close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

1168

код для вставкиСкачать
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Воронежская государственная лесотехническая академия»
БИОТЕХНОЛОГИЯ
Ранняя диагностика заболеваний сеянцев лесных питомников
с помощью методов молекулярно-генетического анализа
Методические указания к практическим занятиям
для студентов по направлению подготовки магистров
250700 – Ландшафтная архитектура
Воронеж 2014
2
УДК 630*
Биотехнология. Ранняя диагностика заболеваний сеянцев лесных питомников с
помощью методов молекулярно-генетического анализа [Текст] : методические
указания к практическим занятиям для студентов по направлению подготовки
магистров 250700 – Ландшафтная архитектура / В. А. Сиволапов,
Н. А. Карпеченко, В. Н. Вепринцев, И. Ю. Карпеченко, А. И. Сиволапов ; М-во
образования и науки РФ, ФГБОУ ВПО «ВГЛТА». – Воронеж, 2014. – 23 с.
Печатается по решению учебно-методического совета
ФГБОУ ВПО «ВГЛТА» (протокол № 2 от 31 октября 2014 г.)
Рецензент заведующий лабораторией лесной биотехнологии
ФГБУ «ВНИИЛГИСбиотех» канд. биол. наук О.С. Машкина
Ответственный за выпуск канд. с.-х. наук, проф. А.И. Сиволапов
Методические указания предлагаются для обучения и подготовки магистров по
предмету «Биотехнология», специалистам генетических лабораторий по молекулярногенетическому анализу.
Методические указания могут быть использованы при обучении слушателей по
соответствующим программам дополнительного профессионального образования.
3
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение……………………………………………………………………..
Список основных терминов…………………………………………………
1.
Общая часть…………………………………………………………..
2.
Методика видовой идентификации фитопатогенов сеянцев
лесных питомников с помощью молекулярно-генетических методов
анализа……………………………………………………………………….
2.1. Сбор образцов с лесных питомников для ДНК-анализа .....................
2.2. Протокол выделения ДНК……………………………………………
2.3. Спектрофотометрическое измерение концентрации ДНК …………..
2.4. Протокол постановки ПЦР……………………………………………..
2.5. Протокол постановки электрофореза в агарозном геле………………
2.6. Протокол выделения и очистки ампликона из агарозного геля (на
примере наборов Eurugen Cleanup Mini).…………………………………..
2.7. Протокол постановки секвенирующей ПЦР…………………………..
2.8. Протокол очистки проб набором BigDye® XTerminator Purification
Kit……………………………………………………………………………..
2.9. Протокол определения структуры ДНК на генетическом
анализаторе ABI PRISM 310……………………………………………….
2.10. Протокол анализа результатов секвенирования…………………….
3.
Описание некоторых заболеваний сеянцев лесных питомников,
выявленных с помощью методов молекулярно-генетического анализа, и
методы борьбы с ними………………………………………………………
Библиографический список…………………………………………………
Приложение 1. Список оборудования для видовой идентификации
фитопатогенов сеянцев лесных питомников с помощью молекулярногенетических методов анализа……………………………………………...
Приложение 2. Список химических реактивов и пластиковой посуды на
различных этапах работ для видовой идентификации фитопатогенов
сеянцев лесных питомников с помощью молекулярно-генетических
методов анализа……………………………………………………………..
4
5
6
8
8
8
9
9
10
11
11
12
12
14
15
18
20
21
4
ВВЕДЕНИЕ
Начало XXI столетия ознаменовалось быстрым развитием и внедрением в
лесохозяйственную деятельность России различных методов биотехнологии и
генной инженерии.
Решение ряда важнейших проблем в области лесной генетики не было
возможно
ввиду
отсутствия
соответствующего
оборудования
и
апробированных методик работ.
Инновационные технологии, внедрённые в современное лесное
хозяйство, при их рациональном использовании, способны дать
положительный эффект в развитии отрасли и вывести её на качественно новый
уровень. Исключением не является и анализ ДНК как растений, так и их
патогенов.
В данной работе большое внимание было сконцентрировано на
модернизации и апробации общепринятых методик и протоколов выделения,
идентификации заболеваний инфекционного происхождения древесных
растений. Исследования проведены в ходе плановых работ отдела лесной
генетики филиала ФБУ «Рослесозащита»-«ЦЗЛ Воронежской области».
Приведённые ниже протоколы могут быть использованы при подготовке
специалистов высших учебных заведений в области молекулярной генетики и
прочих специалистов производств лесного хозяйства.
5
СПИСОК ОСНОВНЫХ ТЕРМИНОВ
Биотехнология – наука о методах и технологиях производства продуктов с
использованием биологических объектов.
Генотип – совокупность генов организма.
Генная инженерия – совокупность методов молекулярной генетики,
направленных на получение рекомбинантных нуклеиновых кислот,
осуществление манипуляций с генами.
Денатурация биополимеров – изменение структуры молекулы, вызывающее
потерю её естественных свойств.
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) – биологический полимер, носитель
наследственной информации всех живых организмов. В ядре клетки она
представлена в виде хромосом.
Лиофилизат – продукт лиофилизации (способ мягкой сушки вещества)
Митотип – генотип по митохондриальной ДНК.
Отжиг праймера – присоединение праймера к ДНК-матрице.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод амплификации (многократного
копирования) небольших количеств фрагментов ДНК.
Праймер – последовательность из нескольких десятков нуклеотидов,
используемая для ПЦР.
Секвенирование – определение нуклеотидной последовательности.
Фитопатогены – инфекционные болезни растений.
Хладагент – вещество, используемое для охлаждения при термостатировании.
Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот под
действием электрического поля.
Элонгация – процесс удлинения нуклеотидной последовательности.
BLAST – Интернет ресурс, применяемый для сравнения нуклеиновых
последовательностей.
6
1. ОБЩАЯ ЧАСТЬ
Одним из действенных способов недопущения роста численности
вредных организмов, приносящих существенный ущерб от потери качества и
количества как репродуктивного материала лесных питомников, так и
древостоев, является их ранняя диагностика и профилактика с применением
современных способов защиты и воспроизводства леса. В связи с этим
возникает необходимость введения в практику современного лесного хозяйства
фитосанитарных обследований состояния лесных питомников на основе
методов молекулярно-генетического анализа. Они позволят поставить точный
диагноз и узнать происхождение репродуктивного материала при наличии
региональной базы данных митотипов основных лесообразующих пород. Во
многом состояние и продуктивность создаваемых лесных культур зависит не
только от факторов внешней среды, но и от качества и происхождения
посадочного материала. На сегодняшний день оборудование и реактивы для
ДНК-анализа являются весьма дорогостоящими, однако их стоимость
оправдана
экономической
и
экологической
целесообразностью,
заключающейся в предупреждении увеличения площади и степени поражения
патогенами, по сравнению с проведением лесозащитных мероприятий и
последующих лесовосстановительных работ.
Причиной повреждения и усыхания лесных растений служит воздействие
ряда факторов абиотической и биотической природы, а также антропогенной –
нарушение агротехники выращивания посадочного материала, несоблюдение
условий хранения, технологии предпосевной обработки и посева семян.
Нередко неблагоприятные погодные условия (аномальные засухи, град и т. д.),
повреждения насекомыми приводят к ослаблению биологической устойчивости
растения и создают предпосылки для поражения различными болезнями.
Важной особенностью для ведения хозяйства является наличие
инкубационного периода инфекционных заболеваний – времени от начала
заражения до появления первых признаков. Длительность этого периода
зависит от способа заражения и вида возбудителя и может продолжаться от
нескольких часов до нескольких лет.
Практическая значимость методов молекулярно-генетического анализа
заключается в диагностике заболеваний уже на ранних стадиях, трудно
идентифицируемых заболеваний и для уточнения диагноза, поставленного по
морфологическим признакам.
7
Диагностика фитопатогенов включает в себя ряд технологических этапов:
выделение генетического материала (ДНК) из лесных растений, амплификация
маркерных
участков
фитопатогенов,
определение
нуклеотидной
последовательности амплифицированных фрагментов, анализ и идентификация
патогенов в базе данных (рис. 1).
Многократное копирование ДНК фитопатогена Отбор образцов с питомника
Выделение тотальной ДНК из вегетативной части растения
...AGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTG…
Идентификация в базе данных Расшифровка ДНК фитопатогена (секвенирование) Рис. 1. Схема видовой идентификации фитопатогенов сеянцев лесных
питомников с помощью молекулярно-генетических методов
Ранее используемый метод фитопатологического анализа посадочного
материала в лесных питомниках основан на обнаружении внешних признаков
болезней: изменение цвета ассимиляционного аппарата или отдельных органов
растения, наличие поверхностных спороносящих органов грибов и др. Он не
позволяет осуществить своевременную профилактику и лечение заболеваний,
что приводит к существенному экономическому и экологическому ущербу.
В связи с вышеизложенным, использование ДНК-анализа представляется
более целесообразным, так как позволяет обнаружить поражение культур в
питомниках на ранних стадиях и предупредить его распространение.
8
2.
МЕТОДИКА
ВИДОВОЙ
ИДЕНТИФИКАЦИИ
ФИТОПАТОГЕНОВ
СЕЯНЦЕВ
ЛЕСНЫХ
ПИТОМНИКОВ
С
ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА
2.1. Сбор образцов с лесных питомников для ДНК-анализа
Отбор образцов для генетического анализа осуществляют в количестве
20-50 поражённых растений каждой возрастной группы. Отобранные растения
высушивают, этикетируют и отсылают в бумажных пакетах в ДНКлабораторию для последующего анализа.
В случае отсутствия поражённых растений в питомнике для оценки его
фитосанитарного состояния осуществляют отбор растений без внешних
признаков заболевания. Сбор проводят по диагонали производственного
отделения или в шахматном порядке.
Для молекулярно-генетического анализа могут быть использованы любые
части растения: хвоя, листья, стебель, корни. Однако лучше выделять ДНК из
поражённого ассимиляционного аппарата.
Помимо растительных тканей возможно выделение ДНК патогенов из
почвы, воды и насекомых.
2.2. Протокол выделения ДНК
Небольшой фрагмент ткани поместить в ступку для растирания, добавить
1 мл прогретого ЦТАБ-буфера (3 % бромид цетилтриметилламоний (ЦТАБ),
1,4 М NaCl, 20 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис, вода деионизованная) и максимально
гомогенизировать образец.
Переместить гомогенат в заранее прогретые в термостате до 65 °С
центрифужные пробирки типа эппендорф. Инкубировать 5-7 мин. Навести и
внести в каждую пробу равный объём смеси хлороформ : изоамиловый спирт
(24:1 соответственно) (работа под вытяжкой). Тщательно перемешать пробы в
течение 1-2 минут. Центрифугировать пробы 2-3 минуты при 13 000 g.
Перенести супернатант в микроцентрифужные пробирки типа эппендорф.
Среднюю и нижнюю фазы в дальнейшей работе не используют. Внести в
каждую пробу 0,7 объёма охлажденного в морозилке изопропилового спирта
9
(работа под вытяжкой). Тщательно перемешать пробы в течение 1-2 минут.
Центрифугировать пробы 2-3 минуты на максимальных оборотах. Слить
жидкость и оставить пробы обсохнуть на воздухе. Добавить в пробирки с
пробами этиловый спирт 96 %. Тщательно перемешать в течение 2-3 минут.
Удалить жидкость из проб. Повторить процедуру промывки этанолом.
Высушить осадок. Добавить в пробы минимально необходимое для
растворения осадка количество мQ-воды. Растворить до полного исчезновения
осадка. Выделенные ДНК необходимо хранить при –20 °С.
2.3. Спектрофотометрическое измерение концентрации ДНК
Поскольку концентрация и чистота препарата ДНК являются важными
факторами, влияющими на ход дальнейшего анализа, необходимо установление
значений этих показателей с помощью спектрофотометра. Для определения
количества ДНК измеряют поглощение раствора в областях с длинами волн
260 и 280 нм. Измерение при 260 нм позволяет рассчитать концентрацию
нуклеиновой кислоты в пробе. Оптическая плотность D = 1 A соответствует
приблизительно 50 мкг/мл двухцепочечной ДНК. Соотношение экстинкции
260/280 нм позволяет судить о чистоте нуклеиновой кислоты. Коэффициент
отношения волн 260/280 нм для чистых препаратов ДНК должен укладываться
в переделы 1,7 – 2,0. Коэффициент отношения волн 230/260 нм должен быть в
переделах 0,3 – 0,9. Выход за параметры этих значений будет
свидетельствовать о чрезмерном загрязнении образцов примесями (белки,
фенолы, соли и др.). Привести концентрации проб к оптимальному значению
путем разбавления водой.
2.4. Протокол постановки ПЦР
Подготовить необходимые компоненты ПЦР-смеси. В штатив с
хладагентом поместить пробирки, предназначенные для проведения ПЦР.
Рассчитать общее количество компонентов. Навести суммарную смесь в одной
пробирке и разнести поровну в остальные. Добавить в каждую пробирку
соответствующую ДНК-матрицу и довести водой до конечного объёма.
10
Состав ПЦР-смеси на 25 мкл: 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера, 2,5 мкл 25 мМ
MgCl2, 1 мкл 10 мМ смесь дНТФ (дезоксинуклеотид трифосфаты), 1 ед. TaqДНК-полимеразы, по 1 мкМ прямого и обратного праймеров, ДНК-матрицы (её
объем зависит от концентрации полученной ДНК), деионизованной воды до
25 мкл. Перемешать, поместить в амплификатор, запустить необходимую
программу.
Классический вид программы ПЦР для амплификатора (стадии со 2 по 4
повторяются циклически в количестве 25-40):
1. Первичный прогрев 95 °С – 5 мин.
2. Денатурация 90-95 °С – 15 сек. Происходит расщепление
двухцепочечной молекулы ДНК.
3. Отжиг 20 сек (температура отжига зависит от длины и нуклеотидного
состава праймера и устанавливается оптимизированной для
используемых праймеров (40-60 °С)).
4. Элонгация 72 °С – 40 сек
5. Конечная элонгация 72 °С – 5 мин.
6. Хранение 4 °С – ∞
Состав смеси и программа ПЦР могут варьироваться и подбираются
экспериментально.
2.5. Протокол постановки электрофореза в агарозном геле
Приготовить агарозный гель (сварить) необходимого состава и объёма.
Состав 2 % агарозного геля: агароза 2 %,трис-ацетатный буфер 2 % (pH 8,5, 2 М
трис, 0,5 М ЭДТА, уксусная кислота, дистиллированная вода), вода до
конечного объема. Необходимый объём геля выбирается, исходя из
вместимости заливочного столика электрофоретической камеры. Собрать
заливочный столик. После охлаждения геля до температуры 55 °С добавить
бромистый этидий (0,01 % от объёма геля), хорошо перемешать и залить в
заливочный столик. Вставить гребёнку. Застывший гель переместить в
электрофоретическую камеру. Смешать краситель с пробами (их соотношение
зависит от кратности красителя, указанной на упаковке). Закрыть камеру и
включить источник питания. После окончания электрофореза поместить гель в
систему гель-документации для анализа результата.
11
2.6. Протокол выделения и очистки ампликона из агарозного геля
(на примере наборов Eurugen Cleanup Mini)
Вырезать фрагменты проб из агарозного геля. Поместить вырезанные
фрагменты геля в микроцентрифужные пробирки. Взвесить фрагменты геля.
К каждой пробе добавить три объёма (в данном случае объём
приравнивается к массе фрагмента геля) «Связывающего раствора».
Инкубировать пробы при 53 °С до полного растворения геля, перемешивая.
Весь объём пробы перенести в собранные колонки. Центрифугировать колонки
с пробами при 13 000 g 30 секунд. Слить жидкость из собирательной пробирки
и добавить в каждую пробу по 700 мкл «Промывочного раствора».
Центрифугировать колонки с пробами при 13 000 g 30 секунд. Удалить
жидкость из собирательной части колонки. Центрифугировать колонки при
13 000 g 60 секунд. Колонки переместить в чистые микроцентрифужные
пробирки. Нанести дозатором на мембрану колонки 12 мкл «Элюирующего
раствора». Центрифугировать колонки с пробами при 13 000 g 30 секунд.
2.7. Протокол постановки секвенирующей ПЦР
Концентрация ДНК-матрицы для расчета количества, используемого на
секвенирующую реакцию, определяется спектрофотометрически (см. п. 2.3).
В микроцентрифужную пробирку внести 10 мкл реакционной смеси
(Terminator Ready Reaction Mix, праймер (3 мкМ р-р), ДНК-матрица,
деионизованная вода). Соотношение компонентов подбирается эмпирически.
Программа амплификации:
1. Первичная денатурация 95 °С – 1 мин.
Затем 25-30 циклов:
1. Денатурация 95 °С – 10 с.
2. Отжиг 50 °С – 10 с.
3. Элонгация 60 °С – 4 мин.
Охлаждение реакционной смеси до 4 °С – 5 мин.
Хранение 4 °С – ∞
После секвенирующей ПЦР необходимо провести очистку продукта от
непрореагировавших компонентов.
12
2.8. Протокол очистки продуктов секвенирующей ПЦР набором
BigDye® XTerminator Purification Kit
Добавить к пробам по 45 мкл буфера «SAMSolution». Тщательно
промешать на вортексе «XTerminatorSolution» и быстро добавить к пробам по
10 мкл. Перемешивать в течение 30 минут. Центрифугировать пробы на 1 000 g
2 минуты. Отобрать не менее 10 мкл супернатанта в пробирки для
последующего определения нуклеотидной последовательности.
2.9. Протокол определения структуры ДНК на генетическом
анализаторе ABI PRISM 310
Электрофоретический анализ и детекцию провести на секвенаторе ABI
PRISM 310 в соответствии с прилагаемой к прибору инструкцией.
1. Подготовка прибора к работе
Установка ячейки. Открыть двери прибора. В промытую1 dH20 и
высушенную ячейку вкрутить три чистые ферулы (верхняя, нижняя,
капиллярная). Вставить ячейку в прибор по направляющим металлическим
штырям.
Установка шприца. В чистый сухой шприц2 медленно набрать полимер
(max 0,8 мл). Протереть шприц. Отвернуть лапку привода шприца на приборе
влево. Вкрутить шприц в ячейку (правая верхняя).
Установка капилляра3. Открыть дверцу печки. Поместить конец
капилляра в перекрестье каналов ячейки и закрепить боковой ферулой. Второй
конец капилляра пропустить в отверстие шайбы крепления электрода и
закрепить так, чтобы конец капилляра выступал на полмиллиметра.
Расположить просвет капилляра напротив окна детектора, совместив метки, и
закрыть крышку. Окончательно закрепить капилляр термо-скотчем и закрыть
дверцу печки. Поместить свободный конец капилляра в буфер.
2. Запуск прибора
Включение прибора и заполнение ячейки. Включить прибор. Включить
ПК. Запустить ПО – Data collection. Закрыть клапан буферной ячейки:
Window>>Manual control>>Function>>Buffer valve close >>Execute. Закрутить
верхнюю ферулу и открутить нижнюю. Продавить полимер до выхода из
13
отверстия
нижней
ферулы:
Data
collection>>Window>>Manual
control>>Function>>Syringe down>>указать Value (для более короткого шага
использовать shift down)>>Execute. Закрутить нижнюю и открутить верхнюю
ферулу. Продавить полимер до выхода из отверстия верхней ферулы. Закрутить
верхнюю
ферулу
и
открыть
клапан:
Window>>Manual
control>>Function>>Buffer valve open>>Execute. Продавить полимер до выхода
из отверстия клапана. Закрыть клапан.
Калибровка и диагностика
Калибровка
автосемплера:
Data
collection>>Window>>Manual
control>>Autosample
colabration>>Tray>>Снимаем
адаптер>>Фиксируем
капилляр на точке в соответствии с изображением на экране>>Start>>Page up
поднимаем автосемплер вверх (shift up – более мелкие шаги), когда
закончилось позиционирование, нажать set (нужно обращать внимание, какой
текст отображается в диалоговом окне)>>Resume.
Диагностика
детектора:
Date
collection>>File>>New
Injection
list>>SeQuensingtestsens, sss>>Modute>>Test CCD 4-colour>>Run.
Установка проб. Закрепить пробы на мягких септах. Нажать Tray.
Собрать сендвидж и установить его в автосемплер. Нажать Tray. Закрыть
дверцы прибора.
Включение
печки:
Data
collection>>Window>>Manual
control>>Temperature set>>Value 50>>Execute>>Window>>Status.
Запуск секвенирования: Data collection>>File>>New>>Sequence sample
sheet на 96 образцов>>Sample name (назвать образцы, согласно занимаемому
месту в штативе)>>Save as>>Закрыть все диалоговые окна для обновления
полученной информации>>File>>New>>Injection list>>Выбирать созданный
sample sheet (в дальнейшем будет пониматься, как матрикс)>>Выбрать
module>>Задать условия электрофореза>>Run.
3. Завершение работы.
Открыть дверцы прибора. Изъять образцы: Tray>>Разобрать и промыть
сендвидж>>Tray. Закрыть и выключить прибор.
Примечание:
1
Промывание ячейки. Отсоединить чашку с буфером и капилляр от
ячейки, вынуть её из прибора. Последовательно промыть каналы ячейки dH20
через все ферулы пластиковым шприцем. Продуть каналы ячейки воздухом из
шприца и дать высохнуть при комнатной температуре.
14
2
Промывание шприца. Отвернуть лапку привода шприца на приборе
влево.
Data
collection>>Window>>Manual
control>>Function>>Syring
home>>Execute. Открутить шприц, избавить от остатка полимера и десять раз
промыть dH20. При необходимости перед промывкой можно разобрать шприц.
Дать высохнуть при комнатной температуре.
3
Капилляр вне упаковки и прибора хранить погруженным концами в
деионизованную воду.
2.10. Протокол анализа результатов секвенирования
Использование программного обеспечения SeqA6. Запустить SeqA6.
Загрузить данные: File>>AddSample(s)…>> в диалоговом окне выделить файлы
сырых данных секвенирования с именами образцов, лежащих в папке с именемдатой в директории «Runs»1 >>нажать кнопку «Add Selected Samples»>>Ok. В
открывшемся окне выбрать содержимое ячейки «DeySet/Primer» – подходящий
набор химии и капилляр. Установить галочку в ячейке «Show». Нажать кнопку
> (play). Во вкладке «Sequenсe» появится нуклеотидная последовательность
образца. После анализа (см. инструкцию к ПО) сохранить последовательности
образцов.
Использование
BLAST.
Открыть
в
браузере
страницу
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Выбрать онлайн-приложение BLAST или перейти
по
ссылке
>
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&
PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome.
Скопировать
последовательность образца из SeqA6 в соответствующее окно ресурса.
Запустить анализ>>нажать <BLAST>.
Примечание:
1
Директория «Runs» обычно расположена по пути: <Корневой
каталог>:\AppliedBio\310\Runs.
15
3. ОПИСАНИЕ НЕКОТОРЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕЯНЦЕВ
ЛЕСНЫХ ПИТОМНИКОВ, ВЫЯВЛЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА, И МЕТОДЫ БОРЬБЫ
С НИМИ
Cladosporium sp. – анаморфные грибы, возбудители темно-оливковой
плесени посадочного материала хвойных пород, также поражающие
преимущественно ослабленные растения. Симптомами кладоспориоза
являются изначальное потемнение хвои, приобретающей на последующих
этапах патогенеза оливковый оттенок, и появление на поверхности тканей
буровато-оливкового мицелия. Спороношение и, следовательно, заражение
растений происходит в течение всего вегетационного периода при
благоприятных для развития гриба условиях. Интенсивному распространению
болезни способствуют повышенная влажность воздуха, часто выпадающие
осадки, резкая смена суточных температур.
На начальном этапе развития болезни кладоспориоза (Cladosporium sp.)
эффективным
является
использование
фунгицидов
на
основе
12-оксофитодиеновой кислоты (12-oxo-PDA), что позволяет в полной степени
оздоровить посадочный материал. В случае эпифитотий (распространение
болезни на значительной территории) целесообразным является полное
удаление поражённых сеянцев и отмерших растительных остатков. При этом
следует производить уничтожение (сжигание) растительного материала за
пределами питомника.
Грибы рода Alternaria являются возбудителями альтернариоза – сухой
пятнистости хвои и листьев. Тёмно-коричневые или чёрные некротические
пятна поражённых участков ткани могут появляться и на стебле. На поздних
стадиях заболевания на поражённой хвое, которая становится бурой, на ветках
появляется бархатистый налет мицелия чёрного цвета. Споры с пораженных
участков тканей легко переносятся ветром на большое расстояние и становятся
новым источником инфекции. Как правило, больные растения располагаются
очагами. Спорообразованию способствует частая смена сухой и влажной
погоды.
Растения, ослабленные неблагоприятными погодными или почвенными
к
альтернариозу.
Факторами,
условиями,
более
восприимчивы
способствующими развитию альтернариоза, являются возможное нарушение
агротехники выращивания, недостаток влаги в почве, низкое содержание азота
16
и калия, избыточное количество фосфора, а также поражённость семенного
материала вирусами, ризоктониозом и другими болезнями.
Наиболее действенный метод защиты от альтернариоза химический.
Защитные обработки против альтернариоза следует проводить после
обнаружения первых симптомов заболевания. Высокую эффективность, по
данным различных исследователей, показали фунгициды на основе дифолатана.
В годы депрессивного развития альтернариоза достаточным является 1-2
обработки фунгицидами, в годы умеренного проявления болезни – 2-3, в
эпифитотийные – 3-4.
Rhizosphaera kalkhoffii. Данный гриб вызывает побурение хвои.
Заражение хвои происходит весной. Конидии распространяются посредством
дождя. К концу лета или осенью на хвое побегов текущего года появляются
отдельные жёлтые пятна. Постепенно они увеличиваются в размерах,
становятся бурыми или красно-бурыми, и в конце зимы – начале весны вся хвоя
буреет. Весной с нижней стороны хвоинок образуются чёрные округлые
пикниды, располагающиеся продольными рядами. Конидии овальные
бесцветные, размером (7-10) × (3-5) мкм, выходят из пикнид в виде мелких
белых капель. В этот период пораженная хвоя опадает.
Распространение конидий и заражение хвои может осуществляться
только в условиях повышенной влажности. Конидии возбудителя прорастают
очень медленно, и поэтому заражение хвои возможно только при длительном её
увлажнении. Систематически повторяющиеся поражения грибом R. Kalkhoffii
приводят к ослаблению, реже к усыханию ее в питомниках и молодых
культурах.
Средствами защиты от побурения хвои служит надзор за появлением и
распространением данной болезни, т.к. обычно поражение вызывает общее
ослабление растения и реже – усыхание. В случае острого протекания
патологического процесса – опрыскивание растений в период вегетации
водными суспензиями фундазола и бордосской смеси.
В лесных питомниках патоген Phoma pomorum вызывает заболевание
фомоз (сухую гниль) посадочного материала хвойных пород. Заражение
растений данным патогеном происходит в основном в период
переувлажнённости почвы, через хвою, контактирующую с землёй. Затем
патоген распространяется вдоль по стеблю и вызывает гибель верхушечной
почки растения. На начальном этапе развития болезни преимущественно
поражаются только ослабленные сеянцы и саженцы, в случае массовой
17
вспышки патогена инфицированию подвергается также и здоровый посадочный
материал.
Для ограничения вредоносности Phoma pomorum наиболее эффективной
является трёхкратная обработка вегетирующих сеянцев комплексом
фунгицидных препаратов, содержащих хлороталонил или его аналоги.
Вследствие того, что виды Phoma являются возбудителем заболеваний многих
пропашных культур (например, патоген кукурузы Ph. pomorum), не
рекомендуется выращивание посадочного материала или создание лесных
культур на данных типах сельскохозяйственных земель без проведения
предварительного севооборота.
Возбудитель склерофомоза имеет половую стадию, которая образуется на
отмерших ветвях сосны, вызываемую грибом Sydowia polyspora. Вред,
причиняемый болезнью, заключается в том, что в питомниках наблюдается
отмирание сеянцев и снижается выход стандартного посадочного материала. В
лесных культурах при сильном и неоднократном поражении деревья отстают в
росте и часто становятся многовершинными.
От склерофомоза в условиях питомника рекомендуется сбор и удаление
пораженных сеянцев в летний период. В лесных культурах целесообразно
проводить обрезку поражённых склерофомозом ветвей.
Naemacyclus minor (или Cyclaneusma minus). Данный гриб вызывает
пожелтение хвои. C. minus представляет большую потенциальную опасность
для хвойных пород. В России указанный аскомицет относят к группе грибов
возбудителей малоизученных болезней молодняков и взрослых хвойных
насаждений. По литературным данным, гриб был обнаружен в окрестности
г. Красноярска, Северном Казахстане, а также США (в штатах Северная
Дакота, Южная Дакота, Небраска и Канзас) и Республике Беларусь. Этот вид
гриба является инвазивным видом для лесов России.
Споры гриба распространяются посредством дождя и ветра. Споры
заражают хвою через устьица с апреля по ноябрь. Гриб хорошо размножается
на опавшей хвое. К концу лета или осенью на хвое побегов текущего года
появляются отдельные светло-зелёные пятна. Постепенно они увеличиваются в
размерах, и в конце зимы – начале весны вся хвоя желтеет.
Для ограничения вредоносности патогена Naemacyclus minor (или
Cyclaneusma minus) наиболее эффективной является четырёхкратная, с апреля
по октябрь, обработка вегетирующих сеянцев комплексом фунгицидных
препаратов, содержащих хлороталонил или его аналоги.
18
Библиографический список
Основная литература
1.
Лутова, Л. А. Биотехнология высших растений [Текст] : учеб. /
Л. А. Лутова ; С.-Петерб. гос. ун-т. – Изд. 2-е, доп. и испр. – СПб. : СПбГУ,
2010. – 240 с.
2.
Падутов, В. Е. Методы молекулярно-генетического анализа [Текст]
/ В. Е. Падутов, О. Ю. Баранов, Е. В. Воропаев. – Мн. : Юнипол, 2007. – 176 с.
Дополнительная литература
3.
Программа и Методика по п. 59 План мероприятий («дорожной
карты») «Развитие биотехнологий и генной инженерии» [Текст] : [утверждён
распоряжением Правительства РФ от 18 июля 2013 г. № 1247-р]. – Пушкино,
2013. – 205 с.
4.
Лесной кодекс Российской Федерации. Комментарии [Текст] / под
общ. ред. Н. В. Комаровой, В. П. Рощупкина. – Изд. 2-е, доп. – М. : ВНИИЛМ,
2007. – 856 с.
5.
Молекулярно-генетическая диагностика грибных болезней в лесных
питомниках [Электронный ресурс] / О. Ю. Баранов, В. А. Ярмолович, С. В.
Пантелеев, Д. Г. Купреенко // Лесное и охотничье хозяйство. – 2012. – № 6. –
Режим доступа: http://scholar.google.com/.
6.
Федоров, Н. И. Лесная фитопатология [Текст] : учеб. /
Н. И. Федоров. – Мн. : БГТУ, 2004. – 462 с.
7.
Сенашова, В. А. Поражения филлосферы хвойных растений,
вызванные фитопатогенными грибами на территории средней Сибири
[Электронный ресурс] / В. А. Сенашова // Болезни и вредители в лесах России:
ВЕК XXI : Материалы Всероссийской конференции с международным
участием и V ежегодных чтений памяти О.А. Катаева. Екатеринбург, 20-25
сентября 2011 г. – Режим доступа: http://ipae.uran.ru/sites/default/files/publications
/Zaharova_EJ/Zakharova_38.pdf
8.
Гниненко, Ю. И. Cenangiumabietis в очагах массового размножения
сосновой пяденицы в Северном Казахстане [Электронный ресурс] /
19
Ю. И. Гниненко, Н. Н. Арапова // I съезд микологов России. Тезисы докладов. –
Режим доступа: http://www.mycology.ru/nam/1crm/part3.pdf.
9.
Мозолевская, Е. Г. Проблема инвазий возбудителей болезней и
вредителей древесных растений в Москве [Электронный ресурс] /
Е. Г. Мозолевская, Э. С. Соколова // Чужеродные виды на территории России. –
Режим доступа: http://www.sevin.ru/invasive/publications/mozol_sokol_02_pr.html.
10. Synthetic molecular mimics of naturally occurring cyclopentenones
exhibit antifungal activity towards pathogenic fungi [Text] / Y. Zhou [et al.] //
Microbiology. – 2011. – № 157. – P. 3435-3445.
11. Жимулев, И. Ф. Общая и молекулряная генетика [Текст] : учеб.
пособие / И. Ф. Жимулев. – Новосибирск : Сиб. унив. изд-во, 2006. – 479 с.
12. Генетические эффекты трансформации лесных экосистем [Текст] /
В. Е. Падутов, Л. В. Хотылева, О. Ю. Баранов, С. И. Ивановская //
Экологическая генетика. – 2008. – Т. VI. – № 1. – С. 3-11.
13. Состояние лесов Российской Федерации в 2013 году и прогноз на
2014 год [Текст] / ФБУ «Российский центр защиты леса». – Пушкино, 2014. –
45 с.
20
Приложение 1
Список оборудования для видовой идентификации фитопатогенов сеянцев
лесных питомников с помощью молекулярно-генетических методов
анализа
№
1
2
Наименование
Автоматические дозаторы
Амплификатор (термоциклер)
3
Весы электронные
4
5
Вортекс
Генетический анализатор
6
Камера электрофореза с источником
питания
Мешалка магнитная
Морозильная камера
7
8
9
10
11
12
13
ПЦР-бокс
Рециркулятор воздуха и УФстерилизатор
рН-метр
Система гель-документации
Система очистки воды
14
Спектрофотометр
15
Термостат твердотельный
16
Термо-шейкер
17
Холодильная камера
18
Центрифуга
19
Шкаф сухожаровый
Использование
Для автоматического дозирования жидкостей
Для проведения полимеразной цепной реакции
(ПЦР)
Для взвешивания образцов и химических
реактивов
Для перемешивания содержимого пробирок
Для определения нуклеотидной
последовательности участков ДНК
Для электрофоретического разделения
наработанных продуктов ПЦР
Для перемешивания компонентов раствора
Для длительного хранения образцов и
химических реактивов (от -20 до -80 °С)
Рабочее место со стерильными условиями
Для стерилизации рабочего помещения
Для измерения рН-среды растворов
Для получения электрофореграмм гелей
Для получения ультрачистой деионизованной
воды
Для качественных и количественных
измерений в растворах
Для инкубации содержимого пробирок при
постоянной необходимой температуре
Для перемешивания и инкубации содержимого
пробирок при заданной температуре
Для хранения образцов и химических
реактивов (от 2 до 8 °С)
Для разделения компонентов смесей на
фракции по массе
Для стерилизации стеклянной посуды
21
Приложение 2
Список химических реактивов и пластиковой посуды на различных
этапах работ для видовой идентификации фитопатогенов сеянцев лесных
питомников с помощью молекулярно-генетических методов анализа
№
Этапы работ
п/п
1
Выделение нуклеиновых
кислот
2
Полимеразная цепная
реакция
3
Электрофоретическое
разделение продуктов
амплификации
4
Выделение и очистка
продуктов амплификации
из геля
5
Секвенирующая
полимеразная цепная
реакция
Наименование
Наконечники для автодозаторов
Пробирки типа эппендорф объемом 2 мл и 1,5 мл
Трис(гидроксиметил)аминометан, С4Н11NO3
Бромидцетилтриметиламмония(CTAB), С14Н29N(СН3)3Br
ЭДТА, С10Н14N2Na2O8·2H2O
Хлористый натрий, NaCl
Меркаптоэтанол-2 (β) (Тиоэтиленгликоль)
Этанол, C2H5OH
Хлороформ, CHCl3
Пропанол-2, С3Н7ОН
Изобутилкарбинол (изоамиловый спирт),
(CH3)2CHCH2CH2OH
Наконечники для автодозаторов
Пробирки типа эппендорф объемом на 0,2 мл
Taq полимераза + буфер + Mg2+
Дезокситрифосфаты
Праймеры
Наконечники для автодозаторов
Уксусная кислота (ледяная), СН3СООН
Агароза[C12H14O5(OH)4]n
Трис(гидроксиметил)аминометан, С4Н11NO3
ЭДТА, С10Н14N2Na2O8·2H2O
Краска для нанесения на гель
Бромид этидия, С21Н20N3Br
Маркер длин фрагментов
Наконечники для автодозаторов
Пробирки типа эппендорф объемом 1,5 мл
Набор для выделения ДНК из агарозного геля
Этанол, C2H5OH
Наконечники для автодозаторов
Пробирки типа эппендорф объемом на 0,2 мл
BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kit
Праймеры
6
7
Очистка продуктов
секвенирующей
полимеразной цепной
реакции
Определение нуклеотидной
последовательности
Наконечники для автодозаторов
Пробирки
BigDye® XTerminatorPurificationKit
310 GeneticAnalyzerCapillary,
POP денатурирующая разделительная матрица
Буфер для генетического анализатора 310 с ЭДТА (10X)
22
Владимир Алексеевич Сиволапов
Никита Александрович Карпеченко
Владислав Николаевич Вепринцев
Ирина Юрьевна Карпеченко
Алексей Иванович Сиволапов
БИОТЕХНОЛОГИЯ
Ранняя диагностика заболеваний сеянцев лесных питомников
с помощью методов молекулярно-генетического анализа
Методические указания к практическим занятиям
для студентов по направлению подготовки магистров
250700 – Ландшафтная архитектура
23
Редактор Е.А. Богданова
Подписано в печать 24.12.2014. Формат 60×90 /16. Объем 1,44 п. л.
Усл. печ. л. 1,44. Уч.-изд. л. 1,47. Тираж 45 экз. Заказ
ФГБОУ ВПО «Воронежская государственная лесотехническая академия»
РИО ФГБОУ ВПО «ВГЛТА». 394087, Воронеж, ул. Тимирязева, 8
Отпечатано в УОП ФГБОУ ВПО «ВГЛТА»
394087, г. Воронеж, ул. Докучаева, 10
6-00
24
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
591 Кб
Теги
1168
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа