close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Генетика лесных древесных растений (ПЗ 35.03.01)

код для вставкиСкачать
1
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное Государственное образовательное учреждение
Высшего образования
ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЛЕСОТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ им. Г.Ф. Морозова
ГЕНЕТИКА ЛЕСНЫХ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ
Методические указания
к практическим занятиям для студентов по направлению
подготовки 35.03.01 — Лесное дело
ВОРОНЕЖ 2016
2
УДК 575+630165
Исаков И.Ю. Генетика лесных древесных растений [Текст]. Методические указания к практическим занятиям для студентов направления подготовки 35.03.01 — Лесное дело / И.Ю. Исаков, А.И. Сиволапов, - Воронеж:
ВГЛТУ, 2016. – 48 с.
Печатается по решению редакционно-издательского совета ВГЛТУ
Рецензент д-р. с/х. наук, зав. кафедрой биологии и защиты растений
ВГАУ А.Л. Лукин
Ответственный редактор канд. с.-х. наук, доц. И.Ю. Исаков
3
ВВЕДЕНИЕ
Генетика сыграла решающую роль в становлении биологии ХХI века
как точной науки. Сегодня генетика вторгается в самые различные области
человеческой деятельности: от медицины и охраны окружающей среды до
социологии и демографии. Генетика стала основой биотехнологии.
Благодаря переоткрытию и восприятию законов Менделя в начале века
биология вошла в семью точных наук. За это столетие генетика прошла огромный путь от менделевских факторов к макромолекулам – белкам и нуклеиновым кислотам. Генетика в настоящее время является одной из важнейших интегрирующих биологических дисциплин, а ее методология продолжает объединять исследования всех форм жизни на земле.
Генетика поздно пришла в Россию, но успешно развивалась: это научные школы Ю.А. Филипченко, Н.К. Кольцова, Н.И. Вавилова. Наши генетики внесли выдающийся вклад в науку. Гомологические ряды в наследственной изменчивости Н.И. Вавилова, генетика природных популяций С.С. Четверикова, открытие Б.Л. Астауровым спонтанной модификационной изменчивости, огромный вклад в частную генетику животных и теорию гена А.С.
Серебровского, работы Н.В. Тимофеева-Ресовского, положившие начало молекулярной генетике и молекулярной биологии, генетико-автоматические
процессы в популяциях Д.Д. Ромашова и Н. П. Дубинина, блестящие исследования по мутагенезу Г.А. Надсона и Г.С. Филипова, М.Н. Мейселя, В.В.
Сахарова, М.Е. Лобашева, И.А. Рапопорта.
В конце тысячелетия в лесных вузах России начали преподавать генетику как самостоятельную дисциплину.
Лабораторные занятия предусматривают проработку следующих разделов:
1. Цитологические основы наследственности. Митоз. Изучение кариотипа
древесных растений. Митотическая активность.
2. Микроспорогенез и развитие мужского гаметофита.
3. Мегаспорогенез и развитие зародышевого мешка. Оплодотворение и
апомиксис.
4. Мутагенез и полиплоидия.
5. Гибридологический анализ. Статистическая обработка данных гибридологического анализа.
6. Географическая изменчивость сосны обыкновенной.
4
7. Оценка генетической гетерогенности испытуемых образцов древесных
растений.
8. Генетическое равновесие в свободно скрещивающейся популяции при
учете одной пары аллелей.
9. Применение изоферментного анализа при изучении гетерогенности природных популяций.
10. Введение в молекулярно — генетический анализ. Статистическая обработка сиквенсов ДНК в компьютерной программе МЕГА.
По каждой теме указана цель работы, задание, перечень материалов и
оборудования, пояснения к заданию и последовательность его выполнения.
Для обеспечения систематической работы студентов над курсом, в целях глубокой проработки учебного материала и облегчения сдачи зачета студенты сдают коллоквиумы.
РАБОТА 1 Цитологические основы наследственности. Митоз.
Изучение кариотипа древесных растений.
Митотическая активность
Ведущая роль в явлениях наследственности принадлежит ядру. Составными компонентами ядра являются хромосомы, в состав которых входит
дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Молекулы ДНК несут наследственную информацию. В каждой соматической (вегетативной) клетке живого организма наблюдается определенный набор хромосом, который носит название кариотипа. Кариотип – это совокупность хромосом соматических клеток
организма, типичная для данного вида растений и животных, характеризующаяся числом хромосом, их величиной, формой и другими морфологическими особенностями. Гомологические хромосомы – парные, соответствующие,
полученные при оплодотворении хромосомы, нормально коньюгирующие
между собой в мейозе.
Задача данной работы состоит в том, чтобы познакомить студентов с
вопросами передачи наследственности при вегетативном размножении, т.е.
при митозе.
Митоз
Задание 1. Внимательно рассмотреть клетки корешков сосны, лиственницы и листьев тополя на препаратах, используя световой микроскоп. Зари-
5
совать фазы: интерфазу, профазу, метафазу, анафазу и телофазу. Особое
внимание обратить на морфологию хромосомы.
Материал и оборудование:
1. Постоянные или полупостоянные препараты митоза (кариокинеза) тополя, лиственницы или сосны.
2. Микроскоп.
3. Салфетка.
Пояснения к заданию. Митоз является основным способом размножения соматических клеток. В процессе митоза происходит сначала удвоение, а
затем точное распределение наследственного материала, содержащегося в
хромосомах, между вновь возникающими клетками. В результате митоза из
одной материнской клетки образуются две дочерние. Ядро каждой дочерней
клетки имеет, как правило, такой же набор хромосом, какой был в исходной
материнской клетке. Между двумя митотическими делениями клетка растет,
функционирует, подготавливаясь к последующему митозу. Это состояние
клетки называется интерфазой. В это время хромосомы сильно деспирализованы и не выявляются при помощи окраски. Ядро имеет мелкозернистую
структуру. Центральный момент, который характеризует эту фазу – редупликация ДНК (удвоение молекулы ДНК). Двойная цепь ее сначала разделяется
на две, и на каждой из них достраиваются новые комплементарные дочерние
цепи нуклеотидов под действием фермента ДНК-полимеразы.
Профаза. Различают раннюю и позднюю профазу. На ранней профазе в
ядре клетки появляются нити хроматинового вещества. В поздней профазе
усиливается спирализация хроматиновых нитей, происходит исчезновение
ядрышек и ядерной оболочки. Каждая хромосома, состоящая из двух хроматид, спирально скрученных и соединенных центромерой, четко проявляется.
Метафаза. Хромосомы концентрируются в центре клетки и располагаются в одной плоскости. Центромера каждой хромосомы, скрепляющая обе
хроматиды, располагается строго в плоскости экватора клетки, а плечи хромосом бывают вытянуты более или менее параллельно нитям веретена. В метафазе хорошо выявляется число, форма и строение хромосом.
Анафаза. Начинается деление центромер всех хромосом. После деления центромер сестринские хроматиды каждой хромосомы отталкиваются
друг от друга и расходятся к противоположным полюсам клетки. Эта фаза
протекает быстро.
6
Телофаза. Дочерние хромосомы деспирализуются и утрачивают видимую индивидуальность. Образуется оболочка ядра, затем восстанавливается
и ядрышко. На этом завершается кариокинез, затем наступает цитокинез (деление цитоплазмы). Цитокинез начинается с того, что в экваториальной части материнской клетки утолщаются нити веретена и между ними образуется
клеточная перегородка. В результате митотического деления соматической
клетки в меристеме образуются из материнской две дочерние клетки, в которых происходит точное и равное распределение наследственного материала
(рис. 1.1).
Значение митоза: митоз поддерживает вегетативное размножение растений, при этом наследственные признаки передаются полностью от материнского растения его потомству.
Рис. 1.1.Схематическое изображение стадий митоза
Выполнение задания. На световом микроскопе изучить все фазы мито-
7
за. Объекты: митоз в меристеме листьев тополя, корешках сосны и др. Сделать подсчет хромосом на 2-3 метафазных пластинках. Зарисовать все фазы
митоза.
Демонстрация слайдов: митоз у диплоидного и миксоплоидного (триплоидного) тополя сереющего. Просмотр микрофотографий: митоз у сосны
обыкновенной, дугласии, тополя сереющего.
Митотическая активность
Задание 2. Определить митотическую активность в конусе нарастания
корешков проростков семян лиственницы, березы, сосны в зависимости от их
длины.
Материал и оборудование
Полупостоянные препараты корешков проростков семян сосны, лиственницы, березы и др. растений во время микроспорогенеза.
Пояснения к заданию. Митотическая активность тканей определяется
отношением числа клеток, находящихся в митозе, к общему числу клеток на
данном участке ткани, например в зоне деления в конусе нарастания корешка. Это отношение выражают либо в процентах или в виде показателя, который получил название митотического индекса (МI). Митотический индекс
чаще всего выражают в промилле (‰), т.е. в числе митозов на 1000 клеток
исследуемого участка ткани.
Выполнение задания: Внимательно рассмотреть под микроскопом
(объектив  40, окуляр 10) полупостоянные давленные препараты и установить зону деления клеток (меристемы конуса нарастания корня или в листьях). Считают число клеток в различных фазах митоза и общее число клеток в
3-5 полях зрения и заносят в таблицу (табл. 1.1).
Таблица 1.1
Митотический индекс в зоне деления корешков проростков семян
березы повислой, имеющих различную длину
Длина
коПоле
решка, зрения
мм
5
1
всего
403
Число клеток в зоне деления
В том числе в митозе
про- мета- анавсего
фаза фаза
фаза
230
71
23
51
телофаза
85
Митотический индекс
(MI, ‰)
8
209
2
380
201
63
17
39
82

1000
525
398
3
410
197
68
9
43
77
Всего 1193 628
202
49
133
244
Среднее 398
209
68
16
44
81
1
393
124
57
8
198
40
2
385
135
46
7
21
61
136

1000
346
20
3
400
149
62
11
24
52
393
Всего 1179 408
165
26
64
153
Среднее 393
136
55
9
21
51
1. Подсчитать число клеток в профазе, метафазе, анафазе и телофазе и
записать в соответствующие графы той же таблицы.
2. Аналогичные подсчеты проводят на других срезах этого корешка и
других корешков. Для получения достоверных данных подсчеты проводят у 5-10 корешков в каждом варианте в 3-5 полях зрения. Среднее
по каждому варианту опыта можно вывести на основании суммирования результатов всех наблюдений.
3. Митотический индекс (МI) определяют отношением среднего числа
митозов к среднему числу клеток в зоне деления в промилле по формуле
M
MI
 1000
,
N
где M – число митозов;
N – число клеток в зоне деления.
Выводы: митотическая активность в клетках кончиков корешков длиною 5 мм значительно выше, чем у корешков длиною 20 мм.
РАБОТА 2 Микроспорогенез и развитие мужского гаметофита
Половое размножение растений возникло на определенном этапе эволюции организмов и является наиболее совершенной формой воспроизведения потомства. По сравнению с вегетативным половое размножение имеет
существенные преимущества. Во-первых, оно обеспечивает значительно
большую численность потомства и, во-вторых, увеличивает его наследственную изменчивость, что создает благоприятные условия для последующего
отбора наиболее приспособленных форм.
9
Половой процесс размножения предусматривает прежде всего образование мужских и женских половых клеток. Эти клетки в отличие от соматических клеток имеют гаплоидный набор хромосом (n). Механизм, обеспечивающий уменьшение числа хромосом вдвое, заключается в особом типе клеточного деления, который называется мейозом.
Задание 1. Рассмотреть клетки, находящиеся в различных фазах мейоза
у тополя или других древесных растений, и зарисовать их.
Материал и оборудование
Постоянные и полупостоянные препараты пыльников тополя, ольхи,
лиственницы или др. растений во время микроспорогенеза.
Пояснения к заданию. Мейоз – процесс деления клетки, предшествующий образованию половых клеток, при котором происходит уменьшение
(редукция) числа хромосом в два раза. Мейоз осуществляется в течение двух
клеточных делений (I и II), состоящих из ряда последовательных фаз. Мейоз
протекает в материнских клетках микроспор и мегаспор (макроспор). В результате мейоза образуются споры, которые в дальнейшем дают начало мужскому гаметофиту (пыльце) и женскому гаметофиту (зародышевому мешку).
Первое деление (мейоз-I) называется редукционным или гетеротипическим,
второе деление (мейоз – II) называют эквационным делением или гомотипическим.
Мейоз – II протекает по типу митоза. Фазы, относящиеся к первому делению, обозначают цифрой – I, ко второму – II.
Профаза – 1. Эта фаза состоит из ряда последовательных стадий: лептотены, зиготены, пахитены, диплотены и диакинеза. На стадии лептотены
хромосомы имеют вид длинных тонких нитей, собранных в ядре в виде рыхлого клубка. Каждая хромосома состоит из двух хроматид.
На стадии зиготены происходит коньюгация (соединение попарно) гомологичных хромосом. Соединение в пары начинается с концов хромосом и
распространяется вдоль.
На стадии пахинемы происходит спирализация (укорачивание и утолщение) пар гомологичных хромосом, которые называют бивалентами. Каждый бивалент состоит из четырех хроматид, которые хорошо различимы и
соединены центромерой.
10
На стадии диплотемы хромосомы в бивалентах отходят друг от друга,
расхождение их начинается с отталкивания центромерных участков гомологичных хромосом. По фигурам бивалентов распознают, произошел ли кроссинговер (обмен участками между хроматидами гомологичных хромосом,
обуславливающий рекомбинацию генов) и был ли он одинарным или двойным. Хромосомы образуют Х-образные фигуры, называемыми хиазмами.
На стадии диакинеза происходит сильное утолщение и укорачивание
хромосом. Биваленты в это время располагаются по периферии ядра.
Метафаза – I. Ядерная оболочка исчезает, биваленты располагаются в
цитоплазме по экватору клетки. Центромеры хромосом прикрепляются к тянущимся нитям веретена. В отличие от митоза в метафазе I мейоза центромеры не делятся.
Анафаза – I. Гомологичные хромосомы расходятся к противоположным полюсам клетки. Вследствие этого число хромосом в дочерних ядрах
уменьшается вдвое. Причем каждая пара бивалентов отходит с равной вероятностью к любому из двух полюсов, независимо от другой пары.
Телофаза – I. Формируется ядерная оболочка, дихроматидные хромосомы концентрируются на полюсах. Образуется диада клеток.
Интеркинез - непродолжительная подготовка к следующему делению.
Мейоз – II мало отличается от митоза по своему механизму, но имеет
некоторые особенности.
Профаза II может отсутствовать или быть очень короткой.
Метафаза – II. Хромосомы располагаются по экватору. К центромерам
хромосом прикрепляются тянущиеся нити веретена.
Анафаза II. Центромеры делятся, хроматиды расходятся к противоположным полюсам клетки. Хромосомы не идентичны, как в митозе, потому
что участвовали в кроссинговере. На каждом полюсе клетки оказывается гаплоидное число хромосом.
Телофаза – II. Хромосомы концентрируются на полюсах клеток и деспирализуются. Формируются ядра, ядрышки, происходит цитокинез. Заканчивается мейоз образованием из каждой материнской клетки четырех макроили микроспор с гаплоидным набором хромосом. Образуется тетрада (рис.
2.1).
11
Выполнение задания. На световом микроскопе изучить все фазы мейоза. Они хорошо просматриваются. Объекты: мейоз в пыльниках тополя, сосны или лиственницы. Сделать подсчет хромосом в метафазе-I и метафазе-II.
Демонстрация слайдов: мейоз у диплоидного и миксоплоидного (триплоидного) тополя сереющего. Знакомство с мейозом на микрофотографиях
(мейоз в пыльниках дугласии, тополя и др.).
Заключение. При мейозе совершаются следующие процессы, имеющие
важное значение в наследовании признаков:
1. Конъюгация гомологичных хромосом.
2. Кроссинговер.
3. Редукция числа хромосом.
Комбинационная изменчивость организмов обеспечивается кроссинговером.
Премейотическая
интерфаза
Профаза I
Лептотена
Метафаза I
Зиготена
Анафаза I
Пахитена
Телофаза I
Диплотена
Метафаза II
Диакинез
Анафаза II
Рис. 2.1. Схематическое изображение последовательных стадий мейоза
Таким образом, микроспорогенез начинается с обособления в субэпидермальной ткани молодого пыльника специальной спорогенной ткани – археспория. Каждая его клетка после ряда митотических делений становится
материнской. Эти материнские клетки проходят все фазы мейоза, и каждая из
них дает по четыре клетки с гаплоидным набором хромосом. Они располагаются вместе и называются тетрадами. Вскоре тетрады распадаются на отдельные клетки – микроспоры, и у них образуется внутренняя и наружная
оболочки. На этом микроспорогенез заканчивается.
Микрогаметогенез
Задание 2. Рассмотреть клетки, находящиеся в различных стадиях
микрогаметогенеза у тополя и других древесных растений, и зарисовать их.
Материал и оборудование
1. Микроскоп.
2. Полупостоянные препараты микрогаметогенеза тополя и др. древесных растений.
Пояснения к заданию. Микрогаметогенез начинается в пыльцевом
зерне. Ядро микроспоры делится митотически и образуются две клетки – вегетативная и генеративная (рис. 2.2). Вегетативная клетка больше не делится, она увеличивается в размерах и накапливает запасные питательные
вещества, которые используются для вторичного деления генеративной клетки и роста пыльцевой трубки при прорастании пыльцевого зерна.
14
Материнская клетка
микроспоры
Синапсис
гомологичных
хромосом
Метафаза I
Метафаза II
Тетрада
микроспор
Первый
митоз в
микроспорах
Развитие
гаплофазы
Ядро
пыльцевой
трубки
Спермии
Рис. 2.2. Образование пыльцевых зерен (микроспорогенез) у цветковых растений
В результате вторичного деления генеративной клетки образуются две
мужские половые клетки, или спермии.
У разных древесных пород окончательное формирование пыльцевых
зерен может различаться. У многих хвойных и лиственных вторичное деление генеративной клетки происходит не в пыльцевом зерне, а в пыльцевой
трубке при его прорастании. У сосны, ели наружный слой оболочки пыльце
вого зерна отстает от внутреннего с двух сторон и образуются два пузыря, что способствует переносу пыльцевых зерен ветром
Выполнение задания. На световом микроскопе изучить все стадии микрогаметогенеза, зарисовать.
РАБОТА 3 Макроспорогенез и развитие зародышевого мешка.
Оплодотворение. Апомиксис
Макроспорогенез
Образование женских половых клеток также начинается с обособления
археспориальных клеток в молодой семяпочке. (Семенные растения делятся
на голосеменные и покрытосеменные. У первых завязь не образуется, а семяпочка лежит свободно. У вторых она развивается в завязи). Но в отличие от
пыльника в семяпочке обособляется только одна археспориальная клетка.
Эта клетка растет и затем претерпевает мейотическое деление, в результате
которого образуется тетрада гаплоидных клеток. Но в дальнейшем развивается только одна из четырех клеток, остальные три разрушаются.
Макрогаметогенез
Оставшаяся клетка растет, формируясь в зародышевый мешок (макроспору). У лиственных пород (покрытосеменных) ее ядро делится трижды митотическим путем, образуя восемь наследственно одинаковых гаплоидных
ядер. Эти ядра обособляются в самостоятельные клетки. Одна из них становится яйцеклеткой (женской половой клеткой). Две другие, находящиеся рядом с яйцеклеткой, называются синергидами. Еще две клетки объединяются
своими ядрами и образуют центральную клетку зародышевого мешка с диплоидным набором хромосом. Оставшиеся три клетки располагаются в противоположной яйцеклетке и синергидам стороне зародышевого мешка и называются антиподами. У лиственных пород деление клеток внутри зародышевого мешка на этом временно прекращается и возобновляется лишь после
оплодотворения. Макроспорогенез у покрытосеменных показан на рис.3.1.
Рис.3.1. Образование зародышевых мешков (мегаспорогенез) у цветковых
растений
Рис. 3.2. Зародышевый мешок у покрытосеменных:
где 1 – две синергиды;
2 – центральная клетка зародышевого мешка (две клетки объединяются
своими ядрами и образуют центральную клетку зародышевого мешка
с диплоидным набором хромосом);
3 – три антипода;
4 – яйцеклетка.
Задание 1. Внимательно рассмотреть на препаратах, фотографиях,
слайдах зародышевый мешок у березы, дуба, сосны и зарисовать.
Материал и оборудование:
1. Постоянные и полупостоянные препараты макрогаметогенеза у сосны, березы, дуба.
2. Фотографии, слайды.
3. Микроскоп.
Выполнение задания. На световом микроскопе внимательно изучить
поэтапно все стадии макрогаметогенеза у сосны, дуба. Используя фотографии, изучить макроспорогенез и развитие женского гаметофита у сосны
обыкновенной.
У хвойных пород (голосеменных) оставшаяся из 4-х клетка разрастается, интенсивно делится митотически и образует многоклеточный бесцветный
эндосперм, содержащий запасные питательные вещества для будущего зародыша. Следовательно, у хвойных эндосперм возникает до оплодотворения и
независимо от него. Его клетки содержат гаплоидный набор хромосом. На
вершине эндосперма, обращенной к пыльцевходу, из его поверхностных клеток формируются архегонии, которые имеют по одной яйцеклетке (рис. 3.3).
1
2
3
4
5
6
Рис.3.3. Схема строения зародышевого мешка у голосеменных,
где 1 – микропиле;
2 – интегумент;
3 – проросшее пыльцевое зерно;
4 – шейковые клетки;
5 – женский гаметофит (эндосперм);
6 – архегонии с яйцеклетками.
Оплодотворение
В генетике тип опыления у растений данного вида называют системой
полового размножения.
У лиственных пород зрелое пыльцевое зерно, попав на рыльце пестика,
прорастает. Образуется пыльцевая трубка, которая проникает в глубь завязи.
Проходя через микропиле, пыльцевая трубка достигает яйцевого аппаратаяйцеклетки и двух синергид и лопается. Спермии попадают внутрь зародышевого мешка. Один из спермиев внедряется в яйцеклетку и их ядра сливаются. Образуется зигота с двойным набором хромосом. Из зиготы развивается зародыш семени.
Другой спермий сливается с диплоидным ядром центральной клетки
зародышевого мешка. В результате образуется триплоидный эндосперм, сначала ядерный, а затем клеточный (рис.3.4).
Процесс двойного оплодотворения у лиственных был открыт в 1898 г.
русским ученым С. Г. Навашиным.
Рис.3.4. Схема двойного оплодотворения у покрытосеменных растений
Генеративный цикл у покрытосеменных древесных растений показан
на рис.3.5.
Рис. 3.5 Генеративный цикл у покрытосеменных древесных растений:
1. Пестик с семяпочкой (после мейотического деления); 2. тетрада мегаспор; 3. образование зародышевого мешка в итоге трех последовательных митотических делений нижней мегаспоры; 4. два
полярных ядра в центре зародышевого мешка; 5. яйцеклетка с двумя синергидами (спутниками);
6. поперечный разрез пыльника с гнездами археспориальной ткани/ из каждой клетки которого
образуется тетрада микроспор; 7. пыльца (микроспора) и первое еѐ деление; 8. проросшая пыльца
с вегетативной и антеридиальной клетками; 9. вегетативное ядро; 10. два спермия; 11. пыльцевая
трубка проросшей пыльцы в тканях пестика, достигшая
20 зародышевого мешка семяпочки; 12. процесс созревания зародыша; 13. семя с созревшим зародышем.
У хвойных эндосперм возникает до оплодотворения и его клетки гаплоидны. Зрелое пыльцевое зерно, попав на пыльцевход семяпочки, прорастает пыльцевой трубкой по направлению к архегониям. Поскольку у хвойных
яйцеклетки не успевают созреть (у сосны целый год, у ели и лиственницы –
несколько недель), то пыльцевые трубки приостанавливают свой рост. Как
только яйцеклетки созреют, рост трубок быстро возобновляется. Это характерно для некоторых лиственных (семейства березовых, буковых, некоторые
виды дуба). Достигнув архегония, пыльцевая трубка лопается, и один из
спермиев устремляется к яйцеклетке. Происходит оплодотворение, возникает
зигота с диплоидным набором хромосом, из которой развивается зародыш
семени, окруженный эндоспермом. Полный генеративный цикл у хвойных
Рис. 3.6. Генеративный цикл у сосны обыкновенной.
1 – тетрада микроспор, образовавшихся в результате мейоза в клетке археспория пыльников; 2 – тетрада мегаспор (макроспор), образовавшихся в материнской клетке семяпочки; 3 – пыльцевые зерна (микроспоры) с воздушными мешками; 4 – созревшая пыльца с антеридиальной и преталлиальными клетками; 5 –
семяпочка с двумя архегониями в эндосперме; 6 - проросшая пыльца с двумя
древесных
показан
на рис.
3.6.
спермиями;
7 –пород
семяпочка
перед
оплодотворением:
пыльцевая трубка со спермиями достигла архегония заростка, в котором сформировались яйцеклетки; 8 –
оплодотворение: слияние спермия с яйцеклеткой; 9 – зародыш; 10 – семя; 11 –
дерево сосны обыкновенной, выросшее из семени; 12 – семяпочка (макроспорангии) на семенной чешуйке (макроспорофилле); 13 – колосок микростробилов с микроспорангиями (пыльниковыми мешками).
21
Апомиксис
У растений бесполосеменное размножение обычно называется апомиксисом в узком смысле этого слова. Встречается как гаплоидный, так и диплоидный апомиксис.
Гаплоидный апомиксис у растений встречается редко и приводит к
возникновению совершенно стерильных растений с резко пониженной жизнеспособностью
Диплоидный апомиксис у довольно многих видов и разновидностей
является единственной формой семенного размножения и полностью вытесняет нормальное половое размножение. Примером такого облигатного апомиксиса могут служить некоторые виды ежевик, роз и у одуванчиков.
Сотрудниками кафедры лесных культур и селекции ВГЛТА выявлен
возможный апомиксис у березы повислой. На семейственной плантации березы получены семена без опыления, всхожесть которых колебалась от 1 %
до 3 %. Это говорит о том, что у березы возможен апомиксис.
РАБОТА 4 Мутагенез и полиплоидия
Мутациями называют внезапные наследственные изменения у отдельных особей, в результате которых организм приобретает новые признаки и
свойства. Мутационные изменения могут затрагивать самые разнообразные
признаки и свойства организмов.
Мутации могут быть спонтанными, возникающими в природе, и индуцированными, вызванными воздействием различных факторов, называемых
мутагенными.
Различают следующие типы мутаций: генные, хромосомные, геномные
и плазменные.
Задача данной работы состоит в том, чтобы познакомить студентов со
спонтанными и индуцированными геномными мутациями.
Задание1 . Рассмотреть микропрепараты, находящиеся в фазе метафазы и анафазы у спонтанных геномных мутантов тополя, зарисовать их.
Материал и оборудование:
1. Полупостоянные препараты пыльников и соматической ткани тополя.
2. Микроскоп.
3. Слайды.
Пояснения к заданию. Рассмотреть различные внутрихромосомные
аберрации: делеции, инверсии и дупликации.
Делеция (нехватка) – выпадение участка хромосомы.
Инверсия – разрыв хромосомы в двух местах одновременно с сохранением внутреннего участка, который поворачивает на 180°.
Дупликация – удвоение одного и того же участка хромосомы.
Транслокация – обмен участками между негомологичными хромосомами.
Существует метафазный и анафазный метод хромосомных аберраций.
Метафазный метод довольно точный, но его используют для четко различимых хромосом. Анафазный метод предусматривает анализ хромосомных
аберраций в анафазе митоза. Чаще всего они представляют собой мосты и
фрагменты.
Выполнение задания. На световом микроскопе подсчитать типы нарушений по фазам митоза или мейоза тополя э.с.-38, Хоперский 1 – геномных
мутантов и занести в табл. 4.1.
Таблица 4.1
Частота нарушений митоза тополя э.с.-38.
Фазы
митоза
мосты
Типы нарушений
отставание забегание
др.типы Всего
фрагменты
хромосом хромосом
нарушений
Метафаза
Анафаза
Телофаза
В качестве контроля можно изучить любой диплоидный тополь.
Задание 2. Окрасить и определить размеры пыльцы геномного мутанта
тополя э.с.-38 с помощью окулярмикрометра.
Материал и оборудование:
1. Пыльца тополя э.с.-38.
2. Предметные и покровные стекла.
3. Препаровальные иглы.
4. Микроскоп световой.
5. Реактив для окраски пыльцы (кармин или йод-хлоралгидрат) готовится за 2-3 суток: 5 г хлоралгидрата смешивают с 2 мл воды, добавляют кристаллический йод – 0,2 г, настаивают 2-3 суток.
Пояснения к заданию. Качественный и количественный состав формирующейся пыльцы в значительной степени определяется динамикой и характером поведения хромосом в мейозе при микроспорогенезе.
Известно также, что между размерами пыльцевых зерен и их плоидностью существует прямая зависимость. Исходя из этого, по такому морфометрическому показателю, как диаметр пыльцы, можно опосредованно судить
об особенностях развития мужского гаметофита исследуемых организмов, об
их генетической природе, в частности о возможной гибридной, мутантной
или полиплодной природе. Это важно учитывать при использовании деревьев в качестве опылителей при гибридизации.
Выполнение задания. В 3-5 полях зрения под большим увеличением
(ок.х 10, об.х 40) выполнить замеры пыльцы окулярмикрометром и занести в
табл. 4.2.
Таблица 4.2
Диаметр пыльцы у исследуемых деревьев тополя, в делениях
окулярмикрометра
Название
Диаметр пыльцы; количество пыльцевых зерен, %
деформированная
8-10
11-14
15 и >
пыльца
Тополь э.с.-38
Выводы. Изучение соматической и генеративной ткани тополя э.с.-38
показывает, что этот тополь является геномным мутантом.
РАБОТА 5 Гибридологический анализ. Статистическая
обработка данных гибридологического анализа
При изучении закономерностей расщепления в гибридном потомстве
сопоставляют фактически полученные в опыте данные с теоретически ожидаемыми в соответствии с формулой расщепления. Фактически полученные
данные могут совпадать или не совпадать с теоретически ожидаемыми
в различной степени.
Статистическая оценка разницы между фактически полученными и
теоретически ожидаемыми данными дает возможность решить, в каких случаях и насколько эта разница существенна и в каких случаях она несущественна и случайна.
Задание 1. Ознакомиться со статистическим характером расщепления
при моногибридном скрещивании.
Материал и оборудование
1. Семена гороха, полученные при гибридологическом анализе.
2. Таблицы значений 2 по П. Ф. Рокицкому.
Пояснения к заданию. В генетико-селекционных работах необходимо
сравнить эмпирические частоты (Рэмп.) с теоретически ожидаемыми (Ртеор.). Например, требуется определить, достоверно ли отклоняются наблюдаемые частоты расщепления генотипов во II поколении гибридного потомства гороха от теоретически ожидаемых частот при расщеплении по второму
закону Г. Менделя при моногибридном скрещивании на генотипы 1(АА) :
2(Аа) : 1(аа).
Чтобы оценить степень соответствия фактически полученных в опыте
данных с теоретически ожидаемыми, К. Пирсон (1900) предложил использовать критерий ХИ-квадрат (χ2) или критерий соответствия.
Критерий χ2 определяется отношением квадрата разности ожидаемых и
теоретических частот на частоту теоретическую.
2
Рэмп
.
Ртеор
.)
2 (

,
Ртеор
где Рэмп. – частота эмпирическая (наблюдаемая);
Ртеор. – частота теоретическая.
Величина χ2 выражается любым положительным числом. Для оценки
степени соответствия фактически полученных в опыте данных с теоретически ожидаемыми пользуются, таблицей значений χ2 при разных степенях
свободы. Для этой таблицы используют данные по анализу моногибридного
скрещивания гороха. В таблицу вносят фактически полученные данные
(Рэмп.) , теоретически ожидаемые данные ( Ртеор. ) в соответствии с
формулой расщепления (при моногибридном скрещивании 3 : 1), затем определя
.Ртеор
.), возводят в квадрат, полученную величину
ют отклонение ( Рэмп
делят на теоретически ожидаемое число семян для данного фенотипа (желтых или зеленых семян). Суммируя частные, получают χ2.
Вычисление χ2 при дигибридном скрещивании производится аналогичным образом. Используют данные, полученные при анализе дигибридного
скрещивания гороха. Вычисление удобно вести, пользуясь табл. 5.3.
Выполнение задания. Установить, соответствуют ли результаты опыта
теоретически ожидаемому (в соответствии с Менделевским расщеплением)
отношению желтых и зеленых как 3 : 1. Разобрать полученную выборку семян на желтые и зеленые. Определить ожидаемые частоты признаков. Рассчитать показатель сходства χ2 по табл. 5.3. Дать заключение о соответствии
или несоответствии фактических (наблюдаемых) и теоретических результатов расщепления.
Таблица 5.1
2
Вычисление χ при моногибридном скрещивании гороха
Показатели
Семена
желтые
Зеленые
110
116
-6
36
44
38
+6
36
Число семян
Фактически полученных Рэмп.
Теоретически ожидаемых при 3:1 ( Ртеор. )
.Ртеор
.)
Отклонение (Рэмп
.Ртеор
.)2
( Рэмп
2
(Рэмп
.
Ртеор
.)
Ртеор
.
36
0,31
116
(
Рэмп
.
Ртеор
.)



0,31+0,947=1,257
36
0,947
38
2
Ртеор
.
Исходя из соответствия 3 : 1, определить теоретически ожидаемые частоты. Из табл. 5.3 следует, что величина χ2 зависит от двух величин: числа
степеней свободы (df) и вероятности (Р). Для уяснения понятия ―степень
свободы‖ достаточно привести простейший пример. Допустим, что имеется
гибрид гороха, давший расщепление по окраске семян на 2 фенотипа (класса):
110 желтых семян и 44 зеленых. Их можно представить как сумму, в
которой одно из слагаемых устанавливается свободно, а другое зависит от
первого. В таком случае только одно слагаемое берется свободно и, следовательно, степень свободы только одна. При трех классах особей будет 2 степени свободы, при четырех – 3 степени свободы и т.д., при n классах df = n1.
Вероятность (Р), от которой также зависит величина χ2 в сельскохозяйственных и лесоводственных исследованиях, условно принимают равной
0,05. Это означает, что если вычисленное значение χ2 не превышает табличного значения χ2, находящегося в графе с вероятностью 0,05, то фактически
полученные данные соответствуют теоретически ожидаемым. Если вычисленное значение χ2 меньше табличного при вероятности 0,05, то фактически
полученные данные более точно соответствуют теоретически ожидаемым.
Если, наоборот, вычисленное значение χ2 больше табличного значения при
вероятности 0,05, то фактически полученные данные не соответствуют теоретически ожидаемым.
В рассмотренном выше примере χ2 при моногибридном скрещивании
гороха равен 1,257. Так как число классов (фенотипов) в этом случае равно
двум (желтые и зеленые семена), то число степеней свободы df равно 1 (2-1).
Из табл. 5.3 следует, что значение χ2, равное 1,257, соответствует вероятности 0,25, то есть находится левее графы с вероятностью 0,05. Это означает,
что фактически полученное расщепление вполне соответствует теоретически
ожидаемому отношению 3 : 1.
Задание 2. Ознакомиться со статистической обработкой данных при
дигибридном скрещивании. Вычислить критерий соответствия χ2.
Материал и оборудование
1. Данные по гибридологическому анализу при дигибридном скрещивании гороха.
2. Таблица значений χ2 по П. Ф. Рокицкому.
Пояснения к заданию. При дигибридном скрещивании вычисленное
значение χ2 равно 0,761 (табл. 5.2.). Так как фенотипов семян в этом случае 4,
то число степеней свободы равно 3 (4-1). Из таблицы значений 2 (табл.5.3)
следует, что такое значение χ2 также находится левее графы с вероятностью
0,05 (между Р = 0,75 и Р = 0,90). Это значит, что фактически полученное
расщепление вполне соответствует отношению 9 : 3 : 3 : 1.
Таблица 5.2
Вычисление χ при дигибридном скрещивании гороха
2
Семена
желтые
зеле- зеленые
желтые
морщиные
морщигладкие
нистые гладкие нистые
Показатель
Число семян
Фактически полученных
(Рэмп.)
Теоретически ожидаемых при
.)
9:3:3:1 (Ртеор
Всего
60
24
20
8
112
63
21
21
7
112
.Ртеор
.) -3
Отклонение (Рэмп
2
9
(Рэмп
.
Ртеор
.)
+3
-1
+1
-
9
1
1
-
0,428
0,047
0,143
-
2
(Рэмп
.
Ртеор
.)
Ртеор
.
0,143
2
(
Рэмп
.

Ртеор
.)


Ртеор
0,143+0,428+0,047+0,143=0,761
.

2
Выполнение задания. Установить, соответствуют ли результаты опыта
теоретически ожидаемому (в соответствии с Менделевским расщеплением)
отношению желтых гладких, желтых морщинистых, зеленых гладких, зеленых морщинистых как 9 : 3 : 3 : 1. По имеющимся данным, определить ожидаемые частоты признаков. Рассчитать показатель сходства χ2 по табл. 5.3.
Дать заключение.
Таблица 5.3
Таблица значений  при разных степенях свободы (по П.Ф. Рокицкому,
с сокращением)
2
Число
степеней
свободы
(df)
1
Вероятность (Р)
0,99
0,95
0,90
0,75
0,50
0,25
0,10
0,05
0,025
0,01
-
-
0,02
0,10
0,45
1,32
2,71
3,84
5,02
6,63
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0,02
0,11
0,30
0,55
0,87
1,24
1,65
2,09
2,56
0,10
0,35
0,71
1,15
1,64
2,17
2,73
3,33
3,94
0,21
0,58
1,06
1,61
2,20
2,83
3,49
4,17
4,87
0,58
1,21
1,92
2,67
3,45
4,25
5,07
5,90
6,74
1,39 2,77 4,61 5,99
2,37 4,11 6,25 7,81
3,36 5,39 7,78 9,49
4,35 6,63 9,24 11,07
5,35 7,84 10,64 12,59
6,35 9,04 12,02 14,07
7,34 10,22 13,36 15,51
8,34 11,39 14,68 16,92
9,34 12,55 15,99 18,31
7,38
9,35
11,74
12,83
14,45
16,01
17,53
19,02
20,48
9,21
11,34
13,28
15,09
16,81
18,48
20,09
21,67
23,21
РАБОТА 6 Географическая изменчивость сосны обыкновенной
Занимая обширный ареал, сосна обыкновенная образует насаждения в
разных климатических условиях. Под влиянием естественного отбора из
большого разнообразия наследственных форм возникают климатические экотипы (климатипы), деревья которых объединяются по ряду общих наследственных особенностей, обуславливающих их устойчивость в данных условиях
среды. Поэтому сосна обыкновенная из различных мест ее ареала обладает
разными наследственными свойствами.
Для выяснения вопроса о возможности и эффективности применения
семян сосны разного происхождения в определенном районе создаются географические культуры. В нашей стране создана государственная сеть географических культур основных лесообразующих пород. На основе исследования
географических культур разработано Лесосеменное районирование основных
лесообразующих пород в СССР (1982). Географическая изменчивость сосны
показана в работе А.И. Чернодубова и др. (2005).
Задание1. Ознакомиться с теоретическим материалом межпопуляционной изменчивости, экспериментальной основой которой являются географические культуры. У четырех климатипов сосны обыкновенной выявить
различия в среднем годичном приросте по высоте и диаметру, длине хвои,
размерах и массе шишек и семян.
Материал и оборудование:
1. Поперечные срезы стволов модельных деревьев изучаемых экотипов
сосны.
2. Семена и шишки.
3. Гербарные образцы сосновых ветвей.
4. Весы.
5. Линейки.
Пояснения к заданию. В популяции варьируют, по существу, все признаки растения: морфологические, анатомические, физиологические и биохимические. Определенная изменчивость наблюдается и в пределах кроны
каждой особи (эндогенная изменчивость), а также в связи с возрастом и соотношением мужских и женских генеративных органов. Изменчивость каждого признака зависит от соотношения и варьирования генетической и паратипической изменчивости компонент общей изменчивости особей по данному признаку. Изучая изменчивость некоторых параметров географических
экотипов сосны, получая средние данные по отдельным районам, можно судить о возможности перемещения семян этих экотипов, например, в боровые
условия Учебно-опытного лесхоза ВГЛТА.
Выполнение задания. Вычертить вспомогательную таблицу (6.1). Провести обмеры и взвешивания образцов отдельно по каждому климатипу: на
поперечных срезах стволов по одному из радиусов измерить ширину всех годичных слоев с точностью до 0,1 мм; измерить длину 25 хвоинок с точностью до 1 мм; измерить длину и ширину 25 шишек с точностью до 1 мм; из
образца семян отсчитать 100 шт. и определить их массу с точностью до 0,01
г: средний прирост по высоте имеется.
Вычислить средние показатели, полученные данные вписать в табл. 6.1.
Сделать заключение о влиянии различного географического происхождения
сосны обыкновенной на изученные показатели. Для характеристики вариационных рядов у древесных растений широко применяется шкала уровней
изменчивости признаков, составленная С.А. Мамаевым (1970).
Уровень изменчивости
очень высокий высокий средний низкий оч.низ
Коэф. изменчивости С,% более 40
21-40
13-20
7-12 мен.7
Таблица 6.1
Характеристика климатипов сосны по некоторым показателям
Средние показатели
Название прирост прирост
длина
ширина
длина
климатипа по выпо диашишки,
шишки,
хвои, мм
соте, м метру, мм
мм
мм
масса
1000 семян,г
РАБОТА 7 Оценка генетической гетерогенности испытуемых
образцов древесных растений
Лесоводственное значение генетической гетерогенности (разнообразия) очень важно при создании культур. Развитие любого признака происходит под влиянием генотипа и условий внешней среды. Мерой оценки генетической гетерогенности совокупности растений по дискретным признакам является наличие и доля особей с тем или иным фенотипом.
Критерием оценки генетической гетерогенности (неоднородности) совокупности испытуемых растений по количественным признакам служит коэффициент наследуемости (Н2). Он отражает долю влияния генетического
разнообразия особей на величину изменчивости фенотипа признака
Н 
2
g2
2
 ph
,
2
где  g - генотипическая варианса;
 2ph - общая фенотипическая варианса.
Задача данной работы состоит в том, чтобы познакомить студентов с
изучением наследуемости количественных признаков в популяциях растений.
Определение коэффициента наследуемости в широком смысле
Задание 1. Рассчитать коэффициент наследуемости в широком смысле
у трех клонов тополя по темпам роста в высоту.
Материал и оборудование
Каждый студент получает параметры высот трех клонов тополя или
другой породы. Тетрадь, карандаш, ЭКВМ.
Пояснения к заданию. Принципиальной основой расчета Н2 на участке, где произрастают клоны тополя, является генотипическая однородность
деревьев (саженцев) внутри клона и генотипическая разнородность клонов
между собой. В этом случае фенотипическая изменчивость между деревьями
одного клона будет экологической и генетической, то есть,
2
ph
е2 g2,
где
 е2 - средовая (паратипическая) варианса,
 g2 - генотипическая варианса
Изменчивость между саженцами одного клона, выраженная фенотипической вариансой, обусловлена различиями между генотипами клонов и неоднородностью экологических условий, то есть
2phg2 е2. Тогда g2 2phе2.
Отсюда коэффициент наследуемости (Н2) равен
2
ph
е2
Н 2 .
ph
2
Рассчитываются средние значения признака по каждому клону ( хк ) и
суммы квадратов отклонений вариант от среднего значения клона
х х  .
2
i
к
Фенотипическая и экологическая дисперсия определяются по формуле
хх

,
2
i
к
n
1
где х i – значение признака в клоне;
х к – средняя арифметическая;
n – общее число наблюдений.
Пример. Определить коэффициент наследуемости высоты клонов тополя (табл. 7.1).
Вычисление экологической дисперсии (  )
2
е
Клон № 1
Высо- х  х
i
к
та, м
( хi )
10
-1
13
+2
11
0
12
+1
10
-1
10
-1
Клон № 2
Таблица 7.1
Клон № 3
(хi  хк )2 Высо- х i  х к (хi  хк )2 Высо- х i  х к
1
4
0
1
1
1
та, м
( хi )
12
14
13
13
14
12
-1
+1
0
0
+1
-1
1
1
0
0
1
1
та, м
( хi )
13
11
10
13
12
13
+1
-1
-2
+1
0
+1
(хi  хк )2
1
1
4
1
0
1
10

13

11

12

10

10
8
1
,6
х


1112 
1
61
6
4
12

14

13

13

14

12
0,8
х


1322 
2
61
6
8
13

11

10

13

12

13
3


1,6
х


12
3
3
6
61
,
6

0
,
8

1
,
6
2 1


1
,
33
е
3
Вычисление фенотипической дисперсии (  )
2
ph
Высота, м ( х i )
10
13
11
12
10
10
12
14
13
Сумма
хi  х к
(хi  хк )2
-2
+1
-1
0
-2
-2
0
+2
+1
-
4
1
1
0
4
4
0
4
1
-
216
х
12
;
18
32
2


1
,88
;
ph
18

1
Высота, м ( х i )
13
14
12
13
11
10
13
12
13
216
Таблица 7.2
хi  х к
(хi  хк )2
+1
+2
0
+1
-1
-2
+1
0
+1
-
1
4
0
1
1
4
1
0
1
32
,
88

1
,
33
2 1
Н


0
,
293
.
1
,
88
Вывод. Коэффициент наследуемости равен 0,293, то есть наследственные различия между клонами составляют 29,3 %; изменчивость высоты деревьев в большей степени обусловлена условиями внешней среды (70,7 %).
Выполнение задания. Выполнить расчет Н2 на полученные от преподавателя параметры клонового потомства тополей и сделать соответствующие выводы.
Определение коэффициента наследуемости в узком смысле
Задание 2.Рассчитать коэффициент наследуемости в узком смысле у
полусибового потомства плюсовых деревьев сосны обыкновенной.
Материал и оборудование:
Каждый студент получает от преподавателя параметры плюсовых деревьев сосны обыкновенной или другой породы, сеянцы (полусибовое потомство), линейка.
Пояснения к заданию. Коэффициент наследуемости в узком смысле
2
(h ) рассчитывают для растений, размножаемых семенным путем. Найти
связь количественных признаков в системе родители-потомки очень сложно,
так как количественные признаки определяются аддитивным (суммарным,
полигенным) действием генов. Коэффициент наследуемости (h2) может быть
вычислен различными способами. Наиболее распространен способ вычисле2
ния как удвоенный коэффициент корреляции h  2rор .
Пример. Рассчитать h2 высоты у однолеток сосны обыкновенной, если
известны высоты материнских деревьев и средние высоты семенного потомства каждого дерева.
Рассчитываются суммы квадратов отклонений (табл.7.3), вычисляются
варианты признака у родителей
34

 44
х
х
,
11
i
2 

 
6
,
30
х
n

1
7
2

и потомства

 4
y

y
,
93



 
0
,
70
,
2
2
y
i
n

1
7
а также коварианса



3
x

x

y

y
,
35

i
i
С


0
,
48
,
OV
n

1
7
коэффициент корреляции между признаком родителей и потомков
C
0
,
48
r
OV


0
,
228
OP
,
2 2
6
,
30

0
,
70
Y
X


коэффициент
наследуемости
2
h

2
r

0
,456
.
op
Таблица 7.3
Расчет сумм квадратов отклонений
Высота материнских деревьев ( xi ),м
Средняя высота однолеток
сосны ( yi ),см
xi  x
yi  y
xi  x 2
 yi  y2
xi x
 yi y
27,6
5,7
1,2
-1,2
1,44
1,44
-1,44
28,7
7,8
2,3
0,9
5,29
0,81
2,07
27,0
7,2
0,6
0,3
0,36
0,09
0,18
35
23,0
7,1
-3,4
0,2
11,56
0,04
-0,68
24,6
8,0
-1,8
1,1
3,24
1,21
-1,98
23,0
5,9
-3,4
1,0
11,56
1,00
3,40
28,9
7,2
2,5
0,3
6,25
0,09
0,75
28,5
7,6
2,1
0,5
4,41
0,25
1,05
,3
х 211
i
х  2,64
y 55,5
i
y  6,9
xx 44
,11

2
i
x


x
y
y
3
,35
yy 4,93 
i
i

2
i
Вывод. Следовательно, на основании испытания материнских деревьев
по их семенному потомству можно предполагать, что аддитивное участие генов в изменчивости сеянцев по их высоте довольно высоко (46 %), хотя изучению подвергалось полусибовое потомство.
Из-за сильного материнского эффекта значения h2, вычисленные таким
способом, часто искажаются. Иногда получаются минусовые значения h2 и
больше 1 по следующим причинам:
1) при сильном взаимодействии генотипа со средой. Если разные генотипы реагируют на изменения среды не одинаково, то потомство генотипически лучших деревьев может расти в новых условиях не лучше, а даже хуже, чем потомство минусовых деревьев. В этом случае коэффициент корреляции между высотами родителей и потомств будет отрицательной, следовательно, отрицательный и h2;
2) при возникновении сильных эффектов от взаимодействия родительских генов в потомстве. Например, при взаимодействии генов двух средних
по росту родителей возникает гетерозисное потомство. Тогда rop и h2 также
могут быть отрицательными.
Выполнение задания. На полученные от преподавателя параметры сеянцев полусибового потомства плюсовых деревьев и параметры материнских
деревьев выполнять расчет коэффициента наследуемости в узком смысле
(h2). Сделать вывод об обусловленности изучаемого признака наследственным фактором и условиями внешней среды.
РАБОТА 8 Генетическое равновесие в свободно скрещивающейся
популяции при учете одной пары аллей
Закономерность, которой должно подчиняться в панмиктической популяции распределение частот трех генотипических классов, контролируемых
двумя аллелями одного аутосомного гена, была установлена в 1908 г. независимо друг от друга английским математиком Г. Харди и немецким медиком
В. Вайнбергом. Внесем в решетку Пеннета частоты двух классов гамет с аллелями А и а, принимая свободное их комбинирование как результат случайного скрещивания родительских особей в панмиктической популяции.
Частоты гамет у
р (А)
q(а)
маточных деревьев
р(А)
р2(АА)
pq(Аа)
g(а)
рq(Аа)
q2(aa)
Запишем частоты генотипических классов в потомстве. Просуммируем
эти частоты, имея в виду, что их сумма, как и сумма частот аллелей  p  q  ,
по определению, равна 1 (или 100 %):
2
2
p
(
AA
)

2
pq
(
Aa
)

q
(
aa
)

1
Это выражение получило название закона, или правила Харди2
Вайнберга. Оно есть результат возведения в квадрат двучлена  p  q . Этот
закон дает возможность определить вероятность содержания генотипов АА,
Аа, аа в свободно скрещивающейся популяции.
Задание 1
1) Познакомиться с законом Харди-Вайнберга.
2) Вычислить частоты генотипов в популяции сосны обыкновенной Усманского бора, растения которой различаются по окраске семян.
Материал и оборудование:
1.
2.
3.
4.
Семена сосны обыкновенной.
Бумага
Карандаш
ЭКВМ.
Пояснения к заданию. У сосны обыкновенной черная окраска семян –
доминантный признак (А), по отношению к белой (а) окраске, N – число особей в популяции, D – число гомозиготных особей с генотипом АА, R – число
гомозиготных особей с генотипом аа, Н – число гетерозиготных особей с генотипом Аа.
Выполнение задания
1. Определить состав популяции. Он будет представлен следующей
формулой: NDRH.
2. Вычислить число генов А и число генов а в данной популяции сосны
обыкновенной по формуле А (число генов) = 2D+H, так как каждое растение
D имеет два гена А, а каждое растение Н – один ген А.
Число генов а = 2R+H, так как каждое растение R имеет два гена а, а
каждое растение Н – один ген.
3. Вычислить частоту (долю) генов А в популяции сосны. Она обозначается буквой р и вычисляется по формуле
1H
2
D

HD

р

 2 .
2
N
N
4. Вычислить частоту генов в популяции по формуле
1H
2
R

HR

q

 2 .
2
N
N
5. Пользуясь формулой Харди-Вайнберга, вычислить состояние равновесия в популяции при р=0,6 и q=0,4 и частоте генотипов АА=0,10, Аа=0,20 и
аа=0,70.
Выполнение задания. Каждый студент выполняет задание самостоятельно, и после чего получает индивидуальное задание и вычисляет состояние равновесия в популяции при определенных частотах р и q. Сделать вывод.
В предложенном примере в популяции сосны обыкновенной во всех
поколениях сохраняется соотношение генотипов с черной окраской семян
АА=0,36, гетерозигот Аа=0,48 и с белой окраской аа=0,16. При этом сохраняется частота гена А – р = 0,6 и частота гена а – q = 0,4.
РАБОТА № 9. Применение изоферментного анализа при изучении гетерогенности природных популяций
Химические реакции в живых организмах осуществляются при помощи катализаторов – ферментов. Ферменты – глобулярные (сферической формы) белки. В белках встречается двадцать типов аминокислот, чередование
которых в белковой цепи определяет специфику фермента, то есть его биологическую функцию. Фермент подходит к субстрату, как ключ к замку. В настоящее время известно около 2000 ферментов, многие из них получены в
кристаллической форме.
Строение молекулы пероксидазы. Пероксидаза – двухкомпонентный
фермент, состоящий из активной группы, вступающей в химическое взаимодействие с субстратами, и коллоидального белкового «носителя», усиливающего каталитическое действие этой группы. Это глобулярный белок диаметром 50 Ǻ (Clementi, Palade, 1969).
Цели и задачи изоферментного анализа. Изоферментный анализ позволяет проводить характеристику растительных форм как в соматических, так и
в репродуктивных тканях. Известно, что в исследуемых образцах формы
ферментов экспрессируются кодоминантно, в отличие от полного и неполного доминирования (Менделевские признаки) морфологических признаков,
которые проявляются иногда через скрытую форму. Кодоминирование – это
явление, когда оба аллеля дают равноценный вклад в формирование фенотипа. Кодоминирование обычно выявляется на электрофореграммах ферментов.
Это один из путей получения информации о генотипе, и он может служить
для выявления полиморфизма белков. Задача данной работы состоит в том,
чтобы познакомить студентов с изучением индивидуальной изменчивости у
древесных растений.
Задание 1. Изучить различные формы березы по системам размножения
(самофертильные, самостерильные формы).
Материал и оборудование.
1. Вертикальная электрофоретическая камера;
2. Источник постоянного электрического тока;
3. Набор реактивов;
4. Зимние почки разных форм березы повислой по уровню самофертильности;
5. Препаровальные иглы.
Методика для экстракции белков. Растительный материал (навески листьев) студенты растирают в предварительно охлажденной фарфоровой
ступке в равном объеме (масса/объем) 100 мМ трис-HCl буфера, pH 7,5, содержащем в качестве защитной добавки и создания антиконвекционной среды 20% сахарозу. Гомогенат центрифугируют (5′) при 8000 об/мин. В качестве лидирующего красителя используют БФС. До вхождения белковых образцов в разделяющий гель электрофорез проводили при постоянном токе 20
мА, затем – 40 мА. Электрофорез завершают, когда бромфеноловая метка
достигала нижнего анодного конца гелей. Разделение белков проводят с помощью вертикального дискового электрофореза в трубках полиакриламидного геля при 4°С в непрерывной системе, описанной Дэвисом (Davis, 1964).
Пероксидазную активность в гелях определяют с использованием бензидина.
Гели после окрашивания фотографируют.
Для удобства интерпретации
разделяющий гель условно поделен на 3 зоны:
Медленно движущиеся изоформы - S (slow) Rf = 0 – 0,25
Изоформы с промежуточным типом движения – I (intermediate) Rf = 0,26 –
0,5
Быстро движущиеся изоформы – F (fast) Rf = 0,51 – 0,75.
Определение Rf (относительной подвижности изоформы фермента в геле)
Для получения приведенных значений (универсальных для считывания)
а х
применяли формулу Rf 0,75 ;
где а – длина дорожки, мм;
х – определяемая (универсальная) длина дорожки, мм;
0,75 – коэффициент, равный длине электрофоретической трубки (подбирается эмпирически);
Экспериментальная часть.
Отобрать почки с каждой формы березы, 1-3 – самофертильные формы,
2 – самостерильная форма.
1. 1 н HCl – 48,0 мл; Трис – 36,6 г; TEMED – 0,23 мл;
2. Акриламид – 30,0 г; МБА (метиленбисакриламид) – 0,8 г;
3. ПСА (Персульфат аммония) – 0,14 г;
Растворы для приготовления концентрирующего геля:
4. 1 н HCl – 48,0 мл; Трис – 5,98 г; TEMED – 0,46 мл; pH 6,7
5. Акриламид – 10,0 г; МБА – 2,5 г;
6. РФ (рибофлавин) 4 г;
7. Сахароза – 40%;
Электродный буферный раствор:
Трис – 6,0 г; Глицин 28,8 г; используют 10% водный раствор.
Проявление гелей на пероксидазу:
Приготавливают два раствора, а) и б)
а) 1. Бензидин – 100 мг;
2. CH3COONa – 6 г;
3. ЛУК (ледяная уксусная кислота) 3 мл (подогреть);
4. С2Н5ОН (пищевой) – 50% - 100 мл;
Порядок приготовления: 1-3-2-4, хранится в темноте.
б) Н2О2 – 0,98 мл; Н2О – до 100 мл;
Смешать перед проявлением 1 ч. а) + 1 ч. б);
Функция концентрирующего геля – соответственно концентрирует содержимое кармана ( экстрагирующий буфер с ферментом + краситель) для
дальнейшего прохождения и сегрегации изоформ на следующей стадии –
стадии разделения.
Разделяющий гель – дифференцирует фракции ферментов по их электрическому заряду и/или по молекулярной массе.
Приготовление растворов. Растворы для приготовления разделяющего
геля (Таблица 7.4).
Формы березы пушистой
Форма 1
Форма 2
Форма 3
S
I
F
Рисунок 3.7 спектр пероксидазы при изоферментном анализе.
S – медленно движущиеся изоформы;
I – изоформы с промежуточным типом движения;
F – быстро движущиеся изоформы.
1,3 – самофертильные формы, 2 – самостерильная.
Вывод: при сравнении указанных форм наибольшей изменчивостью (гетерогенностью) обладает форма № 1 (самофертильная), что говорит о большей приспособленности к изменению условий окружающей среды этих форм
при применении данного метода генетического анализа.
Таблица 7.4 Состав компонентов разделяющего и концентрирующего гелей (Davis, 1964).
Область применения,
Система геля
pH 8,9; 7,5%
(среднепор.)
примеры
pH
К
о
н
ц
.
Белки с моле- 8,3
кулярным весом 104-106,
оптимальное
разделение при
мол. весе 3  10 4
- 3  10 5
(сывороточные
белки)
Р-ры разделяющего геля
Р № На 100
а
мл р-ра
з
д
е
л
.
9,5 1 1н HCl
48,0 мл
Трис
36,6 г
ТЕМЕД
0,23 мл
2 Акриламид
30,0 г
МБА
0,8 г
3 ПСА
0,14 г
Р-ры концентрирующего геля
pH
Соотн.
р-ров
в смеси
№ На 100 мл
р-ра
pH
Соотн.
р-ров
в смеси
8,9
1 ч №1
2 ч №2
1ч Н2О
4 ч №3
4 1 н НСl 48
мл, Трис
5,98 г,
ТЕМЕД
0,46 мл,
рН 6,7
5 Акриламид 10,0 г
МБА 2,5 г
6 РФ 4,0
мг/100 мл
7 Сахароза
40,0 г
6,9
1 ч №4
2 ч №5
1 ч №6
4 ч №7
Электродный буферный р-р
Составные части на
1000 мл р-ра
Трис 6,0 г; глицин
28,8 г
Используют 10% водный раствор
pH
8,3
Полюс
-
+
43
РАБОТА 10. Введение в молекулярно — генетический анализ. Статистическая обработка сиквенсов ДНК в компьютерной программе МЕГА.
Определение нуклеотидного состава нуклеиновых кислот и аминокислотного состава белков является начальным этапом исследований в области
молекулярной генетики. В настоящее время накопилось достаточно много
данных о фрагментарных последовательностях (сиквенсах) ДНК человека,
животных, растений, других живых организмов. Уже полностью расшифрован геном тополя (Populus trichocarpa). Для того, чтобы узнать, произошли ли
мутации (генные, или точечные) в геноме определенного вида, и проявились
ли они фенотипически, необходимо грамотно оперировать с полученными
исследователем или взятыми из базы данных (NCBI, EMBL) последовательностью нуклеотидов. В нашей стране методами молекулярно — генетического анализа у древесных занимаются ученые из Института экологии растений
и животных РАН (лиственница, В. Семериков), Института Общей генетики
РАН (сосна, Д. Политов).
Транзиция — это мутация, обусловленная заменой одного пуринового
основания на другое (А↔Г) или одного пирнимидинового на другое
(У,Т↔Ц). Частота транзиций (Р) вычисляется по формуле
Р = α / L,
где α — число наблюдаемых транзиций; L – общее число нуклеотидных сайтов.
Трансверсия — это мутация, обусловленная заменой пуринового основания на пиримидиновое и наоборот (А,Г↔У,Т,Ц). Частота трансверсии (Q)
определяется по формуле
Q = β / L,
где β — число наблюдаемых трансверсий, L — общее число нуклеотидных сайтов.
Задание 1. Определить количество транзиций и трансверсий на данном
сиквенсе ДНК определѐнного древесного растения (дуб, сосна или береза) и
подобранного в базе данных EMBL (Европейской Молекулярной Биологической Лаборатории — Веб адрес: http://www.embl.org .
Материал и оборудование.
Компьютер с доступом в Интернет, программа МЕГА 5 (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis). Данные сиквенсов ДНК (в электронном
или печатном виде).
Пояснения к заданию. Молекула ДНК состоит из нуклеотидов — аденина, тимина, гуанина и цитозина. Обработанные данные с указанного сайта
имеют вид TCGAAACCTGCC, где буквы обозначают нуклеотиды. Эти данные в текстовом редакторе (Word). Алгоритм действий:
1.
Двойным нажатием открывается диалоговое окно программы
Мега.
44
Запустить Alignment Explorer выбором Alignment|Alignment Explorer/CLUSTAL в командном меню. Для выравнивания берется образец, имеющийся в файле данных сиквенсов (Sequence Data File).
Добавить невыровненный сиквенс из hsp20.fas образца в Alignment
Explorer нажатием правой кнопкой мыши выбором Data|Open|Retrieve
Sequences из File menu.
Выберите в меню команду Edit|Select All чтобы выбрать любое место
из всей последовательности сиквенса.
Выберите команду Alignment|Align by ClustalW чтобы выровнять выбранный сиквенс, используя алгоритм КлусталW.
Сохраните текущую сессию выравнивания выбором пункта Data|Save
Session. Это позволит сохранить текущую сессию выравнивания для будущего редактирования.
Выйдите из Alignment Explorer выбором Data|Exit Alignment Explorer.
Во всплывающем окне появится запрос, желаете ли вы сохранить данные в
MEGA формате. Выберите «Да», затем «Сохранить как» в появившемся окне.
Введите hsp20_aligned.meg как имя файла, и нажмите «Сохранить». Появится завершающее окно, запрашивающее название для данных. Введите HSP
20 Aligned by MEGA, нажмите «Ok». Данные сохранены и пригодны для
дальнейшей работы (экспорту или выравниванию).
Варианты задач по генетике
1. Известно, что растение имеет генотип АаВвссDdEe. Сколько различных типов гамет образует это растение?
2. Скрещивание двух растений сосны обыкновенной, полученных от
черных семян, дало около ¾ черных и около ¼ белых семян. Определить генотипы обеих родительских форм.
3. Сосна с плоским апофизом шишек (А) и черными семенами (В)
скрещена с сосной, имеющей крючковатый апофиз (а) и белые семена
(в). Определить генотипические и фенотипические классы в F2.
4. Нормальное растение гороха скрещено с карликовым: F1 - нормальное. Определить, какое будет потомство: от самоопыления F1, от скрещивания F1 с исходным нормальным, от скрещивания F1 с исходным
карликовым растением.
5. Ель зеленошишечной формы скрещена с красношишечной. В F1 половина гибридов имела зеленую окраску шишек. Определить генотип
исходных родительских форм, если допустить, что ген А обусловливает
красную окраску шишек, а его рецессивный аллель - а – зеленую. Привести схему скрещивания.
46
6. У ночной красавицы при скрещивании растений, имеющих красные
(А) и белые (а) цветки, первое поколение (F1) с розовыми цветками.
Какая окраска цветков будет у растений от обоих возвратных скрещиваний?
7. Скрещиваются особи АаВвСс х АаввСС. Какую часть в потомстве
составят особи с генотипов:
а) АаввСС;
б) АаВвСс;
в) ааввсс.
8. Популяция состоит из 80 % особей с генотипом АА и 20 % - с генотипом аа. Определить в долях единицы генотипы АА, Аа и аа после установления равновесия в популяции.
9. У березы повислой устойчивость к корневой губке доминирует над
восприимчивостью. Биотип шероховатокорой формы березы, поражаемой корневой губкой, скрещен с биотипом, гомозиготным по устойчивости в этому заболеванию. Определить: а) генотипы и фенотипы гибридов F1; б) генотипы и фенотипы гибридов F2.
10. При скрещивании растения со стерильной пыльцой с растением, у
которого пыльца нормальная, получено потомство, в котором ½ фертильных и ½ стерильных растений. Определить генетическую систему
растения отцовской формы.
11. Допустим, что у дуба черешчатого эллиптическая форма желудей
доминирует над бочковидной. Напишите генотипы всех растений в
следующих скрещиваниях:
1) эллиптическая х бочковидная – все потомки эллиптические;
2) эллиптическая х бочковидная - половина потомков эллиптическая;
3) бочковидная х бочковидная – потомки только бочковидные.
12. Определить молекулярную массу гена, контролирующего образование белка, состоящего из 400 аминокислот. Известно, что средняя молекулярная масса нуклеотида 300.
13. Участок гена состоит из следующих нуклеотидов: ТТТ ТАЦ АЦА
ТГГ ЦАГ. Расшифровать последовательность аминокислот в белковой
молекуле, кодируемой указанным геном.
14. Определить, какие нуклеотиды и-РНК кодируют аминокислоты
белковой молекулы в такой последовательности:
а) валин – глицин – лейцин – гистидин;
б) треонин – триптофан – серин – аланин;
в) лизин – метионин – валин – пролин;
г) аланин – лейцин – лизин – треонин.
15. Вычислить частоты генотипов АА, Аа и аа (в %), если гомозиготные особи аа составляют в популяции 1 %.
16. Как изменится равновесное распределение генотипов в популяции
(АА = р2 = 0,49) + (Аа = 2pq = 0,42) + (аа = q2 = 0,09) при установлении
новой концентрации аллелей А = р = 0,6; а = q = 0,4.
17. Какая генетическая система фертильной отцовской линии будет закреплять стерильность линии ЦИТs rf rf?
18. При самоопылении растений овса, выросших из черных зерен, получили 277 черных, 81 серое и 26 белых зерен. Какому типу взаимодействия генов соответствует наблюдаемое соотношение?
19. Наследуемость в широком смысле трех сортов тополя (Э.С.-38, Мариландика, Хоперский-1) равна 0,74. Какова доля средовой изменчивости?
20. Произойдет ли оплодотворение при прорастании пыльцевых трубок, несущих аллели S3 S4 в ткани пестика с теми же аллелями?
Рекомендуемый библиографический список
1. Царев, А. П. Генетика лесных древесных растений [Текст]: рек.
УМО по образованию в обл. лесного дела в кач. учеб. для студентов ВУЗов, обуч. по направлению подготовки дипломир. специалист. «Лесное и
ландшафтное строительство»/ А. П. Царев, С. П. Погиба, Н.В. Лаур, Мин. обр. и науки РФ, ФГБОУ ВПО «МГУЛ», М.: МГУЛ, 2013.-381 с.
2. Генетика [Текст] : доп. УМО по образованию в обл. лесн. дела в качестве учеб. для студентов высш. учеб. заведений / А. Я. Любавская, М.
Г. Романовский, Г. А. Курносов, С. П. Погиба, В. В. Коровин; под ред. С.
П. Погибы; МГУЛ. - М. : МГУЛ, 2005. - 134 с.
3. Клаг, С. [Текст] Каммингс, Р. Основы генетики / Клаг, С. Каммингс
Р. М.: Техносфера, 2007.- 896 с.
4. Козлов Н.Н. Математический анализ генетического кода [Текст]: М:
«Бином. Лаборатория знаний», 2012.-215 с.
5. Корочкин Л.И. Биология индивидуального развития (генетический
аспект) [Текст]: Учебник/ М: МГУ, 2002.-264 с.
6. Кузнецов Вл. В. Молекулярно-биологические и биохимические
методы в современной биологии растений [Текст]: Вл.В. Кузнецов, В.В.
Кузнецов, Г.А. Романов/ М: «Бином. Лаборатория знаний», 2012.-487 с.
СОДЕРЖАНИЕ
Введение……………………………………………………………………….. 3
Работа 1 Цитологические основы наследственности. Митоз.
Изучение кариотипа древесных растений.
Митотическая активность………………………………………….4
Работа 2
Микроспорогенез и развитие мужского гаметофита…………….8
Работа 3
Макроспорогенез и развитие зародышевого мешка.
Оплодотворение. Апомиксис……………………………………..14
Работа 4
Мутагенез и полиплоидия…………………………………………21
Работа 5 Гибридологический анализ. Статистическая обработка
данных гибридологического анализа……………………………. 23
Работа 6
Географическая изменчивость сосны обыкновенной……………28
Работа 7
Оценка генетической гетерогенности испытуемых
образцов древесных растений…………………………………… 30
Работа 8 Генетическое равновесие в свободно скрещивающейся
популяции при учете одной пары аллелей …………………… 36
Работа 9 Применение изоферментного анализа при изучении гетеро38
генности природных популяций …………………………….
Работа10 Введение в молекулярно — генетический анализ. Статистическая обработка сиквенсов ДНК в компьютерной программе
МЕГА.……………………. …..................................................... 43
Варианты задач по генетике…………………………………………………. 44
Рекомендуемый библиографический список …………………………….. 46
Содержание ………………………………………………………………….. 47
Игорь Юрьевич Исаков
Алексей Иванович Сиволапов
Генетика лесных древесных растений
Методические указания к практическим занятиям для студентов направления
подготовки 35.03.01 – Лесное дело
Редактор А.В. Гладких
Подписано в печать 10.12 г. Форм. бум. 6084 1/16. Заказ .
Тираж 150 Объем 3,0 п.л. Усл. п. л. 2,78. Уч.-изд. л. 2,95.
РИО ВГЛТУ. УОП ВГЛТУ. 394613, Воронеж, Тимирязева, 8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
1 314 Кб
Теги
генетика, лесные, растения, древесных
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа