close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Прушинский Алексей Петрович Шифр научной специальности: 03.02.03 - микробиология Шифр диссертационного совета: ДМ208.007.02 Название организации: Владивостокский государственный медицинский университет Адрес организации: 690002, г.Вл
На правах рукописи
Прушинский Алексей Петрович
Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией
03.02.03 - микробиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Владивосток - 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Владивостокский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, ГБУЗ "Приморская детская краевая клиническая туберкулезная больница", г. Владивосток
Научный руководитель: доктор медицинских наук, доцент Мартынова Алина Викторовна
Официальные оппоненты: Тимченко Нелли Фёдоровна, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ "НИИЭМ" СО РАМН, руководитель лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий
Холодок Галина Николаевна, кандидат медицинских наук, Хабаровский филиал ФГБУ "ДНЦ ФПД" СО РАМН - НИИ ОМиД, ведущий научный сотрудник
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится 4 мая 2012 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ208.007.02 при ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития РФ по адресу: 690002 г. Владивосток, ГСП, проспект Острякова, 2 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития РФ Автореферат разослан 3 мая 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Шаркова Валентина Александровна
Общая характеристика работы
Актуальность темы: До сих пор, несмотря на достигнутые результаты в диагностике и лечении этой инфекции, заболеваемость туберкулезом среди детского населения продолжает оставаться на достаточно высоком уровне. Несмотря на постоянно совершенствующиеся схемы лечения с применением противотуберкулезных химиопрепаратов, течение туберкулезной инфекции обладает значительным клиническим полиморфизмом, сопровождаясь выраженным снижением иммунного статуса, что, в свою очередь, как осложняет течение основного заболевания, так и характеризуется развитием различных интеркуррентных инфекций, несмотря на активно применяемые противотуберкулезные химиопрепараты. Основными сопутствующими инфекциями, развивающимися у детей, находящихся на длительной противотуберкулезной химиотерапии, являются инфекции верхних и нижних дыхательных путей. В связи с этим немаловажное значение приобретает изучение особенностей их микробиоценоза, в первую очередь микробиологических и эпидемиологических характеристик основных возбудителей инфекций дыхательных путей нетуберкулезной этиологии. Установлено, что лидирующие позиции в заболеваемости инфекциями верхних и нижних дыхательных путей занимают инфекции, вызванные Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella cattarrhalis. Наименее изученным аспектом данной проблемы являются особенности распространения гемофильной инфекции у детей с туберкулезом, в том числе вопросы носительства штаммов рода Haemophilus у таких пациентов. Не менее важным оказывается и отсутствие информации о микробиологических характеристиках: особенностях факторов патогенности и антибактериальной устойчивости штаммов гемофил, выделенных у пациентов с туберкулезной инфекцией. Не охарактеризованы микробиологические и молекулярно-генетические аспекты формирования микробиоценоза дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией.
Таким образом для организации противоэпидемических мероприятий, а также для совершенствования основных фармакологических формуляров лечения детей c туберкулезной инфекцией, важным является изучение сопутствующих бактериальных инфекций дыхательных путей среди данной группы пациентов, в первую очередь эпидемиологических и микробиологических особенностей распространения штаммов H. influenzae и S. pneumoniae. Учитывая ограниченность информации в отношении микробиологических характеристик H. influenzae, выделенных от детей с туберкулезом, перспективным представляется именно этого возбудителя, что позволит, в конечном итоге охарактеризовать микробиоценоз дыхательных путей у детей с туберкулезом и организовать проведение профилактических мероприятий. Цель исследования: изучение микробиологических и молекулярно-генетических особенностей штаммов H. influenzae, выделенных у детей с туберкулезом, с целью разработки рекомендаций по рациональной антимикробной химиотерапии и обоснования профилактических мероприятий
Задачи исследования:
1. Оценить этиологическую структуру микробиоценоза респираторного тракта у детей с туберкулезом, определить роль H. influenzae в развитии сопутствующих респираторных инфекций.
2. Оценить популяционную структуру штаммов H. influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией.
3. Оценить чувствительность к антибактериальным химиопрепаратам штаммов H. influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией.
4. Изучить особенности факторов патогенности штаммов H. influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией и у носителей.
5. Провести сравнительный геномный анализ основных возбудителей сопутствущих респираторных инфекций для характеристики и дальнейшего прогнозирования формирования микробиоценоза дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией. Научная новизна исследований:
1. Определена этиологическая структура носительства бактериальных возбудителей сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезной инфекцией, отмечены различия в частоте выявляемости бактериальных патогенов респираторного тракта в сравнении с детьми без туберкулезной инфекции.
2. Проведен эпидемиологический анализ заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями, вызванными H. influenzae и другими бактериальными патогенами респираторного тракта у детей с туберкулезной инфекцией и без нее.
3. Проведен клинико-микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг штаммов H. influenzae, выделенных от детей с туберкулезной инфекцией и без нее с оценкой экспрессии факторов патогенности и основных генов, обусловливающих ее развитие.
4. Охарактеризовано состояние чувствительности к антибактериальным химиопрепаратам штаммов H. influenzae, выделенных от детей с туберкулезной инфекцией и без нее.
5. Охарактеризованы молекулярно-генетические особенности формирования микробиоценоза дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией и у носителей штаммов гемофил без туберкулеза.
Практическая ценность работы
Данные об этиологической структуре возбудителей сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезом позволили получить представление об эпидемиологической ситуации по заболеваемости инфекциями дыхательных путей нетуберкулезной этиологии у детей с туберкулезной инфекцией. Проведенный мониторинг антибиотикорезистентности выделенных штаммов H. influenzae, доминирующих в структуре возбудителей инфекций дыхательных путей, позволил получить представление об эффективности общепринятой и проводимой антибиотикотерапии, а также, учитывая механизм формирования устойчивости к антибактериальным средствам, определить возможность коррекции фармакологического формуляра лечения инфекций дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией. Изучение популяционной структуры возбудителей сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезом с определением видовой и серотиповой характеристики штаммов гемофил позволило корригировать противоэпидемические мероприятия в отношении данных инфекций у детей с туберкулезной инфекцией.
По материалам диссертации выпущены методические рекомендации "Микробиологическая характеристика штаммов H. influenzae у детей с туберкулезной инфекцией" и "Эпидемиологические особенности циркуляции штаммов H. influenzae у детей с туберкулезной инфекцией". Результаты исследования использованы при организации мероприятий инфекционного контроля в государственных учреждениях здравоохранения "Приморская детская краевая клиническая туберкулезная больница" и "Краевой детский противотуберкулезный санаторий №1". Материалы диссертации используются в учебном процессе при подготовке врачей на кафедре эпидемиологии ВГМУ.
Апробация научных материалов диссертации Материалы научно-исследовательской работы изложены на постоянно действующих семинарах "Актуальные вопросы госпитальной эпидемиологии" (2008 год); на заседании Приморского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов; на 8-й, 10-й и 11-й Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием ""Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины" (апрель, Владивосток, 2007, 2009, 2010 гг); на Европейском конгрессе клинических микробиологов (ESCMID, 2009, Helsinki); Первом Европейском конгрессе по изучению биопленок (EUROBIOFILMS 2009, Rome, Italy); на VI-й Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" (Москва, 2009); на конференции "Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года" (28-30 сентября, Москва 2009 года); на III международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, июль 2009); на IV международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, 2010); на Всероссийской научной конференции "Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций" (Санкт-Петербург, Военно-медицинская академия, 2009); на Всероссийской научной школе для молодежи "Перспективы развития инноваций в биологии" (ноябрь, 2009, ДВГУ, Владивосток); на V-й научно-практической конференции "Инфекционная патология в Приморском крае" (19-20 мая 2010 года, Владивосток); на Международном симпозиуме по изучению пневмококков и пневмококковых инфекций (ISPPD 7, Tel-Aviv, Israel, 2010); на Европейском Респираторном Конгрессе (сентябрь, 2010, Барселона); на Третьем Съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил РФ "Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия ВС РФ" (декабрь, 2010). Личный вклад автора
Автором осуществлен сбор, систематизация и анализ материала по частоте сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезной инфекцией в Приморском крае. Лично автором проведено клиническое обследование, сбор биологического материала от больных и лиц контрольной группы. При непосредственном участии автора осуществлено выделение, идентификация и оценка чувствительности к антибиотикам полученных штаммов, проведена статистическая обработка полученных результатов. Публикации: По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работы, из них статей в журналах, рекомендованных ВАК - 2.
Объем и структура диссертации традиционная. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 35 таблицами, 22 рисунками. Список литературы содержит 265 источников, из них 109 - отечественных авторов, 156 - зарубежных. Основные положения, выносимые на защиту:
1) В микробиоценозе дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией значительную роль играет H. influenzae, определяемый у 26,6% таких пациентов, наиболее часто выявлямый в монокультуре - в 79,16% случаев, с преобладанием типируемых штаммов (68,18%).
2) Штаммы H. influenzae, циркулирующие среди детей с туберкулезной инфекцией, характеризуются устойчивостью к антибактериальным химиопрепаратам ряда макролидов, фторхинолонов, цефалоспоринов, с высокой долей полирезистентных штаммов - 54,1%. Выделенные штаммы, преобладающие среди нетипируемых изолятов H. influenza, характеризуются гипермутабельностью по отношению к рифампицину и фторхинолонам.
3) Среди штаммов, выделенных у детей с туберкулезом, преобладают штаммы, у которых обнаруживаются гены, определяющие колонизационную способность микроорганизмов в дыхательных путях - lic2a и lic2b.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Контингент, материалы и методы исследования:
Контингентом для клинико-лабораторного обследования явились 90 больных детского возраста с различными проявлениями туберкулезной инфекции, находящихся на лечении в ГБУЗ "Приморская детская краевая клиническая туберкулезная больница". Контрольную группу составили 40 детей с соматической патологией, находящиеся на лечении соматическом отделении МУЗ "Городская детская больница №3 г. Владивостока", которые не состояли ранее в группах диспансерного учета по туберкулезу, не получали последние 3 месяца терапию антибиотиками и были корректно сопоставимы по возрасту и полу с группами наблюдения. Материалом для изучения общей структуры респираторных инфекций среди детей с туберкулезом послужили данные медицинских карт стационарных больных 2822 пациентов. Был проведен оперативный и ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями детей с туберкулезной инфекцией с расчетом средней многолетней заболеваемости и показателя плотности инцидентности согласно методике Зуевой Л.В.
Основным материалом для проводимых исследований у обследуемых лиц являлось отделяемое носоглотки. Забор клинического материала осуществлялся при госпитализации пациента в стационар в течение первых суток до проведения лечения. Исследование материала проводили согласно требованиям Приказа МЗ СССР от 22.04.1985 г. №535. В работе использовались эталонные штаммы культур, полученные кафедрой эпидемиологии ВГМУ в Государственном контрольном институте биологических препаратов им. В.Г. Тарасевича.
Основными направлениями микробиологических исследования явилось выделение чистых культур микроорганизмов и их ассоциации в динамике (82 штаммов, выделенных от больных туберкулезом и 34 штамма - от здорового контингента), их идентификация, биологическая характеристика (факторы патогенности, профили чувствительности к антибиотикам). Определение антибиотикочувствительности проведено диско-диффузионным методом и методом серийных разведений у 116 штаммов в соответствии МУ 4.2.1890-04 "Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам". Определение частоты мутаций проведено по методике Luria and Delbruck. Для подтверждения видовой принадлежности выделенных штаммов H. influenzae, генотипирования их по капсульному полисахариду и их последующего серотипирования и исследования генетических детерминант факторов их патогенности, был использован молекулярно-генетический метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
При проведении геномных исследований последовательности геномов H.ifnfluenzae, M. tuberculosis, S. pneumoniae были получены из GenBank. Получение, анализ и обработка данных были проведены при помощи специального программного обеспечения - модуля BioPerl. Определение групп гомологичных белков среди рассматриваемых штаммов было проведено с использованием программы анализа и выравнивания нуклеотидных последовательностей BlastP. Последующее сравнение геномов выполнялось с помощью пакета программ локального парного выравнивания BLAST 2.0.9.
Статистическая обработка полученной базы данных проводилась методами описательной и параметрической статистики с использованием программы Statistica 6.0, Whonet 5.1, Bionumerics 2.0, MEGA 3.1, Agilent Bioanalyzer 2.5, LIAN 3.5. В ходе статистической обработки материалов главными показателями служили: средняя арифметическая (М), ее средняя ошибка (m), ошибка к проценту относительной величины; кроме того, указывались точки экстремумов исследуемых величин (Аmax и Аmin), рассчитывался доверительный интервал (ДИ) с достоверностью 95%. Совокупность полученных данных проверялась на нормальность распределения (μ1=μ2, μ1≠μ2) с использованием критерия Колмогорова-Смирнова (K-S), критерия Лиллиефорса (L) и критерия Шапиро-Вилкса (Sh-W), а также графическим методом с построением ожидаемой кривой распределения величин. Статистическая достоверность различий параметрических величин подтверждалась парным критерием Стьюдента (Т) для изучения различий между связанными совокупностями; критерием Стьюдента (t) для одной совокупности, двусторонним критерием z c поправкой по Йетси. Для исследования непараметрических величин использовался χ2 и критерий (F) Фишера (для малых выборок).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного эпидемиологического анализа заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями ГБУЗ "ПДККТБ" в период с 2003 по 2010 годы было установлено, что показатель заболеваемости данными инфекциями находится на уровне 284,2%оо (на 1000 пролеченных). В структуре заболеваемости преобладают острые процессы в верхних дыхательных путях - 84,3%. В динамике исследуемых лет отмечена слабовыраженная тенденция заболеваемости к росту с темпом 1,1% за счет роста заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями верхних дыхательных путей (темп прироста 2,7%), инфекции нижних отделов дыхательной системы, наоборот, имеют тенденцию к снижению с темпом 7,7% (рис. 1). Рис.1. Многолетняя динамика заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями
В структуре сопутствующих респираторных инфекций стабильно преобладают заносные инфекции (в среднем 58,3%), заболеваемость которыми находится на среднем уровне 165,3%оо и имеет выраженную тенденцию к росту с темпом 3,4%. Уровень заболеваемость сопутствующими внутрибольничными респираторными инфекциями находился на уровне 118,4%0, колеблясь от 94,9 до 164,9 на 1 тысячу пролеченных пациентов и имея слабовыраженную тенденцию к снижению (2,1%), в основном за счет инфекций нижних дыхательных путей с темпом снижения 5,2%. Скорость развития данных заболеваний у детей с туберкулезной инфекций была изучена с использованием показателя плотности инцидентности, который составляет 3,63 случаев госпитальных инфекций дыхательных путей на 1000 койко-дней пребывания в специализированном стационаре. Лидирующие позиции в структуре заболеваемости респираторными инфекциями, в том числе и гемофильной инфекцией, занимают такие нозоформы, как острый ринофарингит и острый средний отит, характеризующиеся наибольшей плотностью инцидентности - 2,53 и 0,19 случая на 1000 дней госпитализации соответственно.
У 82 детей (91 %) с туберкулезом были выделены следующие виды микроорганизмов: S. pneumoniae, H. influenzae, S. pyogenes, S. galacticae, S. agalacticae, Enterococcus faecalis, Staphylococcus spp., Candida spp., Acinetobacter baumani, Corynebacteria xerosis В контрольной группе у 34 детей (85 %) были выявлены аналогичные по видовому составу микроорганизмы. Нами установлено, что вторым по значимости возбудителем у детей с туберкулезом являлся H. influenzae: всего было выделено 24 штамма (29,27%). При этом пневмококков в составе монокультуры было идентифицировано 24 штамма (44,4%), а штаммов H. influenzae - 19 (35,2%) (табл. 1). Таблица 1
Монокультура и ассоциации выделенных возбудителей
Результат микробиологического исследованияГруппа 1 Группа 2абс%Абс%Монокультура5460,02152,5Ассоциации2831,11332,5Не выявлено88,9615,0Всего исследований:9010040100 p<0,05, распределение нормальное; критерии K-S 0,18, p>0,2, L >0,2
Микробиологическая структура носительства возбудителей респираторного тракта у детей контрольной группы характеризовалась менее значительным преобладанием штаммов S. pneumoniae - их было выделено 14 (41,2%), тогда как H. influenzae выделялась относительно реже, чем в структуре носительства патогенов исследуемой группы - 6 штаммов (17,6%). При этом в составе монокультуры в контрольной группе было идентифицировано всего 8 штаммов пневмококков (38,09%), а гемофил выделено 4 штамма (19,04%). В качестве других монокультур (всего 9 штаммов) были идентифицированы: Streptococcus pyogenes - 3 штамма (14,28%), Acinetobacter baumanii - 1 штамм (4,76%), Moraxella catarrhalis - 1 штамм (4,76%), Staphylococcus aureus - 2 штамма (9,52%), Staphylococcus epidermidis - 1 штамм (4,76%), Klebsiella pneumoniae - 1 штамм (4,76%). Среди ассоциаций микроорганизмов, выделенных у исследуемой группы детей с туберкулезом (у 28 человек) выделялись ассоциации микроорганизмов - S. pneumoniae + S. pyogenes, H. influenzae + S.pneumoniae, H. influenzae + S.pyogenes, S.pneumoniae + Acinetobacter baumanii, S.pneumoniae + Candida spp. При этом более чем в половине случаев (17 человек, 60,7%) в микробных ассоциациях в диагностически значимом разведении было выделено одновременно 3 и более микроорганизма, тогда как у 11 человек (39,3%) микробная ассоциация была представлена 2 патогенами. При анализе результатов серотипирования выделенных штаммов H. influenzae методом полимеразной цепной реакции было установлено, что штаммы H. influenzae типа В составляют 33,3% в структуре всех выделенных штаммов (табл. 2). В группе штаммов, выделенных от пациентов с туберкулезом, штаммы H. influenzae типа В имеют весомое значение, хотя и не являются лидирующими. Обращает на себя внимание тот факт, что большее значение в структуре всех изолятов составляют изоляты других серотипов, а также нетипируемые штаммы (29,2%). В группе штаммов гемофил, выделенных от носителей без туберкулеза, наблюдается выделение гемофил других серотипов, а также нетипируемых гемофил в 33,3%. Таблица 2
Серотиповая характеристика выделенных штаммов H. influenzae Серотиповая группа1 группа2 группаАбс.%Абс.%Типируемые1562,5350в т.ч. тип В833,3116, 6Нетипируемые729,2233,3Нетипированные28,310Всего:241006100P<0,05 При проведении изучения устойчивости к антимикробным химиопрепаратам выделенных нами штаммов H. influenzae в исследуемой и в контрольной группе диско-диффузионным методом нами были получены результаты, представленные в таблице 3.
Таблица 3
Резистентность к антибиотикам штаммов H. influenzae, выделенных у больных туберкулезом (всего 24 штамма)
Анти-
бактериальный перепаратКоличество штаммов (% штаммов)1 группа2 группаS, %I, %R, %S, %I, %R, %Ампициллин16 (66,6)3 (12,5)5 (20,8)5 (83,3)1 (16,6)0 (0)Медоцеф (цефоперазон)12 (50,0)7 (29,1)5 (20,8)5 (83,3)0 (0)1 (16,6)Аксетин (цефуроксим)11 (45,83)7 (29,1)6 (25)6 (100)0 (0)0 (0)Медаксон (цефтриаксон)13 (54,1)6 (25)5 (20,8)6 (100)0 (0)0 (0)Селемицин15 (62,5)5 (20,8)4 (16,6)5 (83,3)0 (0)1 (16,6)Эритромицин11 (45,83)7 (29,1)6 (25)3 (50)2 (33,3)1 (16,6)Тетрациклин13 (54,1)6 (25)5 (20,8)2 (33,3)2 (33,3)2 (33,3)Норфлоксацин19 (79,1)2 (8,3)3 (12,5)3 (50)2 (33,3)1 (16,6)Ципрофлоксацин19 (79,1)3 (12,5)2 (8,3)4 (66,6)2 (33,3)0 (0)Рифампицин20 (83,3)2 (8,3)2 (8,3)5 (83,3)1 (16,6)0 ( 0)Примечание: S-чувствительные, I-умеренно-резистентные, R-резистентные
Как видно из представленных данных, в популяции штаммов H. influenzae, полученных от детей, больных туберкулезом, значительную долю занимают штаммы, устойчивые к бета-лактамным антибиотикам. Данные результаты представляют интерес, поскольку антибиотики этой группы хотя и не входят в схему антибактериальной химиотерапии у пациентов с туберкулезом, но широко применяются у данной группы пациентов при возникновении сопутствующих респираторных заболеваний.
Изучение устойчивости H. influenzae к препаратам фторхинолонового ряда представляет интерес, поскольку данные антибактериальные средства являются препартами резерва в лечении туберкулеза. Чувствительность к фторхинолонам у детей стуберкулезом сохраняется на достаточно высоком уровне - к ципрофлоксацину чувствительны 79,1% гемофил, к норфлоксацину также 79,1%. Среди популяции микроорганизмов, выделенных от пациентов без туберкулеза, чувствительность к фторхинолонам носит схожие тенденции. Также необходимо отметить выявление 2 штаммов (8,3%), имеющих устойчивость к такому антибиотику, как рифампицин, а также двух штаммов (8,3%) умеренно-устойчивых штаммов. Несмотря на то, что среди популяции микроорганизмов, выделенных от контрольной группы, таких штаммов не выявлено, наличие их в исследуемой группе позволяет предположить, что противотуберкулезная химиотерапия является достаточно сильным селективным фактором для появления полирезистентных штаммов среди возбудителей бактериальных инфекций респираторного тракта. При характеристике антибиотикочувствительности микроорганизмов не меньший интерес представляют и интервал минимальной подавляющей (ингибирующей) концентрации, значения которого могут колебаться даже в пределах одного вида, что может быть связано как с внутривидовой вариабельностью, так и с фармакокинетикой и фармакодинамикой антибактериального химиопрепарата, характер предшествующего употребления антибактериальных химиопрепаратов. Одной из особенностей минимальной инигибирующей концентрации у штаммов гемофил, выделенных от носителей без туберкулеза, является более узкий диапазон минимальной подавляющей концентрации, и более низкая, чем в штаммах, выделенных от пациентов с туберкулезом, минимальная ингибирующая концентрация.
Нами установлено наличие значительной части полирезистентных изолятов в исследуемой группе, что может быть опять же объяснено селективным действием длительного применения антибактериальных химиопрепаратов (табл. 4).. Особенно актуальным является то, что полирезистентность в таких штаммах характеризуется довольно частым развитием устойчивости к более чем двум антибактериальным препаратам, тогда как в штаммах, выделенных от больных без туберкулеза - это сравнительная редкость.
Таблица 4
Распространенность полирезистентных штаммов H. influenzae
Наблюдаемая группаВсего полирезистентных штаммовИз них к 2 антибиотикамболее 2 антибиотиков1 группа13 (54,2%)7 (29,2%)6 (25%)2 группа1 (16,6%)1 (16,6%)0 (0%) Т=7.07, p=0,00001
Для изучения скорости развития полирезистентности в штаммах исследуемых групп была изучена динамика развития мутаций, обусловливающих полирезистентность по отношению к тем или иным антибактериальным химиопрепаратам. Нами установлено, что гипермутирующие штаммы выявляются в материале, выделенном от детей с туберкулезом. Одним из возможных объяснений может служить тот факт, что чаще всего гипермутирующими оказываются нетипируемые микроорганизмы (57,14%). Особенно актуальной гипермутабельность культуры H. influenzae является для пациентов с туберкулезной инфекцией, равно и со всеми инфекциями дыхательных путей, потому, что ген, кодирующий устойчивость к рифампицину, ортологичен генам, кодирующим устойчивость к рифампицину таких бактериальных возбудителей дыхательных путей, как S. pneumoniae, M. tuberculosis и некоторых других. Среди детей с туберкулезом нами было выявлено 7 штаммов H. influenzae, гипермутирующих по отношению к рифампицину, среди которых доля нетипируемых составила 57,14%, в контрольной группе было выделено лишь 2 подобных штамма. Количество гипермутирующих штаммов по отношению к фторхинолонам составило 6 в исследуемой группе и 2 - в контрольной. Среди детей с туберкулезом пять из шести штаммов (71,4%) также относились к нетипируемым. При анализе генома секвенированных штаммов гемофил были выявлены различия, которые определяют колонизационную способность штаммов H. influenzae. Установлено, что не все штаммы обладают одними и теми же аллелями lic-оперона: в штаммах, выделенных от детей с туберкулезной инфекцией, ген lic2a, в частности, обнаруживается в 95,83%, а в штаммах контрольной группы всего в 66,6%, по другому аллелю гена lic - гену lic2b - подобное соотношение составляет 45,83% и 16,6% соответственно. Среди гипермутириующих штаммов, выделенные от пациентов с туберкулезом в 100% случаев выявлен гены lic2a и ifE, в 57,14% - ген lic2b, в 85,7% - ген mw.
При изучении наличия и распространенности гомологичных генов у таких отдаленно родственных микроорганизмов как H. influenzae установлено наличие гомологичных генов между такими отдаленно родственными микроорганизмами как H. influenzae и M.tuberulcosis. К ним относятся гены, кодирующие субъединицу D фумарат редуктазы (МT1606 и NTHI0998), гены, кодирующие субъединицы C фумарат редуктазы (MT1605 и NTHI0999), субъедницу белка фумарат редуктазы, утилизирующую серно-железистые соединения (MT1604 и NTHI1000), флавопротеиновую субъединицы фумарат редуктазы (MT1603 и NTHI1002). Также установлено наличие гомологичных генов у H. influenzae и S.pneumoniae: 30S рибосомальная субъединица (участок S10, S19, S3, S17, S14, S8,S5,S13, S11), 50S рибосомальная субъединица (участок L3, L4, L23, L2, L22, L16, L29,L14, L24, L5,L6,L18,L30, L15, L36, L17), а также субъединица SecY белка-транслоказы, альфа-субъединицы РНК-полимеразы.
Способность к формированию микробиоценоза среди трех микроорганизмов (H. influenzae, Mycobacteria tuberculosis и S.pneumonia) подтверждена и анализом белковой гомологии предполагаемых штаммов. Так, при анализе данных генов, кодирующих гомологичные белки H. influenzae, M. tuberculosis и S. pneumoniae, было выявлено наличие гомологичных генов между такими отдаленно роственными микроорганизмами как H. influenzae и M. tuberulcosis.
Таким образом, наличие гомологичных белков подтверждает не только общность вертикальных эволюционных процессов рассматриваемых микроорганизмов, что собственно и привело их к формированию единого микробиоценоза в такой нише как дыхательные пути
ВЫВОДЫ
1. В этиологической структуре носительства микроорганизмов у детей с туберкулезной инфекцией H. influenzae является одним из наиболее распространенных видов. 2. В структуре штаммов H. influenzae значительное место занимают типируемые штаммы, однако треть всех изолятов являются нетипируемыми, что позволяет их считать штаммами с высокой трансформационной способностью, определяющей высокую вероятность латеральных переносов генетическго материала в микробиоценозе.
3. Характеристика антимикробной чувствительности штаммов гемофил, циркулирующих среди детей с туберкулезной инфекцией, свидетельствует о том, что среди них выражено снижение чувствительности к цефалоспоринам, фторхинолонам и рифампицину. При анализе гипермутабельности штаммов по отношению к фторхинолонам (на примере ципрофлоксацина) также выявлено преобладание гипермутирующих штаммов среди нетипируемых изолятов H. influenzae 4. Выявлены различия, которые определяют колонизационную способность в штаммах, выделенных в одном и том же биотопе (дыхательных путях), но в составе микробиоценоза с различными характеристиками (микробиоценоз дыхательных путей у детей с туберкулезом и у детей из контрольной группы). 5. Наличие общего гомолога у таких эволюционно достаточно отдаленных микроорганизмов, как H. influenzae, Mycobacteria tuberculosis, Streptococcus pneumonia, позволяет предполагать наличие и других гомологичных и ортологичных генов в геноме, экспрессия которых приведет к выработке гомологичных белков, взаимодействие которых в микробиоценозе может привести к реализации событий латерального обмена генетическим материалом.
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИКУ 1. В рамках эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями необходима организация мероприятий, направленных на специфическую профилактику сопутствующих респираторных инфекций бактериальной этиологии у пациентов детского возраста в максимально короткие сроки от госпитализации в специализированные стационары.
2. Необходимо ввести в стандарты оказания медицинской помощи пациентам детского возраста специализированных стационаров микробиологический мониторинг микробного пейзажа возбудителей дыхательных путей.
3. Необходимо ввести в стандарты оказания медицинской помощи и формулярные перечни лекарственных средств для лечения сопутствующих респираторных инфекций бактериальной этиологии у пациентов детского возраста с туберкулезом препараты амоксициллина в качестве прпаратов выбора. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Прушинский А. П. Особенности формирования носительства Haemophilus influenzae у детей с туберкулезом / А. П. Прушинский, А. В. Мартынова, О. М. Олексенко // Вопросы практической педиатрии. - 2011. - Т. 6, № 4. - С. 33-36.
2. Мартынова А. В. Эпидемиологические аспекты заболеваемости оппортунистическими инфекциями дыхательных путей детей с туберкулезной инфекцией / А. В. Мартынова, Л. А. Балабанова, А. П. Прушинский // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2011. - № 1 (56). - С. 25-27. 3. Прушинский А. П. Микробиологические особенности штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекций / А. П. Прушинский, А. В. Мартынова // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2010. - № 4 (42) - С. 96-97.
4. Прушинский А. П. Сравнительный геномный анализ штаммов H. influenzae и других бактериальных патогенов респираторного тракта / А.В. Мартынова, А.П. Прушинский // Журнал инфектологии. - 2010. - Т. 2, № 4. - С. 101.
5. Скурихина Ю. Е. Заболеваемость инфекциями верхних дыхательных путей и носительство возбудителей у детей с внелегочным туберкулезом / Ю. Е. Скурихина, А.В. Мартынова, А. П. Прушинский, Л. Н. Лебедева, А. И. Заярный // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - 2008. - № 13. - С. 157-161.
6. Прушинский А. П. Сопутствующие инфекционные заболевания у детей с внелегочным туберкулезом / А.П. Прушинский, Ю.Е. Скурихина // Тезисы докладов VIII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, Владивосток, 19-20 апреля 2007. - Владивосток: 2007. - С.230.
7. Мартынова А. В. ПЦР диагностика бактериальных инфекций дыхательных путей у пациентов с латентным туберкулезом / А. В. Мартынова, А.П. Прушинский // VI Международная конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность" (сборник материалов), Москва, 10-11 ноября 2009. - М.: 2009 - С. 151-152. 8. Мартынова А. В. Применение молекулярно-генетических методов в диагностике инфекций респираторного тракта / А. В. Мартынова, А. П. Прушинский, Е. С. Носач, О. А. Чулакова, Е. В. Сокурова // Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года (Труды научно-практической конференции), Москва, 28-30 октября 2009. - М.: 2009 - С. 233-234.
9. Мартынова А. В. Опыт применения ПЦР в диагностике инфекций респираторного тракта в практическом здравоохранении / А. В. Мартынова, А. П. Прушинский, Е. С. Носач, О. А. Чулакова, Е. В. Сокурова // Всероссийская научная конференция "Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций" (труды конференции), СПб, 19-20 ноября 2009. - СПб.: 2009. - С. 99.
10. Мартынова А. В. Разработка метода идентификации и генотипирования микроорганизмов-возбудителей инфекций респираторного тракта / А.В. Мартынова, А. П. Прушинский, Е. С. Носач, О. А. Чулакова //Материалы Всероссийской научной школы для молодежи "Перспективы развития инноваций в биологии". - Владивосток. - 2010. - С.70-72.
11. Мартынова А. В. Резистентность штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией / А.В. Мартынова, А. П. Прушинский // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов ХI Тихоокеанской науч-практич конф студентов и молодых ученых с международным участием, Владивосток, 21-22 апреля 2010. - Владивосток: 2010. - С. 268
12. Pruschinsky A. P. Bacterial respiratory tract infections as the sequalae of tuberculosis / A.P. Pruschinsky., Yu. E. Skurihina, E. V. Sokurova, K. Smirnov // Clinical Microbiology and Infection. - 2009. - Vol. 15, № 4.- P. 2083.
13. Martynova A. Carriage of the respiratory tract bacterial pathogens in children with latent tuberculosis / Alina Martynova, Alexei Pruschinskyi // International Journal of Infectious Diseases. - 2009. - Vol. 13, P.S34.
14. Pruschinsky A.P. Biofilm formation by respiratory tract bacterial pathogens isolated in children with tuberculosis / Alina Martynova, Alexei Pruschinskyi // Programm and Abstract book of the 1st Eurobiofilms Congress, Rome, Italy, 2-5 September 2009. - Rome: 2010. - P. 149.
15. Martynova A. V. Emergence of Haemophilus influenzae strains in the nasopharynx of children with tuberculosis / A. V. Martynova, L. A. Balabanova, A. P. Pruschinskyi // Pulmonary Medicine. - 2011. - Vol. 2011, P. 420284.
16. Martynova A. V. Respiratory tract bacterial pathogens isolated in children with tuberculosis / A. V. Martynova, A. P. Pruschinsky // Program and Abstract Book of ERS Congress, Barselona 18-22 september 2010. - Barselona: 2010. - P. 670. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
- ВДП - верхние дыхательные пути
- НДП - нижние дыхательные пути
- СРИ - сопутствующие респираторные инфекции
Прушинский Алексей Петрович
Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Уч. изд. л. 1,0 Формат 60  84/16
Тираж 100 экз. Заказ № 478
Отпечатано в типографии ИПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского
690059 г. Владивосток, ул. Верхнепортовая, 50а
20
2
17
Документ
Категория
Медицинские науки
Просмотров
74
Размер файла
77 Кб
Теги
кандидатская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа