close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Биотехнология в лесном хозяйстве 2017 (учебное пособие)

код для вставкиСкачать
0
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЛЕСОТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Г.Ф. МОРОЗОВА»
И.Ю. Исаков А.И. Сиволапов М. Ю. Нечаева
БИОТЕХНОЛОГИЯ В ЛЕСНОМ ХОЗЯЙСТВЕ
Учебное пособие
Воронеж 2017
1
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЛЕСОТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Г.Ф. МОРОЗОВА»
И.Ю. Исаков А.И. Сиволапов М. Ю. Нечаева
БИОТЕХНОЛОГИЯ В ЛЕСНОМ ХОЗЯЙСТВЕ
Учебное пособие
Воронеж 2017
2
УДК 630* 165.62+630*161.6+635.8
И85
Печатается по решению учебно-методического совета
ФГБОУ ВО «ВГЛТУ» (протокол № 6 от 3 июня 2016 г.)
Рецензенты: кафедра биологии и защиты растений
ФГБОУ ВО Воронежский ГАУ;
заведующий кафедрой генетики, цитологии и
биоинженерии ФГБОУ ВО «ВГУ»
д-р биол. наук, проф. В.Н. Попов
Ответственный редактор канд. с.-х. наук, доц. И.Ю. Исаков
Исаков, И. Ю.
И85 Биотехнология в лесном хозяйстве [Текст] : учебное пособие / И. Ю. Исаков,
А. И. Сиволапов, М. Ю. Нечаева ; М-во образования и науки РФ, ФГБОУ ВО «ВГЛТУ». –
Воронеж, 2017. – 208 с.
ISBN 978-5-7994-0767-4 (в обл.)
В учебном пособии изложены основные положения клеточной и тканевой биотехнологии древесных
растений. Представлены основные положения «Комплексной программы развития биотехнологии в Российской
Федерации на период до 2020 года», касающиеся развития лесной биотехнологии. Показаны возможности
использования биотехнологических приемов в практике лесохозяйственного производства, в частности, в лесной
селекции, а также их место в массовом получении ценных генотипов деревьев. Освещается новая интенсивно
развивающаяся отрасль биотехнологии – культивироваиие съедобных грибов, которая предлагает получение
ценного сырья на основе утилизации отходов сельскохозяйственной, лесной, бумажной и перерабатывающей
промышленности.
Учебное пособие предназначено для студентов по направлению подготовки 35.03.01 – Лесное дело, может
быть использовано при обучении слушателей по соответствующим программам дополнительного
профессионального образования.
УДК 630* 165.62+630*161.6+635.8
Учебное издание
Игорь Юрьевич Исаков
Алексей Иванович Сиволапов
Марина Юрьевна Нечаева
БИОТЕХНОЛОГИЯ В ЛЕСНОМ ХОЗЯЙСТВЕ
Учебное пособие
Редактор А.С. Люлина
Подписано в печать 23.12.2016. Формат 60 × 90 /16.
Усл. печ. л. 13,0. Уч.-изд. л. 12,73. Тираж 120 экз. Заказ
ФГБОУ ВО «Воронежский государственный лесотехнический университет имени Г.Ф. Морозова»
РИО ФГБОУ ВО «ВГЛТУ». 394087, г. Воронеж, ул. Тимирязева, 8
Отпечатано в УОП ФГБОУ ВО «ВГЛТУ»
394087, г. Воронеж, ул. Докучаева, 10
ISBN 978-5-7994-0767-4
© Исаков И. Ю., Сиволапов А. И.,
Нечаева М. Ю., 2017
© ФГБОУ ВО «Воронежский государственный
лесотехнический университет
имени Г.Ф. Морозова», 2017
3
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………...…6
Глава 1. КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ.......…14
1.1. Значение метода культуры изолированных клеток, тканей и органов
растений; перспективы его использования в селекции………………..............…14
1.2. Основные этапы развития метода культуры изолированных тканей и
органов…………………………………………………………………….................17
1.3. Оборудование и организация работы в лаборатории по культивированию
изолированных клеток, тканей и органов ............ ………………………………...21
1.4. Питательные среды для культивирования изолированных тканей
растений.........................................................................................................................23
1.5. Техника введения в культуру растительных тканей и условия их
культивирования...................................................... ………………………………...27
1.6. Регуляторы роста растений, их роль в процессе культивирования
растительных тканей.................................................………………………….……29
1.7. Типы культур клеток и тканей ……………………….......................................34
1.7.1. Культура каллусных тканей..............................................................................35
1.7.1.1. Индуцированный морфогенез в культуре каллусных тканей и факторы
его определяющие……………………………………………..................................43
1.7.2. Культура клеточных суспензий и ее использование для получения веществ
вторичного метаболизма.............................................................................................50
1.7.3. Культура одиночных клеток.............................………………………….......56
1.7.4. Гормононезависимые и опухолевые растительные ткани…….……….......58
Глава 2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ
В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ………………………………………………..........…60
2.1. Направления и методы селекции древесных растений………………….....…61
2.2. Размножение отобранных хозяйственно-ценных форм древесных
растений........................................................................................................................62
2.3. Адаптация и доращивание микрорастений в теплице.......................................65
2.4. Клональное микроразмножение растений................................................…......73
2.4.1. Этапы и методы клонального микроразмножения.………………......…….75
2.4.2. Техника культивирования растительной ткани на разных этапах
клонального микроразмножения……………………………......….........………...82
4
2.4.3. Факторы, влияющие на процесс клонального
микроразмножения....….......................................................................................…...85
2.4.4. Оздоровление посадочного материала...……..………………………….......90
2.4.5. Практическое использование метода клонального
микроразмножения растений..………..............................................………………..92
2.5. Биотехнологические приемы, используемые в селекции как
вспомогательные методы….....................................................................................…94
2.5.1. Получение гаплоидов in vitro ......................... ……….………………………94
2.5.2. Преодоление прогамной несовместимости. ………………….…………….99
2.5.3. Преодоление постгамной несовместимости..................................................100
2.5.4. Размножение отдаленных гибридов……………………………………......100
2.5.5. Сохранение генетических ресурсов с использованием методов
клеточной инженерии............................................…………………....................…101
2.6. Самостоятельные технологии получения новых форм и сортов растений...111
2.6.1. Сомаклональная изменчивость растений в культуре in vitro и ее
использование……………………………………………………...........….....…...111
2.6.2. Получение генетически измененных форм растений с помощью
мутагенеза in vitro .................................................................………………….…....115
2.6.3. Клеточная селекция растений, получение растений, устойчивых к
стрессовым факторам………………………….......................................................116
2.6.4. Соматическая гибридизация методом слияния изолированных
хлоропластов……………………………………………………………................124
2.6.5. Генетическая инженерия растений ...........................…………………….....131
2.6.5.1. Основные методы генетической инженерии растений…………….........132
2.6.5.2. Природные векторные системы на основе Ti и Ri плазмид…………...138
2.6.5.3. Трансформация растительных клеток …………………………….……142
2.6.5.4. Улучшение растений с помощью генной инженерии…………….……146
Глава 3. ГРИБОВОДСТВО КАК ОТРАСЛЬ БИОТЕХНОЛОГИИ…………......150
3.1. Культивирование съедобных грибов: возможности и
перспективы…………………………………………………………….............…150
3.1.1. Общая характеристика грибов, их место в системе органического
мира……………………………………………………………………..............….150
3.1.2. Пищевая ценность грибов ..........................................………………..….......152
3.1.3. История, современнее состояние и перспективы развития грибоводства.154
5
3.1.4. Разведение грибов в искусственных условиях ........………………….........156
3.2. Промышленное выращивание грибов-лигнотрофов………………….......…161
3.2.1. Культивирование вешенки (Pleurotus spp.) ..............………………….........161
3.2.2. Культивирование шиитаке (Lentinus edodes)…………………………........168
3.3. Выращивание почвенных сапротрофов.......................………………….........172
3.3.1. Культивирование шампиньона (Agaricus spp.)……………………….....…172
3.3.2. Культивирование кольцевика (Stropharia rugoso-annulata)……………..…178
3.4. Выращивание грибов-микоризообразователей ..........………………….........180
3.4.1. Разведение трюфелей (Tuber).....................................………………….........180
3.4.2. Попытки разведения белого гриба (Boletus edulis)……………………..…182
3.5. Выращивание некоторых видов экзотических грибов…………………...…183
3.5.1. Разведение сморчков ...................................................………………….........183
3.5.2. Культивирование фламмулины бархатистоножковой..……………..…….184
3.5.3. Культивирование опенка летнего ..............................………………….........186
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙСПИСОК ..................................………………….........188
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ…..……191
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
ИЛЛЮСТРАТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ…………………………………….……206
6
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы в лесном хозяйстве мира все более широкое применение
находят методы и приемы биотехнологии – сравнительно новой, интенсивно
развивающейся науки, связанной с целями и задачами лесной генетики,
селекции и с экологическими проблемами отрасли.
В связи с длительным периодом смены поколений у древесных растений
большинство классических генетических подходов в экспериментах с ними
ограничено или невозможно. Использование методов биотехнологии позволяет
сократить продолжительность селекционного процесса с участием древесных
пород и ускорить воспроизводство лесных ресурсов.
В лесах сконцентрировано около 50 % мирового наземного запаса
органического углерода, а лесная биомасса составляет около 80 % наземной
биомассы. В лесах ежегодно заготавливают 3,3 млрд кубометров древесины,
включая 1,8 млрд кубометров древесного топлива и древесного угля. Активное
использование мировых лесных ресурсов наряду с недостаточными объемами и
эффективностью лесовосстановительных работ проявляется в том, что площади
лесов ежегодно по разным оценкам сокращаются на 7-9 млн га.
Биотехнологии в мировом лесном секторе используются в практике
защиты лесов, создания новых форм древесных растений с заданными
признаками, производстве посадочного материала, оценке качества семенного
материала, мониторинге фитосанитарного состояния питомников и лесных
насаждений, а также в глубокой переработке древесины, утилизации отходов,
домостроении.
В практике защиты лесов и создания лесонасаждений в развитых странах
применяются различные группы биотехнологий:
 создание и производство биологических средств защиты леса от
вредителей и патогенов;
 клональное микроразмножение растений (включая соматический
эмбриогенез) для быстрого размножения селекционных достижений и
производства высококачественного посадочного материала;
 методы генетической трансформации для создания новых форм
древесных растений с заданными признаками (в коммерческом
применении этих технологий лидируют США и Китай);
7
 методы молекулярного маркирования для повышения эффективности
селекционной работы, генетической паспортизации и сертификации
семян и растений, оценки фитосанитарного состояния посадочного
материала, питомников и лесов в целом, оценки законности
происхождения древесины;
 сохранение лесных генетических ресурсов путем создания криобанков и
банков депонирования растительного материала in vitro.
В России в силу общего отставания от мирового уровня инновационных
технологий эти биотехнологические методы находятся на стадии научных
разработок и первых прецедентов внедрения в практику.
Они применяются, например, при проведении селекционной работы,
обновлении данных по лесосеменному районированию. Методом клонального
микроразмножения производится посадочный материал некоторых особо
ценных форм древесных растений, например, карельской березы, триплоидных
форм осины. Созданы генетически-модифицированные формы древесных
растений с новыми признаками для плантационного лесовыращивания,
например, с полной устойчивостью к гербицидам.
В отечественном секторе наукоемких технологий по переработке лесных
ресурсов (древесины в первую очередь) ситуация схожая. Так, целлюлознобумажная промышленность мира в 2010 году произвела около 400 млн т бумаги
и картона, в то время как Россия, имея самые большие запасы древесины,
занимая 8 место в мире по объемам целлюлозы и 14 место по объемам
выработки бумаги и картона, произвела всего 7,57 млн т. Целлюлознобумажная промышленность России в настоящее время принимает участие в
развитии производства инновационных биопродуктов на основе комплексной
глубокой переработки всей биомассы древесины, называемой биорефайнингом.
Древесные и технологические отходы, включая щепу и кору, щелока,
шламы, осадки, скоп и другое используются, в основном, в качестве
биотоплива для получения пара и электроэнергии. Эксперименты по
производству биоэтанола и биодизеля из отходов целлюлозно-бумажного
производства, а также работы по созданию и выведению на рынок новых
биопродуктов находятся в зачаточном состоянии. Лидерами в разработке и
использовании новых биотехнологий являются Финляндия, Швеция и США.
По мнению ведущих мировых компаний, уже во втором десятилетии
8
нынешнего века возможна замена до 30 % традиционной продукции
целлюлозно-бумажной промышленности на инновационную.
Будут внедрены технологии производства жидких и твердых биотоплив,
сырья для фармпромышленности, угольных волокон и углепластиков из
осажденного лигнина, композитных материалов, полимеров.
Учитывая низкий уровень инновационной активности в России и
недостаточность имеющегося научного задела, приоритетом является
генерация знаний и стимулирование инновационной деятельности по
внедрению в практику уже созданных технологий в сфере защиты леса и
создания лесных плантаций, а также модернизация действующих предприятий
по производству биопродукции, с использованием уже освоенных в мире
биотехнологий.
Для устранения такого положения 12 апреля 2012 года Правительством
Российской Федерации была принята «Комплексная программа развития
биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года».
Реализация Программы в части приоритетного направления "Лесная
биотехнология" приведет к созданию в стране современной системы
управления лесонасаждениями с привлечением методов ДНК маркирования,
созданию новых биотехнологических форм деревьев с заданными признаками,
развитию плантационного лесовыращивания, созданию условий для
малоотходной переработки древесины, утилизации отходов лесопиления, а
также к созданию спроса на современные экологически безопасные средства
защиты леса.
1. Применение биотехнологий для управления лесонасаждениями
Одним из приоритетных направлений развития лесных биотехнологий
является молекулярное (ДНК) маркирование, направленное на решение
следующих задач лесного хозяйства и промышленности:
- совершенствование принципов и подходов лесосеменного районирования;
- генетическая паспортизация и сертификация семян;
- мониторинг фитосанитарного состояния питомников и лесонасаждений;
- контроль законности происхождения древесины.
Таким образом, комплекс мероприятий направлен на разработку и
ускорение распространения передовых технологий, а также широкое
9
применение биотехнологий в целях повышения эффективности управления
лесонасаждениями.
2. Применение биотехнологий для сохранения и воспроизводства лесных
генетических ресурсов
Современные методы лесной биотехнологии позволят эффективно
проводить мониторинг состояния ресурсов, сохранять и воспроизводить лесные
генетические ресурсы. К таким биотехнологиям относятся следующие:
- создание банков in vitro редких и исчезающих видов лесных растений;
- клональное микроразмножение редких и исчезающих видов лесных
древесных и травянистых растений для создания резерватов;
- мониторинг состояния лесных генетических ресурсов с применением методов
анализа ДНК;
- оценка генетического разнообразия лесных насаждений с использованием
методов анализа ДНК.
3. Создание биотехнологических форм деревьев с заданными признаками
Экономическая эффективность лесонасаждений (лесных плантаций в
частности) в первую очередь зависит от продуктивности и устойчивости к
биотическим и абиотическим факторам среды используемых лесных пород. В
свою очередь эти характеристики зависят от генетической ценности и качества
посадочного материала. Необходимо развивать биотехнологии, направленные
на создание новых форм лесных пород с заданными признаками. К таким
биотехнологиям относятся следующие:
- селекция основных лесообразующих пород на основе ДНК маркирования для
выведения новых гибридных и сортовых форм;
- создание биотехнологических форм деревьев с заданными признаками,
например, с пониженным содержанием лигнинов, устойчивостью к
гербицидам;
- клональное микроразмножение генетически ценных форм деревьев с целью
быстрого выведения на рынок новейших селекционных достижений и
повышения качества посадочного материала.
Биотехнологические формы деревьев являются сырьевой базой
современной лесоперерабатывающей промышленности. Значительная часть
расходов в процессе переработки древесины приходится на отделение
древесной целлюлозы от лигнина, который представляет собой вещество,
10
связывающее волокна древесины. При этом используются едкие щелочные
растворы, высокие температуры и давление. Использование древесины,
содержащей меньше лигнина и больше целлюлозы, существенно повышает
конкурентоспособность лесоперерабатывающей промышленности.
Быстрорастущие деревья являются также одним из эффективных
способов борьбы с изменением климата в качестве поглотителей углекислого
газа. Другим направлением использования быстрорастущего леса является его
использование в качестве сырья для биотоплива.
4. Биологические средства защиты леса
Применение средств химии губительно сказывается на биоразнообразии
лесных сообществ, а отсутствие работ по созданию и производству новых
биологических средств защиты (включая микробиологические и энтомофаги)
не позволяет сдерживать распространение в лесах новых опасных вредителей и
фитопатогенов фитофагов, что негативно влияет на пожарную безопасность в
лесах и приводит к значительным социально-экономическим ущербам от
пожаров. Комплекс мероприятий направлен на изыскание биотехнологических
средств защиты, перспективных для использования в защите леса и разработку
на их основе технологий получения и применения экологически безопасных
средств защиты леса от вредных организмов. Реализация указанного комплекса
мероприятий позволит восполнить отсутствие биологических средств для
защиты леса в стране и будет содействовать созданию в России их
малотоннажных производств.
Увеличение числа биологических средств для защиты леса и расширение
сферы их применения позволит снизить как социально-экономические потери
от вспышек массового размножения вредных организмов, так и пестицидную
нагрузку на леса, содействуя сохранению биологического разнообразия.
В процессе ознакомления с программой рекомендуется обратить
внимание на целевые показатели программы, создание базы для повышенного
потенциала генетических ресурсов древесных растений.
В результате реализации «Комплексной программы …» в России будет
создана современная база промышленного производства, характеризующаяся
повышенным ресурсным потенциалом лесов и существенно сниженным
уровнем безвозвратных отходов лесного производства.
Для внедрения в производство биологических технологий необходима
11
соответствующая подготовка научных и производственных кадров. В
современных условиях специалисты лесного хозяйства должны обладать
комплексом теоретических знаний и практических навыков в области биологии
клеток и тканей, культивируемых in vitro, разбираться в особенностях
биотехнологических приемов и уметь их использовать в лесохозяйственной
практике.
Биотехнология представляет собой междисциплинарную область знания, использующую достижения микробиологии, биохимии, молекулярной биологии,
химии, биофизики, вирусологии, иммунологии, генетики, инженерных наук,
электроники.
Термин “биотехнология” состоит из трех греческих слов: bios – жизнь;
techne – искусство, мастерство; logos – слово, учение; что означает
использование живых организмов и биологических процессов в производстве.
Биотехнологический
процесс
включает
следующие
компоненты:
биологический агент, субстрат, целевой продукт, аппаратуру и совокупность
управляющих ими методов. Первыми биотехнологическими производствами
были хлебопечение, квашение, виноделие, сыроварение.
В традиционном, классическом понимании биотехнологию, определяют как
науку о методах и технологиях производства, транспортировки, хранения и
переработки сельскохозяйственной и другой продукции с использованием
растений, животных и микроорганизмов в естественных и искусственных
условиях.
На современном этапе развития биологической науки новейшая
биотехнология (технология живых систем) определяется как:
1. Дисциплина, изучающая возможности использования живых
организмов, их систем или продуктов их жизнедеятельности для решения
технологических задач, а также возможности создания живых организмов
с необходимыми свойствами методом генной инженерии;
2. Производственное использование биологических структур для
получения пищевых и промышленных продуктов и для осуществления
целевых превращений.
Биологические структуры в данном случае - это микроорганизмы,
растительные и животные клетки, клеточные компоненты: мембраны
12
клеток, рибосомы, митохондрии, хлоропласты, а также биологические
макромолекулы (ДНК, РНК, белки - чаще всего ферменты).
Биотехнология лесная - раздел биотехнологии, занимающийся
сохранением и ускоренным воспроизводством лесных биоресурсов.
Как наука биотехнология оформилась в середине 40-х годов прошлого
века. Теоретическими предпосылками еѐ возникновения и развития явились
открытие химической структуры и пространственной ориентации двойной
спирали молекулы ДНК и получение рекомбинантной (гибридной) молекулы
ДНК (рекДНК), в которой были соединены фрагменты ДНК нескольких
организмов (фага, бактерии, вируса).
Основной
составляющей
современной
биотехнологии
является
биоинженерия, которая включает два направления: клеточную и генетическую
инженерию, их методы и приемы и в настоящее время получили широкое
развитие и стали приоритетным звеном высоких технологий современного
производства.
Объектами исследований клеточной инженерий являются клетки, ткани и
органы растений, культивируемые in vitro. Основателями клеточной инженерии
были П.Ф.Уайт (США) и Р. Готре (Франция). В нашей стране работы в этом
направлении впервые были организованы в Институте физиологии растений
им. К.А. Тимирязева (г. Москва) под руководством А.А. Курсанова,
Р.Г. Бутенко. Объектами исследований были гравянистые растения.
Использование методов клеточной инженерии в экспериментах с древесными
растениями проводились в научно-исследовательских учреждениях Москвы,
Санкт-Петербурга, Уфы, Красноярска, Архангельска, Воронежа, Орла,
Мичуринска.
Объектом исследований генетической инженерии являются хромосомы и
гены растений; в основе методов этой науки лежат манипуляции, направленные
на создание искусственных генетических программ.
В лесной селекции работы по генетической инженерии были начаты в
1984 году – в США впервые была осуществлена трансформация сосны ладанной.
Работы в этом направлении были продолжены в лабораториях по лесной
генетике и селекции Канады, Великобритании, Франции, Швеции, Германии.
Методы биоинженерии растений позволяют создавать новые формы и
сорта с наследственно закрепленными хозяйственно-ценными признаками, в
13
частности с повышенной к биотическим и абиотическим факторам,
повышенной продуктивностью; создавать принципиально новые формы
растений не встречающиеся в природе и обладающие уникальными свойствами;
сокращать время сортовыведения.
В последние годы интенсивно развивается грибоводство – отрасль
биотехнологии, занимающаяся выращиванием съедобных грибов. Она
предлагает новые способы утилизации отходов сельского хозяйства, лесной,
бумажной, перерабатывающей промышленности и позволяет получать ценное
сырье: плодовые тела (пищевой продукт), мицелий для производства
биологически активных добавок (компонент кормовых смесей), отработанный
субстрат (составная часть удобрений).
Авторы выражают благодарность ведущему научному сотруднику
ФГБУ «ВНИИЛГИСбиотех» доктору биологических наук Ю.Н. Исакову
за ценные советы при написании учебного пособия и аспирантке кафедры
лесных культур, селекции и лесомелиорации ВГЛТУ М.А. Мацневой
за компьютерную помощь при подготовке данного издания.
14
ГЛАВА 1. КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
1.1 ЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК,
ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ; ПЕРСПЕКТИВЫ ЕГО
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИИ
Одним из основных методов клеточной инженерии является метод
культуры изолированных органов, тканей и клеток * (сокращенно – культура
тканей или культура in vitro), это выращивание изолированных органов, тканей
и клеток на искусственных питательных средах в стерильных (асептических) и
контролируемых условиях с использованием стеклянных или пластиковых
сосудов или биореакторов.
Клеточная инженерия (или клеточная биотехнология) – одно из наиболее
важных направлений в биотехнологии. Объектом ее исследований являются
изолированные клетки, ткани или отдельные органы растений, которые
культивируются in vitro. В основе методов клеточной биотехнологии лежат
особенности, присущие растительным клеткам – их тотипотентность и
способность к регенерации. Метод клеточной инженерии возник в XIX веке, а в
70-е годы XX века стал самостоятельной прикладной наукой, которая нашла
применение во многих отраслях производства, в том числе и лесном хозяйстве.
Рис. 1. Расположение меристематических тканей в растении
*Полный список терминов и определений, согласно «Комплексной программе…»
приводится в прил. 1.
15
Индукторами морфогенеза являются фитогормоны. Однако реализация
тотипотентности возможна не всегда, потому что разные клетки по-разному
проявляют свои возможности. Иногда гены в них настолько подавлены
(заблокированы) контролем со стороны целостного организма, что проявление
тотипотентности невозможно даже при наличии индуцирующего фактора.
Изоляция клеток от растения и помещение их в культуру in vitro нарушает связи
регулирующей системы и способствует проявлению потенций (возможностей)
клетки. Тотипотентность – характерная особенность растений, соматические
клетки животных такой способностью не обладают, за исключением лишь
некоторых клеток кишечнополостных.
Основные направления применения культивируемых изолированных
клеток, тканей и органов растений показаны на рис. 2.
Рис. 2. Основные направления использования культур in vitro
Первое направление – ускоренное размножение и оздоровление денного
селекционного материала. Основным методом в этом случае является
клональное
микроразмножение
растений,
обеспечивающий
высокий
5
коэффициент размножения растений: для травянистых 10 - 106; для
кустарниковых и древесных 104 – 105, для хвойных 104. Используя культуру
меристем, одновременно с размножением можно оздоравливать посадочный
материал от вирусных и других инфекций.
16
Второе направление – использование изолированных клеток и тканей в
селекции растений. Здесь биотехнологические приемы применяются как
вспомогательные и как самостоятельные методы. Первые, не подменяя
традиционного селекционного процесса, оптимизируют и ускоряют его. Это
технологии in vitro, используемые для устранения последствий отдаленной
гибридизации и размножения отдаленных гибридов, для сохранения ценного
генофонда, получения гаплоидных растений. Вторые предлагают способы
создания принципиально новых генотипов, не встречающихся в природе –
клеточная селекция на основе соматической гибридизации, культуры
изолированных протопластов, мутагенеза in vitro и генетическая инженерия.
В основе третьего направления лежит способность изолированных
растительных клеток продуцировать вещества вторичного синтеза (алкалоиды,
гликозиды, гормоны, эфирные масла, стероиды и др.), которые применяются в
медицине, косметологии, парфюмерии, кормовой отрасли. Для получения этих
веществ используют чаще всего каллусную ткань, выращиваемую в жидкой
среде (суспензионная культура), при этом можно отбирать клеточные линии,
которые продуцируют вторичных веществ гораздо больше, чем исходные
растения. Применение клеточных технологий дает возможность круглогодично
получать вторичные метаболиты, используя при этом растения из любой
климатической зоны.
Основой успешного применения биологических технологий является
возможность создания in vitro оптимальных условий для течения
физиологических процессов, в результате чего обеспечивается нормальное
деление и дифференциация клеток эксплантов, регенерация растений, синтез
метаболитов.
Культура изолированных органов и тканей имеет большое значение как
для теории, так и для практики биологической науки. Теоретические аспекты
этого метода состоят в том, что культура тканей представляет собой популяцию
соматических клеток, созданную в условиях эксперимента. В этом случае
каждая клетка в культуре рассматривается как самостоятельная единица, для
выделения определенных групп таких клеток употребляют термин “популяция”
(на клеточном уровне). Контролируемые условия выращивания позволяют
использовать популяции клеток в качестве модельной системы для
исследований по физиологии и биохимии клеток и тканей, изучению их
17
метаболизма, процесса дифференцировки и морфогенеза, реализации
тотипотентности, механизма возникновения раковых клеток.
Преимущества метода культуры изолированных клеток, органов и тканей
растений заключаются в том, что он позволяет:
– проводить работы круглогодично, вне зависимости от сезона или
климата, используя при этом малые производственные площади;
– размножать с высоким коэффициентом мультипликации ценные
селекционные формы, даже если они представлены минимальным количеством
исходного материала;
– ускорять и оптимизировать селекционный процесс, что особенно важно
для древесных пород, имеющих длительный период развития;
– повышать генетическое разнообразие исходных форм и отбирать среди
них хозяйственно ценные;
– получать растения с новыми наследственными свойствами на основе
переноса генов;
– сохранять ценный генофонд.
Применение биологических технологий изменяет соотношения в системе
человек – производство – природа; способствует индустриализации
сельскохозяйственного и лесного производства; позволяет решить важные
задачи селекции на устойчивость, высокую продуктивность и качество,
способствует значительному улучшению экологической обстановки на всех
видах производств и повышению их эффективности.
1.2 ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ
ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ
Первые попытки культивировать изолированные от растений ткани были
сделаны в конце XIX – начале XX века, интенсивное развитие клеточной
инженерии началось только в середине XX века. В истории развития этого
метода можно выделить следующие этапы.
1 этап (1892-1902 годы) – предыстория. Этот период связан с именами
немецких исследователей Г. Хаберландта (Gottlieb Johann Friedrich Haberlandt,
1854 - 1945), Г. Фехтинга (Hermann Vöchting, 1847 - 1917), К. Рехингера (Karl
Rechinger, 1867 - 1952). Они пытались стимулировать рост растительных тканей
и органов, помещенных на фильтровальную бумагу, пропитанную сахарозой,
18
однако успехов не достигли. Тем не менее, их работы представляют большой
научный интерес, поскольку в них были высказаны идеи и гипотезы, которые
нашли свое подтверждение годы спустя в экспериментах других ученых,
работавших в этом направлении. Так, Хаберландт выдвинул идею о
тотипотентности любой растительной клетки и о возможности их
культивирования in vitro; Фехтинг предположил, что явление полярности
свойственно не только растениям или их органам, но и клеткам; Рихенгер
установил минимальный размер сегмента растительной ткани, способного
образовывать каллус (не менее 1,5 мм).
Главным достижением 2 этапа (1902-1922 годы) явилось создание первых
питательных сред для культивирования тканей животных, основными
компонентом которых были плазма крови и зародышевая жидкость. По
аналогии с этими исследованиями изолированные растительные ткани
выращивали на питательных средах, содержащих их экстракты, однако эти
эксперименты не увенчались успехом – экспланты не проявили достаточной
ростовой активности, поскольку используемые ткани и клетки, как показали
более поздние исследования, не могли ее обеспечить.
На 3 этапе (1922-1932 годы) бельгийский ученый В. Робинс (Frans Hubert
Edouard Arthur Walter Robyns, 1901 - 1986) и немецкий ученый Котте
независимо друг от друга показали возможность культивирования на
синтетической питательной среде меристемы кончиков корней томатов и
кукурузы, но эти культуры обладали низкой жизнеспособностью и через
некоторое время погибали.
4 этап (1932-1940 годы) характеризуется бурным развитием метода
культуры клеток и тканей высших растений, он связан с именами
основоположника этого метода – французского ученого Роже Готре и
американского исследователя Уайта, которые успешно культивировали
изолированные корни (повторяя опыты своих предшественников), и установили,
что при периодической пересадке на свежую питательную среду они могут
расти в культуре практически неограниченное время. Это открытие дало новый
толчок в работе с культурой тканей. Готре успешно индуцировал образование
каллуса из камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны, а Уайт ввел в
культуру ткани растительных опухолей. В этот период начинаются активные
19
исследования по разработке составов питательных сред, по введению в культуру
новых объектов.
Главным событием 5 этапа (1940-1960 годы) было открытие в 1955 году
американскими исследователями Ф. Скугом и С. Миллером нового класса
фитогормонов – цитокининов, в частности кинетина, что дало новый толчок
для экспериментальных работ по культуре ткани. Оказалось, что при
совместном действии цитокининов с ауксинами, можно стимулировать деление
клеток (эксперименты с сердцевинной паренхимой табака), поддерживать рост
каллусной ткани, индуцировать морфогенез в контролируемых условиях. Этот
факт стал основополагающим для большинства методик по культуре клеток и
тканей.
В результате экспериментов было установлено, что использование
натуральных экстрактов (эндосперма кокоса, каштана, кукурузы и некоторых
других растений) в качестве добавок к питательной среде способствует как
поддержанию неорганизованного клеточного роста, так и стимуляции процессов
органогенеза и соматического эмбриогенеза в культуре каллусных тканей и
клеточных суспензий.
В 1949 году Лимассе и Корнюэ обнаружили, что в меристематической
ткани растений не содержится вирусов. На основе этого факта Морель и Мартин
в 1952 году предложили метод культивирования меристем орхидей с целью
получения здорового, безвирусного материала. В дальнейшем культивирование
меристем с большим успехом стало применяться для размножения ценных,
редких и трудно размножаемых традиционными методами форм растений. На
основе этого метода в Институте физиологии растений им. Тимирязева
(г. Москва) Р.Г. Бутенко с сотрудниками были разработаны технологии
клонального
микроразмножения
различных
травянистых
растений,
позволивших впоследствии быстро и с высоким коэффициентом размножать
селекционно-ценный материал. В настоящее время это направление тканевой
технологии наиболее востребовано в практике.
В 1957 году Р.Г. Бутенко с сотрудниками впервые индуцировала
морфогенез в культуре каллусной ткани моркови и получила растения –
регенеранты.
В 1959 году Никел и Тулик разработали метод получения и выращивания
больших масс клеточных суспензий, что в дальнейшем стало основой для
20
создания промышленных технологий получения веществ вторичного синтеза in
vitro. Позже в 1969 году российскими учеными под руководством Р.Г. Бутенко
был разработан метод культивироваиия одиночных клеток, выделенных из
суспензии, деление которых индуцируется с помощью ткани – "няньки".
Определяющей разработкой 6 этапа (1960-1975 годы) было получение
профессором Ноттингемского университета Э.К. Коккингом изолированных
протопластов и определение условий для их культивирования. Несколько
позже было осуществлено их искусственное слияние, что явилось толчком для
разработки методик получения соматических гибридов.
Большое фундаментальное и прикладное значение имела разработка
индийскими учеными Гуха и Махешвари индукции андрогенеза в культуре
пыльников, что представляет особый интерес для селекции в связи с
возможностью получения гаплоидных растений.
7 этап (1975 год – по настоящее время). Развивается техника работ in vitro,
продолжается изучение биологии культивируемых растительных объектов и
создание на их основе биологических технологий, что обеспечивается
разработкой и развитием новых перспективных методов: электрослияния
изолированных протопластов; мутагенеза и клеточной селекции; получения
гаплоидных растений; оптимизации условий глубинного культивированиея
клеток; получения трансгенных растений с использованием протопластов и
векторов, созданных на основе Ti и Ri плазмид Agrobacterium tumefaciens и
A. rhizogenes; переноса генов для двудольных растений (с помощью методов
генной инженерии).
За последние годы отмечен значительный прогресс в развитии
технических приемов работы с изолированными тканями и клетками растений.
Однако объектом исследований, являются, как правило, травянистые растения,
древесные породы используются редко. Это связано прежде всего с тем, что
введение в культуру ткани древесных растений представляет определенные
сложности. Они характеризуются медленным ростом, трудно укореняются,
содержат в тканях большое количество вторичных соединений (фенолы,
гормоны и др.), которые в изолированных тканях активизируются и ингибируют
деление и рост клеток первичного экспланта, что ведет к гибели или снижению
способности его тканей образовывать адвентивные почки.
Первые работы по культуре тканей древесных растений были
21
осуществлены французским ученым Р. Готре в середине 20-х годов прошлого
столетия. В них сообщается о способности тканей некоторых видов вяза и сосны
образовывать in vitro каллус. Позднее (в 40-е годы) было установлено, что ткани
вяза способны индуцировать адвентивные почки, но получить из них побеги не
удавалось. В 60-е годы Матес регенерировал растения осины, которые были
доведены до почвенной культуры.
Очень трудным объектом культивирования in vitro являются хвойные
породы, поэтому эксперименты с ними немногочисленны, а полученные
результаты представляют большой теоретический и практический интерес.
В основном употребляемые в области культуры тканей термины введены
Коблитцем (Koblitz H.) в 70-е годы прошлого века. Термин «культура
меристемы», очень часто используемый и сильно укоренившийся, также не
всегда точно отражает ботанические особенности используемой ткани. В
большинстве же случаев речь идет о культуре верхушек побегов
(меристема+дифференцированная ткань побега+листовые примордии), в то
время как собственно апмкальная меристема, как правило, составляет только
часть экспланта. Поэтому термин «культура меристемы» обычно заменяют
соответствующим более точным названием, например, таким, как верхушка
побега. Понятие «культура меристемы» обычно используют в связи с
получением безвирусных растений, так как в этой области прикладного
исследования он не только прочно укоренился, но также указывает на
специальные связи.
В настоящее время разработаны методы введения и поддержания в
культуре тканей более 200 видов древесных растений, среди них береза (в т.ч.
карельская береза), тополь, осина, гибриды тополей с осиной, каштан, дуб, клен,
сосна, ель, секвойя, лжетсуга, можжевельник, криптомерия и др.
1.3 ОБОРУДОВАНИЕ И ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ В
ЛАБОРАТОРИИ ПО КУЛЬТИВИРОВАНИЮ ИЗОЛИРОВАННЫХ
КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ
На всех этапах работы с культурой тканей необходимы аккуратность и
техничность – точное соблюдение последовательности определенных
манипуляций. Главным условием успешной работы является строгое
22
выполнение правил асептики. Эти положения лежат в основе организации
лаборатории по культивированию изолированных клеток, органов и тканей.
Работа в лаборатории включает несколько этапов:
– подготовка лабораторной посуды;
– приготовление питательных сред;
– стерилизация посуды, инструментов и питательных сред;
– поверхностная стерилизация растительного материала;
– выращивание изолированных клеток и тканей;
– изучение культивируемого материала.
Каждый этап должен проводиться в отдельном помещении, поэтому
лаборатория по культуре тканей должна иметь не менее 5-6 комнат.
Подготовка лабораторной посуды к работе проводится в моечной комнате.
Она оборудуется мойкой с горячей и холодной водой, дистиллятором,
сушильными шкафами.
В специальной комнате готовятся питательные среды. Здесь должны
находиться весы (технические и аналитические), рН-метр, стеллажи или шкафы
дня хранения посуды и реактивов, лабораторные столы, холодильник, вытяжной
шкаф для работы с вредными для здоровья веществами.
В стерилизационной комнате проводится стерилизация посуды,
инструментов и питательных сред. В ней размещаются сушильные шкафы и
автоклавы. Чисто вымытую и высушенную посуду помещают в биксы или
заворачивают в плотную бумагу и стерилизуют сухим жаром в сушильном
шкафу при t° = 160 °С не менее двух часов.
Питательные среды стерилизуют и автоклаве при давлении 1,2 атм
(121 °С) в течение 20 мин. Если в состав питательной среды входят вещества,
разрушающиеся под действием высоких температур, их растворы пропускают
через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22-0,45 мкм и добавляют в
питательную среду после автоклавировиния, когда она охладится до 40 °С.
В операционной комнате устанавливается ламинар-бокс. Она должна быть
изолирована от сквозняков и других источников заражения воздуха
микроорганизмами или их спорами. Здесь осуществляют поверхностную
стерилизацию и изоляцию растительной ткани, вводят ее в культуру, проводят
пересадку
(субкультивирование).
Комната
оборудуется
лампами
ультрафиолетового (УФ) облучения, перед работой проводится дезинфекция. В
23
самом ламинар-боксе стерильность поддерживается за счет постоянной подачи
воздуха через специальные фильтры и тщательной ультрафиолетовой обработке
перед работой.
Выращивание изолированных культур проводится в культуральной (или
климатической) комнате; она оборудуется стеллажами, на которых размещаются
культуральные сосуды с изолированными культурами, в ней поддерживается
искусственный микроклимат: постоянная температура (25...27 0С), 16-часовой
фотопериод, регулируется освещенность (в пределах 1000…4000 люкс) и
относительная влажность воздуха (70 … 75 %).
Выращивание растений-регенерантов проводят в минитеплице с
регулируемым микроклиматом, оборудованной туманообразующей установкой.
В зависимости от целей и задач проводимых работ в лаборатории могут
быть другие специализированные помещения и соответствующее оборудование.
Например, для биохимического анализа – аппаратура для проведения
электрофореза белков, для цитологических исследований – микроскопы,
бинокуляры и т.д.
1.4
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И РАСТЕНИЙ
В культуре in vitro растительные ткани выращивают на искусственных
питательных средах, которые являются единственным источником питания для
растительной ткани, и поэтому они должны содержать все необходимые для
роста и развития растения вещества.
Успех культивирования изолированных клеток и тканей зависит, прежде
всего, от правильно подобранного состава питательной среды. В настоящее
время имеется большое количество различных прописей питательных сред, но
существуют и базовые, стандартные среды, которые подходят для очень многих
экспериментов. Это среда Мурасиге и Скуга (MS), содержащая
сбалансированный состав питательных веществ и отличающаяся от других сред
соотношением аммонийного и нитратного азота. Прописи некоторых
питательных сред, использующихся для культивирования эксплантов древесных
пород, приведены в табл. 1.
Питательные среды для культивирования тканей растений являются
24
многокомпонентными, они могут значительно различаться по количественному
составу, но обязательно включают все необходимые растениям макроэлементы
(азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера, железо) и микроэлементы (бор,
марганец, цинк, медь, молибден). Питательные среды обязательно включают
этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) или ее натриевую соль,
образующую с солями железа так называемые хелаты, которые повышают
усвояемость железа клетками. Кроме того, в состав питательных сред входят
иитамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Иногда (для
получения каллусной ткани) в состав питательной среды вводят жидкий
эндосперм кокосового ореха или каштана. Поскольку изолированные клетки в
большинстве случаев не способны к автотрофному питанию, обязательным
компонентом питательной среды являются углеводы, в качестве которых
используют, как правило, сахарозу, иногда – глюкозу (в концентрации 2...3 %).
Фитогормоны необходимы для дедифференцировки клеток (ауксины) и
для индукции клеточных делений (цитокинины). Поэтому в зависимости от
целей эксперимента в состав питательных сред вводят сочетания этих веществ в
различных концентрациях. В ряде случаев используют безгормональные среды.
Для отвердения среды используют агар-агар (полисахарид, получаемый из
морских водорослей) в концентрации 0,7...0,8 %. Кроме агара применяют и
другие желеобразующие вещества – герлит, биогели. Значения pH питательных
сред должны находиться в пределах 5,6...5,8. От величины pH зависит структура
и активность биологических макромолекул, что влияет на усвоение клеткой этих
соединений. Поскольку клетки растений функционируют в узких пределах pH,
стабильность этой величины является одним из главных условий
культивирования изолированных клеток, тканей и органов.
Для удобства в работе и рационального использования времени готовят
концентрированные маточные растворы солей макро- и микроэлементов, а
также витаминов, которые хранят в холодильнике и используют по мере
необходимости для приготовления необходимых объемов рабочих сред.
В процессе приготовления маточных растворов концентрацию макросолей
увеличивают в 10 раз, а микросолей в 100 раз, все соли последовательно
растворяют в небольших объемах дистиллированной воды, а затем общий объем
раствора доводят до нужного значения. При этом среди микросолей выделяют
три группы (А, Б, В) и для каждой из них маточный раствор готовят в отдельной
25
посуде. Это связано с тем, что соли кальция (группа Б) в присутствии других
солей могут выпадать в осадок, а для приготовления комплекса железа с ЭДТА
(группа В) растворы нужно нагревать.
При длительном и частом субкультивировании (раз в 1-2 месяца) на
питательных средах, обогащенных фитогормонами, удорожает содержание
коллекции и может привести к изменению еѐ генетической стабильности,
жизнеспособности и потере ценных признаков.
Очень часто в процессе экспериментов среды приходится модифицировать
в зависимости от особенностей культивируемого экспланта и целей
проводимого опыта. Поскольку индивидуальные характеристики сортов, форм и
даже отдельных растений могут значительно различаться, в каждом случае
приходится подбирать не только свой состав среды, но и свои условия
культивирования.
26
Таблица 1
Состав основных питательных сред для культивирования изолированных
растительных тканей
Компоненты
Концентрация, мг/л
питательной среды
Мурасиге и
Гамборга
ВТМ
WPM
Скуга
МИНЕРАЛЬНЫЙ КОМПОНЕНТ
МАКРОСОЛИ
ГРУППА А
-
NH4 NO3)
1650
165
400
(NH4)2NO4
-
134
-
KN03
1900
2500
190
_
KH2PO4
170
-
170
170
K2 S04
-
-
860
990
MgSО4 X 7H20
370
250
370
370
-
ГРУППА Б
СаСl2Х2Н20
400
150
44
Ca(NO3)2X 4Н2О
-
-
640
556
96
ГРУППА В
FeSO4 X 7H20
27,8
27.8
27,8
27,8
Na2ЭДТА
37,3
37,3
37,3
37,3
МИКРОСОЛИ
MnS04 X 4H20
H3BO3
ZnSO4, X 7H2O
KJ
Na2MoO4X 2H2O
22,3
6,2
8,6
0,83
0,25
10,0
3,0
2,0
0,75
0,25
22,3
6,2
8,6
0,15
0,15
22,3
6,2
8,6
-
CuS04 X 5H20
0,025
0,025
0,25
0,25
CoCI2 X 6H20
0,025
0,025
0,025
-
ОРГАНИЧЕСКИЙ КОМПОНЕНТ
ВИТАМИНЫ
Мезоинозит
Tиамин HCI
100
0,5
100
10
Пиридоксин HCI
0,5
1,0
0,5
0,5
Никотиновая кислота
0,5
1,0
1
1
Аскорбиновая кислота
1,5
-
-
-
Глутамин
-
-
2
2
100
1
100
1
САХАРА, ОТВЕРДИТЕЛЬ СРЕДЫ
Сахароза
Агар
30000
7000
30000
7000
30000
7000
30000
7000
27
1.5
ТЕХНИКА ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ РАСТИТЕЛЬНЫХ
ТКАНЕЙ И УСЛОВИЯ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Определяющим моментом работы с культурой изолированных тканей
является введение ее в культуру. Получение первичных культур представляет
собой сложную задачу, поскольку поверхность всех органов растений заселена
сапрофитными грибными или бактериальными организмами (или их спорами),
которые активно развиваются на богатых по составу питательных средах и
подавляют рост растительной ткани. Поэтому перед посадкой эксплантов на
питательную среду необходимо провести их поверхностную стерилизацию.
Внутренние ткани растений считаются стерильными, однако в ряде случаев в
сосудах могут находиться микроорганизмы, которые невозможно обнаружить
визуально. Поэтому основным условием успешного введения исходного
материала в культуру является правильно подобранный режим поверхностной
стерилизации.
В качестве первичного экспланта могут быть взяты любые живые,
здоровые части растения (корни, листья, стебли, семена, проростки, зародыши,
меристемы апикальных и пазушных почек, пыльники и др.), обладающие
достаточной морфогенетической активностью.
Стандартной методики поверхностной стерилизации растительных тканей
не существует. Выбор дезинфицирующего агента и времени его по (действия
устанавливаются экспериментально для каждого объекта с учетом его)
особенностей. Однако есть общие правила, которых следует придерживаться.
Поверхностную стерилизацию проводят в несколько этапов. Вначале
механически очищают растительную ткань от остатков земли, засохших
листьев, кроющих чешуй и т.д. Затем материал промывают в проточной воде с
использованием моющих средств, ополаскивают дистиллированной водой,
после чего обрабатывают в растворах дезинфицирующих веществ,
(концентрация и время обработки в каждом случае подбирается индивидуально),
затем тщательно промывают стерильной дистиллированной модой
(по 10...15 мин), меняя ее 3-5 раз. С целью освобождения внутренних шаней
эксплантов от микроорганизмов применяют растворы антибиотиков (время
воздействия 10...15 мин) без дополнительной промывки водой.
Для поверхностной стерилизации растительного материала используют
28
следующие химические вещества: этиловый спирт (С2Н5ОН), перекись водорода
(Н202), диацид, сулему, мертиолят, гипохлориты кальция Са(ClО)2, натрия
(NaCIO), хлорамин-В. Концентрации этих веществ и длительность их
воздействия подбираются индивидуально в зависимости от особенностей
растительного объекта.
На рост и развитие клеточных культур большое влияние оказывают
физические факторы: свет, температура, влажность, аэрация.
Каллусные ткани, как правило, не нуждаются в свете, поскольку не имеют
хлоропластов и являются гетеротрофами. Их можно культивировать в темноте
или при рассеянном освещении. Если в каллусных тканях индуцируют
морфогенетические процессы, их культивируют при освещенности в
1000...4000 лк.
Изолированные меристемы нуждаются в освещенности интенсивностью
3000…10000 лк. Длительность фотопериода составляет, как правило, 16 часов.
На рост и физиологическое состояние культуры тканей влияет длина световой
волны и спектральный состав света.
При выборе температуры культивирования учитывают местообитание
растений в природе. Оптимальной для подавляющего большинства культур
является температура 26 °С. Для индукции морфогенеза температуру понижают
до 18...20 °С.
Уровень влажности при культивировании тканей должен составлять
60...70 %. При сухом воздухе питательные среды в культуральных сосудах могут
подсыхать, что приводит к изменению концентрации солей в питательной среде.
Оптимальными для культивирования являются условия климатических
камер, где заданные параметры регулируются автоматически.
При выращивании суспензионных культур большое значение имеет
аэрация. Если клетки культивируются в сосудах малых объемов, суспензию
нужно постоянно перемешивать. При выращивании суспензионных культур в
больших ферментерах, аэрация обеспечивается автоматически специальной
подачей воздуха.
29
1.6 РЕГУЛЯТОРЫ РОСТА РАСТЕНИЙ, ИХ РОЛЬ В
ПРОЦЕССЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ
В природе любой живой организм имеет систему гормональной
регуляции, которая обеспечивает реализацию его наследственной программы, а
также адаптацию к изменяющимся условиям среды.
Регуляторы роста растений представляют собой органические
соединения, вызывающие стимуляцию роста и морфогенеза растений. Наличие
регулирующей системы особенно важно для нормального роста и развития
тканей in vitro. Поскольку эксплант изолирован от целого растения, присутствие
в составе питательной среды регуляторов роста является глазным инструментом
управления процессами дифференцировки, морфогенеза и развития растений in
vitro.
Регуляторы роста подразделяются на природные и синтетические. К
первым относятся фитогормоны (ауксины, цитокинины, гиббереллины,
этилен, абсцизовая кислота, брассиностероиды, фузикокцины) и
ингибиторы негормональной природы (некоторые фенолы, производные
мочевины).
Синтетические регуляторы роста представлены стимуляторами типа
ауксинов
(индолилмасляная
–
ИМК,
нафтилуксусная
–
НУК,
дихлорфеноксиуксусная - 2,4-Д кислоты); стимуляторами типа цитокининов
(кинетин, 6-бензиламинопурин – БАП) и ингибиторами (морфоактины,
реторданты, дефолианты).
Фитогормоны (гормоны растений) – это вещества, которые
синтезируются в растениях, транспортируются по ним и способны вызывать
ростовые или формативные эффекты даже в малых концентрациях, причем как
и мосте своего образования, так и на расстоянии от него.
Фитогормоны обладают рядом особенностей. Они имеют эндогенное
происхождение, то есть являются продуктами метаболизма самого растения, и
регулируют его ростовые и формообразовательные процессы. Вторая
обенность фитогормонов – их способность передвигаться по растению.
Фитогормон, образовавшийся в апикальной меристеме стебля способен
регулировать ростовые процессы и в других органах, расположенных на
значительном расстоянии, например, в корне; то есть фитогормоны влияют на
30
те процессы в растениях (морфологические, биохимические, физиологические),
обеспечивая таким образом взаимовлияние органов и целостность
растительного организма. Третья особенность фитогормонов – их высокая
физиологическая активность. Они способны вызывать значительные ростовые
или формативные эффекты в малых концентрациях (порядка 10 -12-10-7 М).
Четвертая особенность состоит в том, что действие фитогормонов происходит
как в месте их синтеза (они способны влиять даже на клетки, в которых
образуются), так и на расстоянии от него.
Фитогормоны (ауксины и цитокинины) или их синтетические аналоги
широко применяются при культивировании in vitro клеток, органов и тканей
растений
Ауксины – являются производными индола, это факторы тропизма
растений. Они образуются в апикальных меристемах стебля, откуда с
нисходящим током поступают в другие органы. Ауксины могут образовываться
и в листьях, но в меньшей степени, причем, в молодых листьях их образуется
больше, чем в старых. Ауксины стимулируют рост отрезков колеоптилей,
стеблей, листьев и корней, вызывают их изгибы, а также усиливают
образование корней у черенков.
Физиологический эффект ауксинов проявляется в регуляции растяжения,
деления и дифференцировки. Ауксины могут также стимулировать и
дифференциацию клеток в клетки проводящих тканей. Так, в каллусной ткани
под влиянием ауксина формируются проводящие элементы флоэмы и ксилемы.
Ауксины обладают аттрагирующим (притягивающим) свойством, что
определяет свойство апикального доминирования. Апекс, в котором происходит
синтез этого гормона, является центром, к которому притекают питательные
вещества, а также другие фитогормоны (гиббериллины и цитокинины),
пазушные почки оказываются лишенными этого потока и развиваются гораздо
медленнее, чем верхушечная почка.
Ауксины влияют на расположение листьев на растении. Каждый молодой
лист, пока он растет, служит источником ауксинов. В апикальной меристеме
побегов возникают зоны, которые станут примордиями листьев. Для
окружающих клеток это значит, что место занято, и закладывать новый лист
рядом уже нельзя.
Самым
распространенным
природным
ауксином
является
31
β – индолил -3 - уксусная кислота (ИУК), или гетероауксин, его синтетические
аналоги – дихлорфениксиуксусная (2,4-Д), индолилмаслянпя (ИМК) и
α-нафтилуксусная (НУК) кислоты.
Ауксины стимулируют корнеобразование. Кроме того, они усиливают
размножение клеток в каллусных культурах при образовании придаточных
корней у черенков. В культуре тканей ауксины в сочетании и цитокининами
стимулируют дифференциацию клеток, а также индуцируют образование
корней.
Цитокинины – являются производными 6-аминопурина, они
стимулируют деление клеток. Синтезируются цитокинины в основном в
апикальных меристемах корня, откуда транспортируются с пасокой по ксилеме,
поэтому скорость передвижения цитокининов выше, чем ауксинов. Больше
всего цитокининов содержится в активных меристемах и семенах.
В растениях цитокинины отличаются низкой стабильностью, причем в
старых тканях они разрушаются быстрее, чем в молодых.
Физиологический эффект действия цитокининов заключается в активации
клеточных делений, что достигается за счет стимуляции работы РНК-полимераз,
образования РНК и синтеза белков.
Многие эффекты действия питокининов связаны с их аттрагирующим
свойством, в частности, стимулирование роста клеток листа и семядолей, снятие
апикального доминирования, задержка старения листьев и регуляция
передвижения веществ в растении.
Цитокинины оказывают действие на течение органогенеза (задерживают
образование корней и ускоряют закладку стеблевых почек), могут
стимулировать цветение некоторых видов растений при неблагоприятном
освещении; под их действием активизируются покоящиеся семена и клубни.
Косвенным образом цитокинины могут повышать фотосинтетическую
активность растений, поскольку они оказывают влияние на транспирацию
листьев, открывая устьица; стимулируют образование хлоропластов на ранних
стадиях развития листа; задерживают старение листьев.
При неблагоприятных условиях жизни растений цитокинины способны
стимулировать синтез стрессовых белков, защищающих клетку, что является
предпосылкой для повышения устойчивости растений к неблагоприятным
32
воздействиям (повреждающим температурам, недостатку воды, повышенной
засоленности и т.д.).
Основные природные цитокинины – зеатин и аминопурии. Их
синтетические
аналоги
–
6-фурфуиламинопурин
(кинетин)
и
6-бензиламинопурин (БАП). В зависимости от типов тканевых культур и целей
эксперимента in vitro используют различные сочетания ауксинов и цитокининов.
Гибберелины – принадлежат к тетрациклическим дитерпеноидам и
являются карбоновыми кислотами. Открытие гиббереллинов берет свое начало
из науки о болезнях растений – фитопатологии. Болезнь риса, вызываемая
грибком Gibberella fujikuroi, сопровождается резким вытягиванием стебля.
Исследование этой болезни в 20-е гг. XX в. в Японии привело к выделению
вещества, с помощью которого грибок усиливает рост стебля зараженного
растения. Структура этого вещества, названного гиббереллином, была
установлена в 1955 году Б. Кроссом.
Гиббереллины вырабатываются в основном в фотосинтезирующих листьях
(однако могут синтезироваться и в корнях). Поэтому они действуют прежде
всего на интеркалярные меристемы, расположенные в непосредственной
близости от узлов, к которым прикреплены листья. Наиболее яркий эффект
наблюдается при обработке гиббереллинами интеркалярных меристем злаков:
растения сильно вытягиваются, механическая прочность соломины понижается,
и стебель полегает.
Почки растений не одинаковы. Так, почки каштана, тополя, яблони, березы
покрыты почечными чешуями (катафиллами). Эти чешуи – видоизмененные
листья, которые не занимаются фотосинтезом. Междоузлия между почечными
чешуями короткие, и в основании побега остается так называемое почечное
кольцо (близко расположенные рубцы от почечных чешуй). Затем начинаются
фотосинтезирующие листья, и чем больше площадь листа, тем длиннее
междоузлие под ним. Это означает, что крупный зеленый лист производит
гиббереллина больше, чем меньший по площади, и подает более мощный сигнал
в интеркалярную меристему. Клетки активнее делятся и растягиваются там, где
больше гиббереллина, и междоузлие под крупным листом оказывается длиннее.
Нефотосинтезирующие почечные чешуи практически не вырабатывают
гиббереллина. Поэтому их незачем разделять в пространстве и нет
необходимости создавать листовую мозаику. Интеркалярная меристема не
33
работает, образуется почечное кольцо из сближенныхрубцов от почечных
чешуй. Известны также еще четыре физиологических эффекта гиббереллинов:

Мобилизация запасных питательных веществ при прорастании семян;

С помощью гиббереллинов можно вызвать изменение пола у растений;

Стимуляция цветения ряда растений;

Дифференцированное влияние гиббереллина на рост карликовых
растений.
Абсцизовая кислота (АБК) – ингибитор роста растений. Выделена в 1963
году одновременно и независимо друг от друга Ф. Уорингом из листьев березы и
явора и Ф. Эддикотом, Б. Милборроу и К. Окумой – из молодых коробочек
хлопчатника.
АБК играет крайне важную роль в ответе растений на стрессовое
воздействие – обезвоживание, засоление, действие низких температур. В ответ
на перечисленные воздействия в растениях начинается усиленный синтез АБК,
которая, в свою очередь, резко изменяет экспрессию генетических программ в
клетках: подавляет синтез иРНК и соответствующих им белков, характерных для
нормальных условий, индуцирует работу генов, и, следовательно, синтез
специфических белков, называемых белками ответа на АБК.
Для нормальной жизнедеятельности все молекулы клетки должны
находиться в определенных условиях оводнения. Белки и нуклеиновые кислоты
удерживают воду с помощью водородных связей. Кроме того, в клетке
поддерживается определенная ионная сила, которая также важна для
поддержания конформации белков и нуклеиновых кислот.
Не менее вредно для растительной клетки понижение температуры. Вода
начинает кристаллизоваться, нарушая структуру мембран. Поэтому главная
задача клетки при охлаждении – не допустить кристаллизации воды. При
понижении температуры уровень АБК повышается, растения приобретают
красную или фиолетовую окраску. Мутантные растения с нарушенным синтезом
АБК быстро гибнут при легкой засухе и при слабых заморозках.
АБК снимает маскулинизирующий эффект гиббереллинов. В этом
отношении интересны опыты с сеянцами некоторых хвойных растений.
Обработка их гиббереллином летом способствует формированию мужских
цветков, а опрыскивание сеянцев осенью – женских цветков. Это, видимо,
связано с тем, что летом в апексах растений имеются специфические клетки-
34
мишени и соответствующие белки, РНК для связывания с гиббереллинами и
гибберелловая кислота оказывает присущее ей маскулинизирующее действие. А
осенью клетки апексов растений, видимо, не обладают соответствующей
готовностью к еѐ действию.
Этилен (С2Н4) также относится к числу гормонов растений. Участие
этилена в регуляции роста растений было открыто в 1901 году Д.Н. Нелюбовым
в Санкт-Петербургском университете. Как регулятор физиологических
процессов вызывает широкий спектр процессов, регулируемых этиленом, в
частности, ускорение созревания плодов. В отличие от других гормонов, он не
поступает из одних органов в другие, играя роль дистанционного сигнала.
Вместо этилена по растению транспортируется его предшественник, который и
участвует в передаче сигнала. Сам же этилен, выделяясь из растения в
окружающую атмосферу, может обеспечивать сигнализацию между растениями.
К другим гормональным веществам растений относятся также
брассиностероиды (в настоящее время известно более 60 соединений с
брассиностероидной активностью, например, кастастерон, выделенный из
каштана), жасминовая кислота, салициловая кислота, и группа веществ,
относящихся к т.н. коротким пептидам – системин, фитосульфокин,
CLAVATA 3, SCR – состоит из 53-57 аминокислот и выделяется прорастающим
пыльцевым зерном у капусты. Для каждой линии капусты характерен свой
особый вариант пептида, и при его действии избегается самоопыление.
1.7
ТИПЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
В зависимости от происхождения, способа и условий выращивания
выделяют несколько типов культур клеток и тканей: меристематические,
каллусные, реже – опухолевые ткани, а также суспензионные культуры и
культуры одиночных клеток (рис. 3).
35
Рис. 3. Типы тканевых культур
Меристематические, каллусные и опухолевые ткани выращивают на
агаризованной питательной среде. Каллусы в зависимости от условий
культивирования различаются по плотности (рыхлые, средней плотности,
плотные). Суспензионную культуру клеток (глубинное культивирование)
выращивают на жидкой питательной среде. Клеточные суспензии можно
получать как из каллусных тканей, так и непосредственно из тканей экспланта. В
первом случае лучше использовать каллус рыхлого типа. Если суспензионные
культуры получат непосредственно из тканей экспланта, его помещают в
жидкую питательную среду и постоянно перемешивют в автоматическом
режиме, дедифференированные клетки экспланта отрываются от него и
образуют в питательной среде суспензию.
1.7.1. КУЛЬТУРА КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙ
В природе каллус образуется у растений на месте поранений, это так
называемый раненый каллус, который выполняет функцию защиты и
способствует заживлению раны. Он обладает регенерационной способностью
и образует вокруг места поранения наплыв, отсюда и его название, что в
переводе с греческого означает "мозоль". Состоит каллус из более или менее
36
однородных клеток паренхимы, начало которым дает раневая меристема.
В условиях in vitro каллус можно получить практически из любой ткани
растения (листа, стебля, корня, пыльников и др.).
Каллусная культура – это каллус, возникший в результате
дедифференцировки
и
пролиферации
изолированных
клеток
и
выращиваемый в длительной пересадочной культуре.
В основе каллусогенеза лежит дедифференцировка клеток, то есть
переход специализированных, неделящихся клеток к образованию
недифференцированных делящихся каллусных клеток. В результате
дедифференциации специализированные клетки, утратившие способность к
делению, вновь ее обретают, но при этом лишаются своей специализации,
становясь однородными.
В культуре каллусная ткань представляет собой бесформенный
конгломерат однородных недифференцированных клеток, имеющих
беловатую, кремовую, желтоватую, реже светло-зеленую окраску. С
возрастом в каллусных тканях накапливаются фенолы и их окраска
становится коричневой. Чтобы избежать этого, каллусы необходимо
регулярно пересаживать на свежие питательные среды (пассировать,
субкультивировать) или же вводить в состав питательной среды
антиоксиданты.
Каллусная ткань бесформенна, не имеет определенной анатомической
структуры, однако в зависимости от исходного экспланта и условий
культивирования можно получать каллус, различающийся по консистенции:
– рыхлый, состоящий из оводненных клеток, легко распадающийся на
отдельные клетки;
– средней плотности с хорошо выраженными меристематическими
зонами;
– плотный, в котором дифференцируются элементы камбия и
проводящей системы.
Помещая каллусную ткань на питательные среды определенного
состава, можно индуцировать образование в ней почек, из которых
развиваются растения-регенеранты. Для этого лучше использовать каллус
средней плотности, в рыхлом каллусе процесс регенерации протекает очень
37
медленно или вообще отсутствует, такой каллус чаще всего используют для
получения суспензионных клеточных культур.
Для дедифференциации тканей экспланта (превращения их в каллус)
необходимы два условия: повреждение ткани (наличия у нее раневой
поверхности, на которой и возникает каллус) и присутствие в питательной среде
в равных количествах гормонов ауксиновой и цитокининовой природы.
Дедифференциация и индукция каллу согенеза у интактных растений
обусловлена образованием раневых гормонов (травматиновая кислота) при
механическом повреждении, а в условиях in vitro – соотношением гормонов в
питательной среде. Наибольшую активность в экспериментах такого рода
проявляет ауксин 2,4-Д; из цитокининов применяют БАП, кинетин, зеатин.
Процесс дедифференцировки клеток и тканей индуцируется ауксинами, а
пролиферация (деление) дедифференцированных клеток – цитокининами.
Интенсивное и беспорядочное деление дедифференцированных клеток приводит
к их неорганизованному росту, в результате чего и образуется каллусная ткань.
Таким образом, превращение специализированных клеток в каллусные
(дедифферекцированные) связано с индукцией клеточного деления, способность
к которому они утратили в процессе дифференцировки. Этот процесс
определяется соотношением гормонов (ауксинов и цитокининов) в среде
культивирования.
Основой каллусогенеза является дедиффренциация, в результате которой
утрачиваются специфические черты исходной ткани, что обусловливается
изменениями биохимических и цитологических параметров клеток. Начинается
дедифференциация с использования запасных веществ (крахмала, липидов,
белков) и разрушения клеточных органелл (хлоропластов), одновременно
возрастает количество амилопластов (лейкопластов с запасами крахмала).
Через 6... 12 часов культивирования на каллусогенной среде клеточная стенка
разрыхляется, разбухает, увеличиваются число свободных рибосом, элементов
аппарата Гольджи, размеры и количество ядрышек. Через 48...72 часа
культивирования начинаются деления (т.е. пролиферация) и образуется
первичный каллус. Таким образом, в результате дедифференциации
(восстановления способности клетки к делению) специализированная клетка
растительной ткани становится каллусной.
Каллусная клетка, как и любая другая, имеет свой онтогенез (цикл
38
развития). Ростовая кривая каллусной ткани клеток показана на рис. 3. Она
имеет S-образную форму. Во время латентной фазы роста клетки
подготавливаются к делению: увеличиваются в размерах, ткань разрыхляется,
число клеток в этот период не увеличивается. Вторая фаза (логарифмическая)
характеризуется наибольшей митотической активностью клеток, происходит
интенсивное нарастание массы каллусной ткани, ее рост происходит с
ускорением. Третья фаза – линейная, она характеризуется наиболее активным
делением клеток, причем скорость их роста постоянна. Во время четвертой фазы
происходит снижение темпа роста клеток, их митотическая активность резко
падает. Пятая фаза – стационарная, ростовая кривая выходит на плато,
начинается деградация (отмирание) клеток, завершается цикл их развития, масса
каллуса не увеличивается. Обычно это происходит на 28-30-й день с момента
посадки каллуса на свежую питательную среду.
Ростовая кривая каллусных клеток имеет S-образную форму (рис. 3).
Данный график включает пять фаз. Во время первой – латентной фазы
увеличения числа и массы клеток не происходит. Клетки в этот период
подготавливаются к делению. Вторая фаза – период экспоненциального роста,
характеризующаяся наибольшей митотической активностью и увеличением
массы каллусной культуры. Кроме того, рост здесь происходит с ускорением.
Третья фаза – линейная, где скорость роста клеток относительно постоянна.
Далее наступает фаза замедленного роста, при которой митотическая
активность клеток резко снижается. И пятая фаза – стационарная или период
деградации. Скорость нарастания клеточной массы здесь равна нулю. На
электронно-микроскопических фотографиях показана (рис. 4) тонкая структура
молодой, растущей и стареющей клетки каллусной ткани:
39
Рис. 4. Ростовая кривая при периодическом культивировании каллусных
тканей. Фазы роста: 1 – латентная; 2 – логарифмическая; 3 – линейная;
4 – замедления; 5 – стационарная; а – молодая; б – растущая; в – стареющая
Успех в применении культуры клеток и тканей в первую очередь зависит
от оптимизации физиологических процессов, обеспечивающих нормальную
пролиферацию, их дифференцировку и регенерацию из них взрослых особей.
Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. В
первую очередь это касается злаковых растений. Поэтому важнейшее значение
имеет выяснение механизма морфогенеза in vitro, регенерация и лежащих в их
основы процессов.
Каллусные клетки in vitro сохраняют многие физиолого-биохимические
черты, свойственные нормальным клеткам, входящим в состав растительного
организма. Каллусные клетки сохраняют способность к синтезу вторичных
метаболитов. Морозостойкость и способность к закаливанию присущи
каллусным клеткам, полученным от морозостойких растений. Этим свойством
не обладают каллусные ткани, полученные от тропических и субтропических
40
культур. Таким образом, устойчивость к низким температурам сохраняется при
переходе клетки к каллусному росту. Каллусным тканям свойственна и
фотопериодическая реакция, что связано с сохранением активности
фитохромов. Общим у каллусных и нормальных клеток растения является и
еще ряд признаков, в частности, устойчивость к действию высоких температур,
осмотически активных веществ, засолению.
Вместе с тем каллусные клетки обладают отдельными свойствами,
отличающими их от нормальных. В них появляются специфические белки, и
уменьшается количество белков, характерных для фотосинтезирующих клеток
листа, или они совсем исчезают. Каллусные клетки отличаются большой
генетической гетерогенностью и физиологической асинхронностью.
В результате выхода из-под контроля организма рост каллусных клеток
происходит неорганизованно, асинхронно, и является неограниченным.
Клеточный цикл у каллусных клеток более длительный, чем у растений,
произрастающих в открытом грунте. Особенностью каллусных клеток является
гетерогенность по возрасту. В каллусной ткани одновременно присутствуют
клетки молодые в G1-фазе, старые в G2- и S-фазах цикла клеточных делений.
Значительные отличия наблюдаются в энергетическом обмене каллусных
клеток. Они потребляют меньше кислорода по сравнению с нормальными.
Митохондрии в каллусных клетках так же, как и в меристематических,
являются слабо развитыми, в них мало крист, что не может не оказывать
влияния на активность аэробного дыхания.
Наряду с изменением характера дыхания в каллусных клетках в
направлении усиления бескислородного расщепления углеводов происходит
также сдвиг в сторону пентозофосфатного пути, который является источником
пентоз, необходимых для делящихся клеток.
Каллусные клетки in vitro сохраняют многие физиолого-биохимические
черты, присущие соматическим клеткам растений, из которых они были
изолированы. Так, если исходное растение было устойчиво к действию
неблагоприятных факторов (мороз, засоление, высокие температуры), эти
свойства будут присущи и каллусным клеткам, индуцированным из его тканей.
Главной же особенностью каллусов является то, что они сохраняют способность
к синтезу тех веществ, которые продуцировали клетки интактного растения, в
частности, вторичных метаболитов. Вместе с тем, у каллусных культур
41
появляются свои характерные особенности, которые отличают их от клеток
интактного растения. Например, в каллусных клетках происходит синтез
специфических белков и одновременно уменьшается количество белков,
характерных для фотосинтезирующих клеток (зачастую они полностью
исчезают).
Популяциям каллусных клеток, культивируемых in vitro, присуща
физиологическая асинхронность и генетическая гетерогенность, что
является, их главными отличительными свойствами.
Физиологическая асинхронность – наиболее важная характеристика
каллусных клеток. В результате выхода из-под контроля целостного организма,
рост клеток происходит неорганизованно, асинхронно и является
неограниченным. Каллусная ткань моркови, впервые полученная in vitro
P. Готре более 70 лет назад, в результате периодического субкультивирования
им свежих питательных средах, сохранилась в коллекции до наших дней.
В каллусной популяции клетки в одно и то же время находятся в разных
фазах клеточного цикла: делящиеся, растущие, стареющие, погибающие. Общее
физиологическое состояние такой популяции оценивается по состоянию
большинства клеток. Асинхронность является устойчивым свойством такой
популяции. Если в условиях эксперимента, под воздействием определенных
факторов, синхронизировать пролиферацию клеток, то после прекращения этих
воздействий уже через 3...4 деления асинхронность восстанавливается.
Причинами этого явления могут быть:
– индивидуальные особенности растения, из тканей которого индуцирован
каллус (вид, сорт, генотип);
– свойства самого экспланта;
– условия культивирования (состав среды, температура, освещенность);
– нарушение баланса эндо- и экзогенных гормонов в течение периода
культивирования;
– генетическая гетерогенность клеток и клонов;
– возникающие in vitro аномалии митоза клеток;
– физические факторы (температура, свет, влажность, аэрация).
Долгое время считалось, что каллусные клетки генетически однородны.
Однако со временем было установлено, что клетки каллуса обладают
выраженной генетической гетерогенностью (неоднородностью). Стабильными в
42
генетическом отношении (всегда диплоидными) in vitro являются лишь
меристематические ткани, активно делящиеся в течение онтогенеза
(верхушечные и боковые меристемы, камбий).
В популяциях каллусных клеток могут возникать различные генетические
изменения: полиплоидия, анеуплоидия, хромосомные аберрации, генные
мутации.
Чаще всего генетическая гетерогенность проявляется в виде полиплоидии
(различиях по числу хромосом). Полиплоидные клетки могут содержать 3,4,5 и
более хромосомных наборов.
Нередко наблюдается возникновение анеуплоидных клеток, для которых
характерно некратное изменение числа хромосом (возрастание или уменьшение
хромосомного набора на несколько хромосом). Так, если диплоидные клетки
тополя содержат 38 хромосом, то его анеуплоидные клетки могут содержать 39,
40 или больше хромосом. Отмечено, что чем дольше культивируют каллусные
ткани, тем в большей степени они гетерогенны. Например, в каллусах табака
через 4 года культивирования совсем не остается диплоидных клеток – все они
становятся полиплоидными или анеуплоидными.
Изменение плоидности культивируемых клеток объясняется двумя
причинами:
– влиянием условий культивирования (в частности, гормонального
компонента питательной среды)
– особенностями клеточного цикла полиплоидных клеток – у них лаг –
фаза короче, чем у диплоидных, поэтому они быстрее переходят к делениям, и с
течением времени доля их в клеточной популяции значительно возрастает.
Кроме изменения плоидности при культивировании in vitro могут
возникать хромосомные аберрации (хромосомные перестройки – мутации,
которые изменяют структуру хромосом), в результате чего меняется внешний
вид культивируемых тканей, их обмен веществ, скорость роста. В
культивируемых каллусных клетках могут также возникать изменения,
затрагивающие лишь незначительные участки хромосом или структуру генов.
Они выявляются по изменению морфологических характеристик или физиологобиохимических свойств клеток (методом определения изоферментного состава
белков, используя молекулярные маркеры ДНK).
43
Генетическая нестабильность
обусловлена следующим причинами:
культивируемых
каллусных
клеток
 исходной гетерогенностью (генетической неоднородностью)
материала, вводимого в культуру, стабильно диплоидными н
течение онтогенеза могут быть только меристематические ткани;
 длительным культивированием (пассироиипием) культур, что
приводит со временем к накоплению в них генетических изменений
(в том числе и неравномерного изменения плоидности);
 нарушением регулирующего влияния со стороны целостного
растения при изолировании эксплантов и культивировании их in
vitro;
 влиянием условий культивирования (гормонального компонента
питательной среды – ауксинов и цитокининов). Ауксин 2,4-Д в
высоких концентрациях может проявлять мутагенное, в частности,
полиплоидогенное действие, цитокинины (кинетин) также
способствуют полиплоидизации клеток;
 генотипом исходного растения – каллус, полученный из
изолированных зародышей ели обыкновенной, при длительном
субкультивировании сохраняет генетическую стабильность, а
полученные из него регенеранты идентичны исходным растениям.
Генетическая
гетерогенность
является
необходимым
условием
существования популяции клеток и служит основой для их адаптации.
Генетическое разнообразие каллусных клеток позволяет использовать их для
клеточной селекции растений с целью повышения продуктивности,
устойчивости к неблагоприятным факторам окружающей среды, патогенным
организмам.
1.7.1.1. ИНДУЦИРОВАННЫЙ МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ
КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙ И ФАКТОРЫ, ЕГО ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ
Изучение онтогенеза многоклеточных организмов является одной из
наиболее интересных и сложных проблем в биологии. В последние годы в
экспериментах такого рода стали использовать изолированные ткани, клети,
протопласты, моделируя этот процесс на примере более простых систем. Такой
44
подход дает возможность повторять опыты в одинаковых условиях и позволяет
избавиться от влияния взаимодействия органов в целостной системе
растительного организма.
После завершения процесса дедифференциации, развитие клеток в
каллусных тканях может идти в нескольких направлениях. Первое – вторичная
дифференцировка разной степени сложности: на уровне клеток, тканей, органов,
вплоть до регенерации целого растения (рис. 5). Второе – стойкая
дедифференцировка (“привыкание”), превращение каллусной клетки в
гормононезависимую. Этот путь характерен, как правило, для старых
пересадочных культур. Третье направление – нормальный цикл развития
каллусной клетки, завершающийся ее старением и отмиранием.
С точки зрения практики наибольший интерес представляет вторичная
дифференцировка, представляющая по своей сути морфогенные процессы, в
результате которых из отдельной клетки могут сформироваться
дифференцированные клетки, ткани или целое растение.
Цитогенез – наиболее простой тип дифференцировки каллусных клеток,
который завершается образованием в каллусной ткани отдельных
дифференцированных клеток, имеющих определенное строение и выполняющих
специфические функции. Например, образование эпибластов – клеток, в
которых
накапливаются
вещества
вторичного
метаболизма.
Цитодифференцировка составляет основу морфогенеза. Процесс регенерации
растений начинается со вторичной дифференциации однородных каллусных
клеток, в результате чего они вновь приобретают структуру и функции
специализированных клеток.
Гистогенез – более сложный тип дифференцировки, завершающийся
образованием в каллусе различных тканей: млечников, волокон, элементов
ксилемы (трахей и трахеид) и флоэмы (ситовидные клетки и клеткиспутницы).
Морфогенез – самая сложная дифференциация, приводящая к
образованию целого растения. В каллусной ткани в процессе морфогенеза
формируются различные органы (стеблевой, корневой, флоральный, листовой
органогенез).
Соматический эмбриогенез – образование из соматических клеток
эмбриоидов – биполярных зародышеподобных структур.
45
Основой морфогенных процессов является последовательное включение
генов, отвечающих за дифференцировку. Определяющую роль в этом процессе
играют фитогормоны, как эндогенные (содержащиеся в тканях самого
экспланта, полученные им от материнского растения еще до изоляции), так и
экзогенные (входящие в состав питательных сред). Клетки, изолированные от
интактных растений, лишаются очень многих важных взаимодействий, которые
контролируют их дифференциацию в целостном организме, поэтому in vitro
дифференциация клеток, как и процесс морфогенеза, определяется условиями
культивирования и в сильной степени зависит от внутренних и внешних
факторов (рис. 5).
Рис. 5. Типы вторичной дифференцировки каллусной ткани
К внутренним факторам относятся генотип исходного растения, орган, от
которого взят эксплант, его возраст, время изоляции. Из внешних факторов
наиболее важными являются состав питательной среды (гормональный, и
46
минеральный компоненты), температура культивирования, освещенность
(интенсивность, фотопериод, состав спектра).
Сигналом морфогенеза (индуктором или стимулом) является изменение
гормонального баланса среды. Каллусогенные среды содержат, как правило,
одинаковое количество ауксинов и цитокининов. При преобладании
цитокининов над ауксинами в каллусных тканях закладываются адвентивные
почки, которые впоследствии могут развиться в побеги (индукция стеблевого
органогенеза), а если преобладают ауксины, образуются корни (индукция
корневого органогенеза). Морфогенез индуцируется последовательно: вначале
адвентивные почки, затем – побег и корни. Если сначала в каллусной ткани
будут индуцированы корни, то целое растение, как правило, регенерировать не
удается.
Таким образом, баланс экзогенных гормонов ауксинового и
цитокининового типа определяет как дедифференцировку и неорганизованную
пролиферацию дедифференцированных тканей (каллусогенез), так и индукцию
вторичной дифференцировки самих каллуных тканей (морфогенные процессы
того или иного типа). Следовательно, ауксины и цитокинины являются не
только регуляторами роста растений, но и регуляторами процессов вторичной
дифференцировки клеток, одним из главных стимулов (индукторов)
морфогенеза.
Этот факт был отмечен Ф.Скугом и Е.Миллером в 1957 году и стал
основой теории гормональной регуляции дифференциации и морфогенеза in
vitro:

при сбалансированном соотношении ауксинов и цитокининов
индуцируется каллусогенез;

при преобладании цитокининов над ауксинами происходит
образование ампентивных почек с последующим развитием
побегов;

при преобладании ауксинов над цитокининами отмечается
ризогенез.
Графическая иллюстрация этой теории представлена на рис. 6.
Другим немаловажным стимулом морфогенеза является сама изоляция
экспланта (или растительной клетки) от целостного организма, то есть условия
47
in vitro стимулируют реализацию тотипотентности клетки, что индуцирует
развитие морфогенетических процессов.
Дополнительными стимулами морфогенеза в культуре каллусных клеток
могут быть минеральный состав питательной среды и различные стрессовые
факторы. Присутствие в питательной среде нитратов (серебра, аммония),
некоторых аминокислот (пролин, тирозин), сахаров (маннит, сорбит)
стимулирует процесс морфогенеза. Ионы NH4+ индуцируют в каллусных
клетках морфогенез, а ионы NО3- стимулируют рост и развитие морфогенных
структур. Стрессовые факторы, например, низкие положительные температуры,
также могут стимулировать морфогенез.
Потенциальные возможности (тотипотентность) всех каллусных клеток
одинаковы и каждая из них, независимо от того, из какой ткани был
индуцирован первичный каллус, в определенных условиях может дать начало
целому организму. Однако реально этот процесс осуществляет только 1-2 из
1000 клеток, что зависит от их компетентности (способности к восприятию
стимулов морфогенеза) и возможности детерминировать (развиваться только
по определенному пути с одновременным ограничением возможности развития
в любом другом направлении).
Способность уже детерминированных каллусных клеток к дальнейшему
морфогенезу определяется их минимальной массой. Так, детерминация
адвентивных побегов в каллусной культуре семядолей ели происходит в
клеточных комплексах из 5-6 клеток, а развитие соматических зародышей
детерминируется в 6-10 клеточном агрегате.
Клетки каллусных тканей, не вставшие на путь детерминации, делятся и
становятся или гормононезависимыми, или продолжают использовать
эндогенные гормоны, но при этом утрачивают способность к регенерации.
Последние занимают промежуточное положение между “привыкшими” тканями
и свежими каллусными культурами.
Из всех видов вторичной дифференциации наибольший интерес
представляет морфогенез, который может идти в двух направлениях –
органогенез – последовательное образование отдельных органов растения и
соматический эмбриогенез – образование зародышеподобных структур,
имеющих меристемы почки и корня (рис. 6, прил.).
48
Рис. 6. Гормональная регуляция дедифференциации и вторичной
дифференцировки растительных тканей
Механизм запуска вторичной дифференцировки у каллусных клеток до
конца еще не изучен. Известно, что морфогенетические процессы в каллусных
тканях начинаются с того, что детерминированная клетка (готовая к вторичной
дифференцировке) обособляется от остальных и превращается в клетку –
инициаль. У неѐ утолщается клеточная стенка, ядро увеличивается и
перемещается в центр клетки, уменьшается число вакуолей, увеличивается
количество запасных питательных веществ (крахмала, реже липидов). В клеткахинициалях начинается синтез тканеспецифичных белков, который находится под
контролем определенных генов. Некоторое время эти клетки находятся в лагфазе, перестраиваясь и подготавливаясь к делениям, затем начинают быстро
дробиться, образуя сферическую массу мелких клеток, называемую
меристематическим очагом (в случае органогенеза) или глобулярным
проэмбрио (в случае соматического эмбриогенеза). Они не имеют
определенной локализации и могут возникать как на периферии, так и в
основании или в толще каллусной ткани. При органогенезе в меристематическом
49
очаге со временем дифференцируются зачатки стебля, корня, листа, цветочной
почки (соответственно стеблевой, корневой, листовой, флоральный органогенез).
При соматическом эмбриогенезе в глобулярном проэмбрио формируются
биполярные зародышеподобные структуры, имеющие меристемы, которые в
дальнейшем дают начало побегу и корню.
В настоящее время до конца не ясно, какими именно генами
контролируется признак морфогенеза, однако то, что морфогенетическая
активность каллусных клеток имеет генетическую природу, сомнений не
вызывает. Подтверждением этого служит тот факт, что в ряде экспериментов из
каллусной ткани определенных генотипов ни при каких условиях
культивирования не удается получить растения-регенеранты.
Органогенез индуцируется с помощью гормонов (цитокининов и
ауксинов). Морфогенные процессы в каллусных тканях протекают асинхронно,
одновременно в них могут быть как полностью сформированные структуры
(например, почки), так и их зачатки.
Соматический эмбриогенез мало зависит от экзогенных гормонов. Как
только из питательной среды устраняется дедифференцирующий фактор (как
правило, ауксин 2,4-Д), начинается развитие соматических зародышей, которые
сами обеспечивают себя гормонами. Основным стимулом соматического
эмбриогенеза является уже сама изоляция клеток от целого растения и
помещение их in vitro. Формирование эмбриоидов включает несколько
последовательных стадий (глобулы, сердца, торпеды, соматического зародыша),
при этом они развиваются асексуально, вне зародышевого мешка.
Активные метаболические процессы меристематического очага или
глобулярного проэмбрио обеспечивают усиленный приток к ним питательных
веществ за счет окружающих каллусных клеток, в результате чего они
разрушаются и сформировавшиеся структуры выпадают из общей каллусной
массы.
С точки зрения практики соматический эмбриогенез имеет ряд
преимуществ перед органогенезом. Побеги, полученные в результате
органогенеза, нуждаются в укоренении, тогда как соматический эмбриогенез
позволяет получать эмбриоиды (соматические зародыши) с уже
сформированными апексами корня и стебля, которые в дальнейшем развиваются
в полноценные растения. С помощью соматического эмбриогенеза можно
50
получать “искусственные семена”. Для этого сформированные in vitro
эмбриоиды заключают в полимерные капсулы, вменяющие покровные ткани. В
таком виде их можно транспортировать, использовать для посева как обычные
семена, создавать банки ценных генотипов растений, в том числе и лесных
пород. Инкапсулированные соматические зародыши являются аналогами
настоящих семян, полученных в результате оплодотворения, но они имеют
генотип исходного растения, то есть не являются гибридными. Это очень важно
для практики лесного хозяйства, поскольку большинство лесных пород является
перекрестно опыляемыми видами, что приводит к расщеплению признаков в
потомстве и потере ценных хозяйственных качеств. “Искусственные семена”
получены для дуба (скального и красного), липы (обыкновенной и
крупнолистной), грецкого ореха, некоторых хвойных пород (ели белой, гибрида
белой ели с елью Энгельмана).
Таким образом, наибольший интерес из всех видов дифференцировки
каллусных тканей представляет морфогенез (органогенез и соматический
эмбриогенез). Индукторами морфогенеза являются: изменение гормонального
баланса среды, сама изоляция тканей (клеток) от интактного растения и их
культивирование in vitro; минеральный состав питательной среды; различные
стрессовые факторы.
1.7.2 КУЛЬТУРА КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ И ЕЕ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ ВТОРИЧНОГО
МЕТАБОЛИЗМА
Суспензионная (глубинная) клеточная культура представляет собой взвесь
клеток или их агрегатов (небольших групп) в жидкой питательной среде. Для
роста и развития такой культуры необходимы аэрация и перемешивание, что
обеспечивается применением специальной аппаратуры. Клеточные суспензии
получают, как правило, из каллусной ткани рыхлого типа. Чтобы получить
100 мл клеточной суспензии, необходимо 2-3 г свежей каллусной ткани.
Деление клеток в суспензии так же, как и каллусных клеток, культивируемых на
агаризованной питательной среде, индуцируется цитокининами и ауксинами –
то есть суспензионные культуры представляют собой типичные каллусные
клетки со всеми присущими им свойствами, главными из которых является
синтез веществ вторичного метаболизма. Вторичные метаболиты,
51
синтезируемые каллусными тканями, по качественному и количественному
составу не отличаются от веществ, образуемых клетками интактного растения,
причем in vitro темп роста клеточной биомассы и выход продукта на единицу ее
объема, как правило, выше. Все это явилось предпосылкой для возникновения
промышленной отрасли, осуществляющей биологический синтез веществ,
необходимых человеку с применением клеточных культур. Суспензионные
культуры применяют и в клеточной селекции, используя как сами каллусные
клетки, так и протопласты, выделенные из них.
В последние годы в мировой практике организованы и успешно работают
крупномасштабные
производства
соединений
вторичного
синтеза,
основанные на процессах биотрансформации – превращения исходных
органических соединений (предшественников) в целевой продукт с помощью
клеток живых организмов или ферментов, выделенных из них. Составляющими
любого биотехнологического процесса являются субстрат (питательная среда),
живой организм и целевой продукт. Центральное звено этой системы – живая
клетка, при этом могут использоваться как микроорганизмы (бактерии, грибы),
так и изолированные клетки и ткани высших растений, получение их
метаболитов является конечным продуктом биотехнологического производства.
Высшие растения всегда были для человека источником целого ряда
ценных веществ, в первую очередь лекарственных соединений. В настоящее
время в практике используется около 20 тыс. веществ вторичного синтеза
высших растений. Мак снотворный (Papavеr somnifеrum) является продуцентом
болеутоляющего вещества кодеина диоскорея дельтовидная (Dioscorea
deltoidea) – стероидных гликозидов, стевия (Stevia) – стевиозида, наперстянка
(Digitalis lanata) – дигоксина, тонизирующего сердечную деятельность, тис
ягодный (Taxus) – таксона, обладающего противоопухолевыми свойствами,
рафольфия змеиная (Rauvolfia serpentina) содержит более 20 алколоидов,
которые входят в состав лекарственных препаратов резерпин и раунатин, хинное
дерево (Cinchona ledgeriana) содержит вещества, которые составляют основу
антимапярийного средства “хинидин”, корни женьшеня настоящего (Panax
ginseng), содержащие редкий в природе тип тритерпеновых гликозидов,
обладают тонизирующим и стимулирующим действием.
Растения являются сырьем для получения наркотических веществ,
которые в небольших и строго контролируемых условиях используются в
52
медицине. Так, из мака снотворного получают опиум и героин, из растений коки
– кокоин, из различных сортов табака – никотин. В чае и кофе содержится
кофеин, являющийся биологическим стимулятором. Из цветков хризантемы
(Chrysanthemum cinerariaefolium) выделены пиретрины – вещества,
обладающие сильным инсектицидным эффектом, при этом они не вызывают
резистентности (привыкания) у насекомых, а также не проявляют
кумулятивного (накопительного) токсического эффекта, что делает эти вещества
весьма перспективными для широкого использования в защите растений.
Получение биологически активных веществ методами клеточной и
тканевой инженерии имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционным
использованием растительного сырья:
– получение биомассы клеток не зависит от погодных и климатических
условий;
– в жидкой среде клетки находятся практически в одинаковых условиях
существования, что улучшает их культивирование и приводит к снижению
количества генетически измененных клеток;
– ростовой цикл клеток в жидкой среде в два раза короче, поэтому прирост
иминусной массы в суспензии происходит быстрее по сравнению с твердой
средой, что увеличивает выход веществ вторичного синтеза;
– открывается возможность оптимизации и автоматизации процесса
культивирования.
Прирост растений inivo и увеличение клеточной массы in vitro происходит
с различной скоростью. В лесу за год корень женьшеня увеличивает свою массу
на 1 г, при выращивании на плантации – 3 г. При культивировании клеток корня
этого растения in vitro на агаризованной среде можно получить 0,4 г сухой
массы на 1 л среды в день. В суспензионной культуре (при выращивании в
50-литровом ферментере) биомасса клеток корня женьшеня за сутки
увеличивается на 2 г на 1 л среды. Это в 1000 раз больше, чем при выращивании
женьшеня на плантации. Цена дикорастущего корня может доходить до
нескольких тысяч долларов США, 1 кг имитационного сырья стоит
100...150 долларов. Экономический расчет показывает преимущество
биотехнологического способа получения биомассы женьшеня.
В настоящее время разрешен к применению в медицине и производится с
использованием клеточных технологий лекарственный препарат "настойка
53
биоженьшеня". Культивируемые клетки этого растения применяются в
косметологии и парфюмерии (маски, скрабы, кремы, лосьоны, и др.),
используются в качестве пищевой добавки при выращивании молодняка птиц и
пушных зверей, что значительно повышает их жизнеспособность.
Для медицины большое значение имеют стероидные гормоны. Сырьем для
их получения служат корневища диоскореи лекарственной, содержащие
лиосгенин. Родиной этого растения является Индия, где оно произрастает в
диком виде (высокогорные леса северо-западных Гималаев) и культивируется на
плантациях. В настоящее время его естественные запасы заметно истощились. В
институте физиологии растений (г. Москва) под руководством Р.Г. Бутенко
были получены штаммы клеток и каллусные культуры диоскореи,
продуцирующие
большое
количество
диосгенина.
Эти
штаммы
высокостабильны в отношении роста и синтеза вторичных метаболитов, в
течение 27 лет культивирования показатели их не изменялись, что говорит о
перспективности их промышленного использования.
На интенсивность синтеза, а также на качественный состав вторичных
метаболитов решающее влияние оказывает состав питательной среды. Так,
увеличение биомассы глубинных культуры зависит от количества и
качественного состава углеводов, соединений азота и фосфора. Например,
соотношение различных форм азота в питательной среде оказывало влияние на
синтез диосгенина в культуре клеток женьшеня. Соотношение аммонийного и
нитратного азота 1:3 повышало продуктивность (возрастала биомасса), а
соотношение 2:3 на продуктивность не влияло, но снижало накопление
диосгенина. Повышение концентрации сахарозы до 5 % положительно влияло на
рост клеточной массы, а снижение еѐ концентрации до 1,5 % повышало
продуктивность синтеза диосгенина. Фитогормоны не оказывают существенного
влияния на продуктивность биомассы культур, однако синтез метаболитов в
сильной мере зависит от их природы и концентрации. Так, при замене ауксина
(НУК на 2,4-Д) синтез антрахинона в суспензионной культуре моринды
лимонолистной (Morinda citrifolia) увеличивался в 3 раза.
Обязательным условием глубинного культивирования является
постоянное перемешивание или встряхивание суспензий, что предотвращает
осаждение клеток и обеспечивает их нормальную жизнедеятельность.
Суспензионные культуры характеризуются полностью клеточных
54
популяций и степенью агрегированности. Длительность пассажа суспензионной
культуры составляет 14...16 дней, за это время плотность клеточной популяции
увеличивается с 5x104 до 5х 106 клеток на 1 мл среды, при этом клеточные
агрегаты содержат не более 10...12 клеток.
При субкультивировании клеточных суспензий очень важно постоянно
соблюдать период субкультивирования, режим перемешивания и аэрации,
поддерживать необходимое количество и физиологическое состояние
инокулята, его минимальное количество, обеспечивиющее развитие суспензии,
различно для разных культур. Это связано с тем, что в каждой культуре только
при определенной, характерной лишь для нее концентрации клеток, появляется
так называемый кондиционирующий фактор. Заменить его можно или
повышением содержания углекислоты в среде, или добавлением глютатиона.
Увеличение количества инокулята может сократить длительность лагфазы от нескольких дней до нескольких часов. Подбор оптимального объема
инокулята и продолжительность субкультивирования лежат в основе отбора
быстрорастущих клеточных линий. Для большинства клеточных культур объем
инокулята составляет 10...20 % от общего объема суспензии в начале
культивирования.
Клеточные популяции различаются по способности к синтезу вторичных
метаболитов. У одних продуктивность постоянна в течение всего времени
существования; у других с течением времени она снижается; третьи
нестабильны, и их клетки быстро теряют способность к синтезу. Вторичные
метаболиты образуются во внутриклеточных органеллах клетки: пластидах,
хлоропластах, митохондриях, лейкопластах; накапливаются и сохраняются в
вакуолях и свободном пространстве клетки, в соседние клетки или в
питательную среду они не поступают.
Глубинное культивирование клеток высших растений в целом
подчиняется тем же законам, что и культивирование клеток микроорганизмов,
но обладает рядом особенностей: длительным периодом удвоения,
несбалансированностью роста по основным критериям, наличием целлюлознопектиновой оболочки и вакуолей.
При промышленном выращивании суспензионных культур применяют
специальные системы – биореакторы. В них идут процессы увеличения
биомассы и синтеза вторичных соединений. Использование таких биореакторов
55
позволяет управлять процессом культивирования на основе показаний датчиков,
а также отбирать значительные по объему пробы культивируемого материала в
автоматическом режиме без нанесения вреда культуре.
Биореакторы делят на две группы в зависимости от способа смешивания в
них культуральной жидкости: за счет подачи в них воздуха (барбатажные) или
механическим способом с помощью специальных устройств.
Выращивание культур растительных клеток в биореакторах проводят в
двух режимах: при периодическом и при проточном культивировании. В мерном
случае по окончании процесса откачивают и используют всю суспензию клеток;
во втором – в течение культивирования в биореактор добавляют свежую
питательную среду, одновременно отбирая такой же объем либо суспензии
(открытое проточное культивирование), либо только обработанной питательной
среды, а клетки при этом остаются в реакторе (закрытое проточное
культивирование). Периодическое культивирование является наиболее простым
и распространенным способом выращивания клеток высших растений в
различных объемах: от нескольких мл в пробирках до 0,5... 10 л в лабораторных
и до 20000 л в промышленных ферментерах.
Открытые проточные системы бывают двух типов: турбидостат и
хемостат. В первом случае ферментер оснащается автоматической системой
поддержания заданной концентрации биомассы путем изменения скорости
протока свежей питательной среды и суспензии клеток. Во втором случае в
ферментер с определенной скоростью подается свежая питательная среда и с
такой же скоростью отбирается суспензия клеток, причем скорость размножения
клеток регулируется концентрацией лимитирующего фактора среды.
В настоящее время клеточные культуры выращивают в биореакторах
объемом до 75000 л (немецкая фирма FYTON). В России биосинтез клеток
женьшеня осуществляют в реакторах объемом 2,5 м3 (Омутнинский
биохимический завод) и 7,5 м3 (ТОО “Тембр”, г. Ярославль), а также
культивируют клетки женьшеня, представителей семейства аралиевых,
диоскореи дельтовидной, маральего корня и ряда других растений в
биореакторах объемом 630 л (Институт физиологии растений, г. Москва).
Одна из современных технологий получения вторичных метаболитов
заключается в использовании иммобилизированных клеток культуры. Их
помещают в определенный носитель, а его – в питательную среду. При этом
56
клетки остаются живыми, прекращают рост, но продолжают синтезировать
метаболиты, выделяя их в среду.
Часто синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре
останавливается на промежуточных этапах, не доходит до необходимого
конечного продукта. В этом случае можно использовать процесс
биотрансформации – когда промежуточные метаболиты изменяются до нужного
продукта с помощью культур других клеток (растительных или бактериальных).
Наперстянка, вместо необходимого дигоксина, используемого в кардиологии, в
больших количествах синтезирует дигитоксин. Для его биотрансформации
применяют иммобилизированные клетки недифференцированной суспензионной
культуры наперстянки, которые способны трансформировать дигитоксин в
дигоксин.
Суспензионная культура клеток корня женьшеня (Panax ginseng)
синтезирует фенольные соединения, которые культура клеток женьшеня
корневого происхождения способна трансформировать (превращать) в
гликозиды – ценный фармакологичский продукт.
1.7.3. КУЛЬТУРА ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК
Культура одиночных клеток представляет большой интерес для клеточной
селекции, генетических и физиологических исследований. Потомства одиночной
клетки (клоны) являются объектом для экспериментов по изучению причин
генетической неоднородности каллусных клеток; при культивировании
одиночной гибридной клетки (в результате соматической гибридизации
протопластов) возможно получение клона гибридных клеток. Однако
культивирование одной или нескольких клеток представляет определенные
трудности, поскольку в условиях, пригодных для роста и развития каллусных
культур такие клетки могут только существовать, делиться они не могут. Для
индукции делений одиночных клеток in virto, применяются специальные
методы,
которые
основаны
на
использовании
так
называемого
“кондиционирующего фактора" – метаболитов, выделяемых в среду
делящимися клетками. В популяциях клеток одновременно происходит много
клеточных делений, поэтому кондиционирующий фактор в них всегда
присутствует в достаточном количестве. В случае же культивирования
57
отдельных клеток или их небольших групп, клеточных метаболитов слишком
мало, чтобы индуцировать деление. Для повышения содержания
“кондиционирующего фактора” в питательной среде используют следующие
приемы (рис. 7):
метод ткани - “няньки” - на поверхности агара ювинной питательной
среды рядом с отдельно культивируемыми клетками, отделив их
фильтровальной бумагой, помещают кусочек каллусной ткани; которая и
является в этом случае для одиночных клеток источником “кондиционирующего
фактора”;
– метод “кормящего слоя” – одиночные клетки на фильтроиапьной бумаге
помещаются на поверхность пенополиуретаноного блока, помещенного в
культуральный сосуд, содержащий суспензионную культуру клеток того же вида
растений, что и одиночная клетка; при этом "кондиционирующий фактор",
проникает через пенополиуретан и индуцирует деление одиночных клеток;
– кондиционирование среды – среду культивирования добавляет
культуральный фильтрат от интенсивно делящейся культуры;
– культивирование одиночных клеток в микрокапле очень богатой по
составу питательной среды.
Рис. 7. Методы повышения содержания кондиционирующего фактора
в питательной среде при культивировании одиночных клеток
58
Пока нет точного определения “кондиционирующего фактора”, однако
уже известно, что он термостабилен, водорастворим, не заменяется
фигогормонами, включает низкомолекулярные вещества. Он не является чисто
химическим веществом, а представляет собой сумму факторов, которые
выделяются из клетки. Если одиночные клетки и ткань – «няньку» разделить
стеклянной пластиной, одиночные клетки не делятся, если же вместо стекла
использовать проницаемый материал, например, полиэтилен, одиночные клетки
через некоторое время начинают делиться. Этот эксперимент наглядно
показывает механизм действия кондиционирующего фактора.
1.7.4. ГОРМОНОНЕЗАВИСИМЫЕ И ОПУХОЛЕВЫЕ
РАСТИТЕЛЬНЫЕ ТКАНИ
В норме каллусные клетки могут развиваться in vitro при наличии в
питательной среде гормонов. Однако в ряде случаев при длительном
культивиронании они начинают синтезировать собственные гормоны и могут
расти на безгормональной среде, то есть становятся гормононезависимыми.
Такие каллусные клетки называются «привыкшими» или «химическими
опухолями». По внешним признакам гормононезависимые ткани не отличаются
от обычных каллусных. Механизм "привыкания" до конца пока не изучен,
скорее всего, он связан с длительным гормональным воздействием на
каллусные ткани.
Способность “привыкших ” расти на безгормональной среде роднит их с
опухолевыми
тканями
растительного
происхождении
(причинами
возникновения которых являются бактерии и вирусы) и генетическими
опухолями (появляющимися на межвидовых гибридах). Однако синтез гормонов
у “привыкших” и опухолевых растительных клеток происходит по-разному.
У
“привыкших”
тканей
гормононезависимость
обеспечивается
уменьшением активности генов, отвечающих за синтез ферментных белков,
участвующих в построении молекул гормонов, в результате чего нарушается
процесс их образования. Эти изменения связаны с подавлением определенных
генов, но возможно, что они возникают в результате мутаций.
Экспериментальная проверка природы гормональных изменений в "привыкших
тканях" показала, что такие изменения не наследуются. Если в "привыкших
59
тканях" индуцировать образование растений-регенерантов, а их экспланты
культивировать на среде без гормонов, каллусная ткань на них не образуется.
Это говорит о том, что гормононезависимость не имеет генетической природы.
Таким способом можно проверить только те "привыкшие ткани", клетки
которых могут регенирировать растения, но в большинстве случаев такие ткани
утрачивают способность к регенерации, поэтому определить природу их
гормононезависимости не представляется возможным.
В опухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в растительную
клетку бактериального гена, отвечающего за этот процесс, то есть он обусловлен
генетическими изменениями и передается потомству.
Таким образом, "привыкшие" и опухолевые ткани обладают общим
свойством гормононезависимости, но в опухолевых тканях она является
генетически закрепленной, а у "привыкших" определяется депрессией генов или
же связана с мутациями. Вторым общим свойством у них является утрата
способности к регенерации, получить из них нормальные растения удается
крайне редко.
60
ГЛАВА 2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ
В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ
Селекция древесных растений имеет свои методы, отличающиеся от
методов селекции сельскохозяйственных растений, но с более глубоким
использованием биотехнологии появились новые пути селекции древесных
растений. Основные задачи, стоящие перед селекционерами, генными и
клеточными инженерами, – создание устойчивых к патогенам и
неблагоприятным факторам внешней среды (засухе, морозу, засолению), а
также высокопродуктивных форм древесных растений и улучшение качества
древесины. Эти задачи могут быть решены традиционными методами селекции
за более продолжительные сроки, чем методами клеточной инженерии, хотя
примеров таких мало.
Одной из основных проблем лесной биотехнологии является отсутствие
методической и опытной базы получения устойчивых к неблагоприятным
условиям среды генотипов древесных растений. Это становится особенно
актуальным в связи с изменением климата, в т.ч. участившимися засухами.
Имеется три главных последовательных и взаимосвязанных этапа работ по
массовому получению ценных генотипов древесных растений (и березы) через
культуру тканей. Это набор генетико-селекционных методов получения ценных
генотипов – отбор, гибридизация, мутагенез, генная (геномная) инженерия –
ante vitro (до лаборатории), работа в лаборатории in vitro (подготовка
питательных сред, их стерилизация, поверхностная стерилизация эксплантов
растений и т.д.) и адаптация пробирочных растений-регенерантов к условиям
ex vitro (рис. 8). Все три компонента важны и необходимы для получения
клонов деревьев. Первый компонент является первичным и определяющим весь
дальнейший ход получения новых растений. Однако этот компонент (генетикоселекционный) обычно отходит на второй план, что методически
неправомерно, поскольку от изучения наследования признака дерева, как
минимум, до испытания первого поколения F1, по которому проводится отбор,
зависит и весь остальной ход работы, который заканчивается созданием
плантационных культур целевого назначения.
61
ante vitro
in vitro
ex vitro
•аналитическая селекция
•отбор
•гибридизация
•мутагенез
•генная (геномная) инженерия
•клональное микроразмножение
•каллусная культура
•адаптация к тепличным условиям
•адаптация к природным условиям
Рис. 8. Последовательность основных этапов работ по биотехнологии
древесных растений
2.1. Направления и методы селекции древесных растений
Успешному решению задач повышения продуктивности и качества
древесины важное место занимает внедрение в лесоводство методов селекции.
Для улучшения лесных пород на основе селекции традиционными методами
применяют два основных пути:
1.
Отбор и использование для разведения естественно возникших в
природе ценных форм (аналитическая селекция);
2.
Получение новых ценных форм экспериментальным путем
(методами гибридизации, мутагенеза, полиплоидии и др.) и их использование
(синтетическая селекция).
В лесной селекции, интенсивно развивающейся отрасли лесоводства,
первый путь имеет в настоящее время первостепенное и основное значение для
практики и массового применения селекции в лесном хозяйстве.
Аналитическая
селекция
древесных
растений,
включающая
популяционную и плюсовую селекцию, отражает основные направления
62
селекционно-семеноводческих мероприятий в лесном хозяйстве России,
которые документально подтверждены в Федеральном законе «О
семеноводстве» (1997), «Указаниях по лесному семеноводству в Российской
Федерации» (2000), в «Правилах создания и выделения объектов лесного
семеноводства (лесосеменных плантаций, постоянных лесосеменных участков
и подобных объектов)» (2016) и «Лесном кодексе РФ, ст. 65» (2006). Этот путь
селекции в лесном хозяйстве РФ основной.
Синтетическая селекция древесных растений в лесном хозяйстве мало
применяется, вопросами гибридизации, мутагенеза и полиплоидии могут
заниматься НИИ, опытные станции, кафедры селекции в вузах.
В силу длительных жизненных циклов (онтогенеза) древесных растений –
процесс их селекции крайне медленный.
Перспективным
способом
является
ускоренная
селекция
с
использованием методов биотехнологии.
2.2. Размножение отобранных хозяйственно-ценных форм древесных
растений
При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского
растения и сокращается длительность ювенильного периода. Главные
лесообразующие породы России (сосна, дуб, лиственница, ель) плохо
размножаются вегетативным путем. Отобранные в природе и полученные
искусственно ценные формы можно размножать путем микроклонирования. В
конце XX столетия в НИИ лесной генетики и селекции (г. Воронеж)
отработаны методы микроклонального размножения березы повислой, березы
карельской, тополя сереющего, осины.
Например, в Хоперском заповеднике отобрана аллотриплоидная
крупнолистная форма тополя сереющего, которая является родоначальницей
сорта Хоперский 1. Пол женский. По данным А.И. Сиволапова (2005) это
дерево является миксоплоидом с преобладанием в соматической ткани
триплоидных клеток с 57 хромосомами (74 %). Остальные 26 % приходятся на
долю анеуплоидных и диплоидных клеток с 38 хромосомами.
По итогам 30-летнего конкурсного сортоиспытания Хоперский 1
характеризуется резко выраженным гетерозисом по продуктивности и качеству
63
древесины, адаптивностью в различных экологических условиях. Этот тополь
хорошо размножается только микроклонированием in vitro (рис. 9)
Рис. 9. плюсовое дерево тополя сереющего.
Хоперский заповедник. Возраст 57 лет, диаметр 87 см, высота 41 м
Суть предлагаемой технологии, предназначенной для массового
тиражирования хозяйственно ценного сорта тополя сереющего – Хоперский 1
выращивания качественного стандартного посадочного материала для создания
плантационных насаждений, заключается в следующем. Регенерация растений
осуществляется на основе пролиферации пазушных меристем (прямой выгонки
пазушных побегов), их укоренения и мультипликации полученных
микрорастений, т.е. с помощью модели размножения, исключающей этап
каллусообразования. При этом в качестве эксплантов используются узловые
сегменты активно растущих летних неодревесневших (а не зимних
одревесневших) побегов, применение гормональных питательных сред
ограничивается всего одним сроком культивирования (один месяц) первичных
эксплантов взрослых деревьев, а на этапе укоренения микропобегов, их
доращивания и мультипликации используются одни и те же безгормональные
64
среды. Предлагаемая схема адаптации и доращивания регенерантов тополя в
условиях открытого грунта позволяет получать качественный однородный
(стандартный)
двухлетний
посадочный
материал
для
создания
специализированных плантаций в Воронежской области.
а
б
Рис. 10. Общий вид асептических жизнеспособных первичных культур тополя
сереющего Хоперский 1 при оптимальном режиме стерилизации
а – одноузловые сегменты неодревесневших летних побегов,
изолированные в июне месяце; б – начало развития пазушных почек.
Питательная среда WPM, дополненная БАП 0.5 мг/л и ГК 0.2 мг/л
Формирование хорошо развитых пазушных побегов проявляются при
культивировании эксплантов на питательной среде WPM, дополненной БАП
0,5 мг/л ГК 0,2 мг/л. Добавление в питательную среду ГК позволяет не только
повысить количество морфогенных культур в 1,7 раза у тополя Хоперский 1, но
и способствует элонгации (доращиванию) индуцированных побегов.
Укоренение изолированных побегов в условиях in vitro.
Сформировавшиеся пазушные побеги высотою 1,5-3 см изолируют и
переносят на среду для спонтанного укоренения – WPM c уменьшенным
содержанием макросолей без гормонов. К концу первого месяца
культивирования побеги достигают 5-7 см, а через 2 месяца 7-12 см (рис. 10,
11). Мультипликация микрорастений (многократное микрочеренкование,
осуществляемое для увеличения численности клона) проводится раз в месяц
или раз в 2 месяца на питательных средах WPM или ½ WPM без гормонов. Для
65
этого микрочеренки длиной 1-1,5 см, содержащие одну пазушную почку,
помещают по 20 штук в один пластиковый контейнер (емкостью до 250 мл).
Рис. 11. укорененные растения клона тополя Хоперский 1
2.3. Адаптация и доращивание микрорастений в теплице
Адаптация и перевод микрорастений в теплицу может осуществляться
двумя способами, которые дали одинаково высокий результат для двух
генотипов тополя сереющего. Первый способ – поэтапная высадка
микрорастений в теплицу с предварительным их доращиванием в условиях
лаборатории (традиционный способ); второй – прямая высадка микрорастений
из пробирок в почву теплицы. К преимуществам первого способа относится
возможность круглогодичного его использования. Однако он требует строго
контролируемых условий климатического режима в лаборатории. В противном
случае отмечается резкое снижение сохранности растений в почве теплицы
вплоть до их гибели. Второй способ – более простой и менее трудоемкий.
Единственный его недостаток – временные ограничения высадки в грунт (майиюль).
В обоих случаях необходимо соблюдать следующие условия:
– Перед высадкой пробирочных микрорастений в нестерильные условия
проводится их предварительная адаптация (преадаптация) к условиям
климатической камеры. Для этого микрорастения выдерживают в течение
66
2-3 суток на агаровой среде в открытых культуральных сосудах (со снятыми
пробками) с добавлением в них 1-1,3 мл дистиллированной нестерильной воды.
Такая процедура значительно повышает приживаемость регенерантов в
нестерильном почвенном субстрате.
– Оптимальной высотой микрорастений тополя для перевода их из
пробирочной культуры в нестерильные почвенные условия является 3-5 см, т.е.
цикл субкультивирования в данном случае должен быть равен не двум, а
одному месяцу.
– Для перевода в почву отбираются только хорошо развитые
микрорастения: прямоствольные, с нормальными листьями и сбалансированной
(по отношению к надземной части), хорошо развитой корневой системой
(наличие корней первого и второго порядка).
– Условия климатического режима в лаборатории – 16-ти часовой
фотопериод, освещенность 2-3 клк, температура 24-26 0С. Состав почвенного
субстрата при поэтапном выращивании микрорастений – торф : перлит = 1 : 1.
– Условия климатического режима в теплице – весеннее-летний период,
относительная влажность 80 % (воздушно-капельный полив трижды в день по
10 минут). Состав почвенного субстрата – торф : песок = 1 : 1.
При поэтапной высадке растения осторожно пинцетом извлекают из
агаровой среды и высаживают в почвенный субстрат (торф : перлит – 1:1,
сверху чистый прокаленный песок), помещают в пластиковые или
полиэтиленовые минитеплицы (для поддержания высокой влажности (до 80 %),
необходимой для сохранения тургора у пробирочных растений) и инкубируют в
условиях климатического режима лаборатории (16-ти часовой фотопериод,
освещенность 2-3 клк, температура 24-26 0С). Подготовка почвенного субстрата
в основном сводится к очистке от механических примесей входящих в него
компонентов, стерилизации от бактериальной и грибковой инфекции. Для этого
перлит и песок промывают в проточной воде и прокаливают при 80 0С в
сушильном шкафу в течение 2-х часов. Смесью заполняют пикировочные
контейнеры, проливают слабым раствором марганцовки (KMnO4).
После начала формирования одного нового листа (через 1-2 недели)
влажность постепенно снижают до влажности окружающей среды
(лаборатории). Адаптированные к условиям лаборатории растения (высотой не
менее 5-6 см) высаживают в пленочную теплицу с регулируемым поливом, где
67
их доращивают в течение одного вегетационного периода. Следует отметить,
что при увеличении продолжительности выращивания в минитеплице может
наблюдаться вытягивание растений (чрезмерное увеличение размеров
междоузлий) и их загнивание. Ранней весной (апрель) следующего года
однолетние растения пересаживают на открытый участок (полигон) для их
доращивания и получения двухлетнего посадочного материала, который
пересаживается в полевые условия (на лесокультурную площадь).
Прямая высадка растений из пробирочной культуры в почву
предусматривает отсутствие промежуточного этапа доращивания в
лаборатории.
Перенос
микрорастений
из
культуральных
сосудов
непосредственно в нестерильный субстрат (торф : песок = 1 : 1) теплицы
осуществляли весной и летом (май-июль). Для растения, преадаптированные в
открытых культуральных сосудах, извлекают и пикируют в прямолинейные
бороздки, сделанные в хорошо разрыхленном и выровненном грунте.
а
б
68
в
г
Рис. 12. Микрорастения тополя сереющего перед высадкой в нестерильные
условия (а), в почвенном субстрате (торф : перлит = 1 : 1) в лаборатории =
климатической комнаты (б), грунте теплицы (в, г).
Методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro могут
использоваться как вспомогательные технологии: преодоление прогамной
несовместимости, когда механизмы несовместимости проявляются до
оплодотворения, культивирование семяпочек и незрелых гибридных
зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов
путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение
изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение
отдаленных гибридов.
Методы клеточной селекции могут использоваться для соматической
гибридизации (слияние изолированных протопластов и получение неполовых
гибридов), применение методов генной инженерии (гибридизация на уровне
молекул ДНК).
Получение искусственных семян на основе соматических эмбрионов.
Соматические эмбриоиды (неполовые зародыши) растений, заключенные в
гелевую оболочку. На основе регенерации растений была создана техника
искусственных семян. Соматические эмбриоиды в отличие от зиготических
семян не имеют эндосперма и не могут обеспечить себя питательными
веществами, поэтому эмбриоиды заключают в капсулу из желатина с
69
элементами питательной среды. Искусственные семена сосны получают в США
и создают лесные культуры.
Получение гаплоидов (половых клеток с одним набором хромосом) путем
культивирования микроспор для создания гомозиготных линий, гаплоидных
растений искусственным путем. Использование гаплоидных растений
позволяет ускорить селекционный процесс. Гаплоидные особи стерильны, но
методом индуцированной полиплоидии из них можно получить диплоидные
гомозиготные растения для дальнейшей синтетической селекции. Г.П. Бутовой
в ЦНИИЛГиС были проведены опыты по культивированию пыльников тополя
in vitro с целью получения гаплоидных гомозиготных растений, однако, из
пыльников регенерировали анеуплоидные и диплоидные регенеранты. В
природе гаплоиды могут возникать при отдаленной гибридизации: в зиготе
отдаленного гибрида хромосомы одного вида (как правило, дикорастущего) не
развиваются, что приводит к развитию гаплоидного организма. Спонтанно
возникшие гаплоиды сосны обыкновенной были обнаружены Ю.Н. Исаковым,
А.К. Буториной в ЦНИИЛГиС.
Одним из направлений использования метода культуры изолированных
клеток и тканей является применение его в селекции. Культура тканей в
селекции растений может использоваться в различных направлениях (рис. 13).
Индуцируя различными методами органогенеза в культуре соматических и
генеративных тканей, получают растения-регенеранты идентичные по
диетическим свойствам исходным формам или обладающие новыми
свойствами, а также гаплоидные растения. Весь этот материал находит
применение в селекционном процессе.
В задачу селекционеров входит создание высокопродуктивных форм
растений, обладающих разной формой устойчивости к влиянию биотических и
абиотических стрессовых факторов. Это особенно актуально в связи с
расширением эпифитотий опасных грибных, бактериальных и вирусных
болезней культурных растений и вспышками массового размножения
вредителей, уничтожающих до 30 % (а иногда и более) мирового урожая.
Большой урон сельскохозяйственным посевам и лесным культурам
наносят неблагоприятные температуры. Засухи и морозы приводят к гибели до
50 % посевов, к снижению приживаемости лесных культур. В землепользовании
нашей страны значительна доля кислых и засоленных почв (соответственно 68,9
70
и 16,3 млн га). Урожаи на них низкие, а облесение таких почв представляет
большие трудности.
С увеличением рекреационной нагрузки окружающая среда загрязняется
солями тяжелых металлов, а вследствие техногенных катастроф –
радионуклидами. Прогнозируемое ухудшение климата может сделать эту
проблему еще более острой.
Традиционные методы селекции пока не позволяют создать сорта и
гибриды устойчивые по комплексу признаков, поэтому большие надежды
полагаются на новые и новейшие биотехнологические методы, используя
которые, возможно создание генотипов растений с улучшенными или
принципиально новыми качествами, обладающими одиночной, групповой, реже
– комплексной устойчивостью к неблагоприятным биотическим и абиотическим
факторам среды. Эти методы позволяют создать разнообразие сомаклональных
вариантов, на основе которых можно получать новые сорта или растениярегенеранты с ценными свойствами: повышенной устойчивостью к биотическим
(грибные, бактериальные, вирусные инфекции) и абиотическим (засуха, высокие
и низкие температуры, засоление) факторам. В государственный реестр внесены
отечественные сорта зерновых культур, полученные с использованием линий,
созданных на основе клеточной селекции, проходят испытания генетически
модифицированные линии картофеля, устойчивого к колорадскому жуку и
фитофторе.
71
Рис. 13. Использование методов культуры тканей в селекции растений
Для получения новых сортов растений необходимо выделение и
клонирование генов, создание на их основе векторов для переноса чужеродных
генов из клеток-доноров в клетки-реципиенты, что позволяет осуществлять
трансформацию растительных генотипов и получать трансгенные
(модифицированные) растения с заданными свойствами. Генно-инженерные
технологии используются в биотехнологических лабораториях США, Канады,
Аргентины, Китая, Японии, Германии, Голландии, Франции, Индии. В этих
странах получены формы растений, устойчивые к насекомым и гербицидам
(соя, кукуруза, хлопок, сахарная свекла, рапс, картофель, томаты и др.), к
грибным болезням (рис, картофель, пшеница, сахарная свекла), к засолению
(пшеница).
72
На сегодняшний день размер посевных площадей, занятых под
трансгенными сельскохозяйственными растениями, достиг 50 млн га, в
основном они сосредоточены в США, Аргентине, Канаде и Китае. Из них 80 %
составляют соя и кукуруза. Большинство выращиваемых модифицированных
растений обладают устойчивостью к гербицидам (71 %) и насекомым (22 %).
В России работы по созданию генетически трансформированных
сельскохозяйственных растений были развернуты с 1986 г., после принятия
первой национальной программы по биотехнологии. В настоящее время в
нашей стране создана правовая база для осуществления биотехнологических
работ с использованием в производстве новых трансформированных генотипов
растений, животных, микроорганизмов. Приняты и действуют законы “О
государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности”,
"О селекционных достижениях”, “О семеноводстве” указанная выше
"Комплексная программа развития биотехнологии …".
Клеточные технологии, используемые в селекции, условно можно
разделить на две группы. Первая – вспомогательные методы, которые
пополняют селекцию, не заменяя собой ее традиционных приемов, к ним
относятся:
– получение гаплоидов (культивирование пыльников и микроспор);
– преодоление прогамной несовместимости (оплодотворение in vitro);
– преодоление постгамной несовместимости (культивирование семяпочек
и незрелых гибридных зародышей);
– клональное микроразмножение отдаленных гибридов;
– сохранение ценного генофонда (создание живых коллекций,
криосохранение изолированных клеток, тканей и органов).
Методы второй группы позволяют получать новые формы и сорта
растений самостоятельно, без использования традиционных селекционных
приемов, это:
– клеточная селекция;
– соматическая гибридизация;
– генетическая инженерия.
Некоторые биотехнологии, используемые в настоящее время для
оптимизации селекционного процесса, развиваясь и совершенствуясь, обрели
самостоятельный статус. Так, клональное микроразмножение оформилось в
73
биоиндустрию размножения ценных селекционных форм и оздоровленного
посадочного материала, в то же время приемы этого метода используют на
различных этапах как вспомогательных, так и самостоятельных технологий
получения новых форм и сортов растений. Сохранение генофонда, например,
стало одним из важнейших направлений в экологических исследованиях.
2.4. КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ
Высшие растения размножаются двумя способами: половым (семенами) и
вегетативным (порослью, корневыми отпрысками, отводками, черенками,
прививкой). Для лесных пород основным способом размножения является
семенной. За один вегетационный сезон из семян можно вырастить большое
количество посадочного материала, но для деревьев характерен длительный
ювенильный период, первый урожай может быть в возрасте 20 ... 40 лет, а иногда
и позже, кроме того, не каждый год бывает урожайным, все это усложняет
селекцию лесных пород. Главным же недостатком семенного размножения
является то, что в результате полового процесса в потомстве происходит
расщепление признаков и за счет его генетической неоднородности могут быть
потеряны ценные качества сорта.
Вегетативное размножение позволяет сохранять генотип материнского
растения и сократить продолжительность ювенильного периода размножаемых
растений. Однако для большинства древесных пород традиционные способы
вегетативного размножения не всегда применимы. Во-первых, не все деревья
даже на ювенильной стадии могут размножаться вегетативно с требуемой
эффективностью. Так, коэффициент вегетатинного размножения дуба, сосны,
орехоплодных очень низок. Во-вторых, вегетативное размножение ограничено
возрастом деревьев: с помощью черенкования практически невозможно
размножать деревья старше 10... 15 лет, поскольку у многих из них, особенно
хвойных, с возрастом происходит уменьшение или полная потеря
регенерационной способности, отбор же селекционного материала по
хозяйственно ценным признакам проводят среди взрослых деревьев. В-третьих,
размножение древесных растений с помощью прививок довольно трудоемко и
низкопродуктивно: количество удачных прививок не всегда прогнозируемо в
результате несовместимости тканей подвоев и привоев (например, у дуба)
возможно их взаимное отторжение как в молодом (1..3 года), так и в более
74
старшем (10... 15 лет) возрасте. Корме того, традиционные методы вегетативного
размножения требуют больших производственных площадей и длительного
времени; они не гарантируют получения стандартного здорового посадочного
материала, возможно накопление и передача внутритканевой инфекции
(например, вирусной). Немаловажен и тот факт, что нередко количество
исходного ценного селекционного материала очень ограничено.
Развитие и совершенствование метода культуры изолированных клеток
и тканей привели к созданию принципиально нового способа вегетативного
размножения клонального микроразмножения – это вегетативное
размножение растений с помощью методов культуры тканей (in vitro),
позволяющее получать растения генетически идентичные исходному
экземпляру. Название этой технологии предложил Веббер в 1903 году, оно
происходит от термина “клон", что в переводе с греческого (clon) означает
отпрыск.
В основе клонального микроразмножения лежит уникальная
способность соматических клеток растений проявлять присущую им
тотипотентность – полностью реализовывать свой потенциал развития in
vitro, под влиянием экзогенных факторов (гормонов в составе питательной
среды) давать начало целому растительному организму.
Этот метод перед традиционными способами размножения имеет ряд
несомненных преимуществ, однако следует отметить, что клональное
микроразмножение требует специальных знаний и навыков, определенного
набора лабораторного оборудования, поэтому пока он применяется для
тиражирования только особо ценных, уникальных генотипов, трудно
размножаемых традиционными способами.
Клональное микроразмножение используется по трем основным
направлениям:
– в селекции – для ускоренного размножения ценных селекционных
форм взрослых деревьев, в частности, «плюсовых», гибридов, улучшенных,
элитных форм; предлагаемые технологии пока ориентированы на
селекционные центры, которые работают с материалом, представляющим
особый интерес для науки и практики; например, с помощью этого метода
осуществляется р а з множение гетерозиготных растений, потомство которых
при семенном размножении сильно расщепляется;
75
– в растениеводстве – для оздоровления посадочного материала от
вирусной и бактериальной инфекции с применением культуры меристем
методов термо- и хемотерапиии;
– в решении экологических проблем – для сохранения редких и
исчезающих видов, в том числе занесенных в Красную книгу; клонирование
in vitro позволяет сохранять их генотипы, размножать растения и возвращать
их в природную популяцию.
Клональное микроразмножение имеет большие возможности, в рамках
перечисленных выше направлений использование этого метода позволяет:
– получать генетически однородный посадочный материал;
– достигать высокого коэффициента размножения: для травянистых
растений 105...106, для кустарниковых и древесных 104.,. 105 (для хвойных
104);
– ускорять переход растений от ювенильной к репродуктивной стадии
развития, сокращая тем самым продолжительность селекционного процесса;
- получать вегетативное потомство растений, трудно размножаемых
традиционными способами;
– одновременно с размножением оздоравливать растения;
– сохранять и размножать ценный генофонд и уникальные генотипы;
размножать растения не зависимо от сезона и климата, экономя при этом
производственные площади – в относительно небольшой лаборатории можно
выращивать тысячи растений;
– проводить обмен пробирочными растениями между научными
учреждениями, исключая при этом возможность их заражения карантинными
болезнями;
– регулировать и автоматизировать процесс выращивания растений.
2.4.1. ЭТАПЫ И МЕТОДЫ КЛОНАЛЬНОГО
МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ
Процесс
клонального
микроразмножения
включает
четыре
последовательных этапа:
1) выбор растения-донора, изолирование экспланта и получение хорошо
растущей стерильной культуры;
76
2) собственно микроразмножение – получение необходимого количества
микропобегов);
3)
укоренение размноженных побегов in vitro, адаптация их к
почвенным условиям, а при необходимости – сохранение (депонирование)
растений-регенерантов;
4) выращивание растений-регенерантов в условиях теплицы, перевод их в
открытый грунт и подготовка к реализации.
Существует 4 метода клонального микроразмножения растений: культура
изолированных меристем, индукция возникновения адвентивных почек
непосредственно
тканями
экспланта,
соматический
эмбриогенез,
дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной
культуре.
Основной метод, используемый при клональном микроразмножении –
активация развития имеющихся в растении меристем (верхушечные и
боковые
почки
стебля).
Обязательным
условием
клонального
микроразмножения является идентичность растений-регенерантов исходному
материнскому экземпляру, поэтому в работе используются меристематические
ткани, обладающие генетической стабильностью.
Метод основывается на снятии апикального доминирования у растений,
культивируемых in vitro, что может быть достигнуто двумя путями: или
удалением верхушечной меристемы, или добавлением в питательную среду
веществ цитокининового типа действия (рис. 14, I путь). В обоих случаях
индуцируется развитие пазушных побегов, которые доращивают и либо
отделяют от первичного экспланта и пересаживают на свежую питательную
среду, стимулирующую пролиферацию пазушных меристем и возникновение
побегов более высоких порядков, либо разделяют на микрочеренки, которые
культивируют на безгормональной питательной среде с последующим
укоренением. Этот метод широко используется для производства безвирусного
посадочного материала технических (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур,
стахис) и овощных (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.)
культур; в промышленном цветоводстве (для размножения гвоздики,
хризантемы, розы, герберы); при разведении тропических и субтропических
растений (рододендрона, азалии, камелии, чая и др.); плодовых, также
древесных пород (тополя, ивы, ольхи, березы, рябины, секвойи, туи,
77
можжевельника и др.). Для некоторых сельскохозяйственных культур,
например, картофеля, на основе этого метода созданы промышленные
технологии. При этом из одной меристемы можно получать более 105 растений в
год, причем возможно выращивание в пробирках микроклубней – ценного
безвирусного семенного материала.
Что касается лесных пород, для лиственных (тополя, осины и их гибридов,
ивы,
березы)
разработаны
лабораторные
технологии
клонального
микроразмножения на основе снятия апикального доминирования путем
добавления в питательную среду цитокининов. В этом случае от одного
экспланта в год можно получить в среднем 104…105 растений, а коэффициент
мультипликации одной пазушной почки Populus nigra составляет до 106 растений
в год. Культуру почек используют для размножения эвкалипта, кофе, масличной
пальмы, сосны, вяза, яблони, смородины и других древесных и кустарниковых
пород. Этим методом размножают цитрусовые, но их растения-регенеранты
очень плохо растут на собственных корнях, чтобы они сохранились, их
прививают на нормальные подвои и получают полноценные растения.
Однако следует учитывать, что длительное воздействие на эксплант
цитокининов, входящих в состав питательных сред, может вызвать различного
рода аномалии у растений-регенерантов, в том числе потерю способности к
укоренению, а иногда – гибель растения. Поэтому в случае индукции
адвентивных почек веществами цитокининовой природы нужно стараться
свести до минимума время культивирования эксплантов на среде с гормонами и
чередовать 2-3 цикла получения побегов с их укоренением.
78
Рис. 14. Схема клонального микроразмножения растений методом активации
развития существующих меристем (I путь), индукции возникновения
адвентивных почек на экспланте (II путь): 1 – выбор исходного экспланта;
2 – получение стерильной культуры; 3 – образование адвентивных почек
непосредственно на первичном экспланте; 4 – рост почек и формирование
микропобегов; 5 – размножение микропобегов (черенкование); 6 – рост на
новых средах; 7 – депонирование растений-регенерантов при пониженной
температуре; 8 – перевод растений в тепличные условия; 9 – высадка растенийрегенерантов в почву
79
Второй метод – индукция возникновения адвентивных почек
непосредственно тканями экспланта (рис. 14, II путь). Он основан на
способности изолированных частей растения при соответствующих условиях
культивирования (состав питательной среды) восстанавливать недостающие
органы и, таким образом, регенерировать целые растения. Образования
адвентивных почек можно добиться практически из любых органов и тканей
растения – изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца
луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий). Обязательным условием
индукции адвентивных почек является содержание в питательной среде
цитокинина (чаще всего БАП) или цитокинина и ауксина (ИУК или НУК) в
соотношении 10:1 или 100:1.
Это наиболее распространенный метод клонального микроразмножения
высших растений, особенно широко он используется для получения
посадочного материала многих цветочных культур.
У древесных растений адвентивные почки были индуцированы на
котиледонах сосны обыкновенной, на изолированных зрелых и незрелых
зародышах ели. При массовом размножении растений возможно сочетание двух
методов: индукции адвентивных побегов с последующей активацией их
пазушных меристем.
Процесс формирования адвентивных почек происходит в эпидермальном
и субэпидермальном слоях культивируемого экспланта. Наиболее активной
тканью, способной образовывать почки, каллус или корни (в зависимости от
гормонального баланса питательной среды) является эпидермис. Было показано,
что адвентивные почки могут образовывать и другие ткани: на изолированной
хвое ели обыкновенной адвентивные почки образуются в эпидермальном слое
культивируемого экспланта, в экспериментах с хвоей псевдотсуги – в
субэпидермальных слоях, а при культивировании семядольной хвои сосны
обыкновенной и сосны замечательной – одновременно и в эпидермальных и
субэпидермaльных слоях.
Третий метод, используемый при клональном микроразмножении –
соматический эмбриогенез. В основе его лежит дифференциация из
соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему
внешнему виду напоминают зародыши, возникающие в результате полового
процесса из зиготы, но отличаются от них происхождением – соматические
80
зародыши развиваются асексуально, вне зародышевого мешка.
Соматический эмбриогенез возможно индуцировать непосредственно в
тканях первичного экспланта (прямой эмбриогенез) или же сначала из тканей
экспланта получить каллус, а затем в нем индуцировать образование
эмбриоидов (непрямой эмбриогенез) (рис. 15).
Для клонального микроразмножения предпочтительнее первый способ,
поскольку он позволяет сохранить генетическую стабильность размножаемого
материала. Если используется непрямой эмбриогенез, следует помнить, что
каллусная ткань является генетически гетерогенной и посадочный материал в
этом случае может не быть идентичным растению-донору.
Процесс формирования эмбриоидов in vitro происходит поэтапно.
Каждому этапу соответствует определенный гормональный состав питательной
среды. В начале за счет присутствия в среде ауксина (чаще всего 2,4-Д в
концентрации 1 мг/л) клетки экспланта дифференцируются в эмбриональные.
Уменьшая количество ауксина в питательной среде до 0,1 мг/л или полностью
его исключая из эмбриональных клеток, можно индуцировать эмбриоиды.
Внешне они напоминают биполярные структуры, у которых одновременно
формируются апикальные меристемы стебля и корня. Соматические зародыши
проходят три стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидиую и, в
конечном итоге, развиваются в проросток. Соматические зародыши
представляют собой полностью сформированные растения. Применяя
соответствующие методы, их можно заключить в искусственную оболочку и
получить искусственные семена, которые используются для посева так же, как
обычные семена, являющиеся продуктом полового процесса. Это позволит
сократить затраты, связанные с этапом укоренения и адаптации регенерантов к
условиям in vitro.
Впервые соматический эмбриогенез был индуцирован в тканях моркови в
середине 50-х годов XX века, в настоящее время этот метод используется для
размножения рутовых и орхидных растений, а также злаковых (пшеница,
ячмень), винограда. Среди древесных таким способом можно размножать осину,
эвкалипт, дуб красный и скальный, ель обыкновенную, орех грецкий, липу
обыкновенную и крупнолистую.
Четвертый метод клонального микроразмножения – дифференциация
адвентивных почек в первичнои и пересадочной каллусной культуре.
Рис. 15. Соматический эмбриогенез: 1 – первичный эксплант; 2 – образование каллуса; 2а – формирование глобулярного
проэмбрио; 3, 3а – формирование меристематического очага, стадии развития проэмбрио:4а – глобула; 4б – сердце;
4в – торпеда; 5 – формирование "зародыша"; 6 – искусственные семена; 7 – посев искусственных семян в почву;
8 – растения – регенеранты
81
82
Для получения посадочного материала in vitro этот метод используется
редко, поскольку при длительном культивировании каллуса происходит его
генетическое изменение (структурные перестройки хромосом, генные мутации,
изменяется плоидность клеток, теряется их морфогенетический потенциал).
Тем не менее, метод дифференциации адвентивных почек в первичной и
пересадочной каллусной ткани имеет свои положительные стороны. Прежде
всего, он эффективен – за счет массового образования адвентивных почек из
каллусных клеток можно получить высокий коэффициент мультипликации
(размножения), а в ряде случаев этот метод является единственно возможным
способом размножения растений в культуре. Для селекционеров он
представляет интерес в качестве одного из способов повышения генетического
разнообразия исходного материала как основы для получения новых форм.
Схема клонального микроразмножения растений этим методом показана на
рис. 13 (II). Этот метод применяется, как правило, для растений, каллусная
ткань которых обладает генетической стабильностью, а отклонения между
родительскими формами и растениями-регенерантами, полученными из нее, не
превышают уровня естественной изменчивости. Методом индукции
органогенеза в каллусной ткани можно размножать пшеницу, подсолнечник,
лен, кукурузу, рис, а также ряд декоративных растений (эписцию, драцену,
амариллис).
2.4.2. ТЕХНИКА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ
ТКАНИ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ
КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ
На каждом этапе клонального микроразмножения решается определенная
задача, для выполнения которой необходимо соблюдать соответствующие
условия.
Задачей первого этапа является получение стерильной хорошо растущей
культуры, добиться развития меристем и формирования первичных побегов.
Для освобождения экспланта от микроорганизмов проводят ее
поверхностную стерилизацию, используя различные дезинфицирующие
растворы, подбирая их концентрацию и экспозицию с таким расчетом, чтобы не
причинить вреда растительной ткани.
Чаще всего используют растворы хлорсодержащих (гипохлориты кальция,
83
натрия, хлорамин) и ртутьсодержащих (мертиолят, диацид, сулема) соединений.
После дезинфекции растительную ткань обязательно промывают стерильной
дистиллированной водой, время промывки должно быть таким же, как и время
стерилизации.
На первом этапе культивирования чаще всего используют питательную
среду Мурасиге и Скуга; в зависимости от целей эксперимента добавляют
различные биологически активные вещества (цитокинины, ауксины или
различные их сочетания). Усилить рост эксплантов на этом этапе можно с
помощью антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, глютатиона и др.), их или
вводят в состав питательной среды, или отмывают эксплант в растворе (4...24
часа); иногда положительный эффект оказывает добавление в питательную
среду адсорбента – древесного активированного угля (0,5...4 %).
Продолжительность первого этапа составляет 1-2 месяца.
Целью второго этапа является получение необходимого количества
микропобегов. Для культивирования используют среду Мурасиге и Скуга,
содержащую регуляторы роста. Из цитокининов используют, как правило, БАП
(1…10 мг/л), из ауксинов ИУК и НУК (0,1...0,5 мг/л). На этом этапе важно
учитывать, что при длительном культивировании в присутствии цитокининов
могут
произойти
разного
рода
изменения
растений-регенерантов
(морфологические, цитологические, физиологические). Избежать этого можно,
1 ч и минируя экспланты на средах с минимальным количеством гормонов,
обеспечивающим стабильный коэффициент мультипликации, или же чередуя
циклы культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.
Длительность второго этапа определяется необходимым количеством
микропобегов, минимальная продолжительность этапа 3-4 недели.
Третий этап – укоренение микропобегов, адаптация их к почвенным
условиям. Это наиболее трудоемкий и ответственный этап клонального
микроразмножения, от него зачастую зависит успех всего эксперимента. С
целью индукции корней in vitro меняют состав питательной среды: уменьшают в
два (а иногда и в четыре раза) концентрацию макросолей по прописи Мурасиге и
Скуга (иногда ее заменяют средой Уайта), уменьшают содержание сахарозы в
среде (до 0,5... 1 %), полностью исключают цитокинины. В качестве индуктора
корнеобразования используют ауксины (ИМК, ИУК, НУК): их или добавляют в
среду и культивируют на ней побеги в течение 3-4 недель, или выдерживают
84
побеги в стерильном растворе ауксина, а затем высаживают их на
безгормональную среду, где происходит корнеобразование.
Существует метод укоренения микропобегов в условиях гидропоники, он
позволяет упростить этап укоренения и сразу получать растения,
клишированные к естественным условиям.
Четвертый этап клонального микроразмножения – выращивание
р а с т е н и й в условиях теплицы, перевод их в открытый грунт, подготовка к
реализации. Эту работу проводят весной или в начале лета. Растениярегенеранты с хорошо развитой корневой системой вынимают из культуральных
сосудов, отмывают корневую систему от остатков агара, высаживают в почву.
Состав субстрата для каждого вида культивируемых растений подбирается
индивидуально, перед использованием его стерилизуют при 85...90 °С в течение
1-2 ч, раскладывают в горшочки и помещают их в мини-теплицы при
постоянной температуре (20...25 °С), освещенности (до 5 тыс. лк), влажности
(65...90 %), создают условия искусственного тумана. Через 20-30 дней после
посадки укоренившиеся растения подкармливают раствором минеральных
солей, состав которого зависит от вида выращиваемых растений.
Адаптация пробирочных растений к условиям in vivo происходит очень
сложно. На этом этапе возможна потеря растений. У пробирочных растений
нарушена работа устьиц, поэтому in vivo они потребляют большое количество
воды, кроме того, in vitro очень часто не образуются корневые волоски, в связи с
чем нарушается поглощение воды и минеральных солей из почвы. Чтобы
устранить эти явления, на третьем и четвертом этапах для микотрофных
растений (к числу которых относится большинство древесных пород)
применяют искусственную микоризацию растений – инокулируют корни
растений-регенерантов мицелием микоризообразующих грибов (маслята,
подберезовики, подосиновики, рыжики и др.). Этот прием можно осуществлять
как in vitro, так и in vivo. Первый подход предпочтительнее, поскольку в этом
случае можно контролировать условия культивирования (свет, температура,
влажность, pH, аэрация) и подбирать состав субстрата, обеспечивающий
нормальное формирование микоризы. В результате такого приема улучшается
снабжение растений азотом, в 1,5-2 раза увеличивается приживаемость после
пересадки в почву, повышается прирост надземной биомассы. Положительные
85
результаты были получены при микоризации березы, ольхи, лоха, эвкалипта,
каштана, сосны.
С целью снижения транспирации у растений-регенерантов их листья в
течение всего периода акклиматизации можно опрыскивать 50 %-м водным
раствором глицерина или смесью парафина в диэтиловом спирте (1:1). Такой
прием заметно повышает приживаемость пробирочных растений в почвенных
условиях.
Начинать адаптацию пробирочных растений к условиям открытого грунта
можно уже на третьем этапе клонального микроразмножения. Для этого с тех
пробирок, в которых растения достигают пробки, снимают крышки и оставляют
их в таком состоянии на 1,5...2 недели. За это время растение вырастает и над
краем пробирки появляется его верхушка с развитыми листочками. Растение
переносят в почвенный субстрат, заглубляя его так, чтобы над поверхностью
оставался стебель с 1-2 хорошо развитыми листьями. Этот способ широко
используется для адаптации пробирочных растений винограда.
2.4.3. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПРОЦЕСС КЛОНАЛЬНОГО
МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ
На успех клонального микроразмножения влияют генетические,
физиологические, гормональные и физические факторы.
Большое значение имеет генотип исходного растения. Экспериментально
доказано, что по способности к индукции заложения адвентивных почек, росту
побегов, укоренению, лидируют двудольные травянистые растения. У
однодольных травянистых морфогенетические потенции несколько ниже, а
древесные растения в этом ряду занимают последнюю позицию.
Реализация
морфогенетического
потенциала
при
клональном
микроразмножении зависит также от родоных и сортовых особенностей
исходных эксплантов. Как правило, виды и сорта, хорошо размножающиеся
вегетативным путем in vivo, проявляют высокую регенерационную способность
и в культуре тканей. Среди древесных пород родовая специфика при
размножении in vitro особенно наглядно проявляется у хвойных. Так, при
одинаковых условиях культивирования изолированных зародышей различных
видов сосны (замечательной, желтой, приморской) и ели (обыкновенной,
колючей) образование адвентивных почек у всех видов сосны было выше, чем у
86
видов ели, соответственно 20...30 % и 10 %. Сортовая специфика проявляется,
как правило, на стадии укоренения микропобегов. Так, для определенных сортов
черной смородины и вишни характерна стабильно высокая укореняемость in
vitro.
Большое значение для реализации морфогенетической способности
растений имеет и физиологический возраст экспланта. Ткани проростков семян
обладают более высоким морфогенетическим потенциалом, чем взрослые ткани
этих же растений. Из одного изолированного зародыша семян лиственных пород
за год можно получить 10...100 тыс. растений, тогда как в случае
культивирования их меристем эти цифры уменьшаются на 1-2 порядка.
Для лесохозяйственного производства является актуальным размножение
древесных растений в возрасте старше 20 лет, когда можно оценить их
хозяйственные признаки. Однако размножение таких деревьев in vitro
представляет большие трудности, обусловленные как накоплением
микроорганизмов во внутренних тканях, что затрудняет получение асептических
культур, так и возрастным снижением морфогенетического потенциала
растительных тканей, что уменьшает их жизнеспособность in vitro.
Возрастной барьер можно преодолеть, путем реювенилизации
(омоложения) растений. Ее осуществляют как in vivo, так и in vitro. В первом
случае проводят частую подрезку деревьев с целью стимуляции роста молодых
побегов непосредственно от ствола или от корней (образование корневых
отпрысков), повторную прививку; повторное черенкование. Кроме того,
предложена технология реювенилизации, на основе многократной обработки
дерева или отдельных его ветвей раствором цитокининов (БАП, кинетин), что
стимулирует образование многочисленных адвентивных ночек, развивающихся
в побеги. Реювенильные побеги по морфологическим характеристикам сходны с
молодыми особями, поэтому их меристематические ткани ввести в культуру
гораздо легче.
Омоложению тканей in vitro способствует частое их субкультивирование.
Так, пересадка 1 раз в 10 дней и длительное субкультивирование
эксплантов винограда, взятых от взрослого растения, привело к образованию у
них усиков, наличие которых является признаком ювенильности.
Большое значение для клонального размножения имеет и время (сезон)
изоляции экспланта. Экспланты, введенные в культуру в фазу активного роста,
87
обычно образуют большее количество хорошо развивающихся и
укореняющихся побегов по сравнению с эксплантами, изолированными в фазу
покоя.
Немаловажным фактором, влияющим на размножение растений in vitro,
является размер экспланта. Чем меньше эксплант, тем ниже его
регенерационная способность. Крупные экспланты, состоящие из паренхимы,
проводящей ткани и камбия, могут спонтанно (за счет эндогенных гормонов)
образовывать почки, независимо от соотношения ауксинов и цитокининов в
среде, но в то же время увеличивается вероятность появления в его клетках
различной инфекции. Оптимальной является такая величина экспланта, которая
обеспечивает как активный морфогенез, так и полную стерильность культуры;
она зависит от видовых особенностей растения-донора, а также от свойств
органа, выбранного в качестве экспланта.
Расположение изолированных почек на побеге растения-донора также
влияет на эффективность клонального микроразмножения. Причем,
оптимальный вариант их локализации различается для разных растений. Так, в
эксперименте с крыжовником наибольший морфогенетический потенциал
проявили три верхние почки побега, а у спаржи – почки в нижней части побега.
Одним из основных факторов, определяющих успех клонального
размножения in vitro, является правильный подбор питательной среды. Ее
химический (в том числе гормональный) состав и физические свойства должны
соответствовать задачам каждого этапа клонального размножения.
Соотношение гормонов в питательной среде является определяющим фактором
клонального микроразмножения. При преобладании цитокининов над
ауксинами происходит развитие пазушных меристем, обратное соотношение
гормонов стимулирует корнеобразование, равное содержание ауксинов и
цитокининов индуцирует каллусогенез.
Минеральный и углеводный компонент питательной среды также
оказывает существенное влияние на клональное микроразмножение.
Предпочтение отдается среде Мурасиге и Скуга; для культивирования
древесных растений используют также среды ВТМ и WPM, различающиеся
соотношением аммонийного и нитратного азота.
В экспериментах с глоксинией превышение нормы содержания
нитратного азота и сахарозы индуцировало образование вегетативных почек,
88
снижение концентрации этих веществ стимулировало образование цветочных
почек. В качестве источника углеродного питания на всех этапах клонального
микроразмножения обычно используют сахарозу в количестве 30 г/л, но не
всегда такая концентрация является оптимальной. Так, для изолированных
зародышей ели обыкновенной оптимальная концентрация сахарозы в
питательной среде 5...10 г/л, в этом случае наблюдается стимулирование
образования адвентивных почек и их дальнейшего развития.
Обязательным компонентом питательных сред для клонального
микроразмножения являются биологически активные вещества негормональной
природы (витамины, аминокислоты, различные растительные экстракты). Их
роль особенно важна для образования каллуса, поскольку каллусные ткани не
способны к синтезу биологически активных веществ. Обычно применяют
тиамин и инозит. Потребности эксплантов в других витаминах пока остаются
неясными, однако, превышение нормы этих веществ в среде может привести к
угнетению роста и даже к гибели растений.
Использование гормонов, витаминов подбор минеральных солей
осуществляются с учетом видовых, сортовых и физиологических особенностей
растений в зависимости от конкретных морфогенетических реакций,
индуцируемых в эксперименте.
На успех клонального микроразмножения влияют физические факторы:
консистенция питательной среды, ее кислотность, а также освещенность и
температура.
Культивируют экспланты обычно на агаризованных или жидких
питательных средах. Последние часто, но не всегда, имеют определенные
преимущества, поскольку в них обеспечивается большая подвижность
элементов питания, кроме того, жидкие среды можно менять в процессе
культивирования (частично или полностью). Однако этот способ требует
специального оборудования, часто при таком выращивании эксплантов
наблюдается аномальное развитие побегов. В большинстве экспериментов
используют твердые (агаризованные) среды, условия питания эксплантов в этом
случае несколько хуже, чем на жидких средах, поэтому необходима частая
пересадка эксплантов.
Для роста и развития растений in vitro большое значение имеет
кислотность среды, определяющая доступность для эксплантов питательных
89
веществ. Оптимальными показателями кислотности, как правило, являются
значения pH в пределах 5,6...5,8. При работе с конкретными растениями
учитываются условия их естественного произрастания; так, для ели
обыкновенной оптимальный pH среды in vitro составляет 5,2...5,6, что
соответствует уровню кислотности почв в естественных условиях
произрастания этой породы.
Для культивирования эсплантов очень важны условия освещения. Обычно
in vitro растения выращивают при освещении люминесцентными лампами с
учетом требований материнского растения к интенсивности освещения и
длительности фотопериода. На первых двух этапах размножения оптимальная
интенсивность освещения для большинства растений составляет 1000...3000 лк.
Продолжительность освещения обычно составляет 16 часов в сутки. В
некоторых экспериментах применяют чередование коротких периодов темноты
с последующим продолжительным освещением. Характер роста изолированных
растений и его интенсивность зависят от спектрального состава света. Так, в
экспериментах с березой установлено, что красный свет стимулирует активацию
меристем и укоренение микропобегов, белый несколько замедляет укоренение,
синий – снижает его на половину, в темноте – укоренение еще ниже. Красный
свет активирует ИУК, содержащуюся в среде культивирования, и тем самым
ускоряет процесс корнеобразования и повышает интенсивность роста побегов.
Синий свет увеличивает содержание цитокининов в тканях растений, что
стимулирует образование побегов.
При подготовке растений к переносу в почву интенсивность освещения
повышают до 10 тыс. лк. В этом случае высокая интенсивность света может
задерживать рост растений и вызывать на листьях небольшие хлорозы, однако
при переводе в почву такие растения чувствуют себя значительно лучше и
растут интенсивнее, чем те, которые не прошли предварительной адаптации к
высокой интенсивности света.
Большое влияние на рост и регенерацию растений in vitro оказывает
температура, поскольку каждый метаболический процесс имеет свой
температурный оптимум. При этом должны учитываться условия естественного
произрастания: для тропических растений оптимальная температура
выращивания приближается к 27 °С, растения альпийских лугов лучше
культивировать при 18...20 °С, большинство других – при 25 °С. В начале
90
культивирования с целью повышения жизнеспособности эксплантов иногда
используют более низкие температуры: некоторым видам бегонии, например,
для индукции образования побегов в течение двух недель необходима
температура 15... 18 °С.
Относительная влажность воздуха при выращивании растений in vitro
обычно поддерживается на уровне 60...70 %. При пересадке в почву
пробирочные растения особенно нуждаются в повышенной влажности, что
достигается созданием в минитеплицах условий “мелкокапельного тумана”.
Основным правилом при культивировании растений in vitro является
индивидуальный подбор условий выращивания для каждого вида с учетом
особенностей его естественного произрастания.
2.4.4. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА
При размножении селекционных форм посадочный материал должен быть
свободен от вирусов, бактерий и других микроорганизмов. Освобождение
посадочного материала от инфекции особенно важно в том случае, когда
растения в дальнейшем планируется размножать вегетативно традиционными
методами (черенкование, прививки), поскольку в этом случае инфекция может
передаваться потомству через соматические ткани. Культивирование in vitro
изолированных верхушечных меристем позволяет получать и ускоренно
размножать здоровый посадочный материал многих видов растений.
В тканях растения, пораженного вирусной инфекцией, количество вирусов
снижается по мере приближения к конусу нарастания, а сами меристемы, как
правило, свободны от инфекции. Этот факт лежит в основе метода оздоровления
клонируемого материала путем регенерации растений из меристематических
тканей верхушечных и пазушных почек. Таким способом освобождают от
вирусов картофель, табак, декоративные, плодово-ягодные культуры.
Этот метод особенно эффективен для культур с коротким циклом
выращивания – полученный оздоровленный материал не успевает вновь
инфицироваться. Так, картофель в производстве остается здоровым в течение
года, земляника – 4-х лет. Кроме того, освобожденные от вирусов растениярегенеранты в дальнейшем дают более высокие урожаи.
Размеры меристематической зоны, свободной от вирусных частиц,
различаются для разных видов и сортов растений. Так, культивирование
91
апикальной меристемы картофеля величиной 0,2 мм и дальнейшее получение из
нее растений-регенерантов показали, что часть их все-таки поражена вирусом.
Размер меристематической зоны свободной от вирусной инфекции, зачастую
слишком мал, для того чтобы обеспечить индукцию морфологических реакций
экспланта. Для получения здорового посадочного материала применяют ряд
дополнительных приемов, в частности, термо- и хемотерапию исходных
растений, это позволяет значительно увеличить выход здоровых растений.
В случае термотерапии целые растения или их отдельные органы
подвергают воздействию повышенной температуры (от 25 до 37 °С). Их
помещают в специальные термокамеры, где в течение недели температуру
ежедневно увеличивают на 2 °С. При этом очень важно поддерживать в
термокамере оптимальный режим освещенности и влажности (с учетом видовой
принадлежности растения). Под воздействием высоких температур разрушается
белковая оболочка вирусных частиц и снижается их вирулентность, кроме того,
повышается метаболизм самого растения, что способствует активизации его
защитных механизмов.
Продолжительность термотерапии зависит от термостойкости вирусов и
особенностей самого растения. Так, возбудители вирусных болезней гвоздики
погибают после 10-12-недельного воздействия теплом, а возбудители болезней
хризантем – через 12 и более недель.
Применение термотерапии увеличивает коэффициент размножения и
ристемных культур на 50...60 % и повышает адаптацию пробирочных растенийрегенератов к почвенным условиям. Сочетание метода культуры меристем с
термотерапией позволило получить 70 %-ный выход здоровых растенийрегенерантов хмеля, 90 %-ный земляники, 25 %-ный черной и красной
смородины, 50 %-ный малины, более чем 80 %-ный картофеля. Действие
высоких температур оказывает положительное влияние на процессы
морфогенеза эксплантов. Однако у некоторых растений (луковичные, розы и др.)
в результате длительной термотерапии in vivo рост угнетается, для них
целесообразно проводить термотерапию регенерантов in vitro.
После термотерапии растения проверяют на наличие вирусов, используя
методы иммуноферментного анализа, электронной микроскопии и тесты на
гривянистых растениях-индикаторах.
Хемотерапия заключается в добавлении в среду культивирования
92
противовирусных препаратов широкого спектра действия, например,
«Вирозола» (20...50 мг/л). Процент безвирусных растений-регенрантов в этом
случае значительно возрастает по сравнению с контролем. Хемотерапия
применяется и дает положительные результаты при культивировании меристем
сливы, черешни, малины, ряда цветочных растений.
Использование термо- и хемотерапии не всегда оправдано как
экономически, так и с точки зрения сохранности растений после проводимых с
ними манипуляций, поэтому большие надежды возлагаются на трансгенные
растения, имеющие ген устойчивости к вирусам.
2.4.5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО
МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ
В настоящее время во многих развитых странах мира клональное
микроразмножение представляет собой коммерческую биоиндустрию, которая
поставляет посадочный материал как для своих стран, так и на экспорт, однако,
потребности мирового рынка в такой продукции удовлетворены лишь на уровне
20 %.
За рубежом в больших объемах размножают тропические и
субтропические виды растений, плодовые, древесные (тополь, иву, березу, дуб,
тую, можжевельник, секвойю). Широко и успешно этот метод используется в
цветоводстве и плодоводстве. Так, Голландия является ведущим
производителем оздоровленного посадочного материала цветочных культур, во
Франции 94 % всей продукции цветочных культур получена с помощью методов
культуры изолированных тканей. Италия поставляет на мировой рынок
ежегодно до 250-500 тыс. оздоровленных подвоев фруктовых деревьев (яблони,
сливы, персики). В Германии с использованием методов клонального
микроразмножения выращивают тополя, в Финляндии – березу. В США около
100 биотехнологических предприятий поставили на поток производство
посадочного материала декоративных, овощных, полевых, плодовых и лесных
культур методом клонального микроразмножения.
Широкое коммерческое применение этот метод получил в декоративном
цветоводстве. На промышленную основу поставлены работы по оздоровлению и
клональному микроразмножению селекционных сортов гвоздики, герберы,
93
хризантемы, пеларгонии, бегонии, ириса, гиацинта, фрезии, гладиолуса, лилии;
растений семейства орхидных. В последнем случае коэффициент
мультипликации за 9 месяцев размножения достигает одного биллиона. Это
сделало орхидные, несмотря на сложности выращивания, самой экономически
выгодной среди декоративных культур.
В России и странах ближнего зарубежья также ведутся работы по
клональному микроразмножению декоративных, плодовых, ягодных, овощных,
кормовых культур и древесных пород. Ускоренное размножение винограда, на
основе этого метода, позволяют ученым Крыма получать из одного
одноглазкового черенка в течение 4-х месяцев 8 тыс. растений-регенерантов.
Использование культуры меристем в сочетании с методами хемотерапии
легло в основу технологий получения оздоровленного посадочного материала
малины и повысило продуктивность посадок этой культуры в 6-8 раз.
В специализированных цветоводческих хозяйствах России и Украины с
помощью культуры меристем получают и размножают безвирусный посадочный
материал гвоздик, хризантем, роз, бегоний. В промышленном масштабе метод
клонального микроразмножеиия применяется для выращивания картофеля. В
нашей стране он используется в основном для оздоровления посадочного
материала, закладки супер-супер элитных маточников и для оптимизации и
ускорения селекционного процесса. К сожалению, до сих пор не решена
проблема клонального микроразмножения ряда древесных пород: дуба, бука,
орехоплодных, многих хвойных пород, ткани которых с возрастом быстро
теряют регенерационную способность. Для них положительные результаты
получены преимущественно на ювенильном или на омоложенном материале.
В последнее десятилетие в мире разрабатываются технологии клонального
микроразмножения методом соматического эмбриогенеза. Работы в этом
направлении ведутся во Франции, США, Канаде, Японии. Уже получены
положительные результаты для дуба скального и красного, липы обыкновенной
и крупнолистной, ореха грецкого, ели черной. Найдены подходы к размножению
этим способом лиственницы европейской, ели европейской, псевдотсуги
тиссолистной. Однако в этих технологиях используется ювенильный материал
(зрелые и недозрелые зародыши), что является их главным недостатком.
Для организации и содержания лаборатории по микроклональному
размножению
необходимы
значительные
капиталовложения,
94
высококвалифицированные исполнители; кроме того, определенные технические
трудности, недостаток теоретического обоснования, закономерностей процессов
регенерации in vitro, низкая воспроизводимость, результат опытов, значительные
различия генотипических реакций сдерживают масштабы развития этих методов.
Дальнейшее совершенствование приемов клонального микроразмножения
растений в культуре in vitro позволит в будущем эффективно применять этот
метод для размножения большого числа растений.
2.5. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ
В СЕЛЕКЦИИ КАК ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
2.5.1. ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДОВ IN VITRO
Гаплоидами называются ядра, клетки, организмы с одинарным набором
хромосом, представляющим половину полного набора, свойственному данному
виду (обозначается символом n).
У гаплоидных растений нарушен процесс формирования гамет, поэтому
они, как правило, стерильны, кроме того, такие растения отличаются низкой
жизнеспособностью. Однако с помощью колхицина можно искусственно
удвоить набор хромосом и получить жизнеспособные диплоидные
гомозиготные растения, которые могут быть использованы в селекционном
процессе: на их основе создаются стабильные гомозиготные линии,
использующиеся в опытах по мутагенезу для отбора рецессивных мутаций.
Роль гаплоидов особенно значима в лесной селекции. Деревья имеют
длительный онтогенез, а использование стабильных гомозиготных линий,
полученных на основе гаплоидов, позволяет в несколько раз сократить период
создания ценных гибридов и сортов.
Гомозиготные линии представляют собой наследственно однородные
организмы, в потомстве которых не происходит расщепления признаков,
поскольку их гомологичные хромосомы несут идентичные аллели того или
иного гена. Гомозиготы получаются в результате близкородственного
скрещивания (инбридинга); так, самоопыляющиеся растения практически всегда
гомозиготны. Такие линии используются как для решения некоторых
теоретических вопросов наследственности, при изучении мутаций, так и для
95
практических целей – получения эффекта гетерозиса, создания и поддержания
генетических коллекций.
В норме диплоидные организмы гетерозиготны, два гена различаются
(Аа), фенотипически проявляется действие только доминантного гена (А).
Мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах,
чаще они бывают рециссивными, поэтому выявить их довольно сложно.
Использование гаплоидных растений позволяет определить такие мутации.
Для сохранения ценных свойств линий и сортов необходима
гомозиготность по аллелям, определяющим эти свойства. Гомозиготы
используются для получения эффекта гетерозиса – когда гибриды первого
поколения по ряду признаков и свойств превосходят родительские формы.
Гаплоидные растения могут служить основой для создания гомозигот.
В природе гаплоиды могут возникать при отдаленной гибридизации: в
зиготе отдаленного гибрида хромосомы одного вида (как правило,
дикорастущего) не развиваются (элиминируют), что приводит к развитию
гаплоидного организма. Так были получены гаплоиды картофеля, ячменя и
пшеницы. Возможно и спонтанное возникновение гаплоидов, но частота их
появления очень мала (105 ...106).
Разработаны методики получения гаплоидных растений искусственным
путем с применением клеточных технологий: из изолированных пыльников и
микроспор (андрогенез); изолированных семяпочек (гиногенез), и гибридного
зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны
отцовские хромосомы (партеногенез).
Гаплоиды, полученные in vitro, могут использоваться не только для
практической селекции, они являются ценным объектом в экспериментах по
клеточной селекции и генетической инженерии.
В случае андрогенеза из изолированных пыльников гаплоидные растения
получают двумя способами: культивированием суспензии пыльцевых зерен и
выращиванием микроспор.
При первом подходе суспензию пыльцевых зерен помещают на
поверхность фильтра, смоченного питательной средой и лежащего на
пыльниках, которые играют роль "няньки". В этом случае можно получать
отдельные гаплоидные клеточные клоны, при этом сохраняется регулирующее
действие соматической ткани пыльников. При втором подходе микроспоры для
96
культивирования
получают
последовательным
фильтрованием
и
центрифугированием гомогената пыльников. Ресуспендированные в жидкой
среде микроспоры высевают на поверхность агаризованной среды. Этот способ
позволяет культивировать только репродуктивные ткани и полностью исключает
влияние соматических тканей на процесс андрогенеза. У видов, имеющих
крупные пыльники (например, картофель), суспензию микроспор можно
получать без гомогенизирования пыльников, непосредственно выдавливая их
содержимое в жидкую среду с осмотически активным веществом.
При использовании обоих подходов возможны два пути формирования
гаплоидных растений: индукция регенерантов непосредственно из пыльцевых
зерен или с образованием каллусной ткани и последующим морфогенезом.
В первом случае внутри изолированных пыльников при помещении их на
питательную среду из отдельных пыльцевых зерен при определенных условиях
культивирования развиваются
эмбриоиды
(соматические
зародыши),
впоследствии дающие начало гаплоидным растениям. Во втором случае
репродуктивные клетки дедифференцируются, делятся, образуя каллусную
ткань, в которой индуцируется органогенез и регенерируются растения. Таким
способом были получены растения ячменя и риса.
Каллусные ткани, возникшие из пыльников, не всегда способны к
морфогенезу, кроме того, часто в результате полиплоидизации гаплоидных
каллусов растения-регенеранты могут быть гетерозиготными и разных уровней
плоидности (диплоидными, полиплоидными, анеуплоидными). Прямой
эмбриогенез из микроспор является более перспективным и предпочтительным.
На процесс формирования соматических зародышей из пыльников
существенное влияние оказывает целый ряд факторов, наиболее важными среди
них являются следующие:
– генетические особенности растения-донора (индивидуальные его
характеристики); так, при культивировании пыльников некоторых видов или
линий индуцировать эмбриогенез не удавалось ни при каких условиях, то есть
способность этих растений к эмбриогенезу не была определена генетически;
– возраст и физиологическое состояние исходного растения в момент
эксплантации пыльников; сезон, когда проводится эксперимент – позднее
цветение или цветение в неблагоприятных условиях (например, зимой в
теплице) снижает число эмбриогенньх пыльников;
97
– стадия онтогенеза пыльцы, на которой проведена эксплантация –
наибольшей способностью к эмбриогенезу обладают молодые одноядерные
микроспоры;
– условия культивирования – температурный фактор и гормональный
состав среды.
Стимулирующее влияние на андрогенез оказывает температурные шоки.
Так, воздействие на бутон температуры 3-5 °С в течение 48-72 часов повышает
количество эмбриогенных пыльников. Длительное влияние повышенной
температуры также стимулирует эмбриогенез. Очень хорошие результаты были
получены в эксперименте, где сочетали воздействие повышенной и пониженной
температуры.
На скорость течения андрогенеза влияет гормональный состав среды, при
этом, действие гормонов фазоспецифично. Высокие концентрации гормонов на
стадии мейоза усиливают каллусогенез, а на стадии однядерных микроспор –
эмбриогенез.
Впервые эмбриоиды были получены в культуре пыльников Datura
(дурман) индийскими исследователями Гуха и Магешвари в 1964 г. С тех пор
этот метод развивается в двух направлениях: оптимизация условий
культивирования с целью их практического использования (массовое получение
гаплоидов) и для решения теоретических проблем (изучение in vitro на
модельных объектах закономерностей течения андрогенеза).
В настоящее время насчитывается около 200 видов растений, для которых
получены гаплоиды. В основном это злаковые, пасленовые, крестоцветные;
среди древесных – яблоня, вишня, персик, актинидия, ива, шелковица,
некоторые цитрусовые.
Гаплоидные растения используются не только в генетико-селекционной
работе и для быстрого получения чистых линий, из них можно получать
отдельные гаплоидные клетки и протопласты, которые используются для
изучения генетических и биохимических особенностей соматических клеток
растений.
Проблема получения гаплоидных клеток и растений до конца еще не
решена и целый ряд актуальных теоретических вопросов андрогенеза in vitro
требует дальнейшего изучения. Это прежде всего:
– выяснение условий для реализации тотипотентности микроспор;
98
– выявления связи между микроспорогенезом in vivo и способностью к
эмбриогенезу in vitro;
– изучение взаимодействия соматических и репродуктивных клеток при
индукции эмбриогенеза;
– методы отбора изогенных диплоидов из популяции андрогенных
растений.
Гаплоиды могут быть получены и в результате культивирования
неоплодотворенных семяпочек (гиногенез). В этом случае регенерируют
женские растения, свободные от нежелательных генов, передающихся по
мужской линии.
Гиногенез может идти двумя путями: прямым (через эмбриогенез) и
непрямым (через каллусообразование и последующую дифференцировку –
органогенез). На практике гиногенез используется реже, чем андрогенез.
Техника культивирования изолированных семяпочек была разработана сначала
для ячменя, а сейчас успешно применяется для получения гаплоидов сахарной
свеклы, подсолнечника, картофеля, риса, пшеницы, кукурузы. Частота
образования гаплоидов в случае гиногенеза очень мала: например, у сахарной
свеклы 2 растения на 1000. Гиногенетические зародыши проходят стадии,
аналогичные стадиям формирования зародыша при половом развитии. Отличие
заключается в формировании частей семени: при гиногенезе у зародыша не
образуется эндосперм и отсутствует период покоя, свойственный семенам.
Иногда при отдаленной гибридизации во время оплодотворения
яйцеклетки из-за несовместимости хромосом родителей отцовские хромосомы
могут элиминировать (разрушаться) и развивающийся зародыш оказывается
гаплоидным, содержащим только материнские гены (партеногенез), но
вырастить такой зародыш до нормального растения можно только in vitro,
методом эмбиокультуры, при этом формируется гаплоидное растение. Такой
зародыш называют еще “бульбозум” – от латинской транскрипции названия
дикого ячменя (Hordeum bulbosum), у которого впервые были получены
гаплоидные зародыши. Путем комбинации партеногенетического метода с
культурой изолированных зародышей за 4 года (вместо 10... 12 лет при
использовании традиционных технологий) были получены новые сорта ячменя.
С помощью гаплоидов, получаемых различными способами in vitro,
можно довольно быстро создавать гомозиготные линии, что делает эту
99
технологию весьма привлекательной для селекционеров, особенно в
экспериментах с растениями, имеющими длительный онтогенез. Гаплоидность
полученных
растений
обязательно
должна
быть
подтверждена
цитологическими, генетическими и морфологическими анализами.
2.5.2. ПРЕОДОЛЕНИЕ ПРОГАМНОЙ НЕСОВМЕСТИМОСТИ
Прогамная несовместимость проявляется в том случае, когда в
естественных условиях невозможно осуществить оплодотворение между
выбранными парами. В основе этого явления лежат особенности исходных
растений:
– морфологические – несоответствие длины пыльцевой трубки длине
столбика пестика, в результате чего она не достигает семяпочки (гетеростилия);
– генетические – несоответствие секрета рыльца пестика и пыльцы, в
результате чего пыльца не способна прорастать на рыльцах и оплодотворение не
происходит;
– физиологические – несоответствие во времени созревания пыльцы;
– тканевая несовместимость партнеров, что может привести к остановке
роста пыльцевой трубки в любой момент ее прорастания;
Преодолеть эти явления можно, проводя оплодотворение in vitro,
используя при этом два приема:
а) асептически изолированные завязи помещают на питательную среду,
а пыльцу переносят на поверхность вскрытых семяпочек; в случае
оплодотворения на питательной среде образуются зародыши;
б)
совместная культура пыльцы и неоплодотворенной семяпочки:
завязь искрывают и на питательную среду переносят кусочки плаценты с
семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты
культивируют пыльцу. Визуально оплодотворение определяют по быстро
увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как
привило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало
гибридному растению.
Оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в
скрещивании сортов культурного табака с дикими видами и сделало возможным
получение межвидовых гибридов этой ценной технической культуры.
100
2.5.3. ПРЕОДОЛЕНИЕ ПОСТГАМНОЙ НЕСОВМЕСТИМОСТИ
Постгамная несовместимость возникает при отдаленной гибридизации
после оплодотворения и выражается в формировании неполноценных, щуплых
семян с низкой всхожестью. Причина этого явления – расхождение во времени
развития гибридного зародыша и эндосперма (окружающей его ткани). В таких
случаях зародыш извлекают из семени и выращивают in vitro на питательной
среде методом эмбриокультуры. При этом можно использовать незрелые и
зрелые зародыши.
Определяющим моментом культивирования зародышей является
правильно подобранная питательная среда. Если зародыш незрелый, для его
роста необходима питательная среда с повышенным содержанием сахарозы,
включающая в свой состав также аминокислоты, витамины, гормоны. На более
поздних этапах культивирования можно использовать питательную среду
обычного состава, здесь главной задачей становится подбор условий
культивирования (температуры, влажности, освещенности, длительности
фотопериода). Зрелые зародыши культивируются чаще всего на простых по
составу безгормональных средах. Для эмбриокультуры очень важно воздействие
на нее низкими температурами, особенно для растений, семена которых для
прорастания нуждаются в стратификации (плодовые культуры, лесные породы).
Аллотриплоидный тополь Хоперский 1 скрещивали с тополем канадским.
Известно, что триплоиды не могут давать нормальные семена, однако были
получены недоразвитые незрелые семена, при освобождении их от кожуры и
посеве на питательную среду часть из них дали проростки, но все они были
миксоплоиды.
2.5.4. РАЗМНОЖЕНИЕ ОТДАЛЕННЫХ ГИБРИДОВ
Для размножения ценных гибридов в качестве вспомогательного
используют метод эмбриокультуры, начиная процесс размножения на стадии
зародыша, при этом используют три способа:
– прорастание гибридного зародыша, формирование растения и его
укоренение (безгормональная среда);
– индукция адвентивных почек и развитие побегов из тканей гибридного
101
зародыша (в питательной среде преобладают цитокинины);
– образование каллуса из тканей гибридного зародыша (ауксины и
цитокинины в питательной среде находятся в равном соотношении) с
последующей индукцией в нем адвентивных почек и развитием из них побегов.
В первом случае выход растений будет очень низкий, зачастую они
оказываются стерильными; второй и третий способы позволяют получить
достаточно большое количество гибридного материала. Во всех трех случаях
индуцированные микропобеги можно либо сразу укоренять, либо
дополнительно размножать микрочеренкованием.
Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать
ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла, она широко
используется для размножения отдаленных гибридов зерновых, злаковых,
овощных культур, плодовых растений (вишни, черешни, персика, абрикоса,
моравской рябины, хурмы, мандарина, гибридов абрикос х персик, алыча х терн,
черешня х вишня), а также лесных пород (дуба, тополя, осины, ели, сосны).
Кроме того, эмбриокультуру можно использовать в клеточной селекции.
Применение этого метода сокращает длительность селекционного
процесса, включение его в систему селекции основных лесообразующих пород
(сосна обыкновенная, ель обыкновенная), позволяет ускорить получение ценного селекционного материала примерно в 3,5-4 раза.
Если из гибридных семян с помощью эмбриокультуры удалось получить
растения из неполноценных зародышей, чтобы сохранить их и размножить,
используют методы клонального микроразмножения: активацию изолированных
меристем и индукцию адвентивных почек непосредственно тканями экспланта
(или их сочетание), которые позволяют за сравнительно короткий срок получить
достаточное количество однородного посадочного материала ценных гибридных
форм.
2.5.5. СОХРАНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Устойчивость любого сообщества живых организмов определяется
уровнем биоразнообразия (то есть числом составляющих его видов), что
является основой стабильности жизни на планете. Прирост населения требует
повышенной продуктивности от сельского хозяйства и лесного производства,
102
что может быть обеспечено получением новых форм и сортов растений. Однако
результатом селекции является снижение естественного генетического
разнообразия, поскольку в конечном итоге размножают лишь единичные
отобранные экземпляры, свойства которых на данный момент являются
наиболее
предпочтительными.
Искусственно
созданные
генетически
однородные популяции весьма уязвимы в отношении устойчивости и
адаптивности к неблагоприятным биотическим и абиотическим факторам,
поэтому при ведении селекционного процесса очень важно сохранять дикие
формы растений как в естественных популяциях, так и в искусственно
созданных: они являются природным компонентом, носителем уникальных
генетических систем, которые могут быть использованы в случае изменения
направления селекции.
Повышение
рекреационной
нагрузки
(расширение
городов,
сельхозугодий, вырубка лесов), ухудшение экологической ситуации ведет к
вытеснению диких видов, некоторые из них находятся на грани вымирания.
Хозяйственная деятельность человека кардинально изменяет условия
естественньгх мест обитания растений: создание монокультур провоцирует
эпифитотии и эпизоотии, при проведении рубок выбирают значительное
количество высоко и прямоствольных экземпляров, лесные пожары уничтожают
сотни гектаров насаждений. Эксплуатация лесных ресурсов приводит к
сокращению разнообразия древесной растительности, что влечет за собой
снижение генетического потенциала природных популяций лесных древесных
растений, ослабление устойчивости и продуктивности последующих поколений
леса, потере ценных генов и генных комплексов, а главное – существенно
снижает возможности генетического улучшения искусственных лесных
биоценозов в будущем. Генофонд древесных пород является базой для лесной
генетики, селекции и семеноводства, основной задачей которых является
повышение продуктивности лесов и обогащение их качественного состава, а
также длительное поддержание и изучение выдающихся по биологической
продуктивности и другим показателям лесных биогеоценозов. Поэтому в
настоящее время сохранение генофонда естественных популяций является
приоритетным направлением в системе природоохранительных мероприятий.
Термин генофонд введен в научную литературу в 1928 г.
А.С. Серебровским – это совокупность генов, которые имеются у особей,
103
составляющих популяцию, группу популяций или вид, в пределах которых они
характеризуются определенной частотой встречаемости.
Основой генетической целостности популяции является половой процесс,
в результате которого внутри нее постоянно происходит обмен наследственным
материалом и формируется единый генофонд популяции. Каждое поколение
особей вносит в него свой вклад, определяемый приспособительной ценностью
их генотипа. Генофонд контролируется естественным отбором и определяется
уровнем мутаций и миграций генов.
Важнейшая особенность генофонда – его глубокая дифференцированность
(неоднородность), которая определяется экологическими и географическими
условиями, является основой его геногеографии и служит предпосылкой
селекции.
Сохранение генофонда можно осуществлять как в местах естественного
обитания популяций, на основе традиционных методов, так и в искусственных
условиях с применением биологических технологий.
При использовании первого подхода выделяются лесные генетические
резерваты, создаются архивы клонов, коллекционные культуры (географические
и испытательные культуры), банки семян, пыльцевых зерен и меристем
ценных генотипов. Сохранение и изучение генофонда, в том числе исчезающих
видов древесных растений и популяций, возможно в рамках научных
исследований, проводимых на базе заповедников, природных парков,
ботанических садов, памятников природы. Могут отбираться и сохраняться
отдельные насаждения или деревья (уникальные, эталонные, элитные,
плюсовые).
Лесные генетические резерваты – это участки леса, типичные по своим
фитоценотическим, лесоводственным и лесорастительным показателям для
данного природно-климатического (лесосеменного) района, на котором
сосредоточена ценная в генетико-селекционном отношении часть популяции
вида, подвида, экотипа. В лесной генетический резерват, прежде всего,
включаются спелые и приспевающие насаждения, где уже произошел отпад
менее приспособленных генотипов и сформировался характерный уровень
продуктивности древостоя. Естественное возобновление – основной способ
возобновления леса в генетическом резервате.
Архивы клонов плюсовых деревьев – насаждения, создаваемые с
104
использованием вегетативного потомства плюсовых и элитных деревьев
основных лесообразующих пород в целях сбережения ценного генофонда и
изучения их наследственных свойств. Назначением их является концентрация
вегетативного потомства плюсовых и элитных деревьев в определенных пунктах
данного района.
Географические культуры – опытные культуры древесных пород,
созданные посевом семян, посадкой сеянцев или саженцев разного
географического происхождения в однородных условиях среды или одного
происхождения, но в различных географических районах.
Испытательные культуры – лесные культуры, создаваемые по
специальным методикам семенным потомством плюсовых деревьев, плюсовых
насаждений, лесосеменных плантаций первого порядка и постоянных
лесосеменных участков с целью их генетической оценки.
Заповедники – территории, полностью изъятые из хозяйственного
пользования с целью сохранения и изучения естественного хода природных
процессов и явлений, генетического фонда, отдельных видов и сообществ
животных и растений, типичных и уникальных экологических систем.
Природные парки – природоохранные рекреационные учреждения, территории которых включают в себя природные комплексы и объекты, имеющие
значительную экологическую и эстетическую ценность и предназначенные для
использования в природных, просветительских и рекреационных целях.
Ботанические сады – научно-исследовательские, учебные и
просветительские учреждения, в которых собирают коллекции живых растений
и на их основе изучают богатство и разнообразие растительного мира. Главная
задача ботанических садов – поиски новых полезных растений, их комплексное
изучение, сохранение уникальных видов и форм и их интродукция. Во многих
ботанических садах создаются дендрарии – коллекции древесных пород,
кустарников, кустарничков, лиан с одревесневшим стеблем, выращиваемых в
открытом грунте. Основные направления работы дендрария – интродукция,
селекция, декоративное оформление.
Памятники природы – деревья, участки леса или отдельные лесные
массивы, уникальные по породному составу, производительности, строению
лесных насаждений и иным природным особенностям. Целью сохранения
отдельных насаждений и деревьев (уникальных, элитных, эталонных, плюсовых)
105
является обеспечение сбережения на длительную перспективу ценных насаждений и особей, произрастающих в природных условиях для последующего
использования их в селекционно-генетической работе.
Банки семян, пыльцевых зерен и меристем ценных генотипов –
коллекции жизнеспособного биологического материала, поддерживаемые и
сохраняемые в течение длительного времени, являющиеся базой для
селекционных работ.
Крупнейшим в мире банком семян является коллекция Всероссийского
института растениеводства им. Н.И. Вавилова (г. Санкт-Петербург), в
Национальном хранилище которого собрано свыше 300 тыс. образцов семян
культурных растений и их диких сородичей со всей планеты. Это самая крупная
и уникальная коллекция в мире.
Недостатком сохранения генофонда в коллекциях семян является
снижение их жизнеспособности в процессе хранения. Так, семена большинства
хвойных пород при правильном хранении остаются жизнеспособными в течение
3 лет, семена осины – только в течение 1 месяца; гибридные формы очень часто
образуют нежизнеспособные семена.
В лесных плантациях (лесонасаждениях) диапазон использованных
биотехнологий, как правило, существенно отличается от используемых в лесах
с естественной регенерацией, хотя есть некоторые совпадения. Плантации
могут иметь различные типы систем управления (например, интенсивные,
полу-интенсивные) и в них могут использоваться различные типы
генетического материала (например, дикие материалы, генетически
улучшенные деревья). В зависимости от уровня интенсивности управления и
типа генетического материала, используемого в лесных плантациях, различные
группы биотехнологий могут быть использованы. В целях упрощения, три
различных группы биотехнологий могут быть определены в зависимости от
типа лесонасаждений, начиная с наименее сложных до самых сложных.
Первая группа биотехнологий подходит для наименее интенсивно
управляемых лесонасаждений, и включает в себя целый ряд вегетативных
методов размножения (таких как микропропагация на основе культуры ткани),
биоудобрений и “генетического дактилоскопирования” с помощью
молекулярных маркеров. Это также может быть дополнено традиционными
106
технологиями, такими, как программы улучшения деревьев на ранних этапах
развития.
Вторая группа биотехнологий может быть использована для
лесонасаждений, которые обеспечивают промышленное сырье в больших
масштабах посадки. Один вид, используемый для плантации, может быть
местным или экзотическим, но эти плантации интенсивно используются. Эта
группа включает в себя биотехнологии соматического эмбриогенеза (метод
культуры тканей), использование молекулярных маркеров, анализ локусов
количественных признаков (QTL), секвенирование целого генома и
функциональную геномику.
Третья и наиболее сложная группа биотехнологий включает обратную и
реверсивную геномику, секвенирование целого генома, методы вегетативного
размножения с низкой стоимостью и генетические модификации лесных
деревьев. На сегодняшний день единственными сообщениями о коммерческих
насаждениях генетически модифицированных (ГМ) деревьев являются
сообщения о тополях в Китае. Однако, большинство видов деревьев,
используемых
в лесонасаждениях,
были
успешно изменены на
экспериментальном уровне, и признаки, которые были предметом
экстенсивных исследований, включают формы стволов, устойчивость к
гербицидам, характеристики цветения, содержание лигнина, и резистенцию к
насекомым и грибковым заболеваниям.
С развитием метода культивирования изолированных клеток, тканей и
органов появились новые способы сохранения ценного генофонда растений.
Они требуют специального оборудования, определенных знаний и навыков,
поэтому их использование оправдано лишь в случаях сохранения особо ценных
селекционных форм или редких и исчезающих видов, в том числе занесенных в
Красную книгу.
При сохранении генетического фонда обязательно должны соблюдаться
следующие условия:
– генетические особенности объекта, его способность к регенерации и
размножению не должны изменяться после периода хранения;
– используют здоровую, живую ткань, свободную от инфекции; условия
хранения этой ткани должны гарантировать отсутствие ее заражения болезнями
или повреждения насекомыми;
107
– обоснованность и экономическая оправданность затрат по хранению
коллекции.
Хранение коллекций живых тканей осуществляется двумя способами:
без нарушения процесса роста биологических объектов (растущие,
периодически пересаживаемые коллекции) и с остановкой их роста. В первом
случае коллекции культивируемых растений необходимо пересаживать на
свежую питательную среду через 2-3 недели, суспензионные культуры – через
7-10 суток, каллусные – через 28-30 суток. Это повышает расходы на их
содержание. Существуют приемы, которые позволяют регулировать рост
длительно культивируемых растений. Так, внесение в среду культивирования
ретордантов (соединений, замедляющих рост растений) позволяет увеличить
время между пересадками. Реторданты оказывают осмотическое действие или
являются гормональными регуляторами. В том случае культуры можно
выращивать около года, проводя 2-3 пересадки.
Более распространены методы хранения клеток, тканей и органов, основанные на снижении метаболизма растений. Среди них наиболее
перспективным является криогенный метод – глубинное замораживание
растительных тканей в жидком азоте. В таком состоянии прекращается обмен
веществ в растительных клетках, практически отсутствуют физико-химические
и молекулярные изменения.
Первые попытки замораживания растительной ткани были предприняты в
начале XX века. В 1905 году в жидком азоте были заморожены семена с целью
изучения морозостойкости растений. Знание механизмов естественной закалки
позволило подойти к разработке методик по замораживанию растений, их
органов и тканей с целью длительного хранения. В основу исследований был
положен принцип программного замораживания – поэтапного снижения
температуры с постоянной скоростью, с использованием специальных веществ
криопротекторов, ослабляющих повреждения клеток при замораживании и
оттаивании. Температура снижается в один или несколько приемов со строго
постоянной скоростью в пределах каждого этапа охлаждения.
Достижения криобиологии (науки, изучающей действие на организм
низких и сверхнизких температур) позволили уже в 60-е годы XX века создать
банки клеток растений, микроорганизмов, животных, человека. Методы
криобиологии позволяют не только сохранять генофонд, но и в любое время
108
предоставлять для селекционного процесса генотип с определенными
признаками (пыльцу для проведения гибридизации; уникальные и единичные
семена; трансформированные, мутантные, гибридные клетки, способные к
морфогенезу in vitro; зигогические и соматические зародыши).
Методы криосохранения разрабатываются с учетом видовой специфики
растительных клеток, в каждом случае подходы к замораживанию и
последующему оттаиванию корректируются с учетом особенностей конкретной
растительной ткани. Все криогенные методы основываются на ряде общих
приемов, которые осуществляются поэтапно. Процесс замораживания клеток и
тканей проводится на специальном оборудовании, обеспечивающем
программное замораживание.
Во
время
подготовительного
этапа
криоконсервации
клетки
культивируются на питательной среде, содержащей различные осмотически
активные вещества (манит, сорбит, пролин, у-аминомаслянная кислота), которые
активно связывают воду в клетках растений и повышают вязкость цитоплазмы.
Затем для каждого эксперимента индивидуально подбирают криопротектор.
Чаще других используют легкопроникающие в клетки вещества:
диметилсульфоксид (ДМСО, 5...10 %), глицерин (10...20 %), а также
высокомолекулярные непроникающие вещества: поливинилпирамидон (ПВП),
декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ). Разделение криопротекторов на
проникающие и непроникающие весьма условно, так как при изменении
условий, например, температуры, они могут изменять свои свойства: глицерин
при комнатной температуре является проникающим, а при понижении
температуры до 0 °С – непроникающим. Криопротекторы, особенно
проникающие, являются токсическими соединениями, поэтому лучше
использовать их смесь, в этом случае их взаимодействие снижает токсичность и
конечный эффект повышается.
При замораживании и последующем оттаивании возможны повреждения
клеток, связанные с потерей воды и с образованием льда внутри них. Обычно
лѐд образуется сначала во внешнем растворе вокруг клеток. Размер центров
кристаллизации зависит от степени переохлаждения воды. Чем ниже
температура замораживания, тем выше вероятность начала кристаллизации.
Цитоплазма замерзает при -1 0С, но сами клетки обычно остаются не
замерзшими до – 10…15 0С, поскольку в пределах этих температур плазмолемма
109
еще предотвращает проникновение внутрь кристаллов льда, растущих во
внешнем растворе, поэтому в момент начала кристаллизации воды в цитоплазме
клетки
уже
достаточно
переохлаждены.
Быстрое
переохлаждение
неблагоприятно для растительного организма, но, если температура снижается
постепенно, то клетки успевают потерять часть свободной воды, которая
выходит из них и замерзает на поверхности медленно растущих кристаллов
льда во внешнем растворе. Таким образом, внеклеточный лед выполняет
водоотнимающую функцию. Медленное замораживание может полностью
исключить кристаллизацию воды внутри клетки, однако в этом случае
происходит дегидротация – клетки теряют воду, и протопласт сжимается. Очень
быстрое замораживание исключает дегидротацию, но тогда в цитоплазме
образуются кристаллики льда, при замораживании они не успевают вырасти до
опасных размеров, но во время оттаивания могут повредить протопласты.
Поэтому программное замораживание проводят с оптимальной скоростью на
каждом этапе, а размораживание осуществляют очень быстро. Оптимальная
скорость замораживания может изменяться в широких пределах, она
подбирается индивидуально в каждом конкретном эксперименте и зависит от
проницаемости клеток для воды. Обычно она составляет 0,5....2 °С в минуту,
режим замораживания лежит в пределах от 0 до -40. При такой температуре
клетки становятся полностью обезвоженными. После этого дальнейшее
замораживание растительного материала проводится с использованием жидкого
азота (t = -196 °С). Длительность хранения замороженного материала
практически не ограничена; клетки моркови, например, могут храниться в
течение 20 лет, меристемы картофеля – более 10 лет.
Заключитеяьный этап криосохранения – оттаивание клеток и проверка их
жизнеспособности. Для этого ампулы с растительным материалом помещают в
водяную баню (t = 40 °С, а иногда и 60 °С) и выдерживают до полного
исчезновения последнего кристаллика льда. После оттаивания проверяют
жизнеспособность клеток, окрашивая их специальными красителями, при этом
окрашиваются только мертвые клетки. Жизнеспособные культуры
рекультивируют на искусственных питательных средах.
После хранения в жидком азоте клеточные культуры не теряют
способности к делению и регенерации, у клеток, продуцирующих метаболиты,
не снижается интенсивность их синтеза.
110
На сегодняшний день методы замораживания в жидком азоте с
последующим возобновлением применяются для суспензионных культур
моркови, руты, кукурузы, риса, сахарного тростника; для каллусных культур
тополя. На примере культуры клеток моркови показано, что в процессе
замораживания погибают рыхлые агрегаты и отдельные клетки. Плотные
агрегаты остаются жизнеспособными. Из них образуются новые рыхлые
агрегаты, от которых отделяются свободные клетки, и состав популяции
восстанавливается.
На сегодняшний день методы замораживания в жидком азоте с
последующим возобновлением применяются для суспензионных культур
(моркови, руты, кукурузы, риса, сахарного тростника); для каллусных культур
(тополя, моршанции, сахарного тростника); для андрогенетических эмбриоидов
(белладонны, табака). Культуры после размораживания не теряют
морфогенетических потенций и регенерируют жизнеспособные растения.
Криогенный метод применяется для сохранения культуры меристем –
малые размеры и слабая вакуолизация клеток обеспечивают им высокую
жизнеспособность. Разработаны методы замораживания в жидком азоте
меристематических тканей гвоздик, томатов, картофеля, зимующих почек
морозостойких плодовых деревьев. Кроме того, этот метод используются для
длительного хранения пыльцы, протопластов, эмбриоидов. При замораживании
последних успех во многом зависит от стадии их развития, на раннем этапе
(стадия глобулы и сердца) количество жизнеспособных эмбриоидов выше, чем
на стадии торпеды. При рекультивировании эмбриоиды (в экспериментах с
морковью и льном – соматические, в опытах с табаком, белладонной –
андрогенетические) развиваются в нормальные растения. В генетической
инженерии криогенные методы применяют для длительного хранения
трансгенных растений и их тканей.
Методы криобиологии постоянно совершенствуются и находят новые
области применения, однако не следует забывать, что они требуют больших
затрат и использование их должно быть экономически обоснованным.
111
2.6. САМОСТОЯТЕЛЬНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ
НОВЫХ ФОРМ И СОРТОВ РАСТЕНИЙ
Использование методов культуры изолированных клеток, тканей и органов
растений позволяет оптимизировать селекционный процесс, сохранять ценный
генофонд, решать ряд теоретических вопросов клеточной биологии, физиологии
и генетики растений. Вместе с тем, способы и приемы, предлагаемые этим
методом, легли в основу разработки самостоятельных технологий получения
новых форм и сортов растений: клеточной селекции, соматической
гибридизации, генетической инженерии.
2.6.1. СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ
В КУЛЬТУРЕ IN VITRO И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
В процессе культивирования in vitro формирующиеся регенеранты могут
или полостью повторять исходную форму, или отличаться от нее как
фенотипически, так и по генотипу. Их потомство (половое и вегетативное) эти
изменения сохраняет. Такие регенеранты получили название сомаклоналъные
варианты или сомаклоны, а тип изменчивости – сомаклональная
изменчивость, которая определяется как генетическая изменчивость,
возникающая на уровне культивируемых клеток и тканей, затрагивающая их
морфологические,
физиологические,
биохимические,
цитологические
параметры.
Если такие изменения происходят в культивируемых генеративных тканях
(пыльниках), говорят о гаметоклональной изменчивости. Сомаклональные и
гаметоклональные варианты являются исходным материалом для клеточной
селекции.
Геном организмов находится в постоянном движении, что особенно
наглядно проявляется при культивировании in vitro. Повышение уровня
генетической изменчивости, появление новых генов при искусственном
культивировании имеют большое теоретическое и практическое значение.
Механизм возникновения сомаклональной изменчивости изучен пока
недостаточно, но с уверенностью можно сказать, что это не случайные
спонтанные мутации – сомаклональные варианты возникают во много раз чаще
112
их. Генетические изменения сомаклонов носят комплексный характер,
затрагивают как морфологические и биохимические показатели, так и структуру
генов, хромосом, геномов. Такая скрытая генетическая изменчивость, присущая
чистительным клеткам, реализуется в процессе культивирования на
искусственных питательных средах. Хромосомная нестабильность в культуре
тканей является скорее правилом, чем исключением – именно in vitro возникает
большинство полиплоидов и анеуплоидов. Предполагается, что увеличение
частоты хромосомных аномалий связано с неорганизованным ростом культуры
тканей, который стимулируется действием гормонального компонента
питательной среды (цитокининов или ауксинов).
Среди потомства одного экспланта (субклонов родительской линии) очень
часто обнаруживают различия в морфологии культур, скорости их роста (она
может увеличиваться в три раза), пигментации (встречаются варианты от
бесцветных до интенсивно окрашенных), в способности к привыканию к
гормонам. У каллусных культур отмечается изменчивость в синтезе вторичных
метаболитов – в культурах картофеля заметно различается содержание солодонина, табака – никотина.
При культивировании клеток, органов и тканей in virto происходит
накопление изменчивости, причем уровень ее может сильно колебаться. Часть
самоклональных вариаций не наследуется и постепенно исчезает, однако
значительная доля таких изменений оказывается генетически закрепленной и
передается следующему поколению.
Оценку сомаклональной изменчивости в культуре in vitro проводят на
растениях-регенерантах и их потомстве (как половом, так и вегетативном).
Чтобы идентифицировать какой-либо вариант как сомаклональный мутант, для
видов с половым способом размножения необходима генетическая проверка
регенеранта путем самоопыления и соответствующих скрещиваний; для видов,
размножаемых вегетативным путем, гарантией генетической основы такого
изменения служит сохранение этого признака по крайней мере в двух
последовательных циклах клонального размножения.
Сомаклональные варианты сочетают в себе признаки, которые очень
трудно, а зачастую просто невозможно соединить в одном генотипе методами
традиционной селекции. Это позволяет повысить генетическое разнообразие
113
селектируемого растительного материала и ускорить процесс выведения новых
сортов.
Возникновение сомаклональных вариантов определяется генетической
неоднородностью соматических клеток экспланта, особенностями генотипа
исходного растения, условиями культивирования, типом морфогенеза.
Дифференцированные клетки в нормальном растении, как правило,
диплоидны, но в течение онтогененза некоторые из них могут изменять
плоидность. Даже в меристемах, характеризующихся постоянным числом
хромосом, в процессе дифферернцировки могут формироваться клетки
различного уровня плоидности. Гетерогенный (неоднородный) в генетическом
отношении эксплант при культивировании сформирует гетерогенную
популяцию клеток, из которой будут получены регенеранты с генотипом,
отличающимся от генотипа исходного растения. Формирование клеток,
отличающихся по числу хромосом от клеток материнской ткани, может быть
вызвано
и
физиологическими
нарушениями
(изменением
условий
культивирования), которые ведут к изменению хода митозов.
Сомаклональные варианты могут быть получены от любых типов
эксплантов, но чаще они возникают в каллусной ткани. Даже если длительность
каллусной стадии в процессе культивирования сведена до минимума, возможна
сомаклональная изменчивость, но размах ее в этом случае будет меньше.
Заметное влияние на изменчивость, появляющуюся в процессе
культивирования, оказывает генотип растения-донора. Так, у растений бегонии,
регенерированных из листовых эксплантов, количество вариантов,
отклоняющихся от родительских форм (по размерам, форме и окраске листьев,
цветов) в зависимости от сорта может колебаться от 7 до 43 %; существенно
различается частота морфологических вариантов у разных сортов пшеницы и
малины; у диких видов картофеля частота появления сомаклонов значительно
ниже, чем у сортового материала; а сорта герани проявляют нестабильность не
только in vitro, но и при традиционном размножении стеблевыми черенками.
На частоту возникновения и на разнообразие сомаклональных вариантов
оказывают влияние состав среды (минеральный и углеводный компоненты,
витамины, растительные экстракты). Превышение оптимальной концентрации
гормонов, длительное культивирование в их присутствии приводят к нарушению
клеточного цикла, что влечет за собой появление клеток с измененным числом
114
хромосом. Иногда изменчивость отмечается только в течение первого цикла
культивирования.
Генетические изменения в культуре in vitro зависят от типа морфогенеза
(соматический эмбриогенез или органогенез). При соматическом эмбриогенезе
цикл культивирования (от клетки до растения) значительно короче, чем при
органогенезе, поэтому и отклонений от исходного генотипа значительно
меньше.
Разнообразие сомаклонов определяется особенностями первичного
экспланта. Так, при культивировании мезофильных тканей листа сомаклоны
появлялись в 4 раза реже, чем при использовании лепестков или оси соцветий
того же растения.
Возникновение сомаклональной изменчивости можно объяснить
изменениями структуры хромосом, возникающими спонтанно или под
действием мутагенных факторов среды культивирования, поэтому длительное
выращивание тканей in vitro приводит к увеличению количества и частоты таких
изменений; у регенерантов и их потомства хромосомных изменений меньше, и
проявляются они реже.
Причины и связь между изменениями структуры хромосом и генетической
изменчивостью в сомаклонах до конца еще не изучены. С уверенностью можно
говорить лишь о том, что какую-то часть сомаклональной изменчивости
хромосомные изменения обусловливают.
Сомаклональные варианты нашли практическое применение в селекции
растений. При их использовании можно получать дополнительную генетичекую
изменчивость у видов и сортов без проведения гибридизации. Сочетание
сомаклональной изменчивости с клеточной селекцией открывает широкие
возможности для ускоренного получения новых форм и сортов растений.
Сомаклональные варианты могут сочетать признаки, которые не удается
соединить в одном генотипе обычными селекционными методами. Так, из
сомаклоналъных вариантов, возникших в каллусной культуре риса, с
использованием сомаклональных линий, были отобраны растения, сочетающие
скороспелость и длиннозернистость, скороспелость и устойчивость к
пониженным температурам; получены клоны картофеля, превышающие
исходный сорт по продуктивности, устойчивости к болезням, содержанию
крахмала в клубнях, причем эти признаки сохранялись и у вегетативного
115
потомства при полевых испытаниях. При использовании традиционных
селекционных методов процесс создания нового сорта у сельскохозяйственных
растений составляет 10... 12 лет, тогда как с участием сомаклонов он может быть
ускорен в 2 раза.
Сомаклональные варианты используются при создании новых форм в
цветоводстве. В каллусной ткани герани были отобраны сомаклоны, ставшие
основой для получения сорта Velvet Rose, обладающего крупными и ярко
окрашенными соцветиями.
Использование в практике селекционной работы сомаклональной
изменчивости открывает новые пути для получения сортов или их улучшения по
отдельным недостающим признакам. Однако если же целью эксперимента
является ускоренное размножение выдающегося генотипа методами
клонального микроразмножения, сомаклональная изменчивость может стать
серьезной помехой. Частота сомаклональной изменчивости различается в
зависимости от метода клонального микроразможения. Так, при использовании
методов активации развития меристем и соматического эмбриогенеза процент
сомаклональных вариантов меньше по сравнению с методом индукции
адвентивных почек тканями эспланта и, особенно, с методом индукции
адвентивных почек в первичных и пересадочных каллусных культурах. Это
объясняется как генетической гетерогенностью и нестабильностью каллусных
культур, так и воздействием гормонов (в частности, БАП), содержащихся в
среде культивирования.
2.6.2. ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫХ ФОРМ РАСТЕНИЙ
С ПОМОЩЬЮ МУТАГЕНЕЗА IN VITRO
Возможности сомаклональной изменчивости могут быть расширены и
дополнены применением мутагенеза in vitro, в результате которого в несколько
раз повышается образование стабильно устойчивых по искомым признакам
клонов клеток. Мутагенными свойствами обладают некоторые химические
вещества и ионизирующие излучения. Их воздействие на клетки растений
вызывает наследственные изменения (мутации), которые проявляются
фенотипически. Так, под действием различных мутагенов у яблони были
116
получены карликовые высокоурожайные сорта, а у тополя под действием
колхицина – тетраплоидные растения (4х).
Обработку растений мутагенами осуществляют как in vivo, так и in vitro.
Мутагенез in vitro проводят чаще всего на растениях табака, используемых как
модельный объект. В качестве химических мутагенов наиболее часто
применяют этилметансульфонат (ЭМС), n-этил-n-нитрозомочевину (НЭМ),
n- метил-n-нитро-n-нитрозогуанидин (НГ), n-нитрозометилмочевину (НММ).
Очень широкий спектр мутаций наблюдается при воздействии
ионизирующего (рентгеновские и гамма-лучи) и ультрафиолетового излучений.
Так, из каллусных тканей и протопластов (полученных из листьев табака)
обработанных гамма-лучами, были выделены клеточные линии, устойчивые к
гербицидам.
Мутагены являются высокотоксичными агентами, поэтому применять их
нужно с большой осторожностью, точно соблюдая методические рекомендации.
Химические мутагены используют в низких концентрациях. Выживаемость
клеточных колоний зависит от того, на какой стадии развития культуры
проводилась мутагенная обработка. Так, единичные клетки обрабатывать
мутагеном лучше до их первого деления.
В случае физического мутагенного воздействия клетки нужно отмывать от
среды, в которой проводили облучение, поскольку под действием
ионизирующего облучения в ней образуются токсические вещества. Тем не
менее, считается, что в случае ионизирующего излучения токсический эффект
ниже, чем в случае химического воздействия. При облучении подавляется в
первую очередь репродуктивная и регенерационная способности клеток, а их
метаболическая активность сохраняется даже после воздействия высоких доз.
2.6.3. КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИЙ, ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ,
УСТОЙЧИВЫХ К СТРЕССОВЫМ ФАКТОРАМ
После получения генетически измененных форм растений (на основе
сомаклонов или индуцированных мутаций) проводят отбор по желаемым
признакам или их сочетаниям. Для этого используют методы клеточной
селекции, которые позволяют в жестких селективных условиях отбирать клетки,
характеризующиеся заданными признаками. С помощью селекции на клеточном
117
уровне можно создавать новые формы и сорта сельскохозяйственных растений в
2-4 раза быстрее, чем при использовании традиционных селекционных методов
В лесном хозяйстве работы по клеточной селекции носят пока поисковый
характер в силу методических сложностей по регенерации древесных растений в
культуре in ivtro и практического выхода не имеют.
Объектом клеточной селекции может быть любой материал,
выращиваемый in vitro: культуры соматических или андрогенных эмбриоидов,
органогенные экспланты (сегменты листьев, стеблей, меристем), изолированные
зародыши. Выбор объектов зависит от целей эксперимента и методов
исследования. Для клеточной селекции наиболее удобны суспензии каллусных
клеток и культура протопластов. Они отличаются быстрым ростом, и, кроме
того, в этих случаях обеспечивается равномерное действие селективного агента
на все клетки. В экспериментах по клеточной селекции отбор проводят не
только на уровне клеток, но и на уровне растений-регенерантов, проверяя их на
стабильность в полевых условиях.
Основными приемами клеточной селекции являются:
– прямая (позитивная) селекция, при этом выживают только клетки,
обладающие заданными свойствами;
– непрямая (негативная) селекция, в результате которой избирательно
погибают делящиеся клетки дикого типа, а выживают метаболически
неактивные клетки; такой прием требует дополнительной идентификации
мутационных изменений у выживших клеток;
– тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все без
исключения клеточные клоны;
– визуальная селекция и неселективный отбор, когда отбираемая линия
фиксируется визуально или с помощью биохимических тестов.
Наиболее распространенным методом является прямая селекция. Она
используется чаще всего для выделения растений-регенерантов, устойчивых к
воздействию гербицидов, антибиотиков, токсинов, солей тяжелых металлов и др.
Перед проведением экспериментов по клеточной селекции определяют
оптимальную концентрацию селективного агента, при которой часть клеточной
популяции погибает, а часть остается жизнеспособной. Такая концентрация
используется в последующих опытах. На среде с селективным агентом из
жизнеспособных клеток формируются клеточные колонии, но их устойчивость к
118
данному фактору может быть и не генетической, а связанной с физиологической
адаптацией или определенным состоянием их дифференцировки. Поэтому
первичные колонии в течение последующих 4-6 субкультивирований
выращивают на селективной среде с целью проверки их стабильности, затем 2-3
субкультивирования проводят на среде без селективного фактора, а потом вновь
возвращают в селективные условия и отбирают стабильные и наиболее
жизнеспособные клоны, которые культивируют уже на морфогенных средах,
регенирируя растения, обладающие соответствующими свойствами.
Однако не всегда из клеток устойчивых к какому-либо селективному
фактору формируются растения-регенеранты, обладающие такой же
устойчивостью. Устойчивость клеток и растений-регенерантов может как
совпадать, так и не совпадать. Это связано с различием механизмов
устойчивости у клеток и у растений. Если устойчивость клеток является частью
общего механизма устойчивости растений, из устойчивых клеток популяции
можно получить растения-регенеранты, устойчивые к этому же селективному
фактору. На этом факте основываются методики по созданию растений,
устойчивых к засолению.
Для подтверждения факта генетической изменчивости клеточной популяции используют следующие приемы:
– гибридологический анализ – традиционный путь изучения полученных
растений-регенерантов для подтверждения генетической природы признака
(метод очень трудоемкий и длительный, особенно в случае древесных растений);
– цитологические исследования (подсчет числа хромосом, анализ протекания митоза и мейоза);
– биохимические маркеры (изоферментный анализ, изучение белкового
спектра);
– косвенные показатели (морфологические, физиологические, биохимические параметры);
– визуальную оценку результатов.
В настоящее время клеточная селекция ориентирована на получение
растений, устойчивых к различным стрессовым факторам абиотического и
биотического происхождения, в первую очередь к засухе, засолению, солям
тяжелых металлов, экстремальным температурам, токсинам патогенных грибов.
Одним из наиболее сильных стрессовых факторов для растений является
119
засуха. Водный дефицит в почве вызывает у них как водный стресс, так и стресс
от воздействия повышенной температуры. Стресс, вызванный отсутствием воды,
может быть первичным (в случае засухи) или вторичным (в случае
низкотемпературного, теплового или солевого воздействия). В любом случае у
растений нарушается ферментативная деятельность, накапливаются токсические
вещества, нарушается питание.
Для имитации стрессового эффекта засухи в экспериментах in vitro в
состав питательных сред вводят осмотически активные вещества, которые
понижают внешний водный потенциал. Чаще всего используют
полиэтиленгликоль (ПЭГ) или маннитол. Первые эксперименты такого рода
были проведены в 80-е годы XX века на растениях табака и томатов. Были
отобраны устойчивые каллусные линии, однако при культивировании на среде
без ПЭГ их устойчивость быстро терялась, что свидетельствует о
физиологической природе адаптации. Позднее был разработан метод
идентификации выносливых к засухе генотипов сои путем тестирования
каллусных линий на рост в присутствии ПЭГ. Была установлена зависимость
между засухоустойчивостью растений и выносливостыо культивируемых клеток
к ПЭГ; кроме того, клетки, культивируемые в присутствии ПЭГ (осмотически
адаптированные), обладали повышенной выносливостью и к солевому стрессу.
В условиях современного сельскохозяйственного производства проблема
засоления почв приобрела особое значение в связи с их искусственным
орошением.
Засоление оказывает на клетку комплексное действие. С одной стороны,
нарушается ее осмотический баланс, с другой – ионы натрия и хлора оказывают
и прямое токсическое влияние, нарушая течение физиологических и
биохимических процессов. В результате, снижается тургор клетки, подавляется
активность ферментов, уменьшается фотосинтетическая активность, нарушается
ионный обмен; для обеспечения метаболизма расходуется значительное
количество клеточной энергии.
Экспериментально подтверждено, что механизмы выносливости к
засолению являются сходными как для клеток, культивируемых in vitro, так и
для интактных растений. Поэтому клеточная селекция может быть основой для
получения устойчивых к засолению форм растений.
В настоящее время наряду с солеустойчивыми формами табака
120
(модельный объект клеточной селекции) получены солеустойчивые растения
яровой твердой и мягкой пшеницы; при этом в качестве первичного экспланта
использовали изолированные незрелые зародыши. На селективных средах
индуцировали образование каллуса. В течение 5-6 субкультивирований
выделяли устойчивые клеточные линии, а из них получали растениярегенеранты. Первое семенное поколение таких растений было протестировано
на солеустойчивость. Установлено, что некоторые растения-регенеранты по
устойчивости к засолению превосходят исходные сорта. Солевыносливость
растений зависит от осмотической адаптации клеток. Поэтому отбор
солевыносливых вариантов может проводиться на основе ее оценки.
Одним из видов абиотического стресса растений является ионный
(минеральный) стресс, вызываемый как недостатком в почве ионов,
являющихся источником питательных веществ для растений, так и
присутствием большого количества ионов металлов, оказывающих на растения
токсическое действие. Токсический стресс могут вызывать цинк, кадмий, медь,
ртуть, накапливающейся в почве в больших количествах в результате
техногенной нагрузки.
Устойчивость клеток к токсическим ионам связана с уменьшением
проницаемости плазмалеммы, изменением структуры клеточных ферментов,
детоксикацией этих ионов в результате их связывания с органическими
веществами клетки.
При проведении клеточной селекции на устойчивость к токсическим
ионам используется прямая селекция, а в качестве селекционного агента –
токсические концентрации солей этих металлов. В природных условиях
токсическое действие ионов тяжелых металлов происходит на фоне других
факторов: кислотности почвы, ее микробного ценоза и др. Питательные среды in
vitro содержат только один, но определяющий, селективный агент.
В результате прямой селекции in vitro отобраны клеточные линии
петунии, устойчивые к ртути, сорго – к алюминию, моркови – к марганцу, льнадолгунца – к кадмию; а также суспензионные клеточные культуры дурмана,
устойчивые к кадмию.
В последние годы начаты работы по клеточной селекции к
низкотемпературным факторам. Для растений холодовой стресс может быть
вызван температурами от 10°...15 °С до 0 °С. Особенно чувствительны к
121
пониженным температурам растения тропиков и субтропиков.
Основа механизма устойчивости растений к охлаждению заключается в
способности мембранных липидов оставаться в жидком состоянии, что в свою
очередь обусловлено наличием насыщенных жирных кислот. При температуре
ниже 0 °С повреждения растительных клеток связаны, во-первых, с
формированием внеклеточного льда, а во-вторых, с водным стрессом.
Предотвратить эти явления возможно в результате превращений запасных
веществ в клетке. Так, морозоустойчивые древесные растения накапливают в
клетках больше жиров, а менее устойчивые – сахара.
Количество экспериментов по отбору холодоустойчивых линий пока
невелико даже с травянистыми растениями; этот аспект клеточной селекции еще
не получил должного развития. В результате экспериментов с суспензионными
культурами табака и перца были отобраны клеточные культуры, стабильно
сохраняющие холодоустойчивость.
Важным экономическим аспектом в проблеме увеличения производства, в
том числе и лесохозяйственного, является защита растений от болезней.
Клеточная селекция на устойчивость к биотическим факторам предлагает методы, позволяющие интенсифицировать отбор устойчивых форм растений: в
условиях малых лабораторных площадей можно проанализировать за короткий
срок гораздо большее количество материала, чем в условиях in vivo, кроме того,
in vitro возможно создание более жестких селективных условий.
В качестве селективного агента в клеточной селекции на устойчивость
используются как патогенные организмы (возбудители болезней), так и их
токсины (в чистом виде или виде культуральных фильтратов).
Одним из методов клеточной селекции на устойчивость является культивирование растительных клеток в присутствии патогена (рис. 15). Этот метод
применяется в том случае, когда возбудитель болезни не выделяет токсины или
его токсические вещества мало изучены. Чтобы правильно построить
эксперимент, необходимо знать биологические особенности возбудителя и
условия, способствующие проявлению его патогенности.
122
Рис. 15. Схема клеточной селекции
123
Зачастую в экспериментах in vitro воспроизведение этих параметров
трудновыполнимо. Тем не менее, китайские ученые, используя культуру
изолированных пыльников и несколько штаммов патогена, получили два новых
высокоурожайных сорта риса, обладающих устойчивостью к пирикуляриозу.
В основе второго метода отбора in vitro устойчивых к болезным растений
лежит использование в качестве селекционного агента патотоксинов,
синтезируемых патогеном. По характеру действия на растение патотоксины
разделяют на три группы. Первые обладают неспецифическим действием по
отношению к растению-хозяину, они не определяют данное заболевание и
являются патогенными для широкого круга растений. Таковыми являются
токсины, выделяемые бактерией Pseudomonas cyringae pv. tabaci, вызывающей
бактериальную рябуху табака. Токсины, относящиеся ко второй группе,
обладают специфичностью по отношению к растению-хозяину (как и сам
патоген), но они, так же как и токсины первой группы, не вызывают развитие
болезни. В качестве примера можно назвать Т-токсин (НmТ), вырабатываемый
грибом Helminthosporium maydis – возбудителем гельминтоспориоза кукурузы.
Третья группа объединяет хозяиноспецифические токсины, вызывающие
болезнь растения. Среди них – викторин (HV-токсин), его продуцирует гриб –
возбудитель гельминтоспориоза овса, вызывающий корневую гниль и
пятнистость листьев этого растения.
Механизм действия патогенов на растения различается. Так, одни вначале
поражают клетки растения, а затем выделяют токсин, другие – наоборот,
вначале выделяют токсин, а затем используют вещества клетки для своего
питания. Клеточная селекция целесообразна только во втором случае. Если же
бета-токсин, продуцируемый патогенном, не выделен в чистом виде или
свойства его не изучены, целесообразно использовать третий, наиболее
распространенный метод селекции in vitro на устойчивость. В основе его лежит
использование культуральных фильтратов, различное количество которых
добавляют, как правило, в питательную среду.
Используя этот метод, были получены устойчивые к различным болезням
клеточные клоны картофеля (к фитофторозу, ризоктониозу), томатов (к
фузариозному вилту), моркови (к альтернариозу), пшеницы (к септориозу). В
экспериментах с пшеницей проростки семян, собранных с растенийрегенерантов были более устойчивыми к действию культурального фильтрата
гриба, чем проростки семян исходных генотипов.
124
2.6.4. СОМАТИЧЕСКАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ МЕТОДОМ СЛИЯНИЯ
ИЗОЛИРОВАННЫХ ПРОТОПЛАСТОВ
Одним из методов клеточной селекции является создание неполовых
гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из
соматических клеток или их органоидов (рис. 16).
Рис. 16. Источники получения протопластов у растений
Протопласт – растительная клетка, полностью лишенная клеточной
стенки и имеющая только клеточную мембрану, которая ограничивает
цитоплазму с различными органоидами и другими включениями. Протопласты
способны осуществлять активный метаболизм и выполнять биосинтез, а также
реализовывать тотипотентность.
Культура изолированных протопластов – выращивание клеток,
лишенных стенок (протопластов) в жидкой или на агаризованной питательной
среде.
125
Впервые выделение протопластов было осуществлено в конце XIX века с
помощью плазмолиза и механического разрушения клеточной стенки
мезофильных тканей мясистых клубней. В 1960 году английский ученый
И.К. Коккинг получил изолированные протопласты из кончиков корней томатов,
используя для растворения оболочки растительной клетки ферментный препарат
из культуральной жидкости гриба Myrothecium verrucaria. Ферментативный
метод разрушения клеточной оболочки растений оказался гораздо эффективнее
механического и нашел широкое применение – в настоящее время выделяют и
культивируют протопласты почти 200 видов растений, в том числе и древесных
пород. Выделение проводят из тканей плодов, листьев, корней, стеблей,
клубней, лепестков, клубеньков (у бобовых растений), колеоптилей, эндосперма,
пыльцевых зерен, опухолей различного происхождения, каллусной ткани.
Технически легче протопласты получать из клеток мезофильной ткани листьев и
из клеток суспензионной каллусной культуры.
Клеточная оболочка у растений состоит главным образом из целлюлозы,
гемицеллюлозы и пектиновых веществ. Поэтому для ее разрушения используют
смесь ферментов на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ в различных
концентрациях и соотношениях. Целлюлаза разрушает саму клеточную
оболочку; пектиназы действуют на соединительные ткани листа, разрушая
пектиновые вещества серединной пластины, в результате чего ткань распадается
на отдельные клетки.
Обязательным условием выделения протопластов является добавление в
ферментативную смесь осмотиков или плазмолитиков – веществ, создающих
высокое осмотическое давление в инкубационной смеси. Для выравнивания
давления внутри и вне клетки применяют осмотические стабилизаторы,
концентрацию которых подбирают индивидуально в каждом эксперименте с
учетом вида и физиологического состояния растения, в этом случае удается
избежать осмотического сжатия протопластов.
Ферментативное выделение протопластов осуществляется довольно
быстро – в течение лабораторного опыта из одного грамма ткани или клеток
(используется, как правило, мезофилл листа) можно получить до 10 млн
протопластов. Сначала проводится поверхностная стерилизация растительной
ткани, затем в растворе плазмолитика удаляют нижний эпидермис и разрезают
ткань на полоски шириной 0,5... 1 мм, после чего нарезанные полоски ткани
126
помещают на некоторое время в смесь растворов ферментов и плазмолитика,
проводят фильтрацию через нейлоновый фильтр и центрифугируют.
Выделенные протопласты отмывают несколько раз от раствора ферментов
раствором плазмолитика, затем – жидкой питательной средой, после чего
культивируют на жидкой или твердой питательной среде того же состава, что и
для выращивания клеток и тканей. Особенностью этих сред является
повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования,
которое обеспечивается высокой концентрацией сахаров или CaCl2.
Изолированные протопласты в процессе культивирования очень быстро
восстанавливают клеточную стенку (за 24...48 часов в зависимости от вида
растения), после чего такие клетки начинают делиться, образуя каллусную
ткань, из которой можно регенирировать растения, что свидетельствует о тотипотентности протопластов.
Схема выделения протопластов и регенерации из них растений показана
на рис. 17.
127
Рис. 17. Выделение протопластов из растительных тканей и регенерация
из них целых растений
Идуцированное слияние изолированных протопластов впервые было
проведено в 1970 г. в лаборатории И.К. Коккинга группой его сотрудников. В
качестве индуктора слияния они применили нитрат натрия; в настоящее время
для индукции слияния изолированных протопластов используют растворы с
высоким pH и высокой концентрацией ионов кальция или же импульсы
электрического тока (физический метод слияния). Возможно и спонтанное
слияние изолированных протопластов, но это бывает очень редко.
На сегодняшний день разработана техника выделения и культивирования
протопластов и получения первичных клеточных колоний из протопластов для
128
табака, картофеля, томатов и некоторых других представителей семейства
пасленовых, а также для винограда, плодовых (шелковица, яблоня) и
цитрусовых культур. Протопласты получены для многих древесных пород (вяз,
ольха, береза, некоторые хвойные). Так, для ели канадской, ели сизой, пихты
дугласовой, сосны ладанной, они были выделены из суспензионной культуры,
полученной из незрелых зародышей. Для сосны обыкновенной и ели
обыкновенной из протопластов были получены лишь клеточные колонии,
которые оставались жизнеспособными в течение 30-40 дней, после чего
погибали.
В результате слияния протопластов образуются клетки двух типов:
соматические гибриды и цибриды. Гибридная клетка содержит весь
наследственный материал (и ядерный, и цитоплазматический) родительских
форм (двух или более). Цибридная клетка образуется в том случае, когда после
слияния протопластов объединяются цитоплазмы партнеров, а ядро остается
только от одного из них, остальные ядра разрушаются. Цибрид может
образоваться и тогда, когда один из протопластов лишен ядра или оно
инактивировано в результате какого-либо воздействия (например, облучения).
Гибридизация клеток растений с помощью слияния изолированных
протопластов
получила
название
соматическая
гибридизация
(“парасексуальная или "неполовая ” гибридизация). Этот термин был введен
Дж. Мельхерсом в 1974 г. При соматической гибридизации в качестве
родительских клеток используются не гаметы (половые клетки), как при
традиционной гибридизации, а протопласты (соматические клетки).
Под влиянием определенного экспериментального воздействия (например,
электрических импульсов) они сливаются друг с другом, образуя гибридные
клетки, из которых регенерируют целые растения, представляющие собой
соматические гибриды.
Поскольку в гибридной клетке присутствуют цитоплазматические гены и
отцовской, и материнской форм, наследственная основа соматических гибридов
более богата и разнообразна, чем у половых гибридов. Используя метод слияния
протопластов возможно переносить гены от одного вида к другому в один цикл
гибридизации. Так, в митохондриях содержится информация о мужской
стерильности; применяя соматическую гибридизацию можно получать
гибридные семена без трудоемкого процесса кастрации исходных форм.
129
Хлоропласты содержат генетическую информацию об устойчивости;
соматические гибриды, имеющие эти гены, будут устойчивы к биотическим и
абиотическим факторам.
Таким образом, основная особенность соматических гибридов,
отличающая их от гибридов половых, состоит в том, что в соматической
гибридной клетке присутствуют цитоплазмы обоих родителей, тогда как
половые гибриды имеют цитоплазму только материнского организма.
Впервые соматический межвидовой гибрид высших растений был получен
в 1972 г. В результате слияния изолированных протопластов двух видов табака
Nicotiana glauca и N. Langdorfii. К настоящему времени получены гибридные
растения-регснеранты и гибридные клеточные линии для целого ряда культур. В
основном это представители семейства пасленовых, крестоцветных, зонтичных,
бобовых, цитрусовых (апельсин, грейпфрут). В последнем случае использование
соматических гибридов особенно актуально, так как половая гибридизация у
цитрусовых затруднена из-за полиэмбрионии, мужской стерильности и низкой
завязываемости семян.
Методом слияния протопластов получены внутривидовые (в основном
между различными сортами табака), межвидовые (табак, петунья, дурман,
паслен), межродовые, межтрибные, межсемейственные гибриды (сизый табак и
соя). Большой теоретический интерес представляют межцарственные клеточные
гибриды, полученные путем слияния протопластов растительных и животных
клеток. Были созданы гибриды между протопластами эритроцитов крысы и
дрожжевых клеток, моркови и человека, табака и человека. Отдаленные
клеточные гибриды имеют и прикладное значение. Например, гибридные
клетки, содержащие 11-ю хромосому человека, которая имеет ген, кодирующий
механизм выработки инсулина, могут синтезировать этот гормон. Используя
соматическую гибридизацию, можно получать гибриды от генетически
отдаленных видов растений, которые невозможно получить половым путем;
например, соматические гибриды между соей и кукурузой, пшеницей и
ячменем, рисом и просом. Это открывает перспективу создания растений, не
имеющих аналогов в природе.
Соматическая гибридизация на основе слияния протопластов опирается на
два экспериментальных метода: культуры изолированных клеток и тканей
растений и выделения и культивирования протопластов. В основе методик
130
лежит техника опытов по генетики микроорганизмов – используются большие
популяции клеток обоих родителей. Смешанную суспензию протопластов
обрабатывают индукторами слияния, в результате часть из них сливается друг с
другом в произвольных сочетаниях, но в суспензии остаются и не слившиеся
протопласты; и те, и другие регенерируют клеточные стенки и переходят к
делениям, образуя каллусную ткань. Гибридные популяции отделяют при
помощи различных методов клеточной селекции. Используемые методики,
позволяют работать с популяциями объемом в 106... 108 клеток.
Отбор соматических гибридов в таких популяциях можно вести как на
клеточном уровне, так и на стадии регенерации растений, при этом используют
методы идентификации по пластидам, генетической и физиологической
комплиментации. Изолированные протопласты могут использоваться в
экспериментах по генетической инженерии для непосредственного введения в
них ДНК или органелл, содержащих ДНК.
Возможность получения из изолированных протопластов клеточной линии
и растений-регенерантов позволяет решать целый ряд теоретических и
практических вопросов:
– получать гибриды из трех и более родительских клеток, сочетая при этом
в гибридной клетке как ядерные, так и цитоплазматические гены партнеров;
– создавать асимметричные гибриды, несущие весь генетический набор
одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами другого;
– вести селекцию на клеточном уровне и проводить работы по
экспериментальному мутагенезу in vitro;
– осуществлять внутривидовую, межвидовую и даже межродовую
гибридизацию соматических клеток;
– переносить чужеродную генетическую информацию (например, гены,
определяющие устойчивость растений к различным факторам);
– изучать физиологические процессы у растений (транспорт различных
веществ через цитоплазматическую мембрану; электрические свойства
мембраны; воздействие на нее физических и химических факторов);
– характеризовать сам объект исследований – изолированные
протопласты,
определяя
их
морфологические,
физиологические
и
цитологические параметры.
131
2.6.5. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ
В XX веке развитие биологии позволило начать изучение живых
организмов на молекулярном уровне. В 50-е гг. из биохимии выделилась наука
молекулярная биология, состоящая из нескольких разделов: молекулярной
генетики, молекулярной вирусологии, молекулярной биологии развития.
Историческое становление этих наук определилось развитием методов
классической генетики, микробиологии, вирусологии, а также использованием
достижений
точных
наук:
физики,
математики,
кристаллографии,
рентгеноструктурного анализа.
Генетическая инженерия является одним из разделов молекулярной
генетики. Она исследует возможности и способы целенаправленного создания in
vitro новых комбинаций генетического материала, способного размножаться в
клетке-хозяине и синтезировать конечные продукты обмена. Годом
возникновения генетической инженерии считается 1972, когда в лаборатории
П. Берга (Станфордский университет, США) была получена in vitro первая
рекомбинантная (гибридная) молекула ДНК (рекДНК), в которой были
соединены фрагменты ДНК трех организмов: фага, бактерии и вируса.
При проведении генно-инженерных манипуляций пользуются как
специальными методами и приемами, так и методическими подходами,
заимствованными из биохимии, генетики микроорганизмов, клеточной
инженерии. Последние применяют для регенерации растений из
трансформированных клеток и размножения трансгенных растений.
Генетическая инженерия состоит из двух разделов: генной и геномной
инженерии. Генная инженерия решает задачи введения в геном реципиентной
клетки одного или нескольких чужеродных генов и создания новых типов
регуляторных связей. В таких случаях видовая принадлежность реципиентных
организмов не меняется, но появляются несвойственные им признаки. Геномная
инженерия решает задачи более глубокого вмешательегва в геном, приводящего
к созданию новых, не встречающихся в природе видов организмов.
Генетическая инженерия успешно решает как фундаментальные, так и
прикладные задачи биологии. Теоретическое значение имеют исследования
молекулярной структуры геномов и генов, а также молекулярных механизмов
регуляции их экспрессии (фенотипического проявления признака,
132
контролируемого определенным геномом). Исследования, проводимые в этом
направлении, выявили основные механизмы переключения генов при клеточной
дифференцировке, позволили определить на уровне ДНК структуру некоторых
регуляторных элементов, выяснить генетические причины злокачественного
перерождения клеток. При решении прикладных задач разрабатываются
подходы для создания принципиально новых технологий получения
биологически активных соединений, в частности, гормонов и интерферонов.
В основе классических методов селекции растений лежит половая
гибридизация и отбор полученных генотипов. Все имеющееся в настоящее
время разнообразие форм, сортов и гибридов культурных растений получено с
применением этих методов. Процесс создания новых генотипов занимает много
лет, особенно когда ведется работа с древесными породами, имеющими
длительный ювенильный период. Методы генетической инженерии позволяют
создавать новые генотипы в более короткие сроки, чем традиционные методы
селекции. Кроме того, на основе введения определенных генов, можно
целенаправленно изменять генотип растений. Из трансформированных клеток
путем регенерации (благодаря тотипотентности растительной клетки) возможно
получение растений с новыми свойствами, при этом успех экспериментов по
генетической инженерии во многом определяется уровнем разработки методов
культуры изолированных клеток, тканей и органов.
В лесной селекции генно-инженерные работы были начаты в 1984 г. – в
США впервые была осуществлена генетическая трансформация сосны
ладанной. С тех пор генно-инженерные исследования проводятся в
лабораториях лесной генетики и селекции США, Франции, Канады,
Великобритании, Франции, Швеции, Германии. Основное внимание уделяется
разработке эффективных методов генетической трансформации растений.
2.6.5.1. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
РАСТЕНИЙ
В основе любого генно-инженерного метода лежит создание
рекомбинантной ДНК, образованной в результате объединения in vitro двух или
более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.
133
При этом рекомбинантные ДНК (рекДНК) становятся составной частью
генетического аппарата реципиентного организма.
Существует несколько методов создания рекомбинантных ДНК.
1. Расщепление ДНК (рестрикция) – применяется для выделения генов
(фрагментации молекул ДНК) и проведения с ними различных манипуляций при
создании рекомбинантных геномов. Рестрикция ДНК происходит под действием
специфических ферментов – рестриктаз, которые разрывают межнуклеотидные
(фосфодиэфирные) связи внутри полинуклеотидных цепей ДНК. В зависимости
от характера воздействия на ДНК различают несколько типов рестриктаз.
2. Гибридизация нуклеиновых кислот – позволяет выявлять
специфические последовательности ДНК и РНК на основе комплементарного
принципа образования нуклеотидов (А-Т(У) и Г-Ц) и совмещать различные
генетические элементы. В генетической инженерии этот метод используется для
создания гибридных молекул ДНК и для выявления определенных
последовательностей и ДНК и РНК.
3. Клонирование ДНК – используется для введения фрагментов ДНК в
самореплицирующиеся (способные к удвоению) генетические элементы
(плазмиды, вирусы), что позволяет размножать гены в клетках организмареципиента. Новый генетический материал может приобретаться тремя путями:
трансформацией, конъюгацией, трансдукцией. Трансформация – изменение
генотипа клетки путем внесения в нее ДНК из культуральной среды, при этом
происходит стабильное изменение генотипа и фенотипа клетки. Конъюгация –
прямой перенос ДНК из одной клетки (донора) в другую (реципиент) через
особый белковый мостик (канал), возникающий между клетками. Трансдукция
происходит с участием бактериофагов, которые вводят в ДНК клетки новые
генетические элементы. Кроме бактериофагов возможно использование
плазмид. Бактериофаги – вирусы, поражающие бактерии. Плазмиды –
кольцевые молекулы двуцепочной ДНК, встречающиеся в клетках дрожжей и
бактерий, где они реплицируются в процессе пролиферации клеток как
самостоятельные единицы.
4. Определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование) в
клонируемом фрагменте ДНК применяется для определения точных границ гена
(генов) и аминокислотной последовательности кодируемого белка. Метод
основан на использовании специфических ферментов – рестриктаз, с помощью
134
которых возможно разрезать ДНК на определенные блоки и, используя
химические или энзиматические методы, определять в них позиции
нуклеотидов.
5. Химико-ферментативный синтез полинуклеотидов – используется для
целенаправленного изменения генов и облегчения манипуляций с ними. Синтез
нуклеотидной последовательности целого гена осуществляется ступенчато. Полученные фрагменты соединяются между собой с помощью ферментов. Этот
метод стал крупнейшим достижением биоорганической химии и молекулярной
биологии, он определил путь прямого получения необходимых генов для технологии рекомбинатных ДНК и стал одним из определяющих приемов генетической инженерии. В настоящее время существуют установки (так называемые
«синтезаторы ДНК»), на которых проводится автоматизированный синтез
фрагментов ДНК.
Методы генетической инженерии позволяют проводить различные
манипуляции с молекулами ДНК: разрезать их в определенных местах,
соединять между собой фрагменты ДНК, различающиеся по происхождению,
синтезировать новые молекулы ДНК с несуществующими в природе
последовательностями нуклеотидов. Все эти манипуляции возможно
осуществлять только при использовании специфических ферментов. Основными
ферментами генетической инженерии являются: ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы,
нуклеазы, рестриктазы.
ДНК-полимераза обладает способностью удлинять цепь ДНК, которая
используется в генетической инженерии для построения второй
комплементарной цепи (путем удвоения ДНК-матрицы).
Функция ДНК-лигазы заключается в соединении фрагментов ДНК путем
восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Этот
процесс называется лигированием.
Нуклеазы являются катализаторами реакций гидролиза молекул
нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), в результате чего они распадаются на
фрагменты или на отдельные нуклеотиды. Нуклеазы разделяются на группы в
зависимости от того, на какие молекулы они действуют: ДНК-азы действуют
только на молекулы ДНК, РНК-азы – на молекулы РНК, некоторые (нуклеазы
золотистой фасоли) – одновременно и на ДНК, и на РНК, а рибонуклеаза Н
действует только на гибридную ДНК-РНК-молекулу. По характеру воздействия
135
нуклеазы делятся на два типа: экзонуклеазы и эндонуклеазы. Экзонуклеазы
гидролизируют молекулы со свободных концов, а эндонуклеазы могут
расщеплять последовательности внутри фрагмента или кольцевой молекулы
ДНК.
Основными ферментами, используемыми в генетической инженерии,
являются рестриктазы. Это группа эндонуклеаз, гидролизирующих ДНК строго
по определенным специфическим последовательностям, называемым сайтами
рестрикции. Каждая рестриктаза способна узнавать свой сайт рестрикции и
разрезать ДНК или внутри его, или в непосредственной близости от этого сайта.
Поэтому под влиянием определенной рестриктазы одна и та же
последовательность ДНК всегда будет образовывать одинаковый набор
фрагментов.
В
зависимости
от
характера
расщепления
нуклеотидной
последовательности рестриктазы делятся на несколько типов. Рестриктазы I
типа узнают свой сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на
произвольном расстоянии от него (от нескольких десятков до нескольких тысяч
пар нуклеотидов). Аналогичным образом действуют и рестриктазы III типа, с
той лишь разницей, что расщепление ДНК в этом случае происходит несколько
ближе к сайту узнавания – на расстоянии 20...35 нуклеотидных
последовательностей. Рестриктазы I и III типов невозможно использовать для
решения генно-инженерных задач. Для этих целей пригодны только рестриктазы
II типа – у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Эти рестриктазы
по-разному расщепляют последовательности ДНК (рис. 18). Одни вносят
разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, образуя “тупые”
концы (1), а другие со сдвигом, при этом возникают “ступеньки” – однонитевые
взаимно комплементарные участки, так называемые “липкие” концы (2).
Рекомбинантные молекулы содержат ген или несколько генов (объект
генетических манипуляций) и так называемый вектор (фрагмент ДНК,
обеспечивающий размножение рекДНК и синтез белков). Гены, используемые
для переноса, могут быть получены либо путем ферментативного расщепления
ДНК, в результате чего образуются фрагменты ДНК; либо путем химихобиологического синтеза. Фрагменты, из которых "собирают" рекомбинантную
молекулу ДНК получают с помощью рестриктаз. Эти фрагменты могут иметь
как "тупые", так и "липкие" концы.
136
Рис. 18. Последовательность нуклеотидов в ДНК, узнаваемая тремя
наиболее часто используемыми рестриктазами. Рестрикцирующие нуклеазы
получают из различных бактерий: Нра I – Haemophilus parainfluenzae;
Eco RI – из Escherichia coli, Hind III – из Haemophilus influenzae. Рестриктазы
типа 1 расщепляют ДНК с образованием "слепых" концов, а другие (типа 2) с
образованием по месту разрыва одноцепочечных "липких" концов.
Лигирование (сшивание) фрагментов ДНК в единую молекулу
производится с использование фермента ДНК-лигазы, при этом применяются
различные методы, в зависимости от того, какие концы имеют исходные
фрагменты. Сшивание по "липким" концам (взаимно комплементарным
участкам из 5-6 пар нуклеотидов) происходит довольно легко. Однако
137
целостность двойной спирали в этом случае не восстанавливается, так как
остается два разрыва в фосфодиэфирном остове молекулы ДНК; для их
сшивания используют ДНК-лигазу, которая и завершает образование
рекомбинантной молекулы ДНК.
Фрагменты ДНК, полученные под действием рестриктаз, имеющие
"тупые" концы, также могут быть соединены в результате действия ДНК-лигазы.
В этом случае эффективность лигирования во много раз ниже, чем при сшивке
по "липким” концам, но при этом нет разницы, какими рестриктазами
образованы эти "тупые" концы: любые фрагменты легко соединимы (рис. 15, II).
Если возникает необходимость в соединении фрагмента с "липкими" концами и
фрагмента с “тупыми" концами, "липкие" концы "затупляют". Для этого с
помощью ферментов или разрушают одноцепочечную ДНК, отщепляя ’’липкий
конец”, или "застраивают" "липкие" концы, синтезируя на них вторую нить. В
результате таких манипуляций из фрагмента ДНК с "липкими" концами
получается фрагмент с "тупыми" концами, и его при помощи ДНК-лигазы
соединяют с другим фрагментом с "тупыми" концами.
После того как рекомбинантная молекула ДНК сформирована in vitro, ее
вводят в живые клетки. Однако, когда чужеродная ДНК попадает в клетку
реципиента, происходит ее разрушение внутриклеточными нуклеазами. Для
того, чтобы рекомбинагтная ДНК стала составной частью генетического
аппарата клетки растения-реципиента, она должна либо встроиться в его геном
(интегрироваться в хромосому), либо быть способной к самостоятельной
репликации в чужом геноме. Молекулы ДНК, способные акцептировать
(принимать) чужеродную ДНК, и обеспечивать экспрессию (проявление) и/или
трансформацию (перенос в другие организмы) называются векторами
(векторными молекулами). Вектор позволяет осуществить процесс введения в
клетку дополнительной генетической информации.
В качестве векторов в генетической инженерии используются плазмиды и
бактериофаги. Плазмиды часто содержат гены устойчивости к антибиотикам,
поэтому бактерии, имеющие такие плазмиды, также обладают этой
устойчивостью.
В качестве реципиентного организма может быть использована любая
растительная клетка. Для осуществления трансформации проводят
предварительную обработку клеток соединениями, способствующими
138
проникновению в них чужеродной ДНК, после чего их помещают в среду, где
могут существовать только те клетки, которые получили векторную молекулу
(например, в среду с антибиотиком).
Трансформация основана на свойстве мембраны бактериальной клетки,
при обработке СаС12 становится проницаемой для ДНК, однако, эффективность
проникновения ДНК в клетку довольно низкая и трансформированной
оказывается лишь небольшая часть бактерий; их отделяют от общей массы в
процессе клонирования. Для этого бактериальную суспензию определенной
концентрации выливают на поверхность агаризованной среды в чашке Петри (из
расчета 5-10 бактериальных колоний на 1 см2 поверхности), бактериальная
клетка делится и образует колонию, которая называется клоном, причем из
каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства
бактерии-родоначальника.
Для того чтобы в сконструированной (рекомбинантной) ДНК
бактериальные (прокариотические) гены могли работать в растительной
(эукариотической) клетке, необходимо провести ряд генно-инженерных
манипуляций, в результате которых прокариотическая РНК начинает считывать
бактериальную последовательность с последующей трансляцией белка
растительной клетке. Для выявления экспресии чужеродных генов в
трансгенных растениях на ранних стадиях используют маркеры экспрессии –
репортерные гены. Продукты этих генов легко определяются с помощью
несложных методов. Так, один из репортерных генов при экспрессии образует
флуоресцирующий белок. Обычно экспрессия репортерного гена коррелирует с
уровнем экспрессии функционального гена в трансгенном растении.
2.6.5.2. ПРИРОДНЫЕ ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ Ti и Ri
ПЛАЗМИД
Основной задачей генетической инженерии растений является получение
трансгенных форм, которое проводится в несколько этапов:
– выбор гена и его клонирование;
– подбор генотипа-реципиента;
– введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента;
– регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных
растений.
139
Главным критерием выбора гена является хозяйственная полезность
представляемого им признака. Чаще всего для трансформации растений
используют гены, определяющие различного рода устойчивость: к гербицидам,
пестицидам, к некоторым видам стрессов (температурным). В качестве доноров
этих генов могут выступать дикие виды растений, которые, как правило,
устойчивы к возбудителям болезней, или же геномы бактерий. Методами
традиционной селекции (половая гибридизация) такие гены из-за биологической
несовместимости (разные виды, рода, семейства) зачастую не могут быть
введены в геном растения-реципиента.
В качестве растения-реципиента лучше выбирать растение, имеющее
лишь одно отрицательное качество, которое нужно исправить (например,
поражаемость болезнями), в то время как по другим показателям (урожайность,
скорость роста, качество семян) оно вполне нас устраивает. В этом случае в
геном растения достаточно ввести только один ген, ответственный за синтез
определенного белка, повышающего иммунитет растения к болезням.
Генетическая трансформация растительных клеток (перенос
чужеродных генов в геном растения-реципиента) осуществляется при помощи
Ti-плазмид почвенных агробактерий (Agrobacterium spp.) и методом
биобаллистической трансформации. Главными задачами при этом являются
обеспечение экспрессии чужеродных генов в геноме растения-реципиента и
стабильное наследование этого признака в последующих поколениях. Это
зависит от ряда причин, главная из которых – место интеграции гена в геном
растения-реципиента.
Получение растений из трансформированных клеток определяется
уровнем их тотипотентности, которая зависит, прежде всего, от видовой
принадлежности растения и от некоторых других факторов. Так,
тотипотентность у однодольных растений ниже, чем у двудольных. Методы
культуры изолированных клеток с каждым годом совершенствуются и
оптимизируются, что позволяет разрабатывать приемы и способы регенерации
для все большего числа трансформированных растений, среди которых есть и
древесные.
Основной проблемой при получении трансгенных растений является
способ введения чужеродных генов в хромосомы растений, то есть
трансформация клеток. Перенос генов в растительные клетки и их встраивание в
140
геном растений стали возможными после открытия природной системы
трансформации растений плазмидами почвенных агробактерий (Agrobacteria
tumefaciens и А. rhizogenes).
При заражении растений (двудольных и ряд голосеменных) Agrobacteria
tumefaciens образуются специфические опухоли (корончатые галлы), состоящие
из дедифференцированных, интенсивно делящихся клеток, которые in vitro
могут расти в отсутствии гормонов, необходимых для роста нормальных
растительных клеток. Инактивация агробактерий антибиотиком после
образования опухоли не вызывает прекращения роста и развития корончатых
галлов, то есть агробактерии запускают механизм опухолеобразования. При
этом индуктором возникновения корончатого галла является специфическая
плазмида, названная Ti-плазимдой (от англ. Tumor inducing – индуцированная
опухоль). Часть Ti-плазимды (Т-ДНК, от англ. Transforming DNA) встраивается
в растительный геном, в результате чего начинается синтез веществ,
необходимых для бактерий.
Область Т-ДНК плазмиды содержит гены, отвечающие за биосинтез
опинов (специфических производных аминокислот), которые используются
бактерией в качестве источника азота и углерода. В результате переноса в
клетки растений бактериальных генов, они начинают синтезировать опины, хотя
они не свойственны их метаболизму. Причем, сами бактерии опины не
образуют, поскольку включние генов, отвечающих за их синтез, возможно
только в эукариотических клетках. Такой паразитизм получил название
генетической колонизации.
Кроме генов, отвечающих за синтез опинов, в области Т-ДНК
локализованы гены, кодирующие синтез природных ауксинов и цитокининов,
экспрессия которых в растительной клетке и приводит к формированию
корончатого галла.
Ti-плазмиды представляют собой кольцевые молекулы ДНК длиной около
200 тысяч нуклеотидных последовательностей, они автономно реплицируются
(копируются) в бактериальных клетках. Все Ti-плазмиды имеют сходное
строение и содержат две группы последовательностей нуклеотидов: гены,
обеспечивающие метаболизм самой агробактерии (они функционируют только в
бактериальной клетке) и гены, необходимые для ее трансформации (они
работают в растительной клетке).
141
За вырезание Т-ДНК из состава Ti-плазмиды и перенос ее в геном
растения отвечает так называемая vir-область (область вирулентности) Tiплазмиды, находящаяся вне Т-ДНК. Она представлена генами, которые по своим
функциям можно разделить на два класса: регуляторные (в небольших
количествах постоянно экспрессируются в клетках агребактерий) и гены,
кодирующие белки, вовлеченные в перенос Т-ДНК в растения (экспрессируются
только после непосредственной активации их промоторов). Для того чтобы
произошел процесс трансформации растения, необходимо три условия:
– активация на хромосоме агробактерии 4-х генов, определяющих синтез
специальных полисахаридов на ее поверхности, необходимых для
присоединения бактерии к растительной клетке;
– активация vir-области Ti-плазмиды – для инициации переноса Т-ДНК в
ядро растительной клетки;
– наличие Т-ДНК.
Ti-плазмиды являются природным вектором для переноса генов. С
помощью генно-инженерных методов Ti-плазмида была модифицирована и на ее
основе получены новые векторы для трансформации растений. Модификация
Ti-плазмиды состоит в том, что в ней оставляют регуляторный участок
Т-области, необходимый для переноса генетической информации в
растительный геном, а вместо структурных генов плазмиды, ответственных за
опухолеобразование и синтез опинов, вшивают структурную часть того гена,
который надо ввести в растение.
Недостатком этих плазмид является тот факт, что некоторые гены
Т-области вызывают рост клеток растений независимо от гормонов среды
культивирования, что затрудняет регенирирацию растений. Кроме того,
Ti-плазмиды имеют большие размеры (около 200 тысяч нуклеотидных
последовательностей), что усложняет манипуляции с ней.
Способностью трансформировать растительные клетки обладают также и
Ri-плазмиды (от англ. Root inducing – индуцирующая избыточное
корнеобразование), выделенные из A. rhizogenes, имеющий тот же круг хозяев,
что и А. tumefaciens. В природе при заражении растений этой бактерией
происходит усиленное образование корней – болезнь “бородатый корень”.
Индукция корнеобразования является результатом переноса в клетки
растения Т-ДНК Ri-плазмиды, которая содержит три гена: один из них отвечает
142
за синтез ауксина (индолил-уксусной кислоты), что и обусловливает усиленное
корнеобразование. В отличии от T-ДНК Ti-плазмиды, генов биосинтеза цитокининов в области Т-ДНК Ri-плазмиды нет, поэтому вместо опухолевого роста
индуцируется усиленное корнеобразование под действием ауксина. На основе
Ri-плазмид также получены векторы для генетической инженерии растений.
2.6.5.3. ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
Для получения трансгенных растений используются методы
кокультивирования с агробактерией и прямого переноса генов в растение
(рис. 19 А, Б). Наибольшее распространение получил первый метод. В основе
кокультивирования
лежит
трансформация
растительных
эксплантов
агробактериями, имеющими векторную конструкцию, содержащую чужеродный
ген, встроенный в область Т-ДНК.
Этот метод позволяет получить большое количество трансформированных
клеток и тканей в строго контролируемых условиях.
В качестве исходного материала необходимо иметь штамм агробактерии
с векторной конструкцией. Вектор должен содержать ген, способный
экспрессироваться в растительной клетке, и селективный маркер
трансформации (например, ген устойчивости к антибиотикам и/или
гербицидам).
У подобранных для трансформации растений-реципиентов изолируют
листовые диски, гипокотили, молодые корешки, семядоли, междоузлия,
проводят поверхностную стерилизацию и инокулируют их жидкой средой,
содержащей афобактерию с векторной конструкцией. Заражение экспланта
агробактерией происходит на раневой поверхности экспланта, время
инокуляции зависит от вида растения-реципиента. Как правило, через 24-28
часов кокультивирования в некоторых клетках происходит встраивание в
растительный геном фрагмента Т-ДНК с чужеродным геном. После этого
экспланты переносят на среду, содержащую антибиотик, при этом происходит
избирательная гибель клеток агробактерий. Для регенерации растений из клеток
экспланта или для индукции каллусогенеза, в среду добавляют соответствующие
гормоны.
143
Рис. 19. Кокультивирование (А) и биобаллистика (Б): стрелками показаны
соответствующие стадии. А - клетка агробактрии; заражение агробактерией
эксплантов; трансформируемая суспензия клеток; перенос чужеродной ДНК в
растительную клетку; заражение агробактерией суспензии клеток; интеграция ДНК в
растительный геном; регенерация растений из трансформированной клетки.
Б - микрочастицы с напыленной ДНК; ускорение микрочастиц в гелиевом потоке
бисбаллистической пушки; трансформируемые экспланты
144
Для селективного отбора трансформированных клеток в состав
питательной среды вводят антибиотик или гербицид (селективные маркеры).
Трансгенные растения, экспрессирующие ген устойчивости, будут расти на
среде с селективным агентом, а нетрансгенные растения погибнут. Через 2-3
недели на трансформированном экспланте образуются почки, а из них побеги,
которые субкультивируют на новой питательной среде, укореняют и переносят в
почву. Впоследствии проводят тестирование трансгенных растений с помощью
методов молекулярного анализа, подтверждая их трансгенную природу. По
аналогичной схеме проводится трансформация протопластов, однако в этом
случае из-за низкой способности к регенерации самих протопластов
эффективность трансформации будет меньше.
Методом кокультивации с агробактерией получены трансгенные растения
практически для всех двудольных и некоторых однодольных (пшеница,
кукуруза, рис) сельскохозяйственных растений. Среди лесных растений этим
методом была осуществлена трансформация тополя. Использовали листовые
диски и сегменты молодых стеблей. В экспериментах с гибридом Populus
trichocarpa Hook х P. deltoides Bartz. Ex Marsh и двумя штаммами Agrobacteria
частота трансформации была довольно высокой (до 50 %). Было установлено,
что для успешной трансформации большое значение имеет соответствие
штамма бактерии и вида растения.
Прямой перенос генов в растение позволяет использовать для
трансформации практически любой ДНК-вектор, несущий чужеродный ген. При
этом гибридный ген интегрирует (встраивается) в ядерную ДНК растения и
эспрессируется с использованием механизмов клеточной рекомбинации. К
сожалению, частота трансформации в этом случае крайне низкая. Для прямого
переноса генов в растительные клетки в большинстве случаев используется
трансформация растительных протопластов. Поскольку изолирование и
культивирование протопластов древесных растений связано с большими
трудностями, применение этого метода в генетической инженерии древесных
растений ограничено.
Среди методов прямого переноса генов в растение наиболее эффективным
является метод биобаллистической трансформации. Он применяется как для
однодольных, гак и для двудольных растений. Исходным материалом для
трансформации служит суспензионная культура растительных клеток,
145
протопласты, каллусная ткань или же культивируемые незрелые зародыши
однодольных. В основе метода лежит способность мельчайших частиц (d = 0,61,2 мм) вольфрама, платины, титана или золота (являющихся вектором ДНК и
содержащих необходимую для трансформирования генетическую конструкцию)
на большой скорости пронизывать клеточную стенку и мембрану и проникать в
клетку, не вызывая ее гибели. Такие напыленные частицы на специальной
подложке помещаются в биобаллистическую пушку, трансформируемый
растительный материал помещается на расстоянии 10...15 см под
биобаллистической пушкой. Частички металла с огромной скоростью
выбрасываются из пушки (за счет перепада давления в ней) и, разрывая
клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Клетки, находящиеся по
центру удара, погибают из-за большого количества попаданий частиц, а клетки,
находящиеся в зоне 0,6 ... 1см от центра, трансформируются. Их переносят на
среду для дальнейшей регенерации. С помощью этого метода были
трансформированы кукуруза, пшеница, ячмень и получены стабильные
трансгенные растения.
После трансформации обязательно проводят проверку полученного
материала. Первичную селекцию трансформированных растений проводят на
среде с соответствующим антибиотиком. Такой отбор основывается на том
факте, что в состав векторов для трансформации растений кроме
функционального гена вводят ген селективного маркера, кодирующий
устойчивость к антибиотикам. Однако рост на селективной среде не может дать
полной гарантии трансгенной природы растения, поэтому для точного
доказательства присутствия в геноме последовательности т-ДНК проводят
анализ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и молекулярного
анализа.
На сегодняшний день в генетической инженерии древесных растений (в
основном двудольных) наиболее часто используется метод кокультивирования
растительного материала с культурой бактерии. В Канаде этим методом была
осуществлена генетическая трансформация березы и ольхи, в Швеции – ивы, во
Франции и США – тополей; получены новые сорта тополей, устойчивые к
глифосату – действующему веществу гербицида раундаи. Проводится работа по
трансформации некоторых голосеменных древесных растений. Так, в США
получены трансформированные ткани дуглассии, лиственницы европейской,
146
тсуги; в Швеции – ели белой и пихты кавказской. Поскольку культивировать
голосеменные растения in vitro очень сложно, генно-инженерные работы с ними
пока ограничены.
2.6.5.4. УЛУЧШЕНИЕ РАСТЕНИЙ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ
ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
При использовании методов традиционной селекции довольно часто
ценные признаки могут наследоваться в сцеплении с отрицательными
свойствами, методы генетической инженерии позволяют целенаправленно
вводить в геном растения-реципиента гены, определяющие хозяйственно
ценные признаки, что открывает широкие перспективы для создания
улучшенных сортов. На сегодняшний день получены трансгенные растения
пшеницы, ячменя, кукурузы, некоторых бобовых с улучшенными качествами
зерна, в частности, с измененным аминокислотным составом запасных белков.
Проводятся работы по получению трансгенных растений масличных культур
(рапса) с улучшенным составом жирных кислот.
Одно из направлений генно-инженерных исследований – повышение
продуктивности растений. С этой целью изучаются возможности изменения
метаболизма и увеличения фотосинтеза у трансгенных растений.
Генно-инженерные методы нашли применение в цветоводстве. Получены
коммерческие copтa трансгенных цветочных культур: сорт гвоздики, имеющий
ген, вызывающий ускоренное цветение; 2 сорта гвоздики и 1 сорт хризантемы,
имеющие гены, регулирующие босинтез антоцианов, что позволило получить
растения с нетрадиционной (голубой) окраской лепестков.
Трансгенные растения могут быть использованы в качестве
производителей “съедобных” вакцин. Уже получены растения табака и
картофеля, синтезирующие иммуноглобулин А-G, энтеротокеин, В токсин
холеры, белок поверхностного антигена гепатита В. Белок, полученный из таких
трансгенных растений, по своим физиологическим и антигенным свойствам
ничем не отличается от белка, полученного из животных клеток. В настоящее
время проводятся испытания по вакцинированию человека против гепатита В с
помощью трансгенных растений. Применение трансгенных растений для
147
производства вакцин может удешевить и оптимизировать процесс получения
биологически высокоактивных вакцин.
Одним из главных направлений генетической инженерии является
получение трансгенных растений, обладающих устойчивостью к абиотическим
и биотическим факторам. В природе устойчивость растений к стрессовым
воздействиям обусловлена следующими механизмами:
– физиологической адаптацией;
– морфологической адаптацией;
– изменением метаболизма.
В клетках растений многие биохимические процессы индуцируются тем
или иным стрессовым фактором, причем, ответ на стрессовую ситуацию у
высших растений и у бактерий во многом сходен. Этот факт позволил
использовать бактериальные гены для получения трансгенных растений,
устойчивых к различным стрессам. Из бактериального генома выделили гены,
кодирующие
ферменты,
которые
определяют
биосинтез
веществ,
накапливающихся в клетке при стрессовых воздействиях. Эти гены были
введены в геном растений, в результате чего получены трансгенные растения,
устойчивые к засолению и повышенным температурам. На сегодняшний день
созданы сорта трансгенных газонных трав, которые нормально растут в
условиях повышенной техногенной нагрузки.
В сельскохозяйственном производстве для борьбы с сорной
растительностью повсеместно используются гербициды, которые могут
оказывать отрицательное действие на рост культурных растений. Получить
растения, устойчивые к действию этих веществ, можно в результате прямой
селекции устойчивых к гербицидам форм (скрещивание с дикими видами),
клеточной селекции (получение мутантных клеточных штаммов), использования
генно-инженерных методов (введение в растение гербицид-резистентных генов
растительного или бактериального происхождения).
Основой для создания трансгенных растений является изучение
молекулярных механизмов устойчивости. На первом этапе определяют мишени
действия гербицидов в клетке растения; затем отбирают растения, устойчивые к
гербициду, которые являются источником генов устойчивости; после чего эти
гены идентифицируют и клонируют; и наконец – изучают их экспрессию для
использования в трансгенных конструкциях.
148
В геном трансгенных растений вводили мутантные гены, кодирующие
синтез ферментов, на которые определенные гербициды не оказывали
негативного действия. Таким путем были получены растения лядвенца рогатого
(Lotus comiculatus), устойчивые к действию гербицида белафоса.
В настоящее время в мировой практике сельскохозяйственного
производства к применению разрешено более 20 сортов трансгенных растений,
устойчивых к гербицидам. Среди них: кукуруза, хлопок, рис, соя, пшеница,
томаты, лен. Полевые испытания проводятся с трансгенными сортами клубники,
сахарной свеклы, некоторых цветочных культур.
Огромный урон сельскохозяйственному и лесному производству наносят
эпифитотии, причиной которых являются возбудители грибных, бактериальных,
вирусных болезней. При инфицировании и развитии патологического процесса
включаются механизмы защитных реакций растений. Во-первых, начинается
синтез соединений, ограничивающих или прекращающих жизнедеятельность
патогенов. Во-вторых, создаются структурные барьеры, препятствующие
распространению инфекции (например, лигнификация клеточных стенок
растений). В ответ на инфицирование в клетках растений индуцируются
специфические и неспецифические белки, ингибирующие рост и развитие
патогенов, а также ферменты, определяющие биосинтез фитоалексинов
(веществ, проявляющих фунгицидное и антимикробное действие). При создании
трансгенных растений, устойчивых к различного рода инфекциям, используются
гены, кодирующие синтез этих веществ. Так, в настоящее время получены
трансгенные растения (сорта табака, рапса, томатов, картофеля),
экспрессирующие ген хитиназы (специфического белка) и обладающие
устойчивостью к грибам p. Rhisoctonia. Клонирование и перенос генов,
кодирующих специфические белки защищающие от инфекций семена в период
покоя и прорастания, позволило получить трансформированные растения,
обладающие высокой сохранностью и грунтовой всхожестью семян.
Перенос в растения генов, отвечающих за синтез неспецифических белков,
дает возможность получения растений устойчивых и к грибным, и к
бактериальным инфекциям. Перенос генов, кодирующих ферменты,
индуцирующие синтез фитоалексинов, позволил получить трансгенные растения
томатов и картофеля, устойчивые к фитофторозу и фузариозу.
Весьма актуальным и перспективным является получение трансгенных
149
растений, устойчивых к вирусной инфекции, при этом используют различные
методы. Один из них заключается в том, что в геном растения-реципиента
вводят ген оболочки вируса, что приводит к ингибированию его размножения в
клетке и снижает инфицирование растения. Такие эксперименты были
проведены с картофелем и табаком, в результате были получены растения,
трансформированые геном оболочки вируса табачной мозаики (ВТМ),
обладающие стойким антивирусным эффектом. В настоящее время с помощью
генноинженерных методов получены растения, обладающие устойчивостью к
ряду вирусных болезней: картофель и кукуруза – резистентные к вирусу
скручивания листьев, ячмень – к вирусу карликовости. Иногда растения могут
быть устойчивы сразу к нескольким вирусам – табак, резистентный к ВТМ и
вирусу тыквенной мозаики. Получены четыре трансгенных коммерческих сорта
картофеля, устойчивые к Y вирусу и вирусу скручиннния листьев; тыква,
устойчивая одновременно к трем вирусам.
Актуальным и перспективным на сегодняшний день является получение
трансгенных растений, устойчивых к насекомым. Исследования последних лет
показали, что бактерии Bacillus thuringiensis синтезируют специфический белок
– прототоксин, который в пищеварительной системе насекомых расщепляется с
образованием активной формы токсина, что приводит к гибели насекомого. На
основе прототоксина были созданы препараты для защиты растений от
насекомых-вредигелей, но они оказались нестойкими, быстро инактивировались
и их защитное действие было низким. Экспрессия прототоксина в
бактериальной клетке определяется конкретным геном, который был выделен из
генома В. thuringiensis и интегрирован в геном растений табака методом
агробактериальной трансформации. Экспрессия этого гена была подтверждена
соответствующими методами. Трансгенные растения табака насекомыми не
повреждались. Позднее были получены растения томатов, трансформированные
геном эндотоксина, которые также были устойчивыми к насекомым. На
сегодняшний день ген устойчивости к токсину введен в геном картофеля,
кукурузы (кормовой и пищевой), хлопчатника, сои, риса, брокколи, томатов.
Получен сорт картофеля, обладающий тройной устойчивостью: к повреждению
насекомыми, к вирусу скручивания листьев, гербициду глифосату.
Использование таких трансгенных растений должно способствовать
сокращению применения инсектицидов, что существенно улучшит
экологическую ситуацию в агроценозах.
150
ГЛАВА 3. ГРИБОВОДСТВО КАК ОТРАСЛЬ БИОТЕХНОЛОГИИ
3.1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ СЪЕДОБНЫХ ГРИБОВ:
ВОЗМОЖНОСТИ И ПЕРСПЕКТИВЫ
В последнее десятилетие культивирование съедобных грибов
превратилось в промышленную индустрию, соединяющую традиционные черты
сельского хозяйства и современной биотехнологии. Сегодня в мире
производится около 5 млн тонн съедобных грибов на сумму более 10 биллионов
долларов США. За последние 20 лет продуктивность грибоводства ежегодно
возрастает на 12...20 %. На первом месте по объему производства грибов стоит
Китай (2246 тыс. т), на втором – США (345 гыс. т), на третьем Япония
(336 тыс. т). В больших объемах выращивают грибы во Фракции (232 тыс. т),
Таиланде (80 тыс. т), Германии (60 тыс. т), Польше (59 тыс. т), Канаде
(53 тыс, т), Венгрии (22 тыс. т). Россия производит более 6 тыс. т
культивируемых грибов в год.
3.1.1. ОБЩАЯ XАРАКТЕРИСТИКА ГРИБОВ, ИХ МЕСТО
В СИСТЕМЕ ОРГАНИЧЕСКОГО МИРА
Грибы с незапамятных времен являются объектом пристального внимания
человека; их мир богат и разнообразен, они широко распространены во всех
климатических зонах. В настоящее время насчитывается около 100 тысяч видов
этих организмов, что составляет 1/5 численности всей флоры планеты.
Грибы сильно различаются по внешнему виду, местам обитания,
физиологическим функциям, характеру питания. Эти организмы до сих пор еще
не изучены в полной мере, французский ботаник XVII века А. Вейан назвал их
изобретением дьявола, придуманном им для того, “чтобы нарушать гармонию
остальной природы, смущать и приводить в отчаяние исследователейботаников”.
Разнообразие форм, своеобразие жизнедеятельности определили особое
положение грибов в системе органического мира – их выделяют в отдельное
царство, наряду с царствами животных и растений. Отсутствие хлорофилла,
наличие хитина в оболочках клеток, гликогена в качестве запасного продукта,
наличие мочевины в азотистом обмене, витамина D у некоторых видов сближает
151
грибы с животным миром; в то же время питание путем всасывания (грибы
являются осмотрофами), неограниченный рост вегетативного тела –
характерные признаки растений.
Грибы распространены повсеместно: их споры, мицелий или его
видоизменения встречаются на суше, в воде, почве, воздухе. Они развиваются
как на естественных субстратах (растительного и животного происхождения),
так и на материалах и продуктах, созданных человеком (пластмассы,
искусственные кожи, ткани, нефтепродукты). Поэтому их роль в жизни и
деятельности человека огромна.
Грибы являются постоянным компонентом лесных биогеоценозов. Они
разрушают древесину и другие органические остатки, способствуют питанию
древесных, кустарниковых и некоторых травянистых растений, в то же время
грибы могут быть причиной эпифитотий, приводящих к снижению прироста
деревьев, продуктивности лесов и качества выращиваемой древесины. Плодовые
тела многих видов грибов имеют пищевое, а некоторых – лекарственное
значение и заготавливаются в значительных объемах как продукты питания и
как сырье для переработки.
Грибы лесных биогеоценозов разделяются на три основных экологические
группы: сапротрофы – развивающиеся на растительных и животных остатках в
почве, воде и т.д.; паразиты – существующие за счет организма хозяина и
симбионты – находящиеся в тесном сожительстве с корнями высших растений и
образующие микоризу.
Садротрофные грибы являются одним из основных звеньев в процессе
минерализации отмирающей растительной массы. На 1 кг почвы под пологом
леса ежегодно опадает до 2 т растительного материала (листья, хвоя, семена).
Благодаря большому набору ферментов грибы, наряду с другими организмами
(бактериями, беспозвоночными), принимают активное участие в процессах
деструкции органического вещества, которое накапливается в результате
деятельности фотосинтезирующих высших и низших растений, минерализуя ее
до продуктов, доступных древесным и травянистым растениям.
Грибы-микоризообразователи находятся в симбиотических отношениях с
зелеными растениями. В результате гриб передаст им воду, минеральные соли и
азот, одновременно получая от них продукты фотосинтеза. Совместно с
сапротрофами
грибы
участвуют
в
минерализации
подстилки
и
152
полуразрушившейся древесины. В условиях засухи грибница способна
функционировать при таких уровнях осмотического давления, когда корни
деревьев уже не в состоянии брать влагу из почвы – таким образом грибымикоризообразователи помогают древесным породам переносить почвенную
засуху.
Грибы используются для утилизации многочисленных отходов ряда
производств и бытовой деятельности человека. Физиолого-биохимические
свойства грибов находят применение в сельскохозяйственном производстве,
деревообрабатывающей, пищевой, фармацевтической промышленности, в
медицине, животноводстве. Среди грибов известны мощные продуценты
биологически активных веществ: белков, аминокислот, ферментов, витаминов,
антибиотиков и др.
В настоящее время оформилась новая отрасль производства –
грибоводство, основанная на современных биотехнологических методах, а
также отрасль микробиологической промышленности, занимающаяся
выращиванием на жидких средах биомассы мицелия высококачественных
съедобных грибов с целью получения ценного грибного белка для пищевых и
кормовых производств.
3.1.2. ПИЩЕВАЯ ЦЕННОСТЬ ГРИБОВ
Грибы являются денным пищевым продуктом, обладающим приятным
специфическим вкусом и ароматом. В них содержатся все необходимые
человеку питательные вещества: белки (до 5,5 %), жиры и жирные кислоты (до
0,5 %), углеводы (до 3,1 %), большое количество экстрактивных веществ,
разнообразных минеральных солей и витаминов.
Доля белков в свежих грибах составляет 2...5 %, а в сушеных достигает
25 %, поэтому грибы называют “лесным” или “грибным мясом”. В грибах
обнаружено 18 аминокислот, 8 из которых являются незаменимыми
(поступающими в организм человека только с пищей). По содержанию белка и
составу аминокислот грибы скорее можно сравнивать с ценными овощами, чем с
мясом. Грибные белки усваиваются на уровне растительных, а иногда даже
лучше их, но хуже, чем животные. Так, в плодовых телах шампиньонов белков
содержится 5,94 %, из них усваивается 4,82 %. Для грибов характерно наличие
153
хитина (до 6 % сухой массы), который идентичен хитину ракообразных, он
составляет основу грибной клетчатки – опорной ткани плодовых тел.
Количественное содержание белков и аминокислот в грибах зависит от
способа их переработки, возраста и части плодового тела. Маринование,
например, приводит к уменьшению количества общего азота и белка в грибной
продукции. Даже содержание одной и той же аминокислоты у одного вида гриба
очень различается в зависимости от способа переработки: в сушеных белых
грибах лизина и валин-метионина в два раза больше, чем в маринованных. В
молодых плодовых телах белков больше, чем в старых, причем, в шляпках их
больше, чем в ножках.
Углеводов в плодовых телах грибов в отличие от фотосинтезирующих
организмов меньше, чем азотистых веществ, их количество в зависимости от
вида гриба, условий его произрастания и других факторов составляет от 2,1 до
24,1%.
Жиров (липидов) в грибах содержится до 10 %, причем больше половины
из них являются незаменимыми. Грибы содержат большое количество
органических кислот и ферментов.
В плодовых телах грибов обнаружены витамины А, В, В2, С, D, PP.
Содержание витамина С (аскорбиновая кислота) по сравнению с растительной
пищей (зеленый лук, черная смородина, лимоны) невелико; по этому показателю
они могут быть сравнимы лишь с зерновыми продуктами. Количество витамина
В2 (рибофлавина) у большинства грибов выше, чем в овощах и злаках –
примерно на уровне молока и говядины. Кроме того, в грибах содержатся
тиамин, витамин Е, биотин и витамин РР (никотиновая кислота). Плодовые тела
грибов, окрашенные в желтый цвет (лисички, рыжики) имеют витамин А. В
плодовых телах многих грибов (но не всех) обнаружен витамин D, причем он не
теряет своей активности при переработке.
Грибы содержат целый ряд минеральных веществ калий, фосфор, натрий,
качьций, железо; а также цинк, медь, мышьяк, марганец, йод, особенно велико
содержание цинка. По своей биологичесхой активности грибы как продукт
питания приближаются к печени и дрожжам.
Пищевая ценность грибов определяется не только по содержанию и
усвояемости грибного белка, но и по влиянию на процесс пищеварения
свободных аминокислот в сочетании с ароматическими и экстрактивными
154
веществами. В этом отношении грибные блюда (особенно бульоны) не уступают
по ряду показателей мясным, и даже превосходят их.
Питательная ценность дикорастущих съедобных грибов является
специфическим признаком отдельных видов, а у культивируемых грибов
различается даже у отдельных штаммов. Так, индекс питательности шампиньона
двуспопрового различается у разных штаммов более чем в 10 раз.
Грибы являются ценным дополнительным белковым продуктом,
использование которого особенно актуально в святи с сокращением
естественных источников белка.
В настоящее время сбор съедобных дикорастущих грибов заметно
сократился. Это довольно трудоемкое, не всегда рентабельное занятие; массовое
плодоношение бывает не каждый год, оно ограничено 4...6 месяцами в году и в
сильной мере зависит от погодных условий. Возрастающая антропогенная
нагрузка на лесные биогеоценозы приводит к сокращению численности
дикорастущих видов, кроме того, грибы, в отличие от растений, не имеют
защитных тканей, поэтому они интенсивнее поглощают и накапливают соли
тяжелых металлов и радиоактивные элементы. В силу недостаточной
осведомленности населения о видовых особенностях грибов, имеют место
случаи отравления ядовитыми грибами. Все эти факты свидетельствуют в
пользу искусственного культивирования грибов, при котором гарантированы
стабильные урожаи вне зависимости от сезона и климатических условий и
высокое качество плодовых тел.
3.1.3. ИСТОРИЯ, СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И
ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ГРИБОВОДСТВА
Грибоводство является прикладной отраслью, формирование которой
тесно связано с развитием микологии (науки о грибах) и фитопатологии
(науки о болезнях растений и мерах борьбы с ними). Достижения этих наук
оказали влияние на становление и развитие грибной индустрии.
В 1600 г. парижский садовник на грядках в теплицах, где выращивались
дыни, на конском навозе, который использовали в качестве удобрения,
обнаружил шампиньон двуспоровый. В 1778 г. появилась статья А.Т. Болотова
"О шампиньонах"; а в 1861 г. была опубликована статья Е. Грачева "О
155
разведении шампиньонов", в которой автор обобщил 15-летний опыт
культивирования этого гриба. В это же время итальянский ботаник Микеле
впервые установил способность грибов размножаться спорами и выяснил, что
споровая продуктивность очень велика. Так, шампиньон в течение 5 дней
рассеивает более 10 млрд базидиоспор. Французский миколог Антонио де Бари
разработал методы экспериментального изучения грибов, на основе которых
О. Брефельд впервые предложил метод выделения чистых культур грибов.
М.С. Воронин опубликовал результаты исследований по изучению микоризных
грибов.
На рубеже XVIII - XIX веков в институте Пастера во Франции был
разработан стерильный способ получения грибницы.
В 1707 году французский ботаник Турнефор описал способ выращивания
шампиньонов с применением гобтировки – нанесения на шампиньонные гряды
влажного покровного слоя, что способствует образованию плодовых тел.
Конец XIX в. середина XX в. отмечены большой систематической работой
как в области фитопатологии, так и чисто микологическими исследованиями.
Немецкий миколог Г. Клебс изучал влияние состава питательных сред на рост и
развитие некоторых грибов, в России Н.И. Иванов исследовал их азотистое
питание. В 1881 году русский ученый Ф.М. Каменский опубликовал работу о
симбиозе грибов с корнями подъельника, а в 1887 году П. Пфефер описал
взаимосвязь грибов с высшими растениями. Позже А.Франк, изучавший связи
грибов с высшими растениями, назвал их микоризными. Выдающийся русский
лесовод Г.Н. Высоцкий – основатель степного лесоразведения, предложил идею
внесения микоризообразующих грибов в почву.
С начала XX века обобщаются результаты микологических и
фитопатологических исследований; в это же время проводятся исследования,
имеющие большое прикладное значение. В 1932 году Лемке (Германия)
запатентовал способ выращивания мицелия на субстрате из пшеничного зерна.
В середине 50-х годов начали производить посевной мицелий на опилках
(опилочный) и на палочках лиственных пород деревьев (палочковый). В 1933 г.
в литературе появилось первое сообщение о культивировании шиитаке на
термически обработанных опилках.
В настоящее время грибоводстово оформилось в самостоятельную отрасль
высокорентабельного, экологически чистого и безотходного производства
156
(рис. 18). Опираясь на теоретическую базу микологии и фитопатологии, она
предлагает свои подходы и практические приемы для получения ценного сырья:
плодовых тел грибов (пищевой продукт), мицелия для производства
биологически активных добавок (компонент кормовых смесей), отработанного
субстрата (составная часть удобрений), используя при этом отходы
сельскохозяйственного и лесного производства и перерабатывающей
промышленности.
3.1.4 РАЗВЕДЕНИЕ ГРИБОВ В ИСКУССТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ
Съедобные грибы на искусственном субстрате выращивают издавна. В
тропических и субтропических странах Азии более 3 тыс. лет назад уже умели
культивировать кольцевик и шиитаке. Упоминания о шампиньонах, трюфелях,
сморчках относятся к III в. до нашей эры – древнегреческий естествоиспытатель
Теофраст называл их пищей богов. В Европе первой грибной культурой была
культура шампиньонов, появившаяся сначала в Италии, а к середине XVII века
распространившаяся во Франции, а затем в Великобритании, Швеции и других
странах.
В начале XVIII века этот гриб начали выращивать в России.
В конце XX века в производстве стали широко использовать культуру
съедобных дереворазрушающих грибов: вешенки обыкновенной, шиитаке,
зимнего гриба и некоторых других видов.
Из всех видов съедобных грибов наиболее широкое распространение
получил шампиньон. Этот гриб стал настоящей сельскохозяйственной
культурой, отличающейся высокой урожайностью (за один оборот сбор
плодовых тел с 1 м2 составляет 15...20 кг).
Пока не найдено эффективных способов культивирования облигатных
микоризообразователей, среди которых немало ценных съедобных грибов:
белый, подосиновики, подберезовики, маслята, рыжик. Из этой группы в
условиях естественных и искусственных насаждений культивируются только
трюфели, выращивание которых было начато в середине XVIII во Франции,
позднее их стали культивировать в Германии.
157
Технологический процесс любого грибного производства слагается из
нескольких этапов:
– производство мицелия и его хранение;
– выбор технологии культивирования;
– выбор субстрата для культивирования грибов и способа его
подготовки;
– инокуляция субстрата мицелием и инкубация;
– сбор урожая и его реализация;
– утилизация отработанного субстрата.
На каждом этапе должны соблюдаться определенные технологические
параметры, обеспечивающие оптимизацию условий выращивания.
Культивирование любого гриба начинается с получения посадочного
мицелия. В природе грибы размножаются в основном спорами или фрагментами
мицелия. Подметив эту особенность, грибоводы долгое время в качестве
посадочного материала (в частности, для культивирования шампиньона)
использовали дикорастущую грибницу. Однако этот способ не оправдал себя –
урожайность была низкой. В 1894 году во Франции в Пастеровском институте
впервые была получена чистая культура шампиньона, выращенная in vitro, на
питательной среде из спор гриба. Такая грибница обладала высокой
жизнеспособностью, активным ростом; плодовые тела получали быстрее, их
было больше, чем при использовании "дикого" мицелия. Технология
выращивания мицелия на субстрате из пшеничного зерна получила мировое
признание и различные ее модификации до сегодняшнего времени
используются во всех хозяйствах, занимающихся культивированием съедобных
грибов. С середины XX века стали пользоваться опилочным и палочным
посевным мицелием.
К качеству посевного мицелия предъявляются высокие требования.
Прежде всего, это должны быть высокоурожайные, конкурентно способные
штаммы. Они должны быстро разрастаться в субстрате и образовывать
качественные плодовые тела. Субстратом для производства посевного мицелия
служит зерно, луза подсолнечника или шелуха гречихи с добавлением зерна,
при этом он должен быть хорошего качества, свободным от грибных или
бактериальных болезней. Зерно сначала проваривают, вынимают из воды,
подсушивают до сыпучести, после чего засыпают в молочные бутылки на 2/3
158
объема, закрывают пробкой и автоклавируют при 2 атм. в течение 2 часа.
Остывшее зерно инокулируют чистой культурой гриба и помещают бутылки в
термостат (t = 26...28 °С). По мере зарастания субстрата проводят контроль и
выбраковывают неудачно инокулированные бутылки.
Хранить мицелий можно холодным способом и при помощи жидкого
азота; выбор зависит от поставленных целей и задач. Если мицелий нужно
сохранить в течение нескольких недель или месяцем, используют первый
способ, для длительного хранения (до года или более) второй. При холодном
хранении мицелий помещают в холодильник (t = 2 °С), в таких условиях его
рост задерживается и культура дольше остается жизнеспособной. На лежкость
мицелия оказывают влияние вид зернового субстрата, его количество, размер
культуральных сосудов, аэрация.
При
использовании
жидкого
азота
применяют
программное
замораживание. Культуры хранятся в рефрижераторе с жидким азотом при
температуре t = -160...-196 °С. После восстановления замороженного мицелия
определяют
его
жизнеспособность,
силу
роста
и
урожайность.
Экспериментальные данные показали, что эти параметры у мицелии,
хранившегося в течение года, мало чем отличаются от его параметров до
хранения.
При искусственном выращивании грибов применяют экстенсивное и
интенсивное культивирование.
Экстенсивное культивирование – это получение плодовых тел в
открытом грунте. При этом плодоношение наступает так же, как и в природе –
весной и осенью. Такой способ предполагает использование отходов лесной
промышленности, сельского хозяйства и перерабатывающих производств.
Создание грибных плантаций этим способом широко практикуется в Венгрии,
Италии, Чехии, Германии, Словении. В последние 10-15 лет экстенсивным
способом стали выращивать грибы (в частности, вешенку) в России, на Украине,
в Белоруссии и других странах CHГ. Используя этот прием, можно создать
мини-плантацию вешенки на дачном или приусадебном участке.
Интенсивное культивирование – получение плодовых тел грибов в
закрытых помещениях. В качестве субстрата в этом случае используется солома,
лузга подсолнечника, стружка, опилки и другие отходы сельскохозяйственного
и лесного производства; при этом рост грибов и образование плодовых тел
159
происходит гораздо быстрее, чем при использовании экстенсивного метода. Так,
первое плодоношение наступает через 3-4 недели после инокуляции субстрата,
плодовые тела можно собирать еще в течение следующих 5-8 недель.
Выращивание
грибов
интенсивным
способом
в
специально
оборудованных помещениях с контролируемыми и регулируемыми условиями
имеет ряд преимуществ перед экстенсивным культивированием:
– плодовые тела можно получать в течение всего года вне зависимости от
погодных условий;
– урожайность в этом случае выше и стабильнее (благодаря оптимизации
и контролю условий выращивания);
– технологический цикл короче;
– возможна автоматизация производственных процессов.
Первые попытки выращивания грибов (вешенки) интенсивным способом
были предприняты в середине 60-х годов XX века в Венгрии, с 1971 г. в
Нидерландах работает первая ферма по выращиванию этого гриба.
Выбор субстрата как сырьевой базы культивирования грибов является
определяющим моментом в грибном производстве, при этом основными
критериями являются его химические, физические, биологические,
технологические, производственные свойства; учитывается удобство заготовки,
транспортировки, хранения, а также его экологическая чистота.
Каждый растительный субстрат имеет свои физические особенности,
различаясь по влажности и структуре. Оптимизировать его свойства можно
путем сочетания различных типов растительного сырья. Питательные свойства
субстрата повышают с помощью биологически ценных добавок. При этом
используют отходы мукомольного (отруби, полова, шелуха), пивоваренного
(солодовые ростки), масложирового (жмых), кондитерского (какавелла),
комбикормового (травяная мука) и некоторых других производств. Для
улучшения структуры субстрата и связывания излишков воды он обогащается
минеральными добавками (гипсом, мелом, известью, доломитовой мукой),
содержащими различные формы кальция.
Перед инокуляцией субстрата проводят его гидротермическую обработку,
режим которой зависит от вида культивируемого гриба. Чаще всего применяют
пастеризацию или ксеротермическую обработку.
Пастеризация – это длительная (в течение 20...21 ч) гидротермическая
160
обработка субстрата, которая проводится в специальных емкостях (3...6 см3) с
погруженными тэнами для нагревания воды и субстрата. Температуру воды
поддерживают на уровне 65. ..70 °С, иногда поднимают до 90. ..100 °С. После
обработки субстрат остывает в емкости в течение 12 ч. Чем дольше длится
пастеризация, тем выше ее эффект – погибают пищевые конкуренты
культивируемых грибов, но выживают термовыносливые бактерии, являющиеся
их антагонистами и выполняющие функцию защиты мицелия культивируемых
грибов от плесеней. Таким образом, в результате пастеризации происходит
обогащение субстрата полезной микрофлорой.
Суть ксеротермической обработки состоит в термическом воздействии на
воздушно-сухой субстрат: измельченный субстрат нагревают паром до
102...103 °С, в течение 1…1,5 ч. После ксеротермической обработки горячий
пропаренный субстрат увлажняют водопроводной водой с дезинфицирующими
веществами (гипохлоритом натрия, фундазолом) до 65...70 % от полной
влагоемкости.
Подготовленный субстрат фасуют в емкости (мешки или пакеты),
инокулируют посевной культурой гриба и помещают в инкубационное
помещение, где происходит его обрастание мицелием, образование плодовых
тел, сбор урожая. В этом помещении поддерживается постоянная температура
t =26...28 °С. Влажность воздуха в период инкубации составляет 50...70 %, в
период образования плодовых тел – 95 %. Образование плодовых тел
индуцируется снижением температуры. Инкубационное помещение обязательно
должно иметь систему вентиляции.
Сбор урожая грибов проводят по мере появления плодовых тел. Для
каждого вида культивируемых грибов существуют свои особенности и
закономерности плодоношения.
Экономическая эффективность культивирования съедобных грибов
учитывает не только урожайность, но и показатели эффективности
использования субстрата, одним из которых является биологическая
эффективность (БЭ, %), которая определяется отношением сырого веса
плодовых тел к сухой массе субстрата
БЭ = Мпл.тел/Mcvx.суб.х 100 %
Биологическая эффективность в 100 % означает, что с 1 кг сухого
субстрата получают 1 кг сырых грибов.
161
Субстрат, оставшийся после сбора плодовых тел, представляет собой
органическую массу, почти полностью минерализованную мицелием гриба. Его
можно использовать в качестве органического удобрения для овощных культур
или как субстрат для производства вермикупътуры – выращивания в
искусственных условиях беспозвоночных (чаще всего калифорнийских червей),
активно участвующих в процессе распада органического вещества до
легкодоступных для растений форм.
3.2. ПРОМЫШЛЕННОЕ ВЫРАЩИВАНИЕ ДЕРЕВОРАЗРУШАЮЩИХ
ГРИБОВ
В XX веке в мире широкое распространение получила культура
лигнотрофных грибов, использующих в качестве пищевого субстрата древесину.
Наиболее часто в искусственных условиях выращивают вешенку обыкновенную
и шиитаке, применяя экстенсивную и интенсивную технологии.
3.2.1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВЕШЕНКИ (PLEUROTUS SPP.)
Толчком для искусственного выращивания вешенки послужила первая
мировая война, когда из-за нехватки продуктов питания в Германии этот гриб
стали повсеместно выращивать на пнях, отрубках древесины и других
субстратах растительного происхождения, что было прообразом экстенсивной
технологии
культивирования
вешенки,
усовершенствованный
и
оптимизированный вариант которой используется в настоящее время
практически во всех европейских странах. В последние годы в мире
наблюдается рост производства этого гриба, с 1986 по 1997 г. объем его вырос с
169 тыс. т до 875 тыс. т; при этом наибольший прирост отмечен в Китае.
Вешенка обладает и преимуществом перед другими культивируемыми
грибами за счет того, что выращивание ее очень технологично. Гриб имеет
высокую скорость роста и конкурентоспособность, растет на различных
целлюлозои
лигнинсодержащих
растительных
отходах
лесной,
перерабатывающей промышленности и сельскохозяйственного производства, по
количеству используемых субстратов вешенка не имеет себе равных. На юге
Европы и в США для ее культивирования используют кукурузные стебли и
162
кочерыжки, в Азии – рисовую солому и отходы хлопкового производства, в
Японии – лузгу подсолнечника, на Филлипинах – скорлупу кокосов; в странах с
развитой деревоперерабатывающей промышленностью до 50 % субстрата
приходится на долю коры и опилок. Кроме того, используют солому сои, костры
льна, кожуру картофеля, отходы переработки какао-бобов, сахарного тростника,
кофе, табака, винограда. Отработанный субстрат (после окончания
плодоношения) можно добавлять в корм скоту, кроме того, он является
хорошим органическим удобрением. Недостатками вешенки является хрупкость
плодовых тел и не очень сильный грибной аромат.
В природных условиях вешенка селится на пнях, ветровальных,
усыхающих и сухостойных деревьях осины, березы, ольхи, бука, граба, белой
акации, клена, вяза, ясеня, липы, рябины и других лиственных пород.
Значительно реже этот гриб можно обнаружить на ели, пихте, кедре,
лиственнице. На здоровых деревьях вешенка, как правило, не встречается.
Плодовые тела образуют большие вертикально расположенные сростки, в
которых они плотно прижаты друг к другу. В природных условиях
плодоношение вешенки длится с начала апреля по конец ноября, наибольшее
количество грибов образуется осенью; ее рост определяется температурой,
освещенностью, влажностью.
Для развития мицелия этого гриба оптимальной является температура
+20...+25 °С, он может развиваться (но очень медленно) и при более низких
температурах. Образование плодовых тел начинается при +8°...+15 °С.
Особенностью вешенки является то, что ее плодовые тела лучше развиваются на
вертикальной плоскости, чем на горизонтальной. Поэтому в природе сростки
плодовых тел располагаются вдоль ствола дерева, а при искусственном
культивировании тару с субстратом, как правило, подвешивают в вертикальном
положении.
Находясь под пологом леса, вешенка не нуждается в интенсивном
освещении, для образования плодовых тел достаточно рассеянного света. Как и
любой другой гриб, она нуждается в определенной влажности субстрата, в
природе волны ее плодоношения отмечаются после дождя.
В настоящее время вешенки выделяют в самостоятельное семейство
(Pleurotaceae), которое объединяет около 30 видов, более 10 из них выращивают
в культуре. Наибольшее распространение получила вешенка обыкновенная
163
(Pleurotus ostreatus). Гриб имеет белую мякоть с приятным запахом. Шляпка
диаметром до 20 см, полукруглая, уховидная, гладкая, серовато-желтого или
буроватого цвета. Пластинки нисходящие по ножке, редкие, тонкие, белые,
около ножки с перемычками. Ножка эксцентрическая, редко центральная, короткая (до 4 м), толщиной 2 см, в основании волосистая и суженная.
Вешенка обладает рядом ценных качеств. Ее плодовые тела содержат
большой набор витаминов: В1, В2, В6, В12, РР, Н, С. По количеству витаминов В1
и В2 она не уступает ржаному хлебу, витамина Н – сравнима с молоком, В6 – с
капустой. По содержанию витамина РР (способствующему нормальному
кровообращению и препятствующего возникновению тромбов в кровеносных
сосудах) вешенке нет равных среди культивируемых грибов. Ее плодовые тела
содержат жирные кислоты, необходимые организму человека, а также калий,
кальций, железо, фосфор, натрий и ряд других микроэлементов. Калорийность
вешенки не уступает другим культивируемым грибам и составляет 300 ккал/кг;
ее плодовые тела не содержат крахмала, поэтому блюда из этого гриба показаны
больным сахарным диабетом.
Вешенка содержит множество биологически активных веществ,
способствующих выведению радиоактивных элементов из организма человека,
предупреждению гепатита, язвы желудка, снижению количество холестерина в
крови, нормализации кровяного давления, повышению иммунитета, а также
препятствующих образованию опухолей.
По пищевой ценности вешенка близка к белому грибу. Количество общего
белка у нее несколько меньше, но по содержанию усвояемого белка, она не
уступает этому признанному грибному лидеру. В шляпке вешенки белка
содержится почти в два раза больше, чем в ножке; в молодых и старых
плодовых телах его меньше, поэтому самыми ценными являются плодовые тела
среднего возраста, диаметр шляпки которых составляет 5-8 см.
Вешенку широко используют для промышленного разведения, применяя
как экстенсивную, так и интенсивную технологии культивирования.
Для ее выращивания экстенсивным способом подходит низкосортная
древесина тех лиственных пород, на которых она обитает в природе; ее можно
культивировать и на древесине хвойных пород (ели, сосны, лиственницы,
кедра), но в этом случае для инокуляции нужно использовать специальные
штаммы гриба, выделенные из древесины ели.
164
Плантационное разведение вешенки на вырубках позволяет проводить
биологическую раскорчевку пней. При этом осуществляется защита
прилегающих массивов сосны от корневой губки, а лиственных насаждений от
опенка осеннего и настоящего, поскольку инокуляция пней вешенкой создает
конкуренцию этим патогенным грибам.
Интенсивное культивирование вешенки имеет ряд особенностей и
представляет коммерческий интерес. Ориентирами в определении коммерческой
значимости являются рынок труда, способ заготовки и переработки продукции,
энергетические, технологические и другие затраты. Все эти параметры лежат в
основе построения технологии культивирования вешенки, которая объединяет
ряд взаимосвязанных или независимых технологических операций, по каждой
составляется технологическая карта с указанием ведущих и вспомогательных
показателей. Такие карты являются основой построения бизнес-проекта.
Эффективность культивирования вешенки различается в разных экологогеографических зонах и экономических регионах. Так, в условиях резко
континентального климата требуются большие затраты на оптимизацию
микроклиматических
параметров.
Выбор
субстрата
зависит
от
производственных особенностей региона и доступности сырья.
При экстенсивной технологии культивирования вешенки желательно
использовать свежесрубленную древесину с высокой влажностью. При
пониженной влажности субстрата (менее 80...90 %) подготовленные отрубки в
течение недели вымачивают в воде. Древесина должна быть свободной от
грибов, являющихся пищевыми конкурентами вешенки.
Размер отрубков древесины составляет до 50 см в длину, по диаметру – не
менее 20 см. Очень важным и ответственным моментом является
инокулирование отрубков мицелием (грибницей). Для этого лучше использовать
стандартную грибницу, выращенную в контролируемых условиях лаборатории,
которую можно приобрести в специализированных магазинах или
грибоводческих центрах. Большое значение имеет штамм гриба, зависимости от
времени плодоношения различают зимние и летние штаммы.
Существует несколько способов инокуляции субстрата:
– отрубки древесины устанавливают друг на друга в несколько ярусов, при
этом на торец каждого из них помещают слой грибницы толщиной 1... 1,5 см (из
расчета 100 г грибницы на отрезок диаметром 20 см и длиной 30...35 см). Для
165
того чтобы бруски не пересыхали, их оборачивают полиэтиленовой пленкой, а
верхний ряд посыпают влажными опилками или соломой;
– в отрубке древесины электродрелью просверливают отверстия или
ножовкой делают надпилы, в которые вносят мицелий, затем затыкают их мхом,
опилками или заклеивают клейкой лентой (чтобы предотвратить высыхание
мицелия);
– от отрубков отпиливают диск древесины толщиной 1,5...2. см, на торец
отрубка помещают грибницу, а сверху гвоздями прибивают диск.
Для развития мицелия в древесине (инкубации) отрубки устанавливают в
помещение с температурой 15...20 °С (сарай, пустующий летом погреб, подвал)
и периодически увлажняют (можно накрыть их перфорированной пленкой).
Инкубацию можно проводить и в открытом грунте. Для этого выкапывают
траншею глубиной около 1 м, на дно насыпают слой песка (10... 15 см),
поливают его водой, устанавливают инокулированные отрубки, траншею
накрывают досками и засыпают соломой или смесыо опилок с землей. В сухую
погоду раз в неделю проводят полив (5 л воды на 1 м ), не раскрывая траншеи.
После того как мицелий полностью обрастает древесину отрубков, их
переносят на тенистый участок и создают грибные грядки. Длительность
существования таких грядок составляет 3-5 лет. В течение этого времени они не
должны подвергаться механическим воздействиям (перекопке почвы, переносу
отрубков с места на место), поскольку со временем мицелий из древесины
может проникать в почву. Для улучшения роста грибов на дно траншеи (под песок) можно добавить небольшое количество перегноя или лесной земли.
При интенсивной технологии культивирования, предусматривающей
получение высоких урожаев плодовых тел гриба, определяющим моментом
является выбор субстрата; при этом руководствуются следующими критериями:
– производственные (доступность, транспортировка, стоимость, хранение);
– технологические (однородность, технологичность);
– биологические (инфицированность, селективность);
– физические (структура, дисперсность, влажность, влагоемкость);
– химические (состав, соотношение С и N, pH);
– микологические (биологическая эффективность: рост мицелия вешенки,
урожайность);
166
– экологические (отсутствие радионуклидов, пестицидов, солей тяжелых
металлов).
Важнейшим условием работы грибной фермы является создание
надежной сырьевой базы, которая бы полностью удовлетворяла основным
критериям выбора субстрата. Качественный субстрат должен содержать в
достаточных количествах все питательные вещества, необходимые для развития
и плодоношения гриба (белки, жиры, углеводы, минеральные вещества); его
состав должен соответствовать стандартным требованиям и обеспечивать
высокую продуктивность грибного производства.
За счет сочетания различных типов растительного сырья можно
оптимизировать физические свойства субстрата (структуру, влагоемкость,
плотность, аэрацию, размеры и массу субстратного блока и т.д.). Каждый
растительный субстрат имеет свои особенности. Так, соломистые субстраты
отличаются
хорошей
структурированностью,
аэрацией,
достаточной
влагоемкостыо; опилки имеют хорошую влагоемкость, но очень мелкую
структуру, щепа – наоборот: хорошо структурирована, но ее влагоемкость
низкая. Различные сочетания компонентов позволяет получить субстрат с
оптимальными физическими свойствами.
Современные грибоводческие хозяйства часто используют смеси
субстратов – так называемые композиции, которые включают следующие
компоненты:
– основу (солома, лузга подсолнечника, кочерыжки кукурузы в различных
соотношениях);
– питательные добавки (отруби пшеницы, риса, соевая мука, травяная мука);
– минеральные добавки (известь, гипс);
– защитные добавки (фунгициды, инсектициды).
Апробирование различных композиций должно проводиться только в
экспериментальном порядке.
В естественных условиях вешенка, как и другие дереворазрушающие
грибы, растет в плотной древесине. Развивается она достаточно медленно,
поскольку в процессе питания разрушает сложные литоцеллюлозные
комплексы древесины. При интенсивном культивировании используют рыхлые
субстраты (опилки, измельченную кору, солому, и т.д.), которые содержат
167
легкодоступные для грибов азотные и углеродные источники питания.
Плесневые грибы усваивают их легче и быстрее, чем дереворазрушающие
грибы, поэтому на таких субстратах они составляют серьезную конкуренцию
вешенке. Для уничтожения плесневых грибов проводят термическую обработку
субстрата, применяя чаще всего пастеризацию, используя при этом различные
температурные режимы. Чем выше температура обработки субстрата, тем
большее число видов микроорганизмов погибает, в том числе и полезных.
Пастеризация при умеренной температуре сохраняет комплекс термофильных
бактерий, которые не являются пищевыми конкурентами вешенки, а
способствуют ее росту, разлагая субстрат до легкодоступных для нее
соединений.
После пастеризации субстрата среди сохранившихся микроорганизмов
есть как полезные для вешенки термоустойчивые виды, так и плесени. При
промышленном производстве вешенки возникает необходимость получения
селективного субстрата, который способствует росту мицелия гриба и в тоже
время тормозит развитие ее конкурентн гоп. Добиться этого можно изменением
состава субстрата с учетом различий в пищевых потребностях вешенки и ее
конкурентов.
Из пастеризованного субстрата формируют субстратные блоки. Как
правило, вешенку выращивают в полиэтиленовых мешках (размером 120x40 см)
с перфорациями, диаметр которых составляет 2,0...2,5 см, расположенных на
расстоянии 20...25 см одно от другого. Для удаления избытка влаги при
переувлажнении субстрата нижние углы мешков надрезают. Для вегетации и
плодоношения блоки размещают в 2 или 1 яруса, оставляя между ними
технологические проходы.
Обрастание субстрата мицелием (инкубация) длится 16...20 дней при
температуре 26...28 °С. Снижение температуры до 10... 16 °С способствует
образованию плодовых тел. Некоторые штаммы (так называемые стрессовые)
плодовые тела при кратковременном снижении температуры до 2…5 0С.
В течение цикла культивирования плодовые тела образуются тремя
последовательными волнами (с интервалом и 1,5...2 недели). Началом первой
волны считается появление первых хорошо оформленных сростков плодовых
тел в перфорациях мешков. Кик правило, на первую волну приходится 70 %
всего урожая, на вторую – 20. ..25 %, на третью – 5..10 %.
168
Всего за один цикл культивирования (2...2,5 мес.) с 1 мешка (около 10 кг
субстрата из соломы) можно собрать около 2,5 кг грибов. Обычно
ограничиваются сбором первых 2-х волн.
3.2.2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ШИИТАКЕ (LENTINUS EDODES)
Шиитаке (синонимы черный гриб, китайский гриб, пилолистник) является
традиционным деликатесным грибом в странах Юго-Восточной Азии. Более
1000 лет его выращивают на обрубках древесины в умеренном поясе горных
регионов Китая, Японии, Кореи. По объемам промышленного производства
шиитаке занимают 3-е место в мире после шампиньона и вешенки, в настоящее
время мировое производство этого гриба достигло 450 тыс. т в год. В основном
оно сосредоточено в странах Юго-Восточной Азии (Китай, Япония, Тайвань,
Корея). Лидером в производстве шиитаке является Япония. В последние годы
этот гриб стали выращивать в Австралии, США, Германии, Италии, Австрии; в
странах СНГ он культивируется в небольших объемах в Белоруссии и России.
Еще в древности считалось, что шиитаке продлевает жизнь. Современные
исследования японских ученых показали, что этот гриб обладает многими
ценными свойствами. Японскими исследователями из плодовых тел шиитаке
выделены вещества, являющиеся основой препаратов, снижающих риск
заболевания атеросклерозом (за счет способности снижать уровень холестерина
в крови), замедляющих развитие злокачественных опухолей, регулирующих
имунитет. Шиитаке обладает антивирусными, антибактериальными и
антигрибковыми свойствами.
Плодовые тела этого гриба содержат белки (13... 18 %), жиры (2...5 %),
клетчатку (6... 15 %), витамины (В1, В2, В 12, D), различные микроэлементы. Они
обладают приятным специфическим грибным вкусом и ароматом,
напоминающим что-то среднее между белым грибом и шампиньоном.
Диаметр шляпки шиитаке достигает 5... 10, иногда 25 см, в молодом
возрасте она выпуклая, затем в центре появляется углубление. Поверхность ее у
зрелых грибов сухая, покрыта чешуйками, по краю – бархатистая; окраска
варьирует от светло-коричневой до темно-бурой; пластинки чистые, свободные,
вначале желто-белые, затем буроватые. Ножка центральная или
эксцентрическая, обычно слегка изогнутая, жестковатая, цилиндрическая,
169
длиной 3...5, толщиной 1... 1,5 см, беловатого или буроватого цвета. Ткань при
повреждении становится коричневой. Плодовые тела растут одиночно.
Шиитаке является дереворазрушающим грибом. В природе он встречается
на мертвой древесине дуба, каштана, граба, березы. Может расти на тополе,
осине, иве, ольхе и других лиственных породах.
Выращивают шиитаке с применением как экстенсивной, так и
интенсивной технологий. Более двух третей мирового производства этого гриба
основано на экстенсивной технологии, которая особенно пригодна в регионах с
влажным климатом.
Грибы выращивают на обрубках древесины, заготовленных ранней весной
или поздней осенью, когда в ней наиболее высоко содержание сахаров. При
этом используют здоровые (без признаков гнили) отрубки стволов (диаметром
10...20 см, длиной 1... 1,5 м), а также ветки, через кору которых может проникать
свет. Для культивирования шиитаке подходит древесина тех пород, на которых
гриб встречается в природе.
Приготовленные отрубки замачивают в воде в течение 2-3 дней, затем
делают пропилы до половины их диаметра или высверливают отверстия
диаметром 2 см и глубиной не менее 5 см, куда вносят грибиицу из расчета 7 %
от веса отрубка, затыкают деревянными пробками и заклеивают липкой лентой
(чтобы мицелий не высыхал). Используют мицелий, выращенный в условиях
лаборатории.
Инокулированные отрубки укладывают штабелем не выше 1 м в открытом
грунте (можно в теплице или подвале), укрывают соломой, влажной
мешковиной и перфорированной пленкой. Зарастание древесины отрубков
мицелием гриба (инкубация) длится 9…12 месяцев и зависит от влажности и
плотности древесины, температуры воздуха (оптимальной является
t=24…28 0С). Отрубки не должны пересыхать, в сухую погоду их поливают.
Для стимуляции плодоношения после зарастания древесины, отрубки
вымачивают 2 суток в воде, затем сильно простукивают по всей длине молотком
и после этого выставляют на постоянное место культивирования, выбирая
влажные, затененные, защищенные от ветра места. Отрубки вкапывают в почву
на 1/3 длины, на расстоянии 20…30 см друг от друга, либо располагают их в
виде забора.
Плодоношение наступает весной или осенью. В первый год после
170
инокуляции плодовые тела могут не появиться, тем не менее, за отрубками
нужно продолжать следить, не позволяя им пересыхать; на зиму их можно
оставлять на участке. Весенний урожай, как правило, обильнее, чем осенний и
грибы получаются лучшего качества. Плодоносит шиитаке, как и вешенка,
волнами с периодом в 2-3 недели. За теплый период времени бывает две и более
волны плодоношения. Когда шляпки достигают размера 4…8 см в диаметре, а
края еще слегка загнуты внутрь, начинают сбор плодовых тел. Плодоношение на
отрубках продолжается в течение 2…5 лет, общий урожай грибов за это время
составляет 10…15 % от массы отрубков.
В зависимости от климата района культивирования для экстенсивного
выращивания используют теплолюбивые (летние), холодолюбивые (осенневесенние) и всесезонные штаммы. Правильный выбор штамма гриба
гарантирует хорошие урожаи и длительное плодоношение.
Крупные коммерческие грибные фермы, которые в состоянии
осуществлять значительные инвестиции в оборудование (системы
термообработки
субстрата,
фильтрационной
очисти
воздуха
и
кондиционирования) выращивают шиитаке по интенсивной технологии на
субстратах, содержащих лигнин и целлюлозу: опилках и стружках
лиственных пород (дуб, клен, бук, ольха, береза, тополь, осина, ива).
Оптимальный размер опилок составляет 2-3 мм, более мелкие непригодны,
поскольку они нарушают газообмен в субстрате, что замедляет рост
мицелия. В качестве добавок, улучшающих рост и развитие мицелия,
используют зерно и отруби знаковых культур, отходы пивного
производства и другие источники органического азота и углеводов. Для
создания оптимального уровня pH субстрат и улучшения его структуры
вводят минеральные добавки (мел или гипс).
Чаще всего субстрат состоит из опилок (100 частей), щепы (50 частей),
отрубей (40 частей), гипса (5 частей). Качественный состав компонентов
субстрата может быть несколько видоизменен и зависимости от возможностей
производителя. Субстрат расфасовывают по 2,5.. .3 кг в пакеты из полиэтилена
высокой плотности (ПВП), выдерживающего температуру 121 °С или
полипропилена (ПП) и автоклавируют. На следующий день пакеты в
асептических условиях инокулируют, количество мицелия при этом составляет
3...5 % от массы пакета. Для ускорения колонизации субстрата мицелий
171
необходимо распределить в нем как можно равномернее. Пакеты помещают на
стеллажи, оптимальными условиями инкубации являются температура 25 0С и
влажность воздуха 95... 100 %. Колонизация субстрата (разрастание мицелия)
длится 40…120 дней в зависимости от штамма гриба, состава субстрата,
количества инокулята. К концу инкубации пакеты нужно слабо освещать (50-100
люкс) в течение 6...8 часов в сутки. Когда мицелий полностью освоит субстрат,
он становится плотным и белым. Это стадия так называемого белого блока.
Через некоторое время на субстратном блоке появляются мицелиальные вздутия
– "узелки" белого цвета. После этого блок начинает темнеть, а на его поверхности образуется защитная оболочка, предохраняющая его от высыхания и внедрения конкурентных микроорганизмов; через 40...60 дней наступает стадия
коричневого блока. Такой блок полностью созрел для плодоношения, и на нем в
скором времени появляются примордии – небольшие вздутия, являющиеся
зачатками плодовых тел, их развитие можно стимулировать, освещая блоки по
6-8 часов в сутки с интенсивностью 50-100 люкс.
После инкубации коричневые блоки с примордиями или без них
помещают в камеру плодоношения. С блоков снимают пакеты и расставляют их
на стеллажах поодиночке так, чтобы плодовые тела могли развиваться со всех
сторон блока. Инкубационное помещение должно вентилироваться свежим
воздухом, для чего используют рециркулирующую систему. Для нормального
плодоношения шиитаке нуждается в освещении (интенсивность 100...200 люкс,
длительность – 8...12 часов в сутки), температуре на уровне 14...20 °С (в
зависимости от фазы плодоношения и штамма гриба), относительной влажности
воздуха 80...95 % в начале плодоношения и 50...70 % в период сбора плодовых
тел.
Урожайность шиитаке составляет 20...30 % от массы субстрата, а на
сильно обогащенных субстратах достигает 40...50 %. Обычно бывает от 3 до 6
волн плодоношения, после чего блок рассыпается.
Плодовые тела шиитаке поступают на рынок в свежем и сушеном виде.
При сушке их аромат усиливается. В Юго-Восточной Азии из них делают
разнообразные экстракты и добавляют их в напитки и даже кондитерские
изделия.
172
3.3. ВЫРАЩИВАНИЕ ПОЧВЕННЫХ САПРОТРОФНЫХ ГРИБОВ
3.3.1. КУЛЬТИВИРОВНИЕ ШАМПИНЬОНА (AGARICUS SPP.)
Из всех съедобных грибов наиболее широкое распространение в
промышленной культуре получил шампиньон. Основой его питания является
органическое вещество почвы, В настоящее время культивируют два вида этого
гриба: шампиньон двуспоровый – Agaricus bisporus и шампиньон двукольцевой
– Agaricus bitorquis. Они различаются по некоторым требованиям к условиям
выращивания, товарным характеристикам, устойчивостью к болезням и
вредителям. Шампиньон двуспоровый культивируют более 300 лет. В настоящее
время общий объем мирового производства этого гриба составляет около 80 %.
Его выращивают более чем в 70 странах мира, главным производителем
являются США, там сосредоточено около 25 % мирового производства
шампиньонов. В Европе основные поставщики этого гриба Франция (150 тыс. т),
Ирландия, Англия, Испания (по 80 тыс. т), Голландия (30 тыс. т в год), Италия
(11 тыс. т). В Восточной Европе лидирует Польша (90тыс. т). Шампиньонные
комплексы созданы в Молдавии, Белоруссии, на Украине, в России.
По цвету шляпки выделяют белые, кремовые, коричневые расы гриба.
Плодовые тела шампиньона имеют центральную ножку, шляпку диаметром
5…10 см (иногда-до 33 см). Вначале она округлая, затем выпуклая,
выпуклораспростертая, в центре иногда чешуйчатая. Пластинки гименофора
свободные, тонкие, частые, розоватые в молодом возрасте, позднее темнеют и
становятся красно-бурыми или темно-бурыми, почти черными. Ножка 3...6 см в
длину, толщиной 1-2 см; гладкая, цилиндрическая, к основанию суженная, полая
или плотная внутри, под шляпкой красноватая, с кольцом.
Пищевая ценность шампиньонов определяется тем, что около половины
их сухого вещества составляет белок, который в организме здорового человека
переваривается и усваивается на 70...80 %. Плодовые тела этих грибов содержат
тиамин, витамины группы В, рибофлавин, аскорбиновую, пантеоновую,
фолиевую кислоты, провитамин Л, жирорастворимый витамин токоферол и др.
Шампиньоны богаты различными макро- и микроэлементами, в том числе
дефицитным селеном (около 100 мкг на 100 г сухой массы). Они являются
низкокалорийным продуктом – один кг свежих грибов содержит 175...380 кал, в
173
то же время употребление в пищу даже небольшого их количества вызывает
насыщение.
В искусственных условиях шампиньоны можно успешно культивировать в
течение всего года, при этом урожайность составляет 100... 150 кг с 1 м полезной
площади за один цикл культивирования, годовая урожайность может достигать
400...500 кг/м2. В районах, где безморозный период продолжается не менее
6 мес., в летнее время при невысокой температуре воздуха и достаточной
влажности шампиньоны можно разводить с применением легких укрытий,
предохраняющих субстрат от перегрева и создающих нормальный тепловой и
воздушный режим.
Субстраты для выращивания шампиньона принято называть компостами.
В производстве используются самые разнообразные рецепты компостов и
технологии их приготовления. Натуральный компост готовится с преобладанием
конского навоза. Основой синтетических и полусинтетических компостов –
субстратов является солома, к ней добавляют органические материалы и
минеральные удобрения, обеспечивающие смеси сходство по структуре и
содержанию элементов питания с натуральными компостами. Синтетические
компосты готовят с использованием соломы злаковых, куриного помета и
конского навоза, минеральных добавок. Для полусинтетических компостов
субстратов основой является конский навоз с добавлением соломы (лучше
пшеничной или ржаной) и минеральных веществ (гипс, мел, суперфосфат,
мочевина, аммиачная селитра, мясокостная мука, пивная дробина).
Приготовление компоста – сложный технологический процесс, имеющий
ряд особенностей. Состоит он из трех взаимосвязанных последовательных
этапов: увлажнение соломы (до 75...77 %); размягчение ее в анаэробных
условиях (без кислорода); термическая обработка (пастеризация). Качество
получаемого компоста зависит как от состава, так и от сроков и длительности
компостирования. Выбор компонентов компоста определяется их доступностью
и коммерческой обоснованностью. В специализированных хозяйствах все
технологические процессы автоматизированы, а основные параметры
(температура, влажность, подача кислорода, кислотность) регулируются в
оптимальном режиме. После того как компост готов, его раскладывают в
помещении для культивирования в гряды или в ящики на стеллажах и
высаживают посевной мицелий, который получают, выращивая чистую
174
культуру гриба либо на стерильном навозе, либо на зерновом субстрате.
Если инокуляции проводится мицелием, выращенным на навозе,
используют кусочки массой 15...20 г. Их раскладывают в шахматном порядке
двумя способами. В первом случае компост приподнимают на глубину 2...3 см и
в образующуюся щель кладут кусочек мицелия, приподнятый компост
прижимают, чтобы обеспечить контакт мицелия со средой культивирования. Во
втором – мицелий вносят в предварительно сделанные ямки (на глубину
4…7 см), размещая так, чтобы верхняя его часть была на 2...3 см ниже
поверхности гряды, ямки присыпают компостом и слегка уплотняют. Расход
мицелия, выращенного на навозе составляет 400...500 г на 1 м2 площади.
Если посевной мицелий выращен на зерновой среде, с поверхности
компоста снимают слой 3 см, посевной мицелий равномерно распределяют по
поверхности субстрата, слегка смешивая с ним, снятый компост насыпают
обратно и прижимают, создавая контакт между зерном и субстратом. Норма
внесения зернового мицелия составляет около 300 г на 1 м2 площади, иногда ее
увеличивают до 400 г.
Во время инокуляции очень важно, чтобы влажность компоста не
превышала 60 %, при этом температура воздуха в помещении должна составлять
22...24 °С, а его влажность – до 80 %.
Шампиньоны выращивают с применением однозональной или
многозональной системы культивирования. В первом случае весь цикл
культивирования проходит в одном помещении, во втором – в двух и более
специализированных помещениях, имеющих оптимальные условия для каждой
фазы роста и развития гриба.
В инкубационном помещении поддерживается t = 22-25 °С и 90...95 %-ная
влажность, что гарантирует предотвращение высыхания поверхностного слоя
компоста (полив его крайне нежелателен). При оптимальных условиях процесс
разрастания мицелия продолжается не более 14 дней. После чего проводят
гобтировку – насыпают покровный материал, создавая среду, способствующую
образованию плодовых тел шампиньона, при этом обязательно контролируют
разрастание мицелия вокруг посаженных кусочков. Перед внесением покровного
материала его стерилизуют или дезинфицируют. Для дезинфекции используют
40 %-ный раствор формалина (2...3 л на 1 м3). Покровный слой защищает
компост от колебаний температуры, способствует поддерживанию постоянной
175
влажности, предотвращает заселение его спорами болезнетворных
микроорганизмов и конкурентных грибов. Обычно используют смесь,
состоящую из равных частей песка и торфа, смешанную с известью или мелко
комковатой, слабощелочной (суглинистой или супесчаной) почвой, с небольшим
количеством перегноя. Структура покровной смеси очень сильно влияет на
урожай шампиньонов, чтобы не нарушать ее при поливе, увлажнение компоста
лучше проводить только после того, как мицелий пророс в почву, применяя при
этом краткие опрыскивания с интервалом в 3-4 дня.
В процессе культивирования шампиньона важна правильная вентиляция,
которая оптимизирует содержание углекислого газа и необходимого уровня
влажности воздуха, что способствует формированию мицелиальных тяжей, на
которых затем формируются плодовые тела.
Плодоношение шампиньонов имеет волнообразный характер, промежутки
между волнами и их длина определяется состоянием культуры и технологией
выращивания. Как правило, длина волны составляет до 5 дней. Наибольшее
количество плодовых тел приходится на первую половину плодоношения, затем
урожаи снижаются.
По окончании срока плодоношения использованный компост вывозят из
шампиньонницы и используют в качестве удобрения под овощные культуры.
Старый шампиньонный субстрат можно использовать для приготовления
покровной смеси. В этом случае через год после выгрузки из шампиньонницы
субстрат смешивают с глинистой почвой, подвергают термической обработке и
покрывают им инокулированный компост.
Культивационные помещения после окончания плодоношения тщательно
моют и дезинфицируют.
Производство шампиньонов представляет собой типичную монокультуру.
В относительно небольшом закрытом помещении при повышенной температуре
и влажности создаются условия, благоприятные для развития вирусных,
грибных и бактериальных болезней, а также насекомых-вредителей. Потери
урожая в результате поражения патогенными организмами могут сделать
грибное производство экономически нецелесообразным.
Вирусная инфекция может быть занесена в шампиньонницу с зараженным
посадочным материалом и передастся от больного мицелия к здоровому.
Источником заражения могут быть пораженный мицелий, плодовые тела, споры
176
грибов. Переносчиками вирусов могут быть насекомые. Потери от вирусных
болезней определяются снижением продуктивности и ухудшением качества
грибов. Вирусная инфекция может быть выявлена методом иммунодиагностики,
который позволяет обнаружить вирусные частицы в мицелии и тканях плодовых
тел.
Главным моментом в борьбе с вирусными болезнями является
профилактика, направленная на уничтожение источников инфекции и
перекрытие всех возможных путей ее проникновения, а также уничтожение
переносчиков инфекции.
Среди бактериальных болезней наиболее распространены бурая
(коричневая) пятнистость, мумификация и мокрые бактериальные гнили (гниль
пластинок). Развитию бактериозов способствует высокая влажность воздуха и
повышенная температура. Источниками бактериальной инфекции являются
пораженные мицелий и плодовые тела грибов. Переносчиками возбудителей
бактериозов могут быть двукрылые (мухи), клещи, нематоды и даже персонал.
Соблюдение режима культивирования, своевременное проветривание
шампиьонницы являются основой профилактики бактериозов.
Наиболее серьезный ущерб культуре шампиньонов приносят грибные
болезни, возбудители которых могут обитать в компосте, покровной почве,
внутри и на поверхности кроющегося слоя. В компосте (в основном в соломе)
часто встречается возбудитель оливковой плесени (Miceliophora lutea). Этот гриб
по скорости роста мицелия опережает шампиньон в 3-4 раза и является его
конкурентом при освоении субстрата. В комплексе с возбудителем оливковой
плесени часто встречается гриб стисанус (Stisanus sp.), появление которого
свидетельствует о том, что в ходе подготовки компоста не был доведен до конца
процесс разложения соломы. Очень часто культуру шампиньона сопровождают
грибы навозники (чернильные грибы). Их плодовые тела при созревания
расплываются, превращаясь в чернильную жидкость, которая издает
специфический запах, привлекающий мух, они и разносят споры навозника по
шампиньоннице. Появление этих грибов свидетельствует о нарушениях в
процессе пастеризации субстрата.
В компосте и покровном слое могут развиваться возбудители гипсовой
(Sccoopulariopsis fimicola и Populaspora fimicola), бурой (коричневой)
(Populaspora bissina) и зеленой плесеней (Cbaetomium spp, Trichoderma spp.)
177
Появление гипсовой плесени является показателем неудовлетворительной
структуры и качества компоста (использование старого некачественного навоза,
переувлажненность субстрата и, как следствие – повышенный уровень pH). Если
в период прорастания шампиньонного мицелия температура и влажность в
помещении повышены возможно появление бурой (коричневой) плесени.
Грибы-возбудители зеленых плесеней встречаются в компосте, кроющем слое и
на его поверхности. Их присутствие говорит о нарушениях процесса
пастеризации, следствием чего является снижение селективности компоста.
Зеленые плесени очень быстро разрастаются в субстрате, особенно если
мицелий шампиньона в результате каких-либо причин ослаблен. Посевной
зерновой мицелий в большей степени подвержен поражению зелеными
плесенями, чем навозный.
Внутри и на поверхности покровной почвы встречаются возбудители
паутинистой болезни (Dactylim dendoroide), сухой гнили – вертициллеза
(Verticilium ftmgicola), мокрой белой гнили (Mycogone periciosa). Споры этих
грибов попадают в шампиньонницу чаще всего с покровной почвой, могут
заносится и с вентиляционным воздухомвоздухом, инструментарием, через руки
и одежду персонала, а также насекомыми.
Грибные болезни в шампиньоннице развиваются, как правило, в
результате нарушений в технологии подготовки компоста, поэтому получение
высоких урожаев и здоровых плодовых тел может быть обеспечено точным
соблюдением технологических норм на всех этапах подготовки субстрата и
культивирования плодовых тел.
Среди насекомых наиболее распространенными и опасными вредителями
шампиньонов являются нематоды, клещи, мокрицы, ногохвостки, двукрылые
(грибные мухи, грибные комарики, галлицы). Все они повреждают как
плодовые тела, так и мицелий шампиньонов.
Насекомые попадают в шампиньонницу с субстратом или с покровной
смесью (если была неправильно проведена их пастеризация или дезинфекция),
во время вентиляции, а также при нарушении общих гигиенических норм
работы.
Выращивание шампиньонов проводится в закрытых помещениях, при
контролируемых и регулируемых условиях. Поэтому залогом высокого урожая
и получения стандартных и здоровых плодовых тел является создание и строгое
178
соблюдение оптимального режима культивирования, а также выполнение всех
технологических требований по подготовке субстрата и общих гигиенических
норм. Во многом успех работы определяет правильный выбор штамма гриба для
культивирования, поскольку различные штаммы шампиньона отличаются по
восприимчивости к поражению патогенами.
3.3.2 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КОЛЬЦЕВИКА
(STROPHARIA RUGOSOANNULATA)
Кольцевик или строфария морщинисто-кольцевая – почвенный
сапротроф, малоизвестный съедобный гриб, который для искусственного
культивирования используется сравнительно недавно.
Диаметр шляпки этого гриба составляет 8... 10 см (иногда до 40 см); в
молодом возрасте она белая, затем желтеет, становится каштановой или
красновато-бурой. Пластинки гименофора с возрастом меняют окраску от
беловатой до иссиня-черной. Ножка утолщенная, кремовая или серо-желтая, с
хорошо выраженным кольцом (остатком общего покрывала), с возрастом
становится внутри полой.
Кольцевик имеет сильный грибной аромат, его сравнивают с белым
грибом и подосиновиком, отмечая присутствие ароматических веществ,
сходных с запахом редиса. В его плодовых телах содержится большое
количество минеральных веществ (калия, фосфора, железа, марганца,
молибдена, кобальта, меди, цинка), много витаминов (группы В и РР). По
индексу питательности кольцевик приравнивается к арахису, а по
аминокислотному индексу находится на уровне картофеля, моркови и томатов.
Главным достоинством этого гриба является нетребовательность к
условиям выращивания и простота подготовки субстрата. Кольцевик устойчив к
колебаниям температуры и влажности, что позволяет выращивать его в
открытом грунте. Основным требованием культивирования является
достаточное увлажнение субстрата. Для выращивания кольцевика используют
солому злаков и ее смесь с измельченными початками кукурузы и льняной
кострой. Опилки, стружки, листва, навоз и минеральные удобрения для
выращивания этого гриба непригодны – они отрицательно влияют на рост
грибницы. Солома должна быть свежей, золотистого цвета, блестящей. Ее
измельчают и доводят до влажности 70...75 %. Выращивают кольцевик чаще
179
всего на грядах или в ящиках и полиэтиленовых мешках в теплицах, парниках,
пленочных тоннелях. Для роста гриба требуется рассеянный свет, в тени
кольцевик растет плохо. После укладки соломы в грядки или набивки ею
мешков или ящиков проводят инокуляцию кусочками посевного мицелия
(размером 3x3 см), которые вносят в субстрат на расстоянии 20 см друг от друга
на глубину 5...6 см, (по 500...600 г на 1 м2 поверхности субстрата). После этого
грядки накрывают мокрой мешковиной или несколькими слоями влажной
бумаги, осторожно поливают, не допуския попадания воды в субстрат.
Оптимальная температура культивирования в этот период составляет 25...28 °С.
Мицелий осваивает субстрат в течение 3...6 недель. Как только вся солома
покроется белым, приятно пахнущим мицелием, покрытие с грядок убирают, а
на их поверхность наносят слой грунта (около 5 см), который стимулирует
образование плодовых тел и, кроме того, предохраняет мицелий от высыхания.
Урожай кольцевика во многом зависит от состава покровного грунта.
Оптимальным считается смесь верхового торфа с крупнозернистым речным
песком в соотношении 2:1. Покровный слой увлажняют (на уровне 70...75 %) с
таким расчетом, чтобы вода не достигала субстрата. От времени появления
зачатков плодовых тел (примордиев) до окончательного их развития проходит
1-2 недели. Урожай появляется волнами, через равные промежутки времени
(10... 12 дней), большая его часть приходится на первые две волны. Сбор
плодовых тел продолжается до наступления холодов. В зависимости от
погодных условий и квалификации грибовода можно получать от 5 до 20 и
более кг грибов с 1 м2 гряд. В период сбора урожая гриб менее чувствителен к
колебаниям температуры, в это время необходимы проветривания теплиц.
При сборе плодовых тел кольцевика их не срезают, а выкручивают из
субстрата, а образовавшиеся ямки засыпают покровным грунтом. Хранятся
плодовые тела кольцевика недолго: в холодильнике в полиэтиленовых пакетах
2-3 суток.
Если до холодов было собрано 3 волны урожая, на следующий год нужно
создавать новые гряды, поскольку гриб утилизировал все полезные вещества
субстрата, если только 2 волны, то на зиму гряды можно укрыть пленкой, сухой
листвой, соломенными матами, а весной раскрыть (в зависимости от погодных
условий) и в апреле – мае собрать очередное плодоношение. Использованный
субстрат является хорошим удобрением для огурцов и других овощных культур.
180
3.4 ВЫРАЩИВАНИЕ ГРИБОВ-МИКОРИЗООБРАЗОВАТЕЛЕЙ
Большинство ценных дикорастущих съедобных грибов является микоризообразователями – образуют симбиоз с корнями травянистых и древесных
растений. Развитие и плодоношение этих грибов связаны с определенными
древесными породами, поэтому их искусственное выращивание весьма
проблематично, но тем не менее известны попытки удачного их разведения в
естественной среде их обитания. С этой целью проводят искусственную
инокуляцию субстрата и создают условия, благоприятствующие развитию мицелия и образованию плодовых тел.
3.4.1
РАЗВЕДЕНИЕ ТРЮФЕЛЕЙ (TUBER)
Из множества микоризных грибов наиболее часто выращивают трюфели.
Эти грибы относятся к классу сумчатых, являются облигатными
(обязательными) микоризообразователями. Самыми ценными считаются
плодовые тела настоящего черного французского трюфеля. В природе он растет
в буковых или дубовых лесах на сухой рыхлой почве, иногда этот гриб
встречается под вязами и тополями. Плодовое тело клубневидное или округлое,
размером oт грецкого ореха до небольшого яблока, поверхность его покрыта
черными пирамидальными бородавками. В больших количествах черный
трюфель собирают на юге Франции, встречается он в Швейцарии, северной
Италии, реже – на юге Германии. Первые искусственные плантации этого гриба
были созданы в середине XVII века во Франции и Германии. Кроме черного
трюфеля, в пищу используется белый и степной трюфели.
Белый трюфель (Т. magnatum) встречается в хвойных (молодых ельниках),
лиственных (осинники, березняки) и смешанных лесах (под кустами лещины) на
умеренно влажных, хорошо прогреваемых почвах со слабым травянистым
покровом. Его плодовые тела напоминают по форме клубни картофеля, по массе
они достигают 500 г и более. Растут белые трюфели, как правило, гнездами по
3-5 шт. Этот гриб широко распространен в Западной Европе, на Украине, в
Тульской, Орловской, Смоленской, Владимирской, Московской областях, в
Среднем Поволжье. В XIX крестьяне Подмосковья (Загорск, Александров)
возили на продажу до 5 тонн белых трюфелей в год.
181
Плодовые тела степного (африканского) трюфеля (Terfezia leonis)
напоминают небольшую продолговатую картофелину (до 5 см в длину). Они
отличаются очень приятным грибным ароматом, в Римской империи этот гриб
ценился буквально на вес золота. Встречается в Северной Африке, на Ближнем
Востоке, в средиземноморских странах.
На поверхности почвы плодовые тела трюфелей появляются очень редко,
поэтому обнаружить их весьма сложно – по едва заметным, лишенным
растительности бугоркам на почве. Для поиска этого деликатесного гриба
используют домашних животных, определяющих местонахождение этих грибов
по запаху. Во Франции для этих целей обучали свиней (они чуют гриб за 20 м), в
России – бурых медведей. Хорошо поддаются такого рода дрессировке болонки,
коротконогие пудели, дворняжки; охотничьи собаки для поиска трюфелей
непригодны. Щенков-самок поят молоком, в которое добавляют настой
трюфелей, когда щенки подрастают, им дают игрушки, натертые трюфелями,
прячут их, а когда щенки их находят – поощряют. Трюфели можно находить и
без помощи животных по характерным приметам. Они обычно обитают на
светлых прогалинах, полянах, опушках со слабым травостоем. Растут гнездами,
трава и мох над ними как бы высохшие, а почва вздувается бугорками, от
которых отходят мелкие трещинки, к вечеру над ними кружатся мошки,
привлеченные грибным запахом.
Для создания плантаций трюфелей на юге Франции и в Италии
используют “непрямой” способ – во время посева желудей в посевные борозды
вносят почву, содержащую споры и мицелий гриба. Через 10-12 лет в молодых
дубовых культурах появляются плодоношения этого ценного гриба.
Практикуется также выращивание дубовых сеянцев с искусственно
микоризированной корневой системой. В этом случае при должном уходе за
культурами плодовые тела гриба появляются на 6-7-й год выращивания.
Длительность плодоношения на плантации состашшет 25...30 лет, при этом с
1 га собирают 12...15 кг грибов, цена трюфелей на мировом рынке составляет
около 400 долларов США за 1 кг.
182
3.4.2 ПОПЫТКИ
EDULIS)
РАЗВЕДЕНИЯ
БЕЛОГО
ГРИБА
(BOLETUS
Белый гриб является наиболее ценным из всех съедобных
микоризообразующих грибов. В 30-е годы XX века был предложен способ
выращивания белых грибов. Сначала проводили стимуляцию образования
дополнительных тонких молодых корешков у деревьев, а затем – их
инокуляцию, для которой использовали споры гриба и грибную ткань. На
следующий год, как на месте инокуляции, так и на некотором расстоянии от
него образовывались плодовые тела. Плодоношение было и в последующие
годы. В настоящее время известно несколько способов разведения белых грибов,
в основе которых лежит искусственное внесение мицелия триба (в той или иной
форме) в подготовленную почву. Эти методики можно использовать и для
выращивания
других
микоризообразующих
грибов:
подберезовиков,
подосиновиков,
маслят,
рядовок.
Во
Франции
плодоношение
микоризообразующих грибов были получены при помощи микоризации сеянцев
хвойных пород чистыми культурами масленка летнего и рыжика. Через 4 года
были получены первые плодовые тела, в последующие годы около каждого
дерева собирали по 1...3 кг маслят и 400...500 г рыжиков.
Во многих странах мира ведутся интенсивные поиски путей
культивирования микоризообразующих грибов в искусственных условиях, но
пока разработать эффективную методику получения их плодовых тел не
удалось, хотя в литературе есть сведения об удачных экспериментах. Так,
профессор Я.Е. Карпинский (Польша) из зачатка плодового тела с грибницей,
взятых из природных условий, вырастил в культуральном сосуде нормальное
плодовое тело белого гриба величиной 3 см. Японские ученые сообщили о
получении плодовых тел белого гриба в лаборатории. Возможно, на основании
этих экспериментов будут разработаны способы интенсивного производства
плодовых тел микоризных грибов в искусственных условиях.
Уже сейчас успешно осуществляется выращивание в жидкой питательной
среде погруженного мицелия микоризообразующих грибов (лисичек, белого
гриба и некоторых других видов). Такой мицелий хорошо развивается, содержит
все основные питательные вещества, присущие данному виду гриба в природе,
но теряет специфический грибной запах, что в значительной степени
ограничивает его использование.
183
3.5 ВЫРАЩИВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ
ЭКЗОТИЧЕСКИХ ГРИБОВ
Среди культивируемых экзотических видов грибов наибольший интерес
представляют сморчки (Morchella spp.), фламмулина бархатистоножковая или
зимний гриб (Flammulma velutipes), и опенок летний (Kuehneromyces mutabitis).
3.5.1 РАЗВЕДЕНИЕ СМОРЧКОВ
Сморчки – это первые грибы, появляющиеся в лесу после схода снега.
Наиболее часто встречается три вида сморчков: сморчок настоящий (Morchella
esculenta), сморчок конический (Morchella conica) и сморчковая шапочка (Verpa
bohemica). Все они ценятся за тонкий аромат и нежный вкус. Но следует
помнить, что перед употреблением в пищу сморчки подлежат обязательному
отвариванию в течение 10... 15 мин (отвар сливается!). Сморчки относятся к
классу сумчатых грибов, а по способу питания это напочвенные сапротрофы,
что является теоретической предпосылкой их выращивания в искусственных
условиях. Тем не менее, интенсивной технологии культивирования этого гриба
до сих пер еще не предложено. В настоящее время разработано несколько
способов экстенсивного выращивания сморчков (в естественных условиях их
произрастания).
В Германии был предложен способ, в основе которого лежит их
особенность развиваться на лесных пожарищах. При искусственном
культивировании предлагается в почву вносить кусочки плодовых тел сморчков
и засыпать их золой. Во Франции за основу была взята особенность сморчков
обильно развиваться на гниющих яблоках. По грядкам разбрасывали кусочки
грибов, осенью их рыхлили и закрывали слоем яблочных выжимок. В обоих
случаях на зиму грядки укрывали соломой или листвой, весной укрытие убирали
и через 2-3 недели собирали первые грибы. Эти методы пригодны для
выращивания сморчков на приусадебном или дачном участке.
В культуре на питательных средах мицелий сморчков растет хорошо, но
получить плодовые тела этого гриба в закрытых помещениях пока не удалось.
Во Франции были получены мелкие и немногочисленные грибы; доказана лишь
возможность выращивания сморчков в культуре, но способы их промышленного
184
производства и отбор наиболее продуктивных штаммов нуждаются в
дальнейшей разработке.
3.5.2 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ФЛАММУЛИНЫ
БАРХАТИСТОНОЖКОВОЙ
Фламмулина бархатистоножковая (зимний гриб, зимний опенок) – базидиальный гриб семейства рядовковых, широко распространен в природе,
встречается повсеместно как на валежных стволах, так и на живых деревьях,
приводя их к гибели. Он обладает большой скоростью роста и интенсивным
образованием плодовых тел, которые могут появляться поздней осенью и даже
зимой, когда плодоношение других грибов прекращается. Фламмулине не
страшны заморозки, после их окончания плодовые тела оттаивают и вновь
трогаются в рост. Образуются они кучками (до 30-40 шт.), шляпка выпуклая, голая, гладкая, слизистая, кремовая, бледно-желтая или желтовато-рыжая, от 1,5 до
10 см в диаметре. Ножка чаще центральная, цилиндрическая, желтоватого цвета,
у основания почти черная, волосисто-бархатистая, с корневищным выростом,
глубоко заходящим в субстрат.
Фламмулина обладает целым рядом полезных свойств, главным из
которых является способность синтезировать ферменты тромболитического
действия и белок, тормозящий рост саркомы. В настоящее время ведутся
интенсивные исследования антибиотических и противоопухолевых свойств
опенка зимнего с целью создания новых лекарственных препаратов.
Для культивирования этого гриба используют экстенсивную технологию
(на отходах деревопереработки, впервые запатентованную в Японии) и
интенсивную (объемы производства которой достигли более 100 тыс. т в год).
Основными производителями опенка зимнего являются страны АзиатскоТихоокеанского региона: Япония, Корея, Китай, Тайвань.
При интенсивном культивировании гриб выращивают в стеклянных
банках или пакетах из термостойких пластмасс на стерильном субстрате из
смеси опилок (тополя, осины, ольхи, березы, фруктовых деревьев), соломы
(рисовой и других злаков, а также гречишной шелухи, лузги подсолнечника) и
минеральных добавок.
Японская
технология
предусматривает
использование
опилок
криптомерии и сосны, а в качестве добавок – пивной дробины, мелассы,
185
зерноотходов, костной муки, кукурузного шрота, пепла, минеральных форм
азота. Зимний опенок может расти на отходах бумажной промышленности –
сульфатной пульпе и коре в смеси с рисовыми отрубями.
Культивирование фламмулины в искусственных условиях имеет ряд
особенностей. Этот гриб не отличается высокой конкурентной способностью,
поэтому субстрат для его культивирования нужно автоклавировать, применять
пастеризацию нежелательно – она не обеспечивает полную гибель конкурентных
микроорганизмов. Мицелий фламмулины лучше развивается на небольших
объемах стерильного субстрата (0,5-1 кг) в этом случае он осваивает его за
2-3 недели. Для нормально развития плодовых тел опенку необходимы
температура 10...12 °С, влажность 80.. .85 %, свет 50..100 люкс в течение 10... 12
часов в сутки и вентиляция помещения с 4-5-кратной сменой воздуха в час.
После образования зачатков плодовых тел температуру снижают до 3...5 °С и
поддерживают на этом уровне в течение недели, что способствует образованию
более плотных плодовых тел. Как только длина ножки составит 2…3 см,
температуру повышают до 5...8 °С, сохраняя эти значения до конца
культивирования. Когда плодовые тела дорастут до краев банки, ее горловину
оборачивают полоской картона, которую периодически увлажняют; при длине
ножки 12... 15 см, картон убирают, а плодовые тела срезают как цветы. Через
2…2,5 недели появляется вторая волна грибов, урожай которой составляет
примерно 1/3 от урожая первой волны. Бывает и третья волна плодоношения, но
она, как правило, слабая. В зависимости от состава используемого субстрата,
общий урожай составляет 25...30 % его массы. После окончания плодоношения
использованный субстрат после его термической обработки может быть
использован в качестве удобрения для овощных культур.
Экстенсивная технология выращивания фламмулины такая же, как при
культивировании вешенки. В качестве субстрата используют пни и отрубки
тополя, ивы, осины, липы и других пород с мягкой древесиной, которые
инокулируют зерновым мицелием и выдерживают в течение 4-5 месяцев во
влажных помещениях или траншеях. В течение этого времени гриб полностью
осваивает субстрат. Осенью отрубки выставляют в затененные места, а после
первых заморозков на них появляются плодовые тел. За сезон с одного пня
можно собрать 100...400 г грибов. Длительность плодоношения на такой
плантации составляет 5-6 лет.
186
3.5.3 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ОПЕНКА ЛЕТНЕГО
Опенок летний – сапроторофный дереворазрушающий базидиальный
гриб. Распространен повсеместно в Европе, Азии, Северной Америке,
Австралии. В природе гриб растет на пнях, сухостойных стволах, валежнике
многих лиственных пород (каштана, бука, граба, клена, осины, березы, липы,
реже на хвойных породах). Плодоносит с весны до конца октября-начала ноября,
образуя большие колонии плодовых тел. Шляпка гриба до 7 см в диаметре, в
молодом возрасте выпуклая, затянутая снизу паутинистым покрывалом, затем
плоско-выпуклая и распростертая, с бугорком в центре; ее окраска от охряножелтой до желтовато-коричневой, в центре более светлая, по краю с
просвечивающимися полосами. Ножка центральная, длиной до 8 см, толщиной
0,5 см, к основанию суженная; с буроватым узким кольцом, выше которого –
голая, беловатая или кремовая, ниже – хлопьевидно-чешуйчатая, ржаво-бурая;
жесткая, волокнистая; цилиндрическая, с возрастом становится внутри полой.
Пищевая ценность опенка летнего определяется содержащимися в нем
витаминами, макро- и микроэлементами, ароматическими и биологически
активными веществами. Так, по количеству витамина РР этот гриб может быть
сравним с говяжьей печенью, а витамина B1 в нем значительно больше, чем в
других культивируемых грибах.
Опенок летний культивируют по экстенсивной и интенсивной технологии.
Первые успешные попытки искусственного выращивания этого гриба были
предприняты в нашей стране в 30-е годы XX века. Спустя 10 лет в Германии
был разработан способ выращивания опенка летнего под пологом леса на пнях и
чурбаках. Теперь этот гриб выращивают также в Чехии, Венгрии, Белоруссии,
на Украине.
Экстенсивная технология выращивания летнего опенка такая же, как при
культивировании вешенки. Используется свежесрубленная древесина
лиственных пород, за исключением косточковых. При выращивании этого гриба
на пнях отпадает необходимость их раскорчевки – в зависимости от величины
пня, гриб его разрушает за 5...8 лет. Плодоношение летнего опенка наступает
после того, как мицелий освоит большую часть субстрата и накопит достаточное
количество питательных веществ, как правило, это происходит через 1-2 года.
В Германии древесину, на которой выращивают летний опенок,
187
впоследствии используют для различных поделок. Пронизанная гифами гриба
древесина получила название микодревесина. При пропитывании ее раствором
омыленного парафина получают материал, который легко обрабатывается и
может заменить древесину ливанского кедра при изготовлении лекал, линеек и
т.д. Непропитанную парафином микодревесину применяют при изготовлении
форм, используемых в стеклодувном производстве, при этом срок их службы в
15 раз дольше, чем традиционных форм, изготавливаемых из древесины груши.
Для культивирования летнего опенка можно использовать древесные
отходы (ветки, тонкие стволики, опилки, стружки). Их помещают в траншеи,
вносят мицелий опенка и засыпают слоем почвы в 5 см. В этом случае опенок
плодоносит в течение двух лет, после чего субстрат заменяют новым.
Интенсивная технология предусматривает выращивание опенка летнего в
стеклянных банках, используя в качестве субстрата опилки, стружки или их
смеси с добавлением (15...20 % по весу) отходов зернового или мукомольного
производства. В качестве питательных добавок в субстрат вносят солод, пивное
сусло, картофельную мезгу, пивную дробину, лузгу семян подсолнечника.
Кислотность субстрата должна быть 6,0...7,0. Субстрат стерилизуют (2 часа при
атм.) или пастеризуют (в течение 12 часов при 60 °С, а в течение следующих 2-х
суток постепенно снижая температуру до 45°). Подготовленный субстрат
фасуют в мешки, инокулируют и инкубируют так же, как вешенку.
Для формирования качественных плодовых тел летнего опенка
необходима освещенность 100...200 люкс в течение 11 часов каждые сутки,
влажность воздуха 85...90 %, температура около 16 °С, усиленная вентиляция.
Плодоношение имеет две волны. Общий урожай опенка летнего при
интенсивном культивировании составляет 10...30 % от массы субстрата. В пищу,
как правило, используют только шляпки, поскольку ножки имеют жесткую
структуру.
Недостатком опенка летнего является его плохая транспортабельность:
нежные плодовые тела быстро теряют товарный вид при механических
повреждениях. Поэтому производство этого гриба лучше организовывать вблизи
от потребителя.
188
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Биотехнологии в лесном хозяйстве в развивающихся странах
[Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.fao.org/biotech/sectoraloverviews/biotech-forestry/ru/.
2. Биотехнология растений: Культура клеток [Текст] / под ред.
Р. Г. Бутенко. – М. : Агропромиздат, 1998. – 279 с.
3. Бутенко, О. Ю. Сравнение скорости роста культур сосны и ели,
созданных сеянцами и микрорегенерантами in vitro[Текст] / О. Ю. Бутенко, Д. А.
Шабунин, А. В. Жигунов // Инновации и технологии в лесном хозяйстве. ITF2016 : тезисы докладов V Международной научно-практической конференции,
31 мая-2 июня 2016 г. – СПб., 2016. – С. 40.
4. Вечернина, Н. А. Биотехнология растений [Текст] : учеб. пособие /
Н. А. Вечернина. – Барнаул, 2009. – 224 с.
5. Влияние самоопыления на качество семян и рост потомства у
некоторых видов березы [Текст] Ю. Н. Исаков, Л. А. Миленная, В. В. Иевлев,
И. Ю. Исаков // Генетические и экологические основы повышения
продуктивности лесов : сб. науч. трудов ; отв. ред. С. А. Петров. – Воронеж,
1993. – С. 23-30.
6. Глазко, В. И. Кризис аграрной цивилизации и генетически
модифицированные организмы [Текст] / В. И. Глазко. – Киев : PA NOVA, 2006.
– 206 с.
7. Грибы и грибоводство [Текст] / под ред. П. А. Сычева. – Донецк :
Сталкер, 2003. – 511 с.
8. Егорова, Т. Е. Основы биотехнологии [Текст] : учеб. пособие /
Т. Е. Егорова, М. С. Клунова, Е. А. Живухина. – М. : Академия, 2003. – 208 с.
9. Исаков, И. Ю. Инбридинг и гибридизация в роде Береза. Генезис и
значение [Текст] : моногр. / И. Ю. Исаков, Ю. Н. Исаков. – Германия : LAP
(Lambert Academic Publishing), 2015. – 104 с.
10. Калашникова, Е. А. Получение посадочного материала древесных,
цветочных и травянистых растений с использованием методов клеточной и
генной инженерии [Текст] : учеб. пособие / Е. А. Калашникова, А. Р. Родин. –
М., 2001. – 73 с.
11. Комплексная программа развития биотехнологии в Российской
189
Федерации на период до 2020 года [Электронный ресурс] : утв. Правительством
РФ 24 апреля 2012 года № 1853 п-П8 // СПС КонсультантПлюс / ВГЛТУ.
12. Лутова, Л. А. Биотехнология высших растений [Текст] : учеб. /
Л. А. Лутова. – СПб., 2010. – 240 с.
13. Машкина, О. С. Методические рекомендации по выращиванию
посадочного материала сортов тополя сереющего с использованием технологии
in vitro [Текст] / О. С. Машкина, А. И. Сиволапов, Т. М. Табацкая. – Воронеж,
2011. – 30 с.
14. Морковина, С. С. Инструментарий развития лесного комплекса на базе
биотехнологий [Текст] : моногр. / С. С. Морковина, А. В. Иванова,
В. Е. Сухова. – Воронеж, 2016. – 191 с.
15. Морозов, А. И. Грибы: руководство по разведению [Текст] /
А. И. Морозов. – Донецк : Сталкер, 2000. – 302 с.
16. Мурая, Л. С. Хромосомный полиморфизм семенного потомства
аллотриплоида тополя сереющего [Текст] / Л. С. Мурая, А. И. Сиволапов,
О. С. Машкина // Проблемы репродуктивной биологии растений : тез. докл.
симпозиума (Пермь, 4-6 июня 1996 г.). – Пермь, 1996. – С. 144-145.
17. Нечаева, М. Ю. Биотехнология в лесном хозяйстве [Текст] : учеб.
пособие / М. Ю. Нечаева. – Воронеж, 2006. – 143 с.
18. Перспективы создания плантационных культур быстрорастущих
древесных пород биотехнологией in vitro в лесостепи // Инновации и
технологии в лесном хозяйстве. ITF-2016 : тезисы докладов V Международной
научно-практической конференции, 31 мая-2 июня 2016 г. [Текст] /
А. И. Сиволапов, Т. А. Благодарова, В. А. Сиволапов, С. С. Морковина. –
СПб., 2016. – С. 127.
19. Приказ Минприроды РФ от 20.10.2015 № 438 «Об утверждении
Правил создания и выделения объектов лесного семеноводства (лесосеменных
плантаций, постоянных лесосеменных участков и подобных объектов)»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 12.02.2016 № 41078) [Электронный ресурс] //
СПС КонсультантПлюс / ВГЛТУ.
20. Рекомендации по сохранению и воспроизводству методами
биотехнологии ценных генотипов карельской березы, осины, тополя белого и
сереющего [Текст] / сост. О. С. Машкина, Т. М. Табацкая. – Воронеж, 2005. –
29 с.
190
21. Сельскохозяйственная биотехнология [Текст] : учеб. / В. С. Шевелуха
[и др.]. – 3-е изд. – М. : Высш. шк., 2008. – 710 с.
22. Сиволапов, А. И. Селекция и семеноводство древесных растений
[Текст] : учеб. пособие / А. И. Сиволапов. – Воронеж, 2011. – 204 с.
23. Скаукрофт, У. Р. Сомаклональная изменчивость: Миф о клональном
единообразии [Текст] : пер.с англ. / У. Р. Скаукрофт // Мобильность генома
растений. – М. : Агропромиздат, 1990. – С. 228-260.
24. Тимофеева, О. А. Клональное микроразмножение растений [Текст] :
учебно-метод. пособие / О. А. Тимофеева, Ю. Ю. Невмержицкая. – Казань, 2012.
– 56 с.
25. Цитологические, молекулярные и лесоводственно-селекционные
исследования
коллекции
полиплоидных
тополей
[Текст]
/
А. И. Сиволапов, Д. В. Политов, О. С. Машкина, М. М. Белоконь,
В. А. Сиволапов, Ю. С. Белоконь, Т. М. Табацкая // Сибирский лесной журнал.
– 2014. – № 4. – С. 50-58.
26. Шестибратов, К. А. Лесная биотехнология в России: современное
состояние и перспективы развития [Текст] / К. А. Шестибратов // Инновации и
технологии в лесном хозяйстве. ITF-2016 : тезисы докладов V Международной
научно-практической конференции, 31 мая-2 июня 2016 г. – СПб., 2016. –
С. 151.
27. Щелкунов, С. Н. Генетическая инженерия [Текст] / С. Н. Щелкунов. –
Новосибирск, 2004. – 495 с.
28. Isakov, I. Yu. Peculiarities of growth and development of seed progeny in
silver birch, downy birch and ordinary pine (Pinus silvestris) produced by differed
pollination methods [Text] / I. Yu. Isakov, Yu. N. Isakov // Genetics – Understanding
Living Systems. ХХ International Congress of Genetics : Abstract Book. – German
Genetics Society, 2008. – P. 191-192.
29. Ramawat, K. G. Tree biotechnology [Text] / K. G. Ramawat,
J. M. Mérillon, M. R. Ahuja. – CRC Press, 2014. – 656 p.
30. Some aspects of the nature of figured wood of Karelian birch and its
development by different methods of propagation [Text] / Yu. N. Isakov,
O. S. Mashkina, T. M. Tabatskaya, I. Yu. Isakov // Проблемы развития лесного
комплекса. – Петрозаводск, 1998. – С. 10-12.
191
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ
Агробиотехнология (см. Биотехнология сельскохозяйственная).
Аквакультура – разведение и выращивание рыбы, других водных
животных (моллюсков, ракообразных) и растений (водорослей) с целью
получения товарной продукции и пополнения их запасов в естественных
водоемах.
Адвентивные почки – почки, индуцированные in vitro, из клеток и тканей
в природе их не образующих.
Андрогенез – процесс формирования растения in vitro непосредственно из
микроспоры или пыльцевого зерна, либо через образование каллуса из этого же
материала.
Антибиотики (лат. "anti" - против + греч. "bios" - жизнь) – вещества
природного или полусинтетического происхождения, подавляющие рост живых
клеток, чаще всего прокариот или простейших (в т.ч. бактерий, вирусов и др.).
Антибиотики ветеринарные – ветеринарные формы антибиотиков. В
нашей стране наиболее часто используются тетрациклины, гризин, бацитрацин
и витамицин.
Анеуппоидия – уменьшение или увеличение числа хромосом, некратное
основному числу хромосом вида, вызывающее наследственные изменения.
Апикальное доминирование – подавление роста верхушечных почек на
боковых побегах гормонами, вырабатываемыми верхушечной (апикальной)
меристемой.
Асептика – комплекс приемов и методов, обеспечивающий условия
стерильности.
Ауксины – гормоны растений, производные индола; образуются в
апикальных меристемах и стимулируют клеточное растяжение, рост отрезков
колеоптилей, стеблей, листьев и корней, вызывают их изгибы, а также
усиливают образование корней у черенков.
Бактериофаг (сокр. фаг) – вирус, инфицирующий бактерию. Его
видоизмененные формы используются как клонирующие векторы.
Биобезопасность (см. Биологическая безопасность).
192
Биобензин – разновидность биотоплива: смесь бензина с этиловым или
бутиловым спиртом.
Биобутанол – разновидность биотоплива; бутиловый спирт, получаемый
биотехнологическим способом из сахарного тростника, свеклы, кукурузы,
пшеницы, маниоки, целлюлозы и др.
Биоводород – водород, полученный из биомассы.
Биовыщелачивание – восстановление металлов из руды путем
использования микроорганизмов.
Биогаз – газ, получаемый метановым брожением биомассы (смесь СН4 и
С02).
Биогеотехнология – использование геохимической деятельности
микроорганизмов в горнодобывающей промышленности.
Биогидрометаллургия – извлечение металлов из сырья с использованием
химических реакций в водных растворах.
Биодатчик (см. Биосенсор).
Биодеградация – процесс, при котором органические вещества
разрушаются ферментами, вырабатываемыми живыми организмами.
Биодизель – биотопливо на основе растительных или животных жиров
(масел), а также продуктов их этерификации.
Биозавод (см. Биорефайнери).
Биоизвлечение – использование микроорганизмов для извлечения
ценных материалов (металлов или органических соединений) из сложных
смесей.
Биоимплант – протез, сделанный из биосинтетического материала.
Биоиндустрия (см. Биотехнология промышленная).
Биоиндустрия
в
сельском
хозяйстве
(см.
Биотехнология
сельскохозяйственная).
Биоинженерия – направленная модификация свойств живых организмов,
осуществляемая на генетическом и/или эпигенетическом уровне. Применяется
к микроорганизмам, растениям и животным.
Биоинформатика (син. – "Вычислительная биология") – биологическая
дисциплина, занимающаяся исследованием, разработкой и применением
вычислительных методов (в т.ч. компьютерных) и подходов для расширения
использования биологических, поведенческих или медицинских данных.
193
Биокластер – объединение предприятий, поставщиков оборудования,
комплектующих, специализированных производственных и сервисных услуг,
научно-исследовательских и образовательных организаций в сфере
биотехнологий, связанных отношениями территориальной близости и
функциональной зависимости в процессе производства и реализации товаров и
услуг.
Биоконверсия – преобразование одного химического соединения в
другое живыми организмами (отличается от обработки ферментами,
фиксированными клетками или действия химических процессов).
Биологическая безопасность (сокр. Биобезопасность) – сохранение
живыми
организмами
своей
биологической
сущности,
качеств,
системообразующих
связей
и
характеристик,
предотвращение
широкомасштабной потери биологической целостности.
Биологически активные вещества (БАВ) – общее название веществ,
имеющих выраженную физиологическую активность.
Биологические
средства
защиты
растений
–
организмы,
микробиологические препараты и иные биологические средства, применяемые
для борьбы с вредными для сельскохозяйственных культур организмами.
Биологическое разнообразие (сокр. Биоразнообразие) – разнообразие
жизни во всех ее проявлениях, представленное тремя уровнями: генетическое
разнообразие (разнообразие генов и их вариантов – аллелей), разнообразие
видов, разнообразие экосистем.
Биомасса – совокупная масса растительных и животных организмов,
присутствующих в биогеоценозе в момент наблюдения; возобновляемые
источники органического материала, который может быть использован в
качестве топлива и для промышленного производства.
Биомасса инактивированная – стерилизованная биомасса (кормовые
дрожжи, грибной мицелий и др.).
Биоматериал – 1) материал из живых тканей; 2) синтетический или
естественный материал, используемый в медицинском устройстве или в
контакте с биологическими системами.
Биомедицина – собирательный термин, обозначающий направление на
стыке двух наук – медицины и биологии. В ее основе лежит использование для
194
решения медицинских проблем идей и технологий, разработанных в биохимии,
иммунологии, клеточной биологии и других биологических науках.
Биомедицинские технологии – технологии, используемые в
биомедицине.
Биомедицинская клеточная технология – процесс получения
клеточного продукта для восстановления структур и функций тканей и органов
человека путем замещения клеток этих тканей и органов клетками, вводимыми
извне, или путем активации собственных восстановительных процессов
организма человека, для создания тканей и органов биоинженерными методами
(тканевая инженерия) с последующим их применением в медицинской
деятельности, а также для адресной доставки лекарственных средств в
организме человека.
Бионанотехнология (см. Нанобиотехнология).
Бионефть – биотопливо второго поколения, синтезируемое из биомассы
путем глубокой химической переработки (на основе пиролиза).
Биопестицид – соединение, которое убивает организмы в результате
специфического биологического действия, а не как химические яды.
Биопластик (или органический пластик) – форма пластика,
производимого из возобновляемой биомассы (растительных масел, кукурузы и
др.). Имеется биодеградируемая разновидность.
Биопленки – слой микроорганизмов, развивающихся на поверхности
полимерного материала.
Биополимеры – класс полимеров, встречающихся в природе в
естественном виде, входящих в состав живых организмов: белки, нуклеиновые
кислоты, полисахариды.
Биопрепарат – любой медицинский препарат, происходящий из живых
организмов или их продуктов.
Биопродукты – материалы, химикаты и энергия, получаемые из
возобновляемых биологических источников.
Биореактор
–
устройство,
осуществляющее
перемешивание
культуральной среды в процессе микробиологического синтеза. Различают
механические, аэрлифтные и газо-вихревые биореакторы.
195
Биоремедиация – комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферы с
использованием биологических агентов – метаболического потенциала
биообъектов: растений, грибов, насекомых, червей и других организмов.
Биоресурсы – совокупность биоценозов (биот, биотических комплексов)
из известных видов жизни на Земле (~ 2 млн единиц) и еще не открытых видов
(более 10 млн видов).
Биорефайнери (англ. "biorefinery") – биозавод; предприятие,
осуществляющее конверсию биомассы и производящее топливо, энергию и
химические вещества в полном цикле.
Биосенсор (син. – "Биодатчик") – устройство, в котором чувствительный
слой, содержащий биологический материал, непосредственно реагирующий на
присутствие определенного компонента и генерирующий соответствующий
сигнал.
Биотехнологическое приборостроение – отрасль, занимающаяся
приборами для биотехнологии.
Биотехнология (технология живых систем) – 1) дисциплина, изучающая
возможности использования живых организмов, их систем или продуктов их
жизнедеятельности для решения технологических задач, а также возможности
создания живых организмов с необходимыми свойствами методом генной
инженерии; 2) производственное использование биологических структур для
получения пищевых и промышленных продуктов и для осуществления целевых
превращений.
Биологические структуры в данном случае – это микроорганизмы,
растительные и животные клетки, клеточные компоненты: мембраны клеток,
рибосомы, митохондрии, хлоропласты, а также биологические макромолекулы
(ДНК, РНК, белки – чаще всего ферменты).
Биотехнология "белая" – производство биотоплив, ферментов и
биоматериалов для различных отраслей промышленности.
Биотехнология
ветеринарная
–
часть
сельскохозяйственной
биотехнологии, предметной областью которой является использование
биотехнологии для лечения животных.
Биотехнология "зеленая" – разработка и внедрение в агрокультуру
генетически модифицированных растений.
196
Биотехнология "красная" – производство биофармацевтических
препаратов (протеинов, ферментов, антител) для человека, а также коррекция
генетического кода.
Биотехнология лесная – раздел биотехнологии, занимающийся
сохранением и ускоренным воспроизводством лесных биоресурсов.
Биотехнология медицинская – раздел биотехнологии, занимающийся
производством биофармацевтических препаратов, изделий медицинского
назначения, продуктов лечебного питания (см. также "Биотехнология
"красная").
Биотехнология морская – раздел биотехнологии, занимающийся
вопросами изучения гидробионтов, переработки морепродуктов, разведения
промысловой морской фауны и флоры в марикультуре.
Биотехнология пищевая
(пищевая биоиндустрия) – раздел
биотехнологии, занимающийся разработкой теории и практики создания
пищевых продуктов общего, лечебно-профилактического назначения и
специальной ориентации.
Биотехнология прикладная – раздел биотехнологии, осуществляющий
практическое приложение достижений этой науки.
Биотехнология природоохранная (биотехнология экологическая) –
раздел биотехнологии, занимающийся решением экологических проблем
биотехнологическими методами.
Биотехнология промышленная – практическая ветвь биотехнологии,
осуществляющая широкомасштабное производство биопродуктов по всем
секторам биотехнологии (медицинскому, пищевому, сельскохозяйственному,
энергетическому, экологическому и др.) (см. также "Биотехнология "белая").
Биотехнология сельскохозяйственная – раздел биотехнологии,
занимающийся вопросами теории, методологии и практики применения ее
достижений в растениеводстве и животноводстве (см. также "Биотехнология
"зеленая").
Биотехнопарк – научный парк с акцентом на биотехнологию и
инновационные процессы.
Биотопливные элементы – источники питания, использующие энергию
из живого организма; предназначены для питания имплантируемых
медицинских приборов.
197
Биотопливо – топливо из биологического сырья, получаемое, как
правило, путем переработки стеблей сахарного тростника или семян рапса,
кукурузы, сои и др. Различают жидкое биотопливо (для двигателей внутреннего
сгорания – этанол, биодизель), твердое (дрова, солома) и газообразное (биогаз,
водород).
Биотрансформация – превращение исходных органических соединений
(предшественников) в целевой продукт биотехнологического процесса с
помощью клеток живых организмов или ферментов, выделенных из них.
Биоудобрения – экологически чистые удобрения, получаемые из
биогумуса и натуральных органических веществ.
Биофармацевтика – это отрасли промышленности и научных
исследований, основанные на технологиях получения сложных макромолекул,
идентичных существующим в живых организмах, с использованием методов
рекомбинантных ДНК, гибридом и культур клеток для последующего
использования в терапевтических или профилактических целях.
Биофармацевтическая промышленность (син. – "Биофарминдустрия")
–
ветвь
фармацевтической
промышленности,
производящая
биофармацевтические препараты (протеины, ферменты, антитела).
Биоэкономика – экономика, основанная на системном использовании
биотехнологии. На Западе принят термин "bio-based economy".
Биоэкополис – малое поселение, вписанное в экологически чистый
ландшафт, созданное с применением биотехнологических способов ведения
аграрного хозяйства, с быстровозводимыми, дешевыми и энергоэффективными
домами-усадьбами.
Биоэнергетика – сфера деятельности по обеспечению энергетических
потребностей человека, основанная на принципах или ресурсах живой
природы, направленная на сохранение естественного энергетического и
материального баланса окружающей природной среды.
Биоэтанол – этиловый спирт, получаемый из биомассы путем
спиртового брожения органических продуктов, содержащих углеводы, под
действием ферментов дрожжей и бактерий. Как моторное топливо используется
в виде присадок или в чистом виде.
198
Вакцина – препарат из убитых или ослабленных патогенов или
производных
антигенных
детерминант,
который
может
вызывать
формирование антител у организма-хозяина.
Векторы (векторные молекулы) – фрагменты ДНК, способные
акцептировать чужеродную ДНК, обеспечивать ее размножение, экспрессию
и/или трансформацию.
Вермикультура – выращивание на отходах грибного производства
беспозвоночных организмов (червей), являющихся минерализаторами
субстрата.
Генетическая трансформация растительных клеток – перенос
чужеродных генов в геном растения-реципиента.
Генно-инженерно-модифицированный организм – организм или
несколько организмов, любое неклеточное, одноклеточное или многоклеточное
образование, способные к воспроизводству или передаче наследственного
генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с
применением методов генной инженерии и содержащие генно-инженерный
материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинации генов
(Федеральный закон от 5 июля 1996 г. № 86-ФЗ "О государственном
регулировании в области генно-инженерной деятельности").
Генная инженерия (генетические модификации) – совокупность методов
и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных
рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из
организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие
организмы (Федеральный закон от 5 июля 1996 г. № 86-ФЗ "О государственном
регулировании в области генно-инженерной деятельности").
Генная терапия (генотерапия) – совокупность генно-инженерных
(биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение
изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях
лечения заболеваний (Федеральный закон от 5 июля 1996 г. № 86-ФЗ "О
государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности").
Генно-инженерная деятельность – деятельность, осуществляемая с
использованием методов генной инженерии в целях создания генноинженерно-модифицированных организмов (Федеральный закон от 5 июля
199
1996 г. "О государственном регулировании в области генно-инженерной
деятельности").
Генно-инженерные препараты – препараты разного назначения
(медицинские, биологические), получаемые методами генной инженерии.
Генные мутации – изменение гена, возникающее спонтанно или
индуцированное искусственно.
Генофонд – совокупность генов, которые имеются у особей,
составляющих популяцию, группу популяций или вид, в пределах которых они
характеризуются определенной частотой встречаемости.
Гиббереллины – гормоны растений из группы дитерпеноидных кислот,
синтезируются в активно растущих органах: формирующихся семенах,
верхушечных стеблевых почках, реже в корнях, вызывают ускорение роста
органов (в большей мере стебля, в меньшей – корня) за счет деления и
растяжения клеток.
Гидробионты – организмы, обитающие в воде.
Гидролизное
производство
(гидролизная
промышленность)
–
производство, основанное на реакции гидролитического расщепления
гликозидных связей полисахаридов биомассы одревесневшего растительного
сырья с образованием в качестве основных продуктов реакции моносахаридов,
которые подвергаются дальнейшей биохимической или химической
переработке, либо входят в состав товарной продукции.
Гиногенез – процесс формирования растений in vitro из клеток
зародышевого мешка.
Гистогенез – тип дифференцировки каллусных клеток, завершающийся
образованием различных тканей: млечников, волокон, элементов ксилемы
(трахей и трахеид) и флоэмы (ситовидные клетки и клетки-спутницы).
Глюкозо-фруктозные сиропы (ГФС) – пищевые продукты, получаемые
из крахмала и являющиеся полноценными заменителями сахарозы.
Гобтировка – нанесение покровного грунта при культивировании
шампиньона с целью создания среды, способствующей образованию плодовых
тел, сохранению влажности, температуры и аэрации.
Гормононезависимость клеток, тканей – их способность расти на
безгормональной среде, приобретенная ими в результате длительного
культивирования в присутствии гормонов.
200
Грибоводство – отрасль биотехнологии, занимающаяся выращиванием
грибов в искусственных условиях.
Дедифференциация – переход специализированных, неделящихся клеток
к
пролиферации,
в
результате
чего
образуются
однородные
недифференцированные клетки и формируется каллусная ткань.
Детерминация развития – приобретение клеткой, тканью, органом или
организмом состояния готовности развиваться только по определенному пути с
одновременным ограничением возможности развития в любом другом
направлении.
Диагностикумы – стандартные наборы реактивов для диагностики.
Дифференциация – возникновение качественных различий между
однородными клетками и тканями, приводящее к формированию
специализированных тканей и органов.
Индустрия живых систем (см. Биотехнология промышленная).
Индустрия
нанотехнологий
–
промышленное
производство,
осуществляемое в наношкале. Представляет собой часть индустрии неживых
систем.
Индустрия неживых систем – промышленные производства, имеющие
дело с неживыми системами и объектами.
Инокулюм – часть клеточной суспензии, которую переносят в свежую
питательную среду при проведении субкультивирования.
Каллус – ткань, возникающая путем неорганизованной пролиферации
клеток
различных
органов растений,
состоящая из однородных
недифференцированных клеток.
Каллусная культура – каллусная ткань, культивируемая in vitro в
длительной пересадочной культуре. Клеточная инженерия – метод
конструирования клеток нового типа на основе их культивирования,
гибридизации и реконструкции.
Клеточные технологии (в медицине) - медицинские технологии с
использованием стволовых клеток.
Клональное микроразмножение – получение in vitro, неполовым путем
растений, генетически идентичных исходной форме.
Компетентность клетки – ее способность воспринимать стимулы
морфогенеза и детерминировать.
201
Кондиционирующий фактор – метаболиты, выделяемые в среду
делящимися клетками.
Конъюгация – процесс переноса генетической информации от клеткидонора в клетку-реципиент, который осуществляется при непосредственном
контакте клеток между собой.
Коррелятивные связи – регулирующие связи в системе целостного
растения.
Кормовые добавки – белково-витаминные, минеральные и иные добавки,
применяемые при недостатке в рационах животных некоторых кормовых
ингредиентов.
Криопротектор – вещество, уменьшающее повреждения клеток от
осмотического и механического стресса.
Культура изолированных органов, тканей и клеток (культура тканей
или культура in vitro) – выращивание изолированных органов, тканей и клеток
на искусственных питательных средах в стерильных (асептических) и
контролируемых условиях с использованием стеклянных или пластиковых
сосудов или биореакторов.
Культура изолированных протопластов – выращивание протопластов в
жидкой или на агаризованной среде.
Лигирование – соединение фрагментов ДНК путем восстановления
фосфо-диэфирных связей между соседними нуклеотидами с помощью фермента
ДНК-лигазы.
Лизин – незаменимая аминокислота, широко используется в качестве
кормовой добавки.
Марикультура (лат. "mаге" - "море" + культура) (син. –
"Талассокультура", термин на греческой основе) – искусственное выращивание
морских промысловых организмов – животных и водорослей – в естественных
и искусственных водоемах.
Меристема – образовательная ткань.
Микоризаиия растений – инокуляция их корней мицелием
микоризообразующих грибов (масленок, подберезовик, подосиновик, рыжик,
белый и др.).
Молекулярная биология – наука, изучающая основные свойства и
проявления жизни на молекулярном уровне.
202
Морфогенез – процесс формообразования (заложения, роста и развития)
органов (органогенез), тканей (гистогенез), калпуса (каллусогенез), клеток
(цитогенез) у растений.
Нанобиотехнология (син. – "Бионанотехнология") – создание и
использование биомолекул как компонентов нанотехнологии.
Наномедицина (греч. "nanos" – "карлик" + "медицина") –
комбинированный термин, обозначающий применение нанотехнологий в
лечении и диагностике заболеваний.
Нанотехнология – разработка и использование систем и технических
устройств в наношкале.
Органогенез – процесс возникновения в культуре ткани зачатков органов
(побегов, листьев, корней).
Оригинальное лекарственное средство – лекарственное средство,
содержащее впервые полученную фармацевтическую субстанцию или новую
комбинацию фармацевтических субстанций, эффективность и безопасность
которых
подтверждены
результатами
доклинических
исследований
лекарственных средств и клинических исследований лекарственных
препаратов.
Пастеризация – длительная гидротермическая обработка субстрата для
выращивания грибов.
Партеногенез – развитие особи с участием только материнских генов.
Первичная культура – культура клеток или тканей, взятых
непосредственно от растений (эксплант, впервые помещенный на питательную
среду).
Плазмиды – кольцевые молекулы двуцепочной ДНК, встречающиеся в
клетках дрожжей и бактерий, где они реплицируются в процессе пролиферации
клеток как самостоятельные единицы.
Полиплоидия – увеличение числа хромосом, кратное основному числу
хромосом вида, вызывающее наследственные изменения.
Постгамная несовместимость – выражается в формировании
неполноценных, щуплых семян с низкой всхожестью после оплодотворения при
отдаленной гибридизации.
Постгеномные технологии – технологии, возникшие на основе знаний о
геномах организмов, в первую очередь, генома человека.
203
Прототаст – растительная клетка, полностью лишенная клеточной
стенки, имеющая только клеточную мембрану, которая ограничивает
цитоплазму с органоидами и другими включениями; протопласты способны
осуществлять активный метаболизм и выполнять биосинтез.
Пролиферация – новообразование клеток и тканей путем размножения
уже имеющихся.
Прогамная несовместимость – невозможность в природных условиях
осуществить оплодотворение между выбранными парами при отдаленной
гибридизации.
Программное замораживание растительной ткани – снижение
температуры с постоянной скоростью с применением криопротекторов.
Протопласт – растительная клетка полностью лишенная клеточной
стенки, имеющая только клеточную мембрану, которая ограничивает
цитоплазму с органоидами и другими включениями; способны осуществлять
активный метаболизм, выполнять биосинтез, реализовывать тотипотентность.
Регенерация – восстановление целого организма из его части; регенерация
in vitro – формирование растений-регенерантов.
Ретарданты – соединения, замедляющие рост растений.
Регуляторы роста растений – органические соединения, вызывающие
стимуляцию роста и морфогенеза растений.
Растения-регенеранты – растения с развитой системой побегов и корней
полученные in vitro.
Реювенилизация – омоложение; индукция образования молодых органов
(тканей).
Рекомбинантная ДНК – ДНК, состоящая из фрагментов ДНК различных
организмов.
Репликация – процесс самовоспроизведения макромолекул нуклеиновых
кислот, обеспечивающий точное копирование генетической информации и
передачу ее от поколения к поколению.
Реципиентный организм – организм, принимающий чужеродную ДНК.
Соматические клетки растений – совокупность неполовых клеток.
Соматический эмбриогенез – процесс формироваия зародышеподобных
структур (эмбриоидов) в культуре ткани и клеток.
Суспензионная (глубинная) культура клеток – выращивание взвеси
204
меток или их агрегатов в жидкой среде с использованием аппаратуры,
обеспечивающей перемешивание и аэрацию.
Субкультивирование, пассирование – перенос клеток, тканей в новый
культуральный сосуд, на свежую питательную среду.
Стимулы морфогенеза – совокупность факторов, вызывающих этот
процесс.
Сомаклональная
изменчивость
–
генетическая
изменчивость,
возникающая при культивировании клеток и тканей, затрагивающая
морфологические, физиологические, биохимические, цитологические параметры
клеток.
Соматические гибриды – гибриды, полученные в результате слияния
соматических клеток и содержащие наследственный материал (ядерный и
цитоплазматический) двух или более родительских форм.
Соматическая гибридизация (“парасексуальная” или “неполовая”
гибридизация) – получение гибридов путем слияния протопластов.
Сайты рестрикции – участки генов, по которым ДНК (при помощи
ферментов) может быть разделена на фрагменты.
Секвеиирование – расшифровка нуклеотидных последовательностей
нуклеиновых кислот в клонируемом фрагменте ДНК.
Тотипотентность – свойство любой соматической клетки растений при
выращивании in vitro полностью реализовывать свою наследственную
программу онтогенетического развития, дифференцироваться и развиваться
вплоть до образования взрослого растения.
Трансгенные организмы – животные, растения, микроорганизмы,
вирусы, генетическая программа которых изменена с использованием методов
генной инженерии (Федеральный закон от 5 июля 1996 г. № 86-ФЗ "О
государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности").
Трансформация – изменение генотипа клетки путем внесения в нее
чужеродной ДНК.
Трансдукция – введение в ДНК клетки новых генетических элементов с
участием бактериофагов или плзаимд.
Трансляция – синтез белка в рибосомах при участии информационной,
транспортной РНК и других факторов.
Турбидостат – открытая проточная система культивирования клеточных
205
суспензий с автоматической системой поддержания заданной концентрации
биомассы путем изменения скорости протока свежей питательной среды и
суспензии клеток.
Фитоалексины – вещества, проявляющие фунгицидное и антимикробное
действие.
Чистая культура – мицелий гриба, выращиваемый на искусственной
питательной среде.
Фитогормоны (гормоны растений) – вещества, синтезируемые
растениями, которые транспортируются по ним, вызывая ростовые или
формативные эффекты как в месте своего образования, так и на расстоянии от
него.
Хемостат – открытая проточная система культивирования клеточных
суспензий, при которой в ферментер с определенной скоростью подается свежая
питательная среда и с такой же скоростью отбирается суспензия клеток;
скорость размножения клеток регулируется концентрацией лимитирующего
фактора среды.
Цибриды – получаются в результате слияния протопластов, они содержат
цитоплазмы всех слившихся клеток, а ядро – только одной из них, другие ядра
разрушаются.
Цитокинины – гормоны растений, производные 6-аминопурина;
содержатся в меристемах, индуцируют (в присутствии ауксина) деление клеток
и дифференцировку стеблевых почек у каллусов, активируют рост клеток листа,
задерживают старение срезанных листьев, вызывают открытие устьиц, снимают
апикальное доминирование.
Цитогенез – тип дифференцировки каллусных клеток; завершается
образованием в каллусной ткани отдельных дифференцированных клеток,
имеющих определенное строение и выполняющих специфические функции.
Эксплант – фрагмент ткани или органа, выращиваемый на питательной
среде с целью регенерации растений или используемый для получения каллуса.
Экспрессия – фенотипическое проявление признака, контролируемого
определенным геном.
Эмбриоиды – биполярные зародышеподобные структуры, имеющие две
меристемы (одна дает начало стеблю, другая – корню).
206
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
ИЛЛЮСТРАТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Рис. 1. Введение в культуру первичных эксплантов
Рис. 2. Конгломерат адвентивных почек
207
Рис. 3. Адвентивные почки под увеличением
Рис. 4. Индукция адвентивных почек в каллусной ткани
208
Рис. 5. Эмбриогенный каллус
Рис. 6. Культуры тополя, созданные регенерантами in vitro
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
12
Размер файла
3 134 Кб
Теги
2017, биотехнология, учебно, пособие, лесной, хозяйства
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа