methanol veranderte das Filtrat nicht; die Fallung schien also vollstandig zu sein. Als aber zu einer Probe dcs Filtrates ein uber Kaliumkarbonat destilliertes Methanol4*) hinzur gefugt wurde, fie1 ein feinpulveriger, hellbrauner Niederschlag (= Fallung 2) aus. Fur die vollstandige Fallung des von Fallung 1 erhaltencn Filtrates waren noch etwa 14 kg Methanol notwendig. Erzeugt man jedoch schon Fallung 1 mit iiber Kalk destilliertem Methanol, so ist zur Erzeugung von Fallung 2 wesentlich weniger Methanol erforderlich. Obwohl ich es nur einem Zufall verdankte, zwei Fallungen mit ein und derselben Flussigkeit (Methanol) erhalten zu haben, so ber hielt ich dennoch diese Methode der fraktionierten Fallung bei, da inzwischen die pharmakologische Prufung ergeben hatte, daB Fallung 1 ohne Wirkung, Fallung 2 aber wirksam war. 41) 4 9 ebenso. Hierzu I. Schema, S. 473. Uber wenig gebrannten Kalk destilliertes Methanol verhielt sich 460 Julius August Muller Die ganze Menge des Ruckstandes 1 wurde daher in folgender Weise mit MethanoP) behandelt: Je 1OOO g Ruckstand 1 liefi man in 2OOO g Methanol einlaufen. Fallung 1 wurde abgesaugt und mit wenig Methanol gewaschen. Die Waschflussigkeit, vereint mit dem Filtrat, liei3 man unter Riihren in die gleiche Gewichtsmenge Methanol - diese Menge genugte jetzt zur vollstandigen Fallung - einlaufen. Fallung 2 wurde abgesaugt, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 1346 g (= 2.98%) Fallung 1 aus 45.22 kg alkoholfreiem Saft; 145.4 g (==0.386%)Fallung 2 aus 37.68 kg Saft entsprechendem Filtrat von Fallung 1"'). Mit Fallung 2 war jedoch nicht die Gesamtheit der blutdrucks senkend wirkenden Stoffe erfaRt worden; das Filtrat war fast ebenso wirksam wie Fallung 2. Fallung m i t Athanol. Das Filtrat von Fallung 2 wurde im Vakuum - Badtemperatur 35 bis 4oo - auf 4100 g, entsprechend 37.68 kg alkoholfreiem Saft, eingedampft (= Ruckstand 2). Alle Vcrsuche, durch Behandeln des Ruckstan,des 2 mit Athanol feste Niederschlage zu gewinnen, blieben erfolglos. Schlicfilich wurde folgendermaflen verfahren: Ruckstand 2 wurde in Anteilen von 400 bis 500 g mit der viers fachen Gewichtsmenge Athanol (96%ig) behandelt, wodurch 1920 8 eines dicken wirksamen Extraktes (= Fallung 3) gewonnen wurden. Fallung 3 wurde nach dem Losen in Wasser im Hagemannschen Apparat ausgeathert. Der nach dem Eindunsten der mit gegluhtem Natriumsulfat getrockneten atherischen Losung zuriickgebliebene geringe dunkelbraune, sirupose Ruckstand - etwa 5 g - wurde, da cr physiologisch unwirksam war, nicht weiter untersucht. Aus der wasserigen, ausgeatherten und im Vakuum zum diinnen Extrakt eingedampften Losung hatten sich nach einigen Wochen feine Kristallnadelchen (= Kristalle 1)46) ausgeschieden. Aus den von Fallung 3 abgegossenen alkoholischen Flussigkeiten (= Restfiltrat) wurde nach dern Eindampfen ein siruposer Ruckstand erhalten, aus dem bei mehrwochigem Stehen lang estreckte, sechss eckige Plattchen auskristallisieren (= Kristalle 2)46y. P r u f u n g d e r Fallung 3 auf A l k a l ~ i d e ~ ~ ) . 1. Die Prufung dcr Fallung 3, von der 250 6 angewandt wurden, auf Alkaloide nach dern Untersuchungsgang von S t a s 3 0 t t o fie1 negativ aus. 2. 100 g ausgeatherte Fallung 3, gelost in 400 g Wasscr wurden mit Blciazetatlosung~. (2O%ig) gefallt. Das mit Schwefelwasserstoff 43) Hier und in folgendem ist stets uber Kalk destilliertes Methanol verwendet worden. 4a) Ein Teil des Filtrates wurde mit neutralem und basischem Bleiazetat behandelt. Siehe dort. 46) Siehe S. 463: Untersuchung ,der Kristalle 1. 46) Siehe S. 464: Untersuchung der Kristalle 2. 47) Hierzu 11. Schema, S. 474. Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel. 46 1 in iiblicher Weise vom BleiazetatuberschuB befreite Filtrat wurde darauf mit Scheiblers Reagen~'~) versetzt, der erhaltene Niederschlag gewaschen und auf Ton gepreBt. Die eine Halfte dieses Niederschlages wurde mit Bariumhydroxydi losung, die andere mit Ammoniakflussigkeit zerlegt bzw. gelost und die wasserigen, alkalisch reagierenden Flussigkeiten nacheinander mit Benzol, Ather, Essigester und Chloroform ausgeschuttelt. Nach dem Abdunsten der verschiedenen Losungsmittel hinterblieben nur sehr geringe, hellbraun gefarbte, schmierige Ruckstande, die keine Alkaloidreaktionen mehr gaben. P r i i f u n g a u f G l u k o s i d e u n d Saponine'O). L e p r i n c e 5 0 ) hatte ein Glukosid in der Mistel gefunden, iiber das er aber nichts Naheres mitteilt; nach K o b e r t 51) sollen zwei verschiedene Saponine in Viscum album enthalten sein, ein saures, durch Bleiazetat und ein neutrales, durch Bleiessig fallbares. In Gegensatz hierzu sagt B a r L b i e r i6z) ausdriicklich, daR die von ihm mit Hilfe der genannten BIeiS verbindungen gewonnenen amorphen Stoffe keine Saponine seien. Zur Nachpriifung dieser einander widersprechenden Angaben habe ich lo00 g Ruckstand 1 mit 2OOO g Methanol verruhrt, von der entstandenen Fallung 1 abfiltriert und d a s Filtrat im Vakuum auf 510 g eingedampft. Dieser Ruckstand, der noch die volle blutdrucki senkende Wirkung hatte, wurde i n 3OOO g Wasser gelost und mit einem geringem UberschuB einer Bleiazetatlosung (20%ig) versetzt. Der sehr schleimige Niederschlag (= 1. Bleifallung) wurde, da ein Abfiltrieren unmoglich war, durch Zentrifugieren gewonnen; cr wurde auch in der Zentrifuge, zuerst mit verdiinnter Bleiazetatlosung, dann rnit Wasser, gewaschen. In der von der 1. Bleifallung abgetrennten Mussigkeit, einschlieRi lich Waschwasser, erzcugt Bleiessig eine ebenfalls schleimige Fallung (= 2. Bleifallung), die zwecks Reinigung ebenso behandelt wurde wie die 1. Bleifallung. Eine Probe der von der 2. Bleifallung abgetrennten Flussigkeit wurde mit sek. Natriumphosphat von uberschussigem Blei befreit; sie war im Blutdruckversuch unwirksam. Sowohl die 1. als auch 2. Bleifallung wurden noch feucht mit festem kristallisierten sek. Natriumphosphat verrieben, die Gemische mit Methanol ausgezogen und die Auszuge eingeengt. In beiden Fallen wurde ein Teil eder Ruckstande einmal als solche, das andere Ma1 nach vicrtelstundigem Kochen mit 20%iger Salzsaure und darauf folgender Neutralisation mit Natronlauge mit Fehlingscher Losung gekocht. In keinem Falle wurde letztcre reduziert, so da8, nach diesem Ergebnis zu urteilen, glukosidartige Stoffe, also auch Sapos nine, nicht vorhanden sein konnten. 48) Ein Teil Natriumwolframat werden in funf Teilen Wasser gelost; der Losung werden 0.5 Teile PhosphorsPure (25%ig) zugesetzt. '0) Hierzu siehe LII. Schema, S. 474. 6 0 ) Com t. rend. Acad. Sciences 145, 940 (1907). 81) Brieiiche Mitteilung K o b e r t s an v. T u b e u f , 1. c., S. 43. 62) 1. c. 462 Julius August Miiller Einen anderen Teil der Ruckstande verwandte ich zu Hamolyses versuchen. Hierzu benutzte ich eine 2%ige Aufschwemmung ges waschener Rinderblutkorperchen in einem m/3o Phosphatpufferges misch von PH = 7.4. Das Phosphatpuffergemisch stellte ich nach einer von Ph. F i s c h e r und H. 'H o r k h e i m c r 9 angegebenen Vorschrift her. Den Hamolyseversuch selbst fuhrte ich nach An5 ~ ~ ) Das Ergebnis w a r gabe von L. K o f l e r und 2. L A S A ~ aus. ein negatives. Schlienlich habe ich noch die Wirkung der Ruckstande auf Fische, auf welche Saponine bzw. saponinhaltige Pflanzen giftig wirkcn, untersucht: Bei jeder Versuchsreihe wurde in drei Becherglaser mit je 100 ccm Leitungswasser jc ein Fisch eingesetzt. In dem ersten Glase loste ich 1.0 g, in dem zweiten 2.0 g des betreffenden Ruckstandes, das dritte Glas erhielt keinen Zusatz. Trotzdem verhaltnismaflig grot3e Substanzmengen zu den Versuchcn verwendet wurden, konnte keine Einwirkung auf die Tiere bemerkt werden, so daf3 auch im Fisc'i: versuch Saponine nicht nachweisbar waren. Auch im Blutdruckversuch zeigten die Ruckstandc keinerlei Wirk~ng~~). Die mit Natriumphosphat zerlegten Blcifallungen 1 und 2 wurden nun noch mit Wasser ausgezogen. Auch diese wasserigen Losungen waren im Blutdruckversuch unwirksam, sie reduzierten weder vor noch nach der Behandlung mit Salzsaure Fehlingsche Lasung, sie verursachten keine Hamolyse und lieBen keine Einwirkung auf Fische erkennen. Auch die mit unverandertem Saft angestellten Hamolyseo und Fischversuche verliefen negativ, so dafi der untersuchte Mistelsaft als frei von Saponinen anzusehen ist. V e r s u c h e m i t F a l l u n g 2. 1. In der wasserigen Losung der Fallung 2 erzeugten Wismuts sowie Quecksilberjodidjodkalium, Pikrinsaure, Phosphorwolframs saure, Phosphormolybdansaure Niederschlage. Der mit Phosphors wolframsaure aus 20 g Fallung 2 erhaltene Niederschlag wurde ebenso aufgearbeitet, wie der oben aus Fallung 3 erhaltene. Alkaloidartige Stofie wurden nicht erhalten. 2. Weder aus der neutralen noch aus der sauer oder alkalisch (mit Natronlauge, Soda oder Ammoniak) gemachten Losung d e r Fallung 2 lieR sich mit organischen Losungsmitteln - Ather, Chloros form, Essigester, Amylalkohol - ctwas ausschiitteln. 3. Mit sehr vie1 gesattigtcr Natriumchloridi oder Ammonium: sulfatlosung konnten aus der wasserigen Losung der Fallung 2 zwei flockige, schokoladenbraune Niederschlage gewonnen werdcn, die Siiddtsch. Apoth.sZtg. 68, 476 (1928). Arch. Pharmaz. u. Ber. Dtsch. Pharmaz. Ges. 265, 612 (1927). 06) Hamolysel und Fischversuche habe ich selbst ausgefuhrt, alle anderen bisher und spater angefuhrten pharmakologischen Priifungen hat, wie schon mitgeteilt, Herr Prof. K o c h m a n n vorgenommen. 6s) 64) Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel. 463 aber nicht weiter untersucht wurden, da sie physiologisch nicht mehr wirksam waren. 4. 30 g Fallung 2, gelost in 50 g Wasser, wurden nach dem Ans sauern mit verdunnter Salzsaure mit Pikrinsaure gefallt. Auch diese Fallung (Ausbeute 5 g), sowie das Filtrat davon wurden nicht naher untersucht, da sich im Tierversuch ihre physiologische Unwirksams keit hcrausstellte. 5. 50 g Fallung 2 wurden der Einwirkung von 100 g Xthanol, dem 20 Tropfen konzentrierte Salzsaure zugesetzt worden waren, ausgesetzt. Erst bei Iangerem Einwirken farbte sich das Losungsz mittel; dieses wurde dann abgegossen, durch frisches, saurehaltiges Athanol ersetzt, und dieses Verfahren so oft wiederholt, bis das Losungsmittel farblos blieb. Hierbei blieben 10 g ungelost zuruck (= a). In Wasser war dieser Ruckstand leicht loslich. Aus der sauren alkoholischen Losung schieden sich beim Eins dampfen (zunachst im Vakuum, zuletzt im 45" warmen Wasserbade) wurfelformige Kristalle aus, die aus fast reinem Kaliumchlorid bes standen. Das Filtrat hiervon wurde bis zur Sirupdicke eingedamDft und der Ruckstand mit Wasser aufgenommen; dabei blieben 1.7 g einer fast schwarzen Masse ungelost (= b). Das sauer reagierende Filtrat von b wurde ausgeathert. Die atherische, hellbraun gefarbte und uber gegliihtem Natriumsulfat getrocknete Losung hinterlief3 nach dem Verdunsten des Athers einige Tropfchen eines hellbraunen, eigenartig riechenden Oles, das, mit ganz wenig Wasser aufgenommen, mit den meisten Alkaloids reagenzien Fallungen gab. Mit anderen organischen Losungsmitteln lief3 sich weder aus der sauren noch aus der ammoniakalisch ges machten Flussigkeit etwas ausschutteln. Aus der ammoniakalisch gemachten Flussigkeit fielen jedoch in reichlicher Menge Kristalle von Ammoniummagnesiumphosphat aus. Daraus ging hervor, daf3 durch die Saurebehandlung Phosphorsaure aus organischer Bindung frei gemacht worden war: denn das Doppelr salz fie1 nicht aus, wenn die einfache wasserigc Losung der Fallung2 ammoniakalisch gemacht wurde. Das Magnesium dagegen ist von vornherein ionogen gebunden im Mistelsaft vorhanden; es ist in be> kannter Weise fallbar. Im Tierversuch ergab sich die Unwirksamkeit von a, b und dem Filtrat von b. Endlich wurde, analog Fallung 3, auch Fallung 2 mit neutralem und mit basischem Bleiazetat behandelt. Auch in diesem Falle ging die physiologische Wirksamkeit verloren. U n t e r s u c h u n g d e r K r i s t a l l e 1. Bei der Aufarbeitung von Saft I waren etwa 70 g Kristalle 1 (S. 460) erhalten worden, die eine leichte, weif3e, aus MgO bcstehende Asche hinterlieoen. Dic Kristalle losten sich nur langsam beim Kochen mit vie1 Wasser; die mit Karboraffin entfarbte und filtrierte Losung konnfe dann ziemlich weit eingedampft werden, ohne daf3, selbst bei Eiskuhlung, Kristallisation einsetzte. Leichter erfolgte dies 464 Julius August Muller selbe, wenn man die konzentrierte Losung mit dem halben Volumen Athanol uberschichtete und einen Tag lang ruhig stehen lie8. Auf diese Weise wurde das Rohprodukt .dreimal umkristallisiert; es stellte dann ein ieichtes, weifies, aus kleinen nadelformigen Kristallen be. stehcndes Pulver dar. Die Kristalle enthielten Kristallwasser. 0.6755 g verloren beim Trocknen uber Phosphorpentoxyd bei 1000 im Vakuum 0.1416 g Wasser. Die Elementaranalyse ergab Werte, die gut auf Magnesiumlaktat pafiten. A n a l y s e d e s w a s s e r f r e i e n S a l z e s : 5.804 mg Sbst.: 7.556 mg CO,, 2.769 mg H 2 0 , 1.203 mg MgO. - 4.959 mg Sbst.: 6.469 mg COz, 2.172 mg HzO, 1.030 mg MgO. - 6.978 mg Sbst.: 9.115 mg C 0 2 ,3.361 mg HzO, 1.410 mg M 0 4.098 mg MgSO,. - 5.580 mg Sbst.: 7.293 mg COz, 2.705 mg H z 8 , l . z 3 mg MgO = 3.311 mg MgSO,. [CH, . C H ( 0 H ) . COzlaMg. Ber.: C 35.58. Gef.: C 35.51, 35.58, 35.63, 35.65. Ber.: H 4.98. Mg 12.02. Gef.: H 5.34, 4.90, 5.39, 5.42, Mg (ausMgO) 12.50. 12.53, 12.19, 12.36. (ausMgS0,) - -, - - 11.86. 11.99. [CH,. C H ( 0 H ) . COZ],Mg 3H40. Ber.: HzO 21.08. Gef.: H,O. 20.96. Die Werte fur MgS04 wurden erhalten, indem das bei der Verbrennung im Platinschiffchen zuruckgebliebene MgO mit einigen Tropfen verdiinnter Schwefelsaure gelost, letztere im Mikromuffelofen nach P r e g 1 abgeraucht und das MgSO, nach dem Gluhen und Erkalten gewogen wurde. + Die qualitativen Reaktionen auf Milchsaureb6) fielen positiv aus. Das Zinksalz kristallisierte mit 3 Mol. H2O. Dadurch ist die Saure als d,ls oder GarungssMilchsaure identifiziert. U n t e r s u c h u n g d e r K r i s t a l l e 2. Aus dem Restfiltrat waren etwa 20 g Kristalle 2 (siehe S. 460) ges wonnen worden, die mehrfach aus Wasser bis zum konstanten Schmp., 166 bis 1 6 6 . 5 O (korr.), umkristallisiert wurden. Sie waren in organischen Losungsmitteln unloslich. E 1e m e n t a r a n a I y s e : 5.526 mg Sbst.: 8.053 mg C o n , 3.814 mg HzO. - 5.551 m Sbst.: 8.104 mg C 0 2 , 3.872 mg H20. - 5.861 mg Sbst.: 8.503 mg COP, 4.205 mg H 7.75. CRHI4OB(Mannit).Ber.: C 39.54, H 6.72. CBH&6(Inosit). Ber.: c 39.98, Gef.: C 39.74, 39.82, 39.57, H 7.72, 7.81, 8.03. Georges T a n r e t 6') hatte in der Mistel (Beeren und Blatter) idnosit und rac.$Inosit gefunden. Fur diesen Stoff sprach zunachst die optische Inaks tivitat der einfachen wasserigen Losung. wie ich noch vor Ausfiihrung der Elementaranalyse festgestellt hatte. Dann veranlafiten mich aber die durch die Verbrennung ermittelten hohen Wasserstoff werte sowie der Schmelzpunkt, mit dem Vorliegen von dSMannit zu rechnen. Die wasserige Losung dieses Hexits ist kaum mcrklich linksdrehendbe). Die Kechtsdrehung wird erst bes h20. B e i 1 s t e i n , 4. Aufl.. 111, 275. Compt. rend. Acad. Sciences 145, 1196 (1907). 68) B e i l s t e i n , 4. Aufl., I, 535: [ a ] =~ 22.50 (wasserige LGsung mit 10%Mannit und 12.8% wasserfreiem Borax), ohne Temperaturangabe. 56) 57) + 465 Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel merkbar bei Gegenwart von Borsaure, Borax u. a . 9 . Ich €and: 2.6112 g Sbst.: 2.5040 g wasserfreien Borax, gelost in 15.2150 g Wasser; t = 150, d y z 1.0993, a = 6.0750 im 200~rnrn+Rohr. Daraus berechnet [a] = t- 21.5P. ‘r+ A z e t y l p r o d u k t d e r K r i s t a l l e 2. 2 g Kristallc 2, 1 g wasscrfreies Natriumazetat, 10 g Essigsaures hydrid wurden unter RuckfluBkuhlung erhitzt und, nachdem die erstc stiirmische Rcaktion voriibcr war, noch eine Stunde lang im Sieden gehalten. Beim EingieRcn des Reaktionsgemisches in kaltes Wasser fielen in reichlicher Menge weil3e Kristalle aus, die aus heiRem 50%igen Athanol umkristallisiert wurden. Unloslich in Wasser, kaltem Athanol und anderen organischen Losungsmitteln; schwer loss lich in heiI3em Athanol, leicht loslich in Eisessig. Schmp. 122.5 bis 123O (korr.), Ausbeute: 3.79 g reines Produkt. Zur Analyse wurden die Kristalle im Vakuum uber Phosphorpentoxyd bei loOo getrocknet. 5.077 rng Sbst.: 9.283 mg CO,. 2.743 mg H,O. - 5.557 mg Sbst.: 10.154 mg CO,, 3.026 mg H,O. C,,H,,O,,. Ber.: C 49.74, H 6.05. Gef.: C 49.87, 49.84. H 6.05, 6.09. Der Schmelzpunkt eines Gemisches aus dsManniP) und den Kristallen 2 war unverandert, 166 bis 1 6 6 . 5 O . Die Identitat der Kristalle mit dsMannit, und damit das Vorkommen dieses Hexites in der Mistel ist somit erwiescn. B. S a f t I1 (E r n t e 1929/30)8O). Aus der Erntc 1929/30 standen 50 kg alkoholhaltiger PreBsaft zur Verfugung, entsprechend 45.25 kg alkoholfreiem Saft. Die Klarung und Gewinnung der Ausflockung erfolgte wie bei Saft I be5 schrieben. Das Eindampfcn dcs Saftes im Vakuum wurde aber dieses Ma1 in Glaskolben vorgenommen, die in das Wasserbad (Badtempes ratur hiichstens 400) eingehangt wurden. Auf diese Weise konnte die Temperatur besser als bei Verwendung des Kupferapparates bes obachtet und reguliert werden, so da8 eine Schadigung der wirks samen Stoffc sicher vermieden wurde. Ich erhielt 7 kg Ruckstand (= Ruckstand 1). U n t e r s u c h u n g d e s D e s t i 11a t i o n s g u t es. Bei der Dcstillation ging zuerst der zur Konservicrung zugesetzte Alkohol, spater cin saures, wasseriges Destillat uber. Letzteres wurde mit einer Anschlammung von frisch gefalltem Bariumkarbonat, das sich zunachst auflostc, im Uberschui3 versetzt. Beim Eindampfen des Filtrates hinterblieb ein etwas braun gefarbter Ruckstand. Aus der mit Karboraffin entfarbten und filtrierten Losung desselben kristallis sierten nach weitgehendcm Eindampfen und nach Zusatz von Athanol nadelige Kristalle aus, die aus einem AIkohoLWassersGemisch mehrs 59) 80) Sammlungspraparat. Hierzu 1V. Schema, S. 475. Archiv uad Berichre 1932 31 466 Julius .luaust Muller fach umkristallisiert wurdcn. Sie gaben die Reaktionen der Essigsaure und cnthielten Kristallwasser. 8.306 mg Sbst. verlorcn bei loo0 0.554 mg €120. A n a l y s e d e s w a s s e r f r e i e n S a l z c s : 7.762 mg Sbst.: 4.000 mg C02, 1.971 mg H20,5.979 mg BaCOs. C,H,O.Ba. Rer.: C 18.79, H 2.37, Ba 53.79. Gef.: C 18.74, H 2.84, Ba 53.62. C4H601Ba- H 2 0 . Ber.: H,O 6.59. Gef.: H,O 6.55. A u f a r b e i t u n g d e s R u c k s t a n d e s 1. Aus Ruckstand 1, der zur Konservierung mit Toluol versetzt worden war, hatten sich nach 14tagigem Stehen nadelformige Kristalls chen abgeschiedcn, die mit Hilfe einer klcinen Laboratoriumsfilters presseul) abfiltriert und in dcr Prcsse mit einem Gemisch gleicher Teile Methanol und Wasser gewaschen wurden, wobei sie in fast rein weiDcm Zustande gewonnen wurden. Sie wurden als Magnesium; laktat identifiziert. Ausbeute: 75 g. Filtrat und Waschflussigkeit wurdc im Vakuum noch weitcr auf 6 kg - eingedampft; der Ruckstand hatte dann dic Konsistenz eines dicken Sirups (= Riickstand 1 a). M e t h a n o 1 3 u n d A t h a n o 1 f a 11 u n g. Aus 2 kg Riickstand wurde in der friiher beschriebencn Wcise (siehc bei Saft 1) mit 4 kg Methanol Fallung 1 abgeschieden, die mil einem MethanolsWassereGemisch (5 + 2) gewaschen wurde. Den aus Filtrat und Waschflussigkeit durch Eindampfen im Vakuum ers haltenen, noch dunnflussigen Riickstand - 1650 g - liei3 man aus einem Schiitteltrichter langsam in 4OOO g Athanol (%%ig) untcr heftigem Riihren (Turbine) einlaufen. Die als dicker brauner Extrakt sich abscheidende Fallung, von der sich der braun gefarbte Allcohol klar abgienen liea, sollte zu klinischen Vcrsuchen verwendct werden. Sic hatten nach den bei Saft I gemachten Erfahrungen die gcsamten blutdrucksenkend wirkenden Stoffe (also Fallung 2 und 3 vereinigt) enthalten miissen. U b e r r a s c h e n d e r w e i s e w a r a b e r d i e s e Fallung fast unwirksam, dafiir aber s t a r k toxisch. Die Fallung wurde nun in Befolgung dcs bei Saft I schon bcschric: benen Arbeitsgangcs in ihre einzelnen Komponcnten (Fallung 2 und Fallung 3) zerlegt; aber eine Anreichcrung der schr schwachen Wir: kung wurde nicht crzielt. Beide Fallungcn wirkten jetzt fast nur noch toxisch. Da Fallung 1 aus Ruckstand 1 a weder den Blutdruck herabsctzte noch toxisch wirkte, wurde zunachst aus dem Rest des Rucks standcs 1 a - 4000 g - diese Fraktion mit Methanol abgetrcnnt. Aus dem Filtrat wurde das Methanol im Vakuum abdestilliert, wobei 2760 g eines dicken Extraktcs (= Ruckstand 2) zuriickblieb, der stark blutdrucksenkend wirkte, gleichzeitig aber auch stark toxisch war. 6 1 ) Diese Filtcrpresse hat sich zum Filtrieren grijBerer Mengen triber Fliissigkeiten sowie zum Sammeln von Niederschlagen recht gut bewiihrt. 467 Zur Kenntnis der lnhaltsstoffe der nordischen Mistel Versuchc, die toxischen S t o f f e zu entfernen. 1. 27.6 g Ruckstand. gelost in 22.4 g Wasser, wurden allmahlich mit Azeton vcrmischt. Noch 50 g Azeton mischten sich klar mit der Losung, weiterer Zusatz verursachte Triibung. Nachdem im ganzen 100 g Azeton Z U gesetzt waren, wurde kraftig durchgeschuttelt. Nach einiger Zeit trennte sich das emulsionsartige Gemisch in zwei Schichten. Die etwas triibe, azetonhaltige Oberschicht wurde abgegossen, die Unterschicht noch viermal mit je 50 g Azeton kraftig durchgeschuttelt, und das Azeton jedesmal abgegossen. Zur letzt blieb eine kaum noch flieBendc braune Masse zuriick. Diescr von anhaftendem Azeton vollstandig befreite Ruckstand zeigte im Tierversuch eine bisher noch nie beobachtete, das Atemr zentrum lahmende Wirkung. Der aus der azetonhaltigen Fliissigkeit crhaltene sirupose Ruckstand war ohnc Wirkung. Eine Aufarbeitung des Ruckstandes 2 mit Azeton kam also nicht in Frage. 2. 27.6 g Ruckstand 2, gelost in 22.4 g Wasser, wurde allmahlich rnit iSPropano1 versetzt. Auch hier zeigte sich dieselbe Erscheinung wie bei An. wendung von Azeton: zuerst klare Mischung (bis zu 25 g Propanolzusatz), bei weiterem Zusatz (50 g) Trubung, nach einiger Zeit Entmischung. Die Unterc schicht wurde noch zweimal mit je 60 g Propanol durchgeschuttelt, im ubrigen wurde ebenso verfahren, wie vorher bei der Anwendung von Azeton be. schrieben. Der hier erhaltene Ruckstand wirkte zwar blutdrucksenkend, war aber auch toxisch. Die Behandlung des Riickstandes 2 mit Propanol war demnach nicht empfehlenswert. Behandlung des Saftes mit Aluminiumhydroxyd. In der Fermentchemie war erstmalig von Rich. W i I1 s t a t t e r und seinen Schiilern Aluminiumhydroxyd als selektives Adsorptions$ mittel eingefuhrt worden. Uber seine Verwendung bei pflanzens chemischen Arbeiten war nichts bekannt; immerhin war es denkbar, da13 es bei der Isolierung physiologisch wirksamer oder zur Entfernung unerwiinschter Stoffe - beim Mistelsaft der toxischen Anteile gute Dienste leisten konnte. Ich habe fur meinc Versuche ein Alus miniumhydroxyd benutzt, das Rich. W i 11 s t a t t e r und Heinrich K r a u t "*) als ,,Praparat C" bezeichnen, und das ich nach deren An5 gnben bereitet habe. Mein Praparat unterscheidet sich von dem der genannten Autorcn insofern, als ich das AI(0H)s nach dem Auss waschen nicht trocknete, sondern durch AbgieBen das Waschwasser s o weit wie moglich entfernte, und die zuruckbleibende Suspension nls solche verwandte. 600 g Ruckstand 2, in 2500 g Wasser geliist, wurden unter Umriihren (Turbine) mit 2000 g einer A1(0H),rAnschlammung (Gehalt: 2.94% Al(0H)J vcrsetzt. Die Mischung wurde noch drei Stunden hindurch langsam geriihrt, dann der Ruhe iibcrlassen. Zur Konservierung gab ich 10 g Toluol hinzu. Nach 24 Stunden wurde vom Adsorbat abfiltriert, das Filtrat samt dem zum Waschen venvendeten Wasser im Vakuum auf 440 g eingedampft, und dieser Kuckstand 3 mit 75 g Xthanol verriihrt. In diesem Gemisch hatten sich 62) Ber. Dtsch. Chem. Ges. 56, 1118. 31' ~ 468 Julius August Muller nach einwochigem Stehen Mannitkristalle ausgeschieden. Durch Einlaufenc lassen des Filtrates vom Mannit in die vierfache Menge Athanol (965dig) konnten 17.9 g eines hellbraunen Niederschlages (= Fallung 2) gewonnen wers den, der wenig toxisch, aber auch fast unwirksam war. Das Filtrat von diesem Niederschlage wurde im Vakuum auf 390 g konzentriert (= Ruckstand 4). Ein nochmals unternommener Versuch, aus dem mit Natronlauge oder Natriurnkarbonat alkalisch gemachten Ruckstand 4 die wirks samen Stoffe zu gewinnen, verlicf wieder ergebnislos. Es wurde dabei aber die Beobachtung gemacht, dai3, und zwar in beiden Fallen, Ammoniak frei wurde. 1. 50 g Riickstand 4 wurden mit 20 g Natronlauge (45%ig) vermischt und durch dieses Gemisch bei 350 und 25 m m Druck ein langsamer Luftstrom ge: saugt, der verdunnte Salzsaure passieren muate. Beim Eindunsten der salzs sauren Flussigkeit hinterblicben 0.62 g eines weiBen Salzriickstandes, der aus Ammoniumchlorid bestand. 2. 290 g Ruckstand 4 wurden mit verdiinnter Sodalosung alkalisch ge: mascht, wobei zuerst CO, dann NH, entwickelt wurde, und dann in einer von Arthur M ii 11 e r 03) beschriebenen ,,Extraktionssaule" erschopfend mit Chloroform ausgezogen; hierbei wurden im ganzen 600 g einer hellbraunen Losung erhalten. Fur die pharmakologischc Prdfung wurden 6 g der ChIoroformlosung (ents sprechend 38.52 g PreBsaft) fiinfmal mit je 5 ccm nla HCI ausgeschiittelt. Die hellbraun gefarbte wasserige Losung wurde mit Natriumkarbonatlosung genau neutralisiert und darin noch 16 mg Kochsalz gelost, SO daB nach dem Aufs fiillen mit Wasser auf 38.52 (= Saftkonzentration) eine physiologische Kochs salzlosung erhalten wurde, in der die mit Chloroform ausschiittelbaren Stoffe gclost waren. Diese Losung hatte toxische Eigenschaften. Nun wurdc die restliche Chloroformlosung konzentriert, darauf mit verdunnter Salzsaure und Wasser aus eschiittelt. Von einem braunen Harz wurde abgegossen, und die wasserige t o s u n g uber Kalziumchlorid und Kalk zur Trockene gebracht. Die zuriickgebliebene harzige Masse wurde mit Wasser wiederholt ausgeknetet. Diese wasserige Losung war aber, trotzdem sie nur auf den zehnten Teil des dem ursprunglichen Pressaft entsprechenden .Ges wichts aufgefullt wurde, sehr viel weniger toxisch als die vorher beschriebene Ausschuttelung. Da in dem zweiten Falle die wasserige Liisung fast keine harzigen Stoffe mehr enthiclt, so darf man wohl diese fur die toxische Wirkung wrantwortlich machen. Die mit Chloroform extrahierte karbonatalkalische Losung war im Blut5 druckversuch unwirksam. Ein Vcrsuch, die Wirkstoffc an Karboraffin zu adsorbieren, ver: lief ergebnislos. Wie weiter oben beschricben, wurden nun 1000 g Ruckstand 2 mit Aluminiumhydroxyd behandclt. Das zu einem dicken Extrakt (= Ruckstand 3) im Vakuum eingedampfte Filtrat hiervon wurde rnit nur so viel absolutem Athanol verruhrt, da13 ein klarer Sirup entstand, in dem nach einiger Zcit wieder Mannit auskristallisierte. Das Filtrat von lctzterem wurde nun mit absolutcm Athanol bis zur cben be5 stehen bleibenden Trubung versetzt. Diescs Gemisch lie13 man in eine vorhcr ermitteltc, zur vollstandigen Fallung ausreichende Menge abs soluten Athanols unter kraftigem Ruhren cinlaufen. ") €lei15 und Gewdrzpflanzen 7, 40 (1924). Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel 469 Die entstandene Fallung (2) war unwirksam. Das auf j00 g im Vakuum eingcdampfte Filtrat wurde allmahlich mit 2ooo g Xther versetzt, indem nach jedem Zusatz kraftig durchr geschuttelt wurde. Nach einiger Zeit bildeten sich zwei Schichten aus. Die hellgelb gefarbte atherische Oberschicht war unwirksam; die braune Unterschicht, von der Konsistenz eines dunnen Extraktes, setzte den Blutdruck stark herab und war kaum noch toxisch. Die Losung dieses Extraktes in Athanol war trube (MgrLaktat); in dem Filtrate kristallisierte im Laufe einer Woche wieder Mannit aus. Das hiervon erhaltene Filtrat - 620 g - wurde nochmals mit 2700 g absolutcm Athanol verriihrt, und die von einer extraktartigen, unwirksamen Abscheidung abgegossenc Flussigkeit im Vakuum auf 750 g (= Ruckstand 4) eingedampft. Wie eben beschrieben, wurde nun der Rest des Ruckstan,des 2 verarbeitet mit der Abanderung, daR die Behandlung mit Xthcr fort. fie1 (vgl. IV. Schema). Ein Teil des so gewonnenen Ruckstandes 4 wurde zu klinischen Versuchen verwendet; der Rest wurde anteilweise wie folgt be3 handelt: F a 11 u n g m i t v e r d u n n t e r S c h w e f e 1 s a u r e. Ruckstand 4 wurde mit der sechsfachen Menge absolutem Athas no1 verriihrt, von der entstandenen Fallung (3) abfiltriert und das Filtrat im Vakuum fast zur Trockene gebracht. Der Ruckstand wurde erneut mit der zehnfachen Menge absolutem Athanol des in Arbcit genommenen Ruckstan'des 4 aufgenommen und filtriert. Aus dieser alkoholischen Flussigkeit wurde mit verdunnter, alkoholischer Schwefelsaure (1 g konz. H&OI, 10 g abs. Athanol) ein weifier, volus min6ser. etwas schleimiger Niederschlag ausgefjillt, der unwirksam war. Diese Fallung loste sich nur in Wasser; sie war rein anorgas nischer Natur und bestand aus Ammoniumn und Kaliumsulfat. Der geringe UberschuR an Schwefelsaure wurde aus der alkohos lischen Flussigkeit durch Schutteln mit Bariumkarbonat entfernt. Aus dem im Vakuum auf etwa ein Drittel eingedampften Filtrat kristallis sierte wiederum Mannit aus. Die filtrierte Flussigkeit (= Endfiltrat), aus der das von K o c h s m a n n '9 untersuchte Praparat ,,F. A. €41:' bereitet worden war, das jetzt von sehr vielen im ursprunglichen Mistelprensaft vors hanldenen ,,Ballaststoffen" befreit war, zeigte im Tierversuch noch die volle blutdrucksenkende Wirkung, die, wie jetzt sich herauB stellte, derjenigen von Cholinderivaten ahnlich war. Fallung mit Quecksilberchlorid. Ein aus 100 g Ruckstand 4 erhaltenes ,,Endfiltrat" wurde mit einer ger sattigten Losung von Quecksilberchlorid in absolutem Xthanol versetzt. Das Gemisch blieb zwei Tage lang stehen; danach wurde der Niederschlag abs gesaugt, mit Xthanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute 8 g. 64) 1. c. 470 Julius August Miillcr Nach den Angaben von B o r u t t a u und C a p p e n b e r g e s ) wurde der fein zerriebene Niederschlag viermal mit je 100 g hciDem Wasser Bus: gelaugt, und die vereinigten Auszuge im Vakuum eingedampft. Aus dem Kiickstand wurde das Quecksilber mit Schwefelwasserstoff. das Chlorion mit frisch gefalltem Silberkarbonat entfernt. Das Filtrat wurde noch einmd mit Schwefelwasserstoff gesattigt. wobei ein wenig Silbersulfid ausfiel, von dern abfiltriert wurde. Nach Entfernen des Schwefelwasserstoffes wurde die Fliissigkeit mit einer gemessenen wasserigen Weinsaurelosung genau neutralis siert und noch ebenso viel Weinsaurelosung hinzugefiigt, um saure weins saiire Salze zu erhalten. Der Ruckstand der zur Trockene gebrachten Liisung wurde mit absolutem Hthanol ausgezogen, die Losung etwas eingeengt und mit einer alkoholischen Losung von Platinchloridchlorwasserstoff versetzt. Die ausfallenden hellgelben, sehr kleinen Kristalle waren optisch isotrop; ails einem Tropfen Wasser auf dem Objekttrager umkristallisiert, wurden liingliche doppelbrechende Kristalle erhalten. Dieser Dimorphismus ist nach V o r 1 a n d e r und K a u f m a n n 66) charakteristisch fur Cholin. Auch die Entwicklung von Trimethylamin beim Erwarmen einiger Kristalle mit einein Tropfen Natronlauge deutete auf Cholin hin. ebenso wie die sehr geringe 1,iislichkeit des Chloroplatinates in 70%igem Athanol. Die Elementaranalyse entschied endgultig fur Cholinhexachloroplatinat. 5.428 mg Sbst.: 3.988 mg CO,, 2.257 mg H,O, 1.720 mg Pt. 3.921 mg Sbst.: 0.167 ccm N (240. 749 mm). ~ioH280,N1C16Pt. Ber.: ' C 19.47, H'4.58, N 4.55, Pt 31.67. Gcf.: C 20.04, H 4.65. N 4.82, Pt 31.69. Die noch zweimal mit derselbcn Materialmenge durchgefuhrte Fallung mit Quecksilberchlorid fuhrte jedesmal zu dem gleichen Ergebnis. F a 1 l u n g m i t R e i n e c k e s S a 1 z. Das aus 100 g Ruckstand 4 erhaltene ,,Endfiltrat" wurde im Vakuum auf 70 g eingeengt und dann mit einer gesattigten absoluts alkoholischen Losung von ReineckesSalz, [Cr(CNS)r(NHs)*]NH4, iiberschichtet. Nach eintagigcm Stehen wurde vorsichtig ums geschwenkt und die rosarot gefarbten Klistalle nach 24 Stunden abs gesaugt. Ausbeute 1.2 g. Unter dem Mikroskop betrachtet, zeigte die Hauptmenge der Kristalle dic Form regelmafiiger, sechseckiger Plattchen; nur vereinzelt fanden sich langer gestreckte Sechsecke. Die Kristalle waren doppelbrechend. mit gerader Ausloschung. In den meisten Losungsmitteln unloslich, gingen sie bei an. haltendem Kochen mit sehr viel Methanol in Losung. Nach Zusatz von etwas Wasser und folgendem freiwilligen Eindunstenlassen dieser Liisung erhielt man rubinrote breite Nadeln. A m besten eignete sich Azeton zum Umkristallisicren, das in der Weise erfolgtc, da13 die durch schwaches Erwarmen erhaltcne Losung, mit 25% Wasser versetzt, dem freiwilligcn Eindunsten ubcrlassen wurde. Von Zeit zu Zeit wurden die abgeschiedenen Kristalle abs filtriert, und das Filtrat weiter eindunsten gelassen. Auf diese Art wurden zunachst 9 Fraktionen gewonnen. Da die Kristalle keinen scharfen Schmclzpunkt hatten, auch andcre Reinheitskriterien nicht 85) en) I. c. 1. c. Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistcl 47 1 vorhanden waren, so blieb fur letztere nur die Elementaranalysc und nach erneutem Umkristallisieren wicder de Elementaranalyse maagebend. F r a k t i o n 1. 5.667 mg Sbst.: 5.475 mg CO,, 2.597 mg H 2 0 , 1.084 mg Cr,O,. - 5.527 mg Sbst.: 5.365 mg CO,, 2.545 mg H 2 0 , 1.027 mg Cr20,. 3.824 mg Sbst.: 0.748 ccm N (19.50, 752 mm). Gef.: C 26.35, 26.47. H 5.13, 5.15, Cr 13.09, 12.71, N 22.59. F r a k t i o n 2. 5.853 mg Sbst.: 5.620 mg CO,, 2.624 mg H@, 1.088 mg Cr,O,. - 5.484 mg Sbst.: 5.255 mg CO,, 2.505 mg HZO,1.056 mg Cr20,. 2.630 mg Sbst.: 0.5155 ccm N (210. 762 mm). Gef.: C 26.18, 26.13, H 5.02. 5.11, Cr 12.73, 13.17, N 22.83. F r a k t i o n 3. 4.475 mg Sbst.: 4.332 mg CO,, 2.242 mg H,O, 0.829 mg ( : r 2 0 3 . - 4.910 mg Sbst.: 4.753 mg CO,, 2.299 mg H,O, 0.907 mg Cr20,. 2.839 mg Sbst.: 0.5439 ccm N (190, 763.6 mm). Gef.: C 26.40, 26.40, H 5.61, 5.24. Cr 12.68, 12.64, N 22.50. F r a k t i o n 4. 4.070 mg Sbst.: 4.076 mg CO,, 2.072 mg HzO, 0.747 mg C r 2 0 3 . - 4.301 mg Sbst.: 4.241 mg CO,, 1.976 mg H,O, 0.785 mg Cr,03. 0.933 mg Sbst.: 0.1813 ccm N (190, 763.6 mm). Gef.: C 27.51, 26.89, H 5.70, 5.14, Cr 12.56, 12.49, N 22.83. F r a k t i o n 5. 6.634 mg Sbst.: 6.331 mg CO,, 3.101 mg H 2 0 , 1.212 mg C r 2 0 3 . - 6.638 mg Sbst.: 6.332 mg CO,, 3.049 mg H 2 0 , 1.226 mg Cr20,. 2.144 mg Sbst.: 0.4047 ccm N (200, 764.5 mm). Gef.: C 26.03, 26.02, H 5.23, 5.14, Cr 12.50, 12.64, N 22.12. F r a k t i o n 6. 5.038 mg Sbst.: 4.947 mg CO,, 2.279 mg HsO,0.912 mg Cr203. - 5.485 mg Sbst.: 5.355 mg COz, 2.560 mg HzO, 0.997 mg Cr203. 2.624 mg Sbst.: 0.497 ccm N (190, 763.0 mm). Gef.: C 26.78. 26.63. H 5.06, 5.22, Cr 12.39. 12.44, N 22.23. F r a k t i o n 7. 6.306 mg Sbst.: 6.417 mg CO,, 2.950 mg H,O. 1.162 mg Cr,O,. - 4.869 mg Sbst.: 4.909 mg CO,. 2.262 mg H20, 0.868 mg Cr,03. 1.927 mg Sbst.: 0.353 ccm N (20.50, 754.0 mm). Gef.: C 27.75, 27.50, H 5.23. 3.20. Cr 12.61, 12.20, N 21.14. F r a k t i o n 8. 6.050 mg Sbst.: 6.882 mg CO,, 3.080 mg HnO, 0.954 mg (:r203. - 5.744 mg Sbst.: 6.541 mg CO,, 2.905 mg HzO, 0.886 mg Cr203. 1.619 mg Sbst.: 0.2744 ccm N (230, 755.0 mm). Gef.: C 31.02, 31.06, H 5.70. 5.66, Cr 10.79, 10.54, N 19.42. F r a k t i o n 9. 6.286 mg Sbst.: 6.528 mg CO,, 2.868 mg H20,1.063 mg Cr,O,. - 1.367 mg Sbst.: 0.2528 mg N (220, 753.0 mm). Gef.: C 28.32, H 5.11, Cr 11.56, N 21.20. - Wic ersichtlich, stimmten die Fraktionen 1, 2, 3, 5, 6, sowie die Fraktion 4 und 7 in ihrer Zusammensetzung weitgchend iiberein. Diese und Fraktion 8 wurden daher in der angcgebenen A rt umkris stallisiert, Fraktion 9 dagegen nicht, da von dieser nur noch etwa 10 mg vorhanden waren. Die Elementaranalyse dieser Fraktion hatte Werte ergeben, die recht gut auf AzetylcholiniReineckat pafiten: C,,H220zN,S,Cr. Ber.: C 28.42, H 4.77, N 21.11, Cr 11.20. Gef.: C 28.32, H 5.11. h'21.20. Cr 11.56. Die a d e r s t geringe Menge dieser Fraktion lieB eine weitere Untersuchung nicht zu. Elementaranalyse der beim Umkristallisiercn tionen 1, 2, 3, 5, 6 gewonnenen Kristalle (I): der vereinigten Fraks 4 72 Julius August Miiller 5.630 mg Sbst.: 5.316 mg COz, 2.466 mg H20,1.064 mg Cr20,. 1.589 mg Sbst.: 0.3087 ccm N (200, 756.5 mm). Gef.: C 25.75, H 4.90, Cr 12.93, N 22.53. Elementaranalyse von I nach erneutem Umkristallisieren: 4.432 mg Sbst.: 4.185 mg CO,. 2.145 mg H 2 0 , 0.826 mg Cr20,. 1.561 mg Sbst.: 0.3067 ccm N (22.50, 756.5 mm). Gef.: C 25.75, H 5.42, Cr 12.75, N 22.59. - - Die Zusammensetzung dieser Kristalle (I) wurde als einheitlich angesehen. Die Werte der Analyse paBten auf CholinsReineckat. Zurn Vergleich wurde diese Verbindung Bus im Handel befindlichem Cholinchlorid hergestellt. Sie wurde teils in Form undeutlich begrenzter, sechseckiger Blattchen, teils in sechss oder auch vierstrahligen, im letzten Falle Xsformigen Sternen erhalten. Die nach dem Umkristallisieren erhal: tenen Kristalle glichen den Kristallen (I). Elementaranalyse des CholinrReineckats: 4.401 mg Sbst.: 4.180 mg CO,, 2.140 mg HzO, 0.797 mg Cr,O,. 0.961 mg Sbst.: 0.1862 ccm N (180, 759.5 mm). CoH?oON7S,Cr. Ber.: C 25.56, H 4.77. Cr 12.31, N 23.21. Gef. (CholinsReineckat): C 25.90, H 5.44, Cr 12.39. N 22.71. KristalleI: C 25.75, H 5.42. Cr 12.75, N 22.59. Elementaranalyse der Fraktion 8 nach dem Umkristallisieren (Kristalle 11) : 4.786 mg Sbst.: 5.166 mg CO,, 2.357 mg H20,0.800 mg Cr20,. 1.613 mg Sbst.: 0.2744 ccm N (200, 756.5 mm). Gcf.: C 29.44, H 5.51, Cr 11.44, N 19.73. Elementaranalyse der vereinigten Fraktion 4 und 7 nach dem Ums kristallisieren (Kristalle 111): 4.880 mg Sbst.: 5.364 mg C 0 2 , 2.544 mg H20,0.757 mg Cr20,. 2.258 mg Sbst.: 0.3851 ccm N (20.50, 760.0 mm). Gef.: C 29.98, H 5.83, Cr 10.61, N 19.84. Die Kristalle I1 und I11 wurden vereinigt, da sie recht ahnlich zusammengesetzt waren, und umkristallisiert (Kristalle IV). 4.978 mg Sbst.: 5.435 mg CO,, 2.576 mg HzO, 0.799 mg CrzO,. 1.351 mg Sbst.: 0.2313 ccm N (190, 759 mm). Gef.: C 29.78, H 5.78, Cr 10.98, N 19.94. - Auf Grund der Analyse der Kristalle IV, von denen noch etwa 120 mg vorhanden waren, konnte Propionylcholin als vorliegend in Betracht kommen. CI2H2,O2N,S,Cr. Ber.: C 30.09, H 5.06, Cr 10.87, N 20.49. Ergebnis d e s Hofmannschen Abbaues. 100 mg Kristalle IV wunden in 10 ccm Azeton gelost, der Losung 3 ccrn Wasser hinzugefugt und der Reineckatrest mit Silbersulfats losung als SilberiReineckat gefallt. Aus dem Filtrat wurden durch vorsichtigen Zusatz verdiinnter Bariumchloridlosung Ags und so45 Ionen entfernt und die Base gleichzeitig in ,das Chlorid ubergefiihrt. Das Filtrat nebst dem zum Waschen des AgCl und Bas04 geS brauchten Wasser wurden nach kraftigem Schutteln mit Ag,O der Wasserdampfdestillati~n~~) unterworfen, das Destillat in verdunnter Salzsaure (2 ccm Wasser 4 Tropfen konz. HC1) aufgefangen. Ganz zu Anfang der Destillation machte sich ein Geruch nach + 473 Z u r Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistcl Azetaldehyd bemerkbar. Das eingeengte Destillat wurde mit Chloros platinsaure versetzt und weiter eingedunstct. Dabei schieden sich goldgelbe tetraedrische Kristalle aus, deren Menge durch Zugabe von absolutem Athanol noch vermehrt werden konnte. Ausbeute etwa 4 mg. 2.289 mg Sbst.: 1.133 mg CO,, 0.661 mg H20,0.850 mg Pt. CBHION~C1,Pt(Trimethylaminchlorplatinat).Ber.: C 13.63, H 3.82. Pt 36.96. Gef.: C 13.50, H 3.23, P t 37.13. Beim Eindampfen des Filtrates vom Destillationsruckstand hinterblieb ein dunner Sirup, der beim Aufbewahren uber Schwefeb saure glasig wurde, und zarte Kristallnadelchen enthielt. Die sehr hvgroskopische Masse zerfloi3 bereits beim Herausnehmen aus dem Exsikkator und roch schwach nach Trimethylamin. Dieser Geruch trat starker hervor, als der Ruckstand mit einigen Tropfen Natron: lauge versetzt wurde. Beim Ansauern der eben genannten hygroskopischen Masse mit Phosphorsaure machte sich ein der Propionsaure ahnlicher Geruch bemerkbar. Dieses saure Gemisch wurde mit einer AtherEhloros formsMischung, zuletzt mit Ather ausgeschuttelt. Nach dem Vere dunsten der Losungsmittel blieb ein auBerst geringer, stark sauer reagierender und nach niederen Fettsauren riechender Ruckstand ubrig. Mikrochemische Reaktionen auf Propionsaure fielen jedoch negativ aus; insbesondere konnte das charakteristische Bariumsalz nicht erhalten werden. AuBer auf Propionsaure wurde mikrochemisch noch auf Milchsaure, Essigsaure und Buttersaure gepruft, ohne aber zu einem positiven Ergebnis zu fuhren. Weitere Reaktionen an5 zustellen. war wegen Materialmangels jetzt nicht mehr moglich. 1. Schema der Aufarbeitung des Saftes I. (Zu Seite 459.) Filtrierten Saft (wirksam) auf warmen: __ 500 er. Ausflockung sam). * Filtrat von Ausflockung (wirksam) im - - ~Vakuum eindampfen: V Ruckstand (wirksam) mit Methanol fallen: ___ + ---+ (unwirks Destillat. Fallung 1 (unwirksam). Y Filtrat (wirksam) mit mehr Methanol vermischen: - . + Fallung 2 (wirksam). Y Filtrat (wirksam) im Vakuum eins __ -. dampfen : Destillat (Methanol). Y Ruckstand 2 (wirksam) mit Athanol -~ ___ _ _ fallen: d -+ V Filtrat (SRestfiltrat) (unwirksam) im - --___-Vakuum eindampfen: - -- Kristalle 1 (MpLaktat). Fallung 3 (wirksam). Kristalle 2 (d:Mannit). Verwendet wurde die Apparatur nach P a r n a s und W a g n e r , siehea% r e g 1 , Die mikrochemische Elementaranalyse, Berlin 1930. 474 Julius August Miiller 11. Schema der Untersuchung von Fallung 3. (Zu Seite 460 bis 461.) A. Priifung auf Pflanzenbasen nach S t a s 0 t t o : ergebnislos. B. Versuch. rnit Hilfe von Phosphorwolframsiiure basische Stoffe zu isolieren: Wasserige Losung von Fallung 3 mit Blciazetat fallen: __-.+ Bleifallung V Piltrat mit H,S sattigen: -----kBleisulfid . ? Das von H2S befreite Filtrat mit Salzs saure ansaucrn, dann mit Scheiblers Reagens fallen: + -.. 0 Filtrat Ndederschlag trocknen. .- v .~ n Niederschlag mit Ba(OH)2 zerlegen. V Niederschlag in verd. NH, losen. f V Lijsung mit Benzol, Ather, I'ssigester, Chloroform ausschiitteln: Ergcbnis negativ. Filtrat mit Benzol, Xther, Essigcster, Chloroform ausschutteln: Ergebnis negativ. 111. Schema der Bleifallungen. (Zu Seite 461 bis 462.) Kiickstand 1 mit Methanol fallen: Fallung 1 (unwirksam) f Filtrat :im Vakuum eindampfen: _ - Destillat (Methanol) * In Wasser geliisten Ruck: stand mit Bleiazetatlosung versetzen: A'... .- . 0 Filtrat mit Bleig essig versetzen: I V k Filtrat mit Na2HP04 cntbleien: f 1. Bleifallung mit 2. Bleifallung mit NazHPOd zerlegen. Reaktionsmodukt mit Methinol ausr ziehen: N a 2 H P 0 , zerlegen. Reaktionsprodukt mit Methanol ausziehen. I w Filtrat (unwirksam) I f-- Y Methanollosung. Methanol verdunsten: t Ruckst and (unwirksarn) __ -/\ /\- Ruckstand mit Wasser ausziehen: t Filtrat (unwirksam) \/- I V Methanollosung. Methanol vcrdunsten: __ Kiickstand mit Wasser ausziehen. V V Riickstand (unwirksam) Filtrat (unwirksam I.-- ! f \/ -- 1- \/--- j. Priifung auf Saponine (Hamolyse.. FischsVersuch) n e g a t iv. Fehlingsche Losung wird nicht reduziert, auch nicht nach Kochen rnit Siuren. Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel 475 IV. Schema der Aufarbeitung des Saftes II. (Zu Seite 465 bis 473.) Saft (wirksam, toxisch) im Vakuum eindampfen : 4 Ruckstand 1 (wirksam, toxisch): V Filtrat (wirksam, toxisch) fliissigkeit eindampfen: > Destillat enthalt Essigz saure. Abscheidung von Mg: Laktat. __-. + Waschs + c Riickstand l a (wirksam, toxisch) mit Methanol fallen: wasseoiges Destillat. -> Fallung 1 (unwirksam). V Destillat (Methanol). Filtrat im Vakuum eindampfen: V Kiickstand 2 (wirksam, toxisch) im Wasser losen; Liisung mit Al(OH), . . ... behandeln: .f Al(0H)pAdsorbat. V Filtrat (wirksam. weniger toxisch) im Vakuum eindampfen: -Y Riickstand 3 mit wenig (96%ig) verriihrcn: -. -+ Athanol wasseriges Destillat. + Abscheidung von Mannit. Filtrat mit viel Athanol (96%) ver; -. . -. mischen: * Fallung 2 (unwirksam). Filtrat eindampfen: + Destillat (Xthanol). c c -.. V Riickstand 4 (wirksam, fast nicht toxisch) mit absol. Xthanol ver: . .. ._ setzen: --+ V Filtrat fast zur Trockene Fallung 3 (unwirksam). -> Destillat (Xthanol). . V Riickstand 4a mit viel absol. Xthanol aufnehmen: ._ .. -.. + V + Filtrat mit verd. HzS04 versetzen: -1 Riickstand (unwirksam). Filtrat mit BaCO, schiitteln: .- -.f BarNiederschlag. Filtrat im Vakuum auf % einengen: -- -+ Destillat (Athanol). Abscheidung von Mannit. V V Filtrat (5Endfiltrat): I > -. V ._ . v Fallung rnit HgCI, Fallung mit ReineckeSSalz Aufarbeitung der Fallung fuhrt zur Isolies rung von Cholin Aufarbeitung dcr Fallung fiihrt zur Isolies rung von Cholin und Propionylr cholin e c 476 Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel 2 u s a m m e n f a s s u n g. Die mitgeteilten Untersuchungen haben zu folgenden, hinsichtz lich der Inhaltsstoffe der nordischen Mistel, Viscum album L., var. Laubholzmistel (speziell Apfelbaummistel), neuen Erkenntnissen g efuhr t : 1. Der Mistelsaft enthalt freie Essigsaure. 2. Der Mistelsaft enthalt das Magncsiumsalz der Garungs:(d,l)= Milchsaure. 3. Der Mistelsaft enthalt &Mannit. 4. Die blutdrucksenkende Wirkung des Mistelsaftes ist einem Ges misch von Azylderivaten (des Cholins zuzuschreiben. In diesem Gemisch konnte das Vorhandensein von Propionylcholin sehr wahrscheinlich gemacht werden; die Anwesenheit von Azetyb cholin ist unsicher. 488. K. W. Merz: Uber das Cichoriin und die Konstitution des Xskulins und des Skopolins. (Aus dem Pharmazeutischen Institut der Universitiit Berlin.) Eingegangen am 10. August 1932. Vor einigen funfzig Jahren hat N i e t z k i I ) aus den Bluten von Cichorium Intybus ein Glykosid isoliert, das in der Literatur') unter dem Namen Cichoriin gefuhrt wird. N i e t z k i beschrieb das Glykosid als w e i k , zu Buscheln vereinigte Nadeln vom Schmp. 215 bis 22W, die sich in Ather nicht, in kaltem Wasser kaum, dagegen leicht in heii3em Wasser und Alkohol losten. Auch in Ammoniak, in atzenden und in kohlensauren Alkalien waren sie schon in der Kalte mit gelber Farbe leicht loslich. Bei der Spaltung des Glykosids erhielt N i e t z k i das Genin als feine Nadeln oder Blattchen, die bei 250 bis 255O schmolzen. Auch das Genin war in Alkalien leicht loslich; diese Losungen zeigtem blauliche Fluoreszenz. Aus den Elementaranalysen und den Ergeb: nissen der Glykosidspaltung berechnete der Autor fur das Glykosid dia Formel C d L h o i ~. 4 %HK), fur das Genin CmHi,O,. Es schien nicht uninteressant, das Glykosid erneut zu unter: suchen mit dem Zicl, seine Konstitution aufzuklaren. Bei der Darstellung des Cichoriins erweist es sich als vorteilhafter, zur Extraktion der Bluten 98%igen, statt wie N i e t z k i 60%igen Alkohol zu verwenden. Der starke Alkohol erleichtert die Aufarbeitung der Ausziige. 1) 2) Arch. Pharmaz. 208, 327 (1876). v a n R i j n I D i e t e r 1 e , ,,Die Glykoside", Berlin 1931.
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