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Kellenberger, E ., c i A. Ryter : Schwciz. Z. Path. Bakt. 18, 1122, 1955
(U niversité de Genève, Institut de Physique, Dép. de Biophysique.)
C o n trib u tio n à l’étude d u n o y a u b actérien .
L’intérêt que l’on porte actuellement aux nucléoïdes des bacté­
ries et le nombre de travaux qu’on leur consacre paraissent, à pre­
mière vue, disproportionnés par rapport à l’importance du sujet.
Cependant les travaux de génétique bactérienne effectués par
Lederberg (18), Cavalli (6), liages (12) et d’autres auteurs (4) ont
montré que l’hérédité de ces organismes suit de près les lois de
la génétique classique. Ainsi les bactéries représentent un matériel
intéressant pour l’étude de problèmes génétiques parce qu’elles
forment des populations énormes avec des temps de génération de
quelques 20 à 30 minutes. Par ailleurs, la facilité avec laquelle on
peut les cultiver, les observer et les compter en a fait un matériel
expérimentale de choix pour étudier les relations virus-cellule hôte
et en particulier les aspects génétiques qui en découlent (19). Nous
pensons ici à la lysogénisation des cellules (19) et à la transduction
de caractères héréditaires d’une bactérie à une autre à l’aide d’un
bactériophage (4). La généralisation des résultats obtenus dans ces
domaines serait facilitée si l'on pouvait comparer la structure nu­
cléaire et le mécanisme de division des bactéries avec ceux des cel­
lules supérieures.
L’existence de noyaux bactériens, dans le sens d’une concentra­
tion de l’acide désoxyribonucléique en des lieux définis appelés
nucléoïdes n’est plus contestée. (Piekarski, 23, 24 ; Stille, 29 ; Dela­
porte, 10. 11 ; Robinow, 25 et autres, 30). Des méthodes cyto­
logiques perfectionnées, en microscopie optique (8) et électronique
(13) nous ont révélé en outre que les nucléoïdes sont composés
d’éléments nucléaires plus petits. Robinoio, qui avait appelé ces
éléments nucléaires les « chromosomes », avait proposé un certain
mode de division pour ces derniers. Prenant la longueur d’une cel­
lule comme mesure pour son âge individuel, il essayait d'arranger
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Par E. KELLENBERGER et A. RYTER.
K e l l e n b e r g e r et K y 1 e r . . .
1123
1 La litté ra tu re co n cern an t la controverse sur l'existence de la m itose est
très abondante. Les indications bibliographiques peuvent être trouvées dan s (9)
et (2).
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en séquence les différentes configurations chromosomiales qui ap­
paraissent simultanément dans une culture en croissance (20). On
constate cependant que, si l’on pousse l’hydrolyse qui précède la
coloration des nucléoïdes un peu plus loin, bien des figures nuclé­
aires observées ne trouvent plus leur place dans le schéma établi par
Robinow. I)e Lamater a émis alors l’hypothèse que la division des
bactéries suivait le schéma de la mitose (8, 9). A l’appui de cette
hypothèse il montre que l’on peut arranger les figures nucléaires
présentes dans une culture en croissance exponentielle de façon à
ce qu’elles satisfont à l’image d’un cycle mitotique. Ce procédé
d’arrangement, quelque peu arbitraire, n’a pas été sans susciter des
critiques 1 et le but des recherches actuelles en cytologie bacté­
rienne est d’apporter des observations et des expériences nouvelles
susceptibles de confirmer ou d’infirmer cette hypothèse.
Expérimentalement, ce but peut être atteint par l’étude de cel­
lules en divisions synchronisées (Lark et Manioc, 17, 20). Une
autre voie serait l’étude des formes nucléaires non « conformes »
telles qu’elles apparaissent dans de nombreuses souches et dont les
images se prêtent moins facilement à la reconstruction d’un cycle
mitotique (31). L’étude d’espèces microbiennes voisines aux bac­
téries enfin devrait permettre d’établir le lien entre cellules primi­
tives et cellules supérieures.
Avant d’aborder ces problèmes cependant il faut contrôler ri­
goureusement si les figures nucléaires qu’on voit sont significa­
tives, c’est-à-dire si elles sont l’expression régulière et univoque
d’un état défini de la cellule. Il est évident que dans cet ordre de
grandeur — la méthode des coupes minces révélant théoriquement
des détails de 1 à 10 mu — la notion de structure réelle doit être
remplacée par celle de structure significative. En effet, n’ayant
aucun espoir de voir ces structures fines à leur état vivant nous
devons nous contenter d’en obtenir un coagulât plus ou moins gros­
sier, un précipité plus ou moins spécifique. Ainsi l’image à elle
seule perd tout intérêt pour autant qu’elle n’exprime pas claire­
ment un seul état fonctionnel du noyau ; en aucun cas elle ne peut
correspondre à la « réalité ». 11 est évident que les différentes mé­
thodes d’investigation doivent donner des résultats concordants,
soit identiques, soit complémentaires et c'est dans l’accord des ré-
1124
Kcllenborgeret Ryter
ponses données par différentes méthodes et à différents traitements
que nous trouverons la preuve si oui ou non les structures obser­
vées sont significatives.
Dans le présent travail nous nous sommes proposé en premier
lieu d’établir la concordance entre trois méthodes qui mettent les
nucléoïdes en évidence : La coloration hydrolyse/Giemsa (Piekarski-Robinow, 26), la révélation pour l’observation globale au
microscope électronique (Mudd et al., 21 ; Kellenberger, 14, 15) et
les coupes ultraminces [Birch-Anderson et al., 1 ; Chapman et Hillier, 7 ; Bradfield, 3 : Brieger et Glauert, 5). Nous contrôlons tout
d’abord si des manipulations succédant à la fixation, très diffé­
rentes pour chacune des trois méthodes, peuvent provoquer des
modifications grossières. Ensuite nous appliquons ces trois mé­
thodes à l’étude de différents états nucléaires spécifiques, provo­
qués artificiellement, pour pouvoir discuter si les détails observés
sont significatifs. Nous montrons enfin que plusieurs indices nous
font supposer (pie les structures fines ne sont pas significatives et
qu’un fixateur plus spécifique du matériel nucléaire devrait être
recherché.
Matériel et Méthodes.
a. Cultures bactériennes : Nous nous som m es restrein ts volontairem ent sur
la souche E. coli K12 S que nous avions déjà étudiée dan s des travaux u lté­
rieurs (15).
T outes les cu ltu res étaient laites en Difco T ryptone 1 °/o ad d itio n n é de 5%o
de NaCl, aérées et m aintenues à 37° C. Dans toutes les expériences, des cultures
en croissance exponentielle, contenant 3 à 5 fois 1()8 cellules p a r ml et q u ’on
obtient ap rès 2)4 heures des cultures ont été ou fixées directem ent, ou soum ises
a u traitem ent respectif.
Carence : P o u r ob ten ir des bactéries à l'état carencé n ous suspendons en
tam pon des cellules p ro v en an t d ’une culture de 2 'A h eu res centrifugées et lavées.
Cette suspension est aérée et m aintenue à 37° C p en d an t 2 heures environ, ce
qui épuise les réserves disponibles de la cellule. T outes les bactéries sont
survivantes à ce traitem en t (15).
A uréom ycine : I.a cu ltu re de 2 Vi heures reçoit 4 y p ar ml de l’antibiotique
fraîchem ent dissout en T ryptone. Après 1 heure de cu ltu re toutes les cellules
sont encore viables et p résentent le n o y au en form e an n u la ire caractéristique
que nous avons d éjà décrite alleurs (14, 15. 27).
Irrad iatio n aux ray o n s ultraviolets : On reprend une culture de 10 m l après
centrifugatio n dans 1 m l de tam pon et expose celte suspension d an s un verre
de m ontre pendant 30 secondes aux UV provenant d ’une S terilam pe W esting­
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b. T raitem ents spéciaux :
Contribution à l'étude du noyau bactérien
1125
house T ype W I. 782 L à une distance de 1 ni. La suspension est ensuite diluée
d an s 10 ml de T ry p to n e frais de 37° et l'on continue la culture p e n d an t encore
30 m inutes à 37°, aérée, tem ps après lequel les bactéries présentent d 'u n e façon
hom ogène la fragm entation des nucléoïdes, suite caractéristique de l’irrad ia tio n
(15).
c. Mise en évidence des nucléoïdes : A yant constaté que la fixation à l'OsO»
en niileu liquide donne d ’aussi bons ré su ltats que celle dan s les v apeurs d ’OsOi
après étalem ent des bactéries sur gélose, n ous avons procédé d an s ce trav ail
presque exclusivem ent de la m anière suivante : On a jo u te de l’OsOi au pH 7 ad
0,5 °/o directem ent à la cu ltu re en T ry p to n e que l'on laisse agir p en d an t 10
m inutes (20). A p a rtir des cultures ainsi fixées on procède à une des trois
m éthodes suivantes :
1. C oloration Feulgen-Giemsa, selon fiobinoiv (26, 15) : Les bactéries fixées
et lavées en tam pon sont étalées sur agar. On les colle ensuite su r la lam e de
verre en ap p liq u an t cette dernière co ntre l’agar. On sèche la lam e d an s le vide
p o u r procéder ensuite à l’hydrolyse d an s du HCl norm al à 60° C p endant
10 m inutes. On rince les fro ttis dans l’eau, on les place pen d an t quelques m in u ­
tes dans un tam pon pH 7.2 et on les tran sfère dans la solution Giemsa (0,3 ml
de coloran t Ciba d an s 10 ml du m êm e tam pon) pendant une heure environ.
A près coloration, les fro ttis sont m ontés avec du tam pon sous lam elle et o b ­
servés au m icroscope.
2. O bservation globale (directe) a u m icroscope électronique : On étale 3— 1
gouttes de la culture bactérienne fixée et lavées en tam pon su r de l’ag ar recou­
vert d ’une m em brane de collodion (14, 15). Le liquide filtre à travers le collodion en quelques m inutes. Après la filtratio n , on fait flo tter le film de collodion
qui porte les bactéries su r de l’eau distillée.
La polym érisation du m étacrylate p résente cependant des irrég u larités
assez gênantes. On constate tout d ’abord des variations d an s la d u reté du p o ly ­
mère, l'ap p aritio n de bulles et quelques fois une co ntraction ou un gonflem ent du
tissu provoquant l’éclatem ent des cellules. Ce phénom ène reste assez m ysté­
rieux, m ais il semble qu'il dépend de la qualité de la fixation. C hapm an et
H illier préconisent p o u r l’éviter une fixation prolongée (16 h) l’intro d u ctio n
de 5 %o de NaCl. Mais m algré ces p récau tio n s cet inconvénient n ’est pas to u ­
jo u rs évité.
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3. Coupes m inces : Nous avons suivi, p o u r la fixation et l’enrobage des
bactéries à quelques d étails près les indications de C hapm an et Hillier (7) et de
D irch-Anderson et al. (1). La fixation prélim in aire se fait au OsOi 0,2 % pen d an t
5 m inutes. A près cen trifu g atio n le culot est rep ris dans de l’OsOa 2°/o tam ponné
au pH 7,2 selon Pallade, ad d itio n n é de 4 %o de NaCl et laissé 16 heures à 20° C.
Le lavage se fait en tam pon acétate véronale contrairem en t à H illier qui lave
5 l'eau distillée. Au lieu de conserver les bactéries sous form e de suspension, ce
qui exige de nom breuses centrifu g atio n s po u r la d ésh y d ratatio n , nous in tro ­
duisons le culot ap rès lavage d an s 0,1 ml d 'a g a r 1,5 % tam ponné à l’acétate de
véronale. Une fois l’ag a r p ris on découpe de petits cubes que l’on d ésh y d rate
dans l’alcool étylique. P o u r l’inclusion n ous em ployons com m e H illier 25 °/o
de m éthyl-m étacrylate dan s 7 5 % de butyl-m étacrylate déjà visceux afin d 'a s­
su rer une bonne polym érisation.
1126
K e l l e n b e r g e r et R y t e r
d) Appareils : M icroscope optique : W ild, F lu o tar 100 (ouverture 1, 3) con­
den sateu r aplanétique, ach ro m atiq u e (ouverture 1.3), les deux en im m ersion à
huile ; lum ière verte, filtre interférenliel.
M icroscopes électroniques : TTC, T yp KM et KMk et RCA typ EMU-2D.
M icrotom e : TTC m odifié (le bloc décrit une rotatio n d an s un p lan p erp en ­
diculaire au couteau). Des lam es de raso ir « S chick-E versharp > ont été aiguisées
d’après la m éthode de S jôstrand
Résultats.
s Nous tenons à rem ercier ch aleureusem ent le P ro f. F. Sjôstrand, chez qui
l’un de nous (K) a pu s’initier aux m éthodes m odernes des coupes ultram inces.
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, _ .
.....
,4. hssais préliminaires.
Nous avons montré précédemment que la méthode de la colo­
ration et celle de l’observation globale au microscope électronique
donnent des résultats concordants quant aux formes nucléaires qui
peuvent apparaître dans les bactéries lors de la croissance normale
ou à la suite de différents traitements. Les images donnés par la
nouvelle méthode, celle des coupes minces, ne nous montrent plus
qu’un vingtième à un cinquantième de l’épaisseur totale de la bac­
térie et en conséquent plus qu’une fraction du noyau dont l’aspect
peut sensiblement différer de l’image globale, de sorte qu’un con­
trôle de concordance par simple superposition est impossible. Il
faudrait recourir à des contrôles supplémentaires, indirects, pour
être sûr que cette méthode ne provoque pas de modifications gros­
sières affectant l’organisation générale des nucléoïdes. Nous avons
étudié séparément tout d’abord les influences que pourraient avoir
deux manipulations qui suivent la fixation et qui diffèrent des deux
autres méthodes, soit le lavage et la déshydratation à l'alcool. Pour
savoir si la composition du bain de lavage était important, nous
avons préparé selon les deux autres méthodes des cellules lavées
à l’eau distillée, au tampon et au Difco Tryptone. Nous avons cons­
taté que les résultats après lavage à l’eau distillée étaient sensible­
ment moins constants qu’après lavage dans les deux solutions tam­
ponnées : tantôt les nucléoïdes étaient composés d’éléments très fins,
tantôt ils se présentaient compacts, globulaires, alors que le lavage
au tampon que nous avons adopté en définitive pour la méthode
des coupes minces donnait des résultats plus réguliers. Pour savoir
si la déshi/dratation par les alcools entraînait des modifications,
nous avons transféré des préparations pour l’observation globale
au microscope électronique successivement dans de l’alcool de 30,
50, 70, 80 et 90 % avant de les sécher. Les différents stades de la
déshydratation ne montraient aucune transformation visible au ni-
C.onlrilmtion à tr lm lc du novan bactérien
I 127
Pathologie und Hakteriologic, Vol. 18. No. 5 ( 15105)
7»
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veau de l'organisation générale des nucleoides. La déshydratation
par passages dans l'alcool ne donne donc pas d'autres résultats que
le séchage direct.
D’autres observations préliminaires portent sur l'influence de
la fixation à l'acide osmique qui est. en principe, lu même pour les
Irois méthodes, mais elle est prolongée dans le cas des coupes
minces. Il a été démontré par Slem/icn (28), Kna*Il et Zapf (16)
que les nucleoides bactériens sont visibles sur des bactéries ví­
vanles, déposées sur une mince couche de gélose, observées au mi­
croscope à contraste de phase. Les nucléoïdes se présentent alors
sous formes de zones assez diffuses légèrement plus claires que le
cytoplasme. Sur de (elles cellules nous avons fait agir le OsO,. On
observe alors une accentuation nette du contraste et on a l’impres­
sion que la forme des nucléoïdes devient plus nette et plus marquée.
Ces observations ont été faites sur des cellules en croissance, et
sur des cellules traitées à l'auréomycine. Ce phénomène est plus
facilement visible sur ces dernières. Nous ne pouvons pas décider
s’il s’agit d’un changement structural ou simplement d’un change­
ment de la densité optique des deux constituants, soit du cyto­
plasme. soit du noyau. Une autre observation concernant le pro­
cessus de la fixation, révélée cette fois par la méthode de l’obser­
vation globale au microscope électronique après fixation aux va­
peurs d’()s()4, était la suivante : Les cellules fixées à 37" C pré­
sentaient des nucléoïdes plus contrastés et avec des détails de
structure plus fins que celles fixées à 20". De manière générale le
contraste obtenu lors de cette méthode est assez variable ; s'il est
plus marqué, on observe aussi des détails plus fins. Des expériences
étendues ont été faites également sur l’influence de la concentra­
tion du fixateur. Une concentration aussi bas que 0.2 % d'OsO,
produit encore les mêmes images pour l’observation globale au
microscope électronique que celle de 2 %.
On voit que le problème de la fixation est loin d'être résolu
122). Ces quelques observations préliminaires nous disent seule­
ment pour l’instant que l'arrangement général des nucléoïdes n'en
est pas ou que très peu affecté alors que les détails plus fins le sont
certainement. Nous avons étudié également la fixation an formol
au microscope électronique. Nous retrouvons les mêmes nucléoïdes.
mais ils sont moins détaillés et plus diffus, ressemblant davantage
aux images observées sur des cellules vivantes au microscope à con­
traste de phase.
1 12 8
K e l l e n b e r g e r el K y t e r
a)
b)
/>’. Etude comparative de différents états nucléaires.
a) Les nucléoïdes de bactéries en croissance exponentielle.
L'observation d'une culture en croissance exponentielle nous
montre une multitude de formes nucléaires. Les divisions cellu­
laires n'élanl pas synchrones, nous assistons à lotis les slades de la
division nucléaire .simultanément, du nucléoïde représenté par un
seul lambeau de forme irrégulière au nucléoïde composé de plus
pelils éléments irréguliers eux aussi (fig. 1 ). Ces différents aspects
seraient, d'après De Lamater 18 I l image d'un cycle mitotique : en
particulier le nucléoïde composé de petits éléments représenterait
l’interphase. Nous avons essayé d'estimer approximativement le
nombre relatif des diverses formes morphologiques, mais sans suc­
cès. Sur la base de nombre d'expériences que nous avons faites de­
puis 1952 nous avons pu constater que la répartition de ces formes
est extrêmement arbitraire et varie d’une expérience à l'autre, mal­
gré toutes les précautions prises. 1Entre autre, nous avons employé
la fixation en milieu nutritif pour exclure les modifications impor­
tantes dues aux changements métaboliques juste avant la fixation.I
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Fig. /. K. eoli S on croissance ex p o n en tielle: a) coloration hydrolvse-G ieinsa
I-1.000 X ) ; bi o bservation globale au m icroscope électronique 16.OOOX). On
voit sur les images île cultures en croissance norm ale une m ultitude de form es
nucléaires représentant différents stades de division.
Contribution à l'élude du noyau bactérien
1 125)
«)
h)
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Fin- 2. I.es mêmes cellules com m e sur lifi. 1 observées p a r coupe mince. Ces deux
images proviennent de deux séries d'expériences d iffé re n te s: al dans celle
série de coupes, les nucléoïdes rem plis d 'u n e masse spongieuse étaient p rép o n ­
dérants (32.000 X | : bi dan s cette série de coupes, la m atière nucléaire form e
des m asses plus denses 132.000 X ). Dans d 'a u tre s expériences la m atière n u ­
cléaire était encore plus disperse et filam enteuse, rem plissant presque entière­
m ent la vésicule nucléaire.
1130
K e l l c n b e r g e r cl R y I c r
!>)
n)
<•)
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Fig. 3. La form e < fragm entée - des m icléoïdes ap p araissan t 30 m¡miles après
l’irrad iatio n aux ray o n s u ltra v io le ts: al révélée p a r coloration (2.500 X ) ;
b) par observation globale au niior. électronique (0.000 X ) ; cl p ar coupes
m inces (32.000 X ). Sur les coupes minces ont voit que la vésicule nucléaire ellemême n'est pas subdivisée et que l'aspect fragm enté est dû au contenu spon­
gieux de la vésicule.
Contribution à l'étude du noyau bactérien
(i)
1131
l>)
Mais tout se passe comme si ces structures fi nés étaient extrême­
ment sensibles et que la fixation n'empêchait pas d'éventuelles mo­
difications ultérieures. Les coupes ultraminces que nous avons ef­
fectuées sur ces cellules ont confirmé ces observations. Nous avons
trouvé, comme d'autres auteurs travaillant sur K. Coli il), une
vacuole » nucléaire, contenant un corps plus dense accolé par­
tiellement contre la parois de celle vacuole (fig. 2 1>). Mais nous
trouvons également des vacuoles, dans lesquelles le matériel a une
apparence filamentcuse-spongieuse tfig. 2 a ) (3, 7). Nous avons de
nouveau l'impression que certaines séries nous montrent beaucoup
plus de cellules à inclusions nucléaires denses que d'autres cpii pré­
sentent plus de cellules avec le matériel spongieux.
b)
Les nucléoïdes / nnjmcntés, apparaissant après irradiation
ultraviolettes.
Nous avions montré précédemment que les bactéries irradiées
aux rayons ultraviolets s'allongent si l'on continue à les cultiver
là). 30 minutes après l'irradiation, toutes les cellules présentent
un seul grand nuciéoïde allongé et fragmenté, donnant l'image
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Fig. i. La form e axiale des nucléoïdes de bactéries carencées : al |)ar coloration
(3.800 X | ; 1») p ar observation globale (5.600 X |.
1132
K c l l e n b e r g e r i‘l H y l c r
a)
b)
c)
d’une « interphase » fortement exallée. Nous espérions que les
coupes minces avec leur haute résolution donneraient de nouvelles
précisions sur ce phénomène. Comme le montre la fig. 3. la coupe
nous révèle un aspect des nueléoïdes «pii concorde parfaitement
avec les observations faites par la méthode globale dans ce sens que
le nucléoïde est composé de nombreuses particules ramifiées à l’ap­
parence spongieuse. Si nous analysons cette image par rapport aux
vésicules nucléaires délimitées nous constatons que leur nombre
n’a apparemment pas augmenté : il s’agit d'un seul nucléoïde dont
l’aspect fragmenté est dû aux structures intérieures «le la vésicule.
La structure fine «te la masse spongieuse cependant ne diffère pas
de celle trouvée dans les cellules en croissance normale. Quant à la
coloration (fig. 2 a) nous avons déjà signalé qu’elle se prêle mal à
l’étude de l’état nucléaire « fragmenté » : très souvent, les fragments
ne sont pas visibles ou pas résolus.
c)
Les nueléoïdes en forme de bâtonnets axiales observés dans
des cellules carencées.
La coloration nous représente cet état nucléaire par un bâtonnet
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F ig .5. I.a form e an n u laire «les nueléoïdes ap rès Iraitem enl «les bactéries avec
«les doses sublélhales d 'auréom ycine : al p a r coloration, p h o to g rap h ié à la lu ­
m ière orange 13.000 X) ; bl p a r coloration, photographié à la lum ière verte
13.000 X) ; cl p a r observation globale au m icroscope électronique (6.000 X ).
Sur la photographie prise à la lum ière orange on peut d iscerner le centre plus
claire du nucléoïde.
Contribution à l’élude du noyau bactérien
1133
axial plus ou moins diffus. La première observation globale au
microscope électronique mollirait tout d’abord les mêmes images
de nucléoïdes diffus (15). Des travaux plus récents nous révèlent
que ce bâtonnet est composé de renflements successifs, donnant
l’image d’un ruban ou d’une corde tordue (fig. 3). Celte dernière
image concorde parfaitement avec celle que nous obtenons par la
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Fig. <i. Mêmes cellules que fig. 5 étudiées par coupe m inces (.'12.000 X ). On est
tenté de voir dan s les nucléoïdes des chrom osom es déroulés en to u ran t un
nucléole, m ais la preuve que ces figurent soient significatives n'est pas apportée.
1134
K «■ 1 1 c n 1> o r g i* r i'l H y I e r
coupe mince, cpii nous montre une seule (exceptionnellement deux)
vésicules nucléaires allongées, disposées axialement et contenant
une trame de matière d'épaisseur inégale.
<1) Les nucléoïdes en forme annulaire des bactéries traitées avec
des doses subléthales d'auréomycine ( I I, 15, '27).
Les nucléoïdes colorés sous celle l'orme nous mollirent une
forme globulaire au milieu de la cellule, remplissant celle dernière
de loule sa largeur (lig. f>). Quelques fois, en particulier lors de l'ob­
servation avec un filtre jaune, on peut distinguer une structure an­
nulaire de ces nucléoïdes. L’observation globale au microscope
électronique révèle une forme annulaire nelle. Les coupes minces
révèlent une vésicule nucléaire sphérique contenant en son centre
un corps dense (fig. (>). Ce corps est entouré d'une masse spon­
gieuse qui remplit la vésicule. Suivant remplacement de la sec­
tion on ne distingue évidemment plus le corps central, mais seule­
ment les ramifications de la substance spongieuse.
Dans toutes ces investigations nous n'avons jamais pu distin­
guer une membrane nucléaire séparant la vésicule nucléaire du
cytoplasme. D'autre part, ces vésicules se retrouvent indépendam­
ment de la méthode de préparation employée sous une forme qui
est uniquement et clairement prescrit par l'étal cellulaire avant la
fixation.
La mise en évidence du noyau bactérien par coloration, l'obser­
vation globale et l'observation des coupes minces au microscope
électronique concordent en ce qui concerne l'arrangement général
cl même la forme de la vésicule nucléaire. Des cellules fixées à
l'()s()4 présentent un cytoplasme régulièrement et finement co­
agulé dans lequel se trouvent incluses les vésicules nucléaires con­
tenant un précipité grossier. La forme de ces dernières esl variable
suivant l'état de la cellule avant la fixation et en particulier, dans
les cellules en croissance normale, suivant l'étal de division. La
méthode des coupes minces a permis de constater en plus que la
forme « fragmentée » des nucléoïdes n'est pas composée d’une mul­
titude de vacuoles individuelles, mais d'une seule ou de deux vési­
cules remplies d'une matière granuleuse, spongieuse. Mlle a permis
également de définir la forme annulaire des nucléoïdes comme
étant une vésicule globulaire avec un corps central. Les structures
fines observées sur les cellules colorées et sur les images que donne
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Discussion.
I 135
l'observation globale au microscope électronique cependant ne re­
flètent pas uniquement la forme de la vésicule nucléaire, mais
aussi ses structures internes. Ainsi les parties les plus claires que
l'on observe au microscope électronique doivent correspondre aux
vacuoles dépourvues rie matières que nous révèlent les coupes
minces. La matière spongieuse » à l'intérieur de la vésicule nu­
cléaire contient certainement l’acide désoxyribonucléique. Le fait
que dans les cellules traitées à l'auréomycine par exemple, toute
la vésicule nucléaire est Colombie alors (pie souvent le centre l'est
moins ou pas du tout, montre clairement que c’est celle substance
spongieuse qui représente les nucléoproléines ou le DNA pur. Jus­
qu'à quel point cependant l'apparence de ce coagulai est-elle signi­
ficative ? Nous ne pouvons pas encore le décider, parce qu'il se
peut tpie la fixation soit imparfaite et que les artéfacts de fixation
soient prépondérants, lin regardant les coupes minces de celte
forme annulaire, on a l'impression que ces ramifications pour­
raient représenter des chromosomes, mais d’autres observations
solicitent une prudence extrême quant à l’interprétation de ces
images, en particulier le fait qu’elles ne semblent être indépendantes
de la fixation. Nous avons plusieurs raisons de croire que la matière
nucléaire à l'intérieur de la vésicule est mal fixé :
I" Le noyau paraît rester sensible à des modifications de dé­
tails même après la fixation. La structure des nucléoïdes change
selon le bain de lavage qu'on emploie.
2° Des expériences (non publiées) portant sur la fixation de
bactériophages T2 à l’OsO, ont montré que ce pliage reste sensible
au choc osmotique même après une fixation de plusieurs heures.
Le plot de DNA qui sort de la tête du pliage est cependant d’autant
plus compact que la fixation préalable a été longue.
3“ L’accentuation de la forme et du contraste des nucléoïdes
lors de la fixation à l'OsO, que nous avons observée au microscope
à contraste de phase indique que la coagulation est probablement
grossière à l'intérieur de la vésicule nucléaire.
Conclusions : Il n'y a pas de doute (pie la méthode des coupes
minces donne des résultats concordants et complémentaires. 11 est
cependant peu probable que l'aspect de la structure spongieuse
(pii se trouve à l’intérieur de la vésicule nucléaire soit significatif,
l'our pouvoir utiliser le grand pouvoir de résolution de cette tech­
nique, on doit s’efforcer de perfectionner les méthodes pour arriver
soit à des coagulais plus fins, soit à une régularité stricte de la ré-
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Contribution à l'élude <lu noyau bactérien
I I 36
K e l l g n b c r g e r rl 1? v i e r
ponse ¡ai fixateur. A partir de ce moment on pourra décider, si les
nucleoides contiennent sous toutes leurs formes un corps plus
dense, peu ou pas colorable, tel que nous l avons trouvé sur les cel­
lules traitées à l'auréomycine. La méthode des coupes minces aura
alors de fortes chances de pouvoir contribuer à la compréhension
du mécanisme de division. Klle permettra aussi d'associer éven­
tuellement les ligures anormales trouvées après différents traite­
ments à l’arrêt temporaire ou à l’exaltation de certaines phases d'un
cycle de division.
Ce travail a pu être effectué grâce à une subvention du F onds National
Suisse de la R echerche .Scientifique.
Nous rem ercions M adame E. (h ristin yer-H u b er de l’aide q u ’elle nous a
apportée pour les colorations.
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auch w ir K ern- und C ytoplasm a-S trukturen von B akterien an u ltrad ü n n en
Schnitten (nach dem Vorgeben von S jö stra n d l mit Hilfe des E lek tro n en ­
m ikroskops — vorw iegend mit dem 75 kV-Phi!ips E lektro n en m ik ro sk o p , z. T.
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D iscussion.
Conlrihutiou ä Heinde du uoyau bnclerien
I 137
auch mit dem 100 kV-Siemens-Geräl (vgl. untenstehende Figurl untersu ch t. Zel­
len von liaeillus m eyatherium a u s <ler log-Phasc zeigten im Bereich d e r Nukleoide
eine F ein stru k tu r, die große Ä hnlichkeit mit d er von Kcllenberycr und Hyter an
gleicher Stelle hei Escherichia coli gefundenen aufw eisen. B em erkensw ert e r ­
schien uns. daß diese In u en stru k lu ren grundsätzlich mit gleicher Bcgelmüßigkcil
wie hei licht m ikroskopischer P rä p a ra lio n (z. B. nach d er Feulgen-K eaktion) zu
finden sind und daß sie an den gleichen O rten wie die Feulgen-posiliven S tru k ­
turen liegen. Sie treten grundsätzlich unahhängig von d er Fixierungsm elhode in
K rscheinung. doch w erden sie d u rch Osmium am besten konserviert. Auch die
K ontraste w erden hei O sm ium -Fixierung am günstigsten.
ln einzelnen sind
an den O rten d er Nukleoide d unklere G ranula zu finden, die offensichtlich d u rch
fiidige Hiemente m iteinander verbunden sind. An m anchen Stellen liegen solche
G ranuluketten parallel zueinander, so daß m an an eine Hängsleilung d er Finzelclem enlo erin n ert w ird. Das Ganze liegt in einer optisch leeren Blase . deren
D urchm esser hei 3000 A legt.
Kincn Hinweis verdient die Zellw and, die ge­
schichtet» (wohl drei-schichtig) erscheint. — Kine au sfü h rlich ere P ublikation
ist im Druck
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lin d , m eyatherium . 30.000 X , elektr. opt. u ltrad ü n n geschnitten nach S jöstrand.
(P iekarski und (liesbrechlj
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