close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Интенсивность свободно-радикального окисления липидов и белков и состояние антиоксидантной системы у больных с тяжелой черепно-мозговой травмой

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Держинский Николай Владимирович Шифр научной специальности: 03.01.04 - биохимия Шифр диссертационного совета: Д 208.101.02 Название организации: Тюменская государственная медицинская академия Адрес организации: 625023, г.Тюмень, ул.
На правах рукописи
ДЕРЖИНСКИЙ
Николай Владимирович
ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ И СОСТОЯНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ С ТЯЖЕЛОЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМОЙ
03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук Тюмень - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Уральский государственный университет физической культуры"
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Львовская Елена Ивановна доктор медицинских наук, профессор ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Бышевский Анатолий Шулимович доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России, профессор кафедры биохимии Лунева Светлана Николаевна доктор биологических наук, профессор ФГБУ РНЦ ""Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова" Минздравсоцразвития России, заведующая биохимической лабораторией
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится ...... мая 2012 г. в ..... часов на заседании диссертационного совета Д 208.101.02 при ГБОУ ВПО "Тюменская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (625023 г. Тюмень, ул. Одесская, 54). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тюменской государственной медицинской академии
Автореферат разослан " "____________2012
Ученый секретарь диссертационного совета С.А. Орлов
Актуальность проблемы. Медикосоциальная значимость тяжелой черепно-мозговой травмы связана с высокой частотой её возникновения, а в последующем длительной нетрудоспособностью, частой инвалидизацией, высокой смертностью, особенно среди лиц молодого и среднего возраста (Яхно Н.Н., Штульмана Д.Р., 2003; Верещагин Н.В. и соавт., 1996, 1997; Суслина З.А., 1999, 2000; Гусев Е.И. и соавт, 2001; Лебедев В.В., Крылов В.В., Сувалян А.Г., 1997; Агаева, К.Ф., 2001; Halliwell, B., 1981). Среди пострадавших от черепно-мозговой травмы (ЧМТ) 92% составляют люди трудоспособного возраста. Тяжелая ЧМТ требует длительного лечения и больших финансовых затрат. Для острого периода ЧМТ характерна значительная активация гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы и иммунодепрессия, что расценивается как проявление стресса (Минкин Л.Н., 1988). Стресс, вызванный ЧМТ, развивающаяся ишемия, сопровождаются усилением продукции активных форм кислорода (АФК), интенсификацией процессов свободно-радикального окисления (СРО), что в свою очередь способствует активации антиоксидантной системы (АОС) организма. Соотношение про- и антиоксидантных систем во много определяет дальнейшие адаптивные возможности организма, "цену" адаптации, исходы заболевания (срыв адаптационных механизмов или адаптацию - приспособление к новым условиям).
При ЧМТ создаются условия для активации СРО. Головной мозг восприимчив к окислительному стрессу в связи с высоким потреблением кислорода мозговой тканью. Потенцированию окислительного стресса в тканях головного мозга способствует большое количество катехоламинов, фосфолипидов, олеиновой кислоты, Fe2+, высокое отношение липиды/белки, усиление метаболизма арахидоновой кислоты, образование пероксинитрита, перепроизводство NO`, низкое содержание в ликворе трансферрина и церулоплазмина, низкое количество витамина А, крайне низкая активность глутатионпероксидазы и, почти, полное отсутствие каталазы (Барабой В.А., 2006).
Оксидативное повреждение нервной ткани приводит к дезорганизации клеточных мембран, изменению активности мембраносвязанных ферментов и, в конечном итоге, к апоптозу и гибели клеток (Барабой В.А., 2006; Биленко М.В., 1989; Львовская Е.И., 1998). Окислительная деструкция клеточных мембран рецепторного аппарата, нарушение метаболизма гормонов, нейротрансмиттеров и т.д., прежде всего, связаны со СРО липидов и белков. Активация процессов СРО является общей реакцией мозга на повреждение. Свободно-радикальные процессы (СРП) объективно характеризуют тяжесть патологического процесса и физиологического напряжения травмированного мозга (Никушкин Е.В., 1989; Суткова Д.А., 1992). По мере активации СРП, нарастает степень дезинтегративных преобразований мембранных структур клеток, существенно нарушается их функция, (Никушкин Е.В., 1989) что может являться причиной более тяжелого течения черепно-мозговой травмы (ЧМТ) (Крыжановский Г.Н., 1997).
В большинстве работ посвященных изучению СРО при ЧМТ приводятся данные, касающиеся процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Сумная Д.Б., 2003; Кучин Д.Г., 2005; Садова В.А., 2008), не беря во внимание окислительную деструкцию белков. До настоящего времени практически отсутствуют работы, в которых одновременно исследуются процессы ПОЛ и окислительной модификации белков (ОМБ), что затрудняет оценку соотношения их уровней. Весьма противоречивы данные о липопероксидации при ЧМТ, особенно в первые две недели острого периода. В связи с этим чрезвычайно актуальным становиться рассмотрение параметров липидной пероксидации, окислительной модификации белков, активности про- и антиоксидантных ферментов, изменений фосфолипидного состава, а также их сравнительной характеристики у пациентов разных возрастных групп с тяжелой ЧМТ, исходом которой являлись благоприятные и летальные исходы. Данное исследование позволит повысить точность прогноза и обеспечит более эффективный контроль над течением и терапией тяжелых травм головного мозга. Цель исследования: определить соотношение уровней процессов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков, активность про- и антиоксидантных ферментов в динамике острого периода тяжелой черепно-мозговой травмы у пациентов разных возрастных групп с разным исходом травмы.
Задачи исследования
1. Оценить динамику содержания гептан- и изопропанолрастворимых продуктов перекисного окисления липидов в крови и ликворе больных разных возрастных групп с разным исходом острого периода тяжелой черепно-мозговой травмы.
2. Определить уровень окислительной модификации белков плазмы крови больных разных возрастных групп в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы.
3. Оценить изменение уровня аскорбат-индуцированного перекисного окисления липидов в крови и ликворе больных разных возрастных групп с разным исходом острого периода тяжелой черепно-мозговой травмы.
4. Исследовать динамику изменения в крови активности про- и антиоксидантных ферментов у больных разных возрастных групп с разным исходом острого периода тяжелой черепно-мозговой травмы.
5. Изучить фосфолипидный спектр плазмы крови больных в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы.
Научная новизна. Впервые изучено соотношение свободно-радикального окисления липидов и белков, а так же про- и антиоксидантных ферментов у пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой разных возрастных групп и разным исходом травмы. Показано, что в остром периоде тяжелой черепно-мозговой травмы происходит разнонаправленное изменение содержания продуктов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков. Перекисное окисление липидов и окислительная модификация белков находятся в реципрокных отношениях в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы (на протяжении первых 14 суток). Впервые установлены возрастные различия в содержании окислительно-модифицированных белков при тяжелой черепно-мозговой травме: постепенное нарастание спонтанно карбонилированных белков к 8-14 суткам у пациентов 20-39 лет и волнообразное (снижение на 1-3 сутки с последующим повышением к 4-7 и повторное снижение к 14 суткам) у пациентов 40-59 лет. Установлено, что острый период тяжелой черепно-мозговой травмы сопровождается повышением индуцированного перекисного окисления липидов. Наиболее выраженное повышение уровня антиокислительной активности у пациентов 20-39 лет выявлено в крови, у пациентов 40-59 лет в ликворе. Впервые установлено, что у пациентов с летальным исходом "среднее" содержание липопероксидов в крови и ликворе ниже, чем у пациентов с благоприятным исходом. Впервые показано, что наступлению летального исхода предшествовало снижение содержания гептанофильных липопероксидов в сыворотке крови ниже уровня контрольной группы. Выявлено, что в случае летальных исходов наблюдалось снижение уровня антиокислительной активности в сыворотке крови и антиокислительной активности-2 в ликворе.
Показано, что при тяжелых черепно-мозговых травмах происходит повышение активности антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидазы и каталазы) на фоне снижения активности супероксиддисмутазы. Впервые показано, что в случае летальных исходов наблюдался более выраженный прирост активности глутатионпероксидазы, более выраженное снижение активности каталазы и супероксиддисмутазы. Выявлен значительный рост активности ксантиноксидазы при тяжелой черепно-мозговой травме. Установлено, что прирост активности ксантиноксидазы на 4-7 сутки более чем в 3,7 раза, а на 8-14 сутки более чем в 4,3 раза является прогностически неблагоприятным признаком.
Установлено, что изменение фосфолипидного спектра плазмы крови на 1-3 сутки при тяжелой черепно-мозговой травме проявляется снижением содержания общих фосфолипидов, фосфатидилхолина, на фоне увеличения сфингомиелина, фосфатидилсерина, кардиолипина, лизофосфатидилхолина.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость данного исследования, прежде всего, заключается в том, что оно пополняет существующее научное знание об особенностях процессов липопероксидации, окислительной модификации белков, их соотношении, уровнях индуцированных ПОЛ и ОМБ, активности про- и антиоксидантных ферментов при тяжелой черепно-мозговой травме. Полученные в работе данные могут применяться с целью оценки эффективности проводимой терапии, прогноза исхода, контроля за состоянием пациентов. Внедрение результатов в практику. Основные положения данной работы используются при обучении студентов на кафедрах биохимии УралГУФК и ЧелГМА, кафедре травматологии и ортопедии ЧелГМА. Результаты данных исследований внедрены в практику работы отделений НУЗ ДКБ на станции Челябинск ОАО РЖД, ОКБ №3 и ОКБ №1.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Первые две недели тяжелой черепно-мозговой травмы характеризуются реципрокными отношениями между перекисным окислением липидов и окислительной модификацией белков.
2. Усиление перекисного окисления липидов сопряжено с увеличение окисляемости липидов.
3. Повышение активности ксантиноксидазы ассоциировано с приростом липопероксидов и является маркером тяжести состояния пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой.
4. Параллельное определение продуктов свободно-радикального окисления липидов и белков на базальном и индуцированном уровнях, активности ксантиноксидазы и супероксиддисмутазы позволит повысить эффективность контроля за проводимой терапией, улучшит прогнозирование исходов тяжелой черепно-мозговой травмы.
Апробация работы. Основные положения доложены на: Восьмой научно-практической конференции молодых ученых УралГУФК (Челябинск, 2009); Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лившица, приуроченной к 65-летию Челябинской государственной медицинской академии "Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии" (Челябинск, 2009); Седьмой международной научно-практической конференции "Новые достижения европейской науки" (София, 2011); Российской научно-практической конференции "Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы", (Челябинск, 2012). Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 4 в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ.
Личный вклад автора. Материал, предоставленный в диссертации, обработан и проанализирован лично автором. Автор принимал непосредственное участие в проводимых обследованиях и динамическом наблюдении большинства пациентов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Полный объем диссертации - 155 страниц печатного текста, иллюстрирована 43 рисунками, 17 таблицами. Указатель литературы содержит 241 публикацию, из них 136 отечественных и 105 зарубежных.
Материалы и методы
Общая характеристика обследованных больных. В исследование было включено 202 пациента в остром периоде тяжелой ЧМТ двух возрастных групп: 20-39 и 40-59 лет мужского и женского пола, находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии №1 ГКБ №3 г.Челябинск. Из исследования были исключены пациенты с явной сопутствующей патологией, а также с повторной ЧМТ в анамнезе. У всех пациентов травматическое повреждение головного мозга было подтверждено компьютерной томографией. Исследуемым материалом являлась кровь и ликвор. Исследовано ПОЛ-ОАЗ: у 72 пациентов с благоприятным исходом заболевания и у 32 пациентов с летальным исходом. У 41 пациента с благоприятным исходом исследовалась ОМБ. У 28 пациентов с благоприятным и у 15 пациентов с летальным исходом исследовали глутатионпероксидазу, каталазу, супероксиддисмутазу. Ксантиноксидазу определяли у 73 пациентов с благоприятным исходом и у 29 пациентов с летальным. У 28 пациентов с благоприятным исходом исследовали фосфолипидный спектр крови. Группу сравнения (контроля) составили 57 человек в возрасте от 20 до 59 лет, 32 человека жалоб на самочувствие не предъявляли, ЧМТ в анамнезе не имели (являлись сотрудниками ГКБ №3). Оставшиеся 25 - были пациентами, проходившими обследование в ГКБ №3, с вегетативной дистонией, остеохондрозом, алкогольным опьянением.
В работе применялись следующие методики исследования:
Для изучения параметров системы "ПОЛ-АОЗ" использовались следующие методы: 1. Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых сред по методике Волчегорского И.А. и др. (1989). Результаты выражали в виде так называемого индекса окисления, для чего рассчитывали соотношение Е232/Е220 и Е278/Е220 (Волчегорский И.А., 1989).
2. Для определения конечных продуктов перекисного окисления липидов использовали спектрофотометрический метод по Львовской Е.И. с соавт.(1991). 3. Определение интенсивности аскорбат-индуцированного ПОЛ проводили по методу Львовской Е.И. (1998)
4. Окислительную модификацию белков оценивали по уровню образования динитрофенилгидразонов по методу Е.Е. Дубининой (1995). 5. Активность СОД определяли по методу Чевари С. и соавт (1985). 6. Определение активности ксантиноксидазы в сыворотке крови производилось по методу Hashimoto, 1974 г., спектрофотометрически при длине волны 292 нм по образованию мочевой кислоты из ксантина. 7. В сыворотке крови определяли каталазную активность по методу Королюк М.А. и соавт. (1988). 8. Определение активности глутатионпероксидазы в эритроцитах проводили по методу, описанному Власовой С.Н., Шабуниной Е.И., Переслегиной И.А. (1990).
9. Для определения фосфолипидного спектра плазмы крови использовался набор Sentinel (Италия)- тонкослойная хроматография.
Результаты обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики (Лакин Г.Ф., 1990). Применялись критерии непараметрической статистики (Гублер Е.В., Генкин А.А 1969): Манна - Уитни (U) и Вальда-Вольфовица (WW). Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (rs).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Соотношение продуктов СРО липидов и белков в крови и ликворе у больных с тяжелой ЧМТ. При ЧМТ грубо нарушается гомеостаз нейронов, быстро расходуются запасы глюкозы, развивается ишемия. Усиленный метаболизм арахидоновой кислоты, ксантиноксидазная реакция, утечка электронов из дыхательной цепи митохондрий, перепроизводство NO` и образование пероксинитрита, а при кровоизлияниях - гем-протеины, освобождение ионов железа из депо ферритина становятся источниками активных форм кислорода (АФК), приводящих к интенсификации СРО. Головной мозг является органом с высокой предрасположенностью к индукции свободно-радикального окисления.
Согласно полученным данным в течение 14-ти дневного лечебного процесса, как представлено в таблицах 1 и 2, у пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой содержание всех категорий липопероксидов в сыворотке крови и ликворе превышали значения контрольной группы уже с 1-3 суток. Изменения содержания изопропанолрастворимых диеновых коньюгатов (ИРДК) сыворотки крови и ликвора у пациентов, как 20-39 лет, так и 40-59 лет во многом сходны: содержание ИРДК ликвора было выше соответствующих показателей в сыворотке крови. Максимальные значения ИРДК были в ликворе у пациентов 20-39 лет на 4-7 сутки, а минимальное превышение, зафиксированное в сыворотке крови, выявлено у пациентов 40-59 лет на 8-14 сутки после травмы и было достоверно выше значений контрольной группы в 1,98 раза. Максимально большие, достоверные, значения ИРДК в сыворотке крови зафиксированы у пациентов 20-39 лет на 4-7 сутки после травмы. Они превышали значения контрольной группы в 2,72раза. В ликворе наибольшие значение ДК были зафиксированы у пациентов 20-39 лет в гептановой фазе на 4-7 сутки, превысив значения контрольной группы в 6,91 раза.
Наиболее выраженное увеличение концентрации изопропанол-растворимых кетодиенов и сопряженный триенов (ИР КТ и СТ) сыворотки крови выявлено на 4-7 сутки у пациентов 20-39 лет и составило 421% (р<0,05U) по сравнению с контролем. Наибольший прирост КД и СТ в ликворе был определен на 4-7 сутки в гептановой фазе у пациентов 20-39 лет - 703%. Наибольшее количество конечных продуктов зафиксировано в ликворе на 1-3 сутки у пациентов 40-59 лет в гептановой фазе - 662% (р<0,05U). Таким образом, на протяжении всего исследования наиболее выраженное увеличение всех категорий продуктов ПОЛ наблюдалось в ликворе. Это, возможно, обусловлено тем, что данная гуморальная среда наиболее приближена к месту "катастрофы".
На протяжении 14 суток после ЧМТ содержание продуктов липопероксидации у пациентов с благоприятным исходом, независимо от возраста превышало показатели контрольной группы, что говорит об отсутствии стабилизации процесса. Таблица 1 Содержание продуктов ПОЛ изопропанольной фазы сыворотки крови у больных различных возрастных категорий в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы
Группы1234Возраст20-39 лет ПоказательКонтроль (N=21)1-3 сутки
(N=40)4-7 сутки
(N=32)8-14 сутки
(N=32)Диеновые конъюгаты0,475±0,021,137±0,108
P1-2<0,05U1,294±0,157
P1-3<0,05U0,919±0,052
P1-4<0,05UКетодиены и сопряжённые триены0,299±0,011,140±0,122
P1-2<0,05U1,261±0,090
P1-3<0,05U0,627±0,050
P1-4<0,05U P3-4<0,05WWШиффовы основания0,040±0,0030,060±0,012
P1-2>0,05U0,065±0,011
P1-3<0,05U0,045±0,013
P1-4<0,05U Возраст40-59 летПоказательКонтроль
(N=16)1-3 сутки
(N=32)4-7 сутки
(N=26)8-14 сутки
(N=22)Диеновые конъюгаты0,485±0,0281,223±0,11
P1-2<0,05U1,102±0,146
P1-3<0,05U0,961±0,115
P1-4<0,05UКетодиены и сопряжённые триены0,337±0,0021,033±0,127
P1-2<0,05U1,025±0,123
P1-3<0,05U0,877±0,16
P1-4<0,05UШиффовы основания0,042±0,0020,066±0,011 P1-2>0,05U0,070±0,016 P1-3>0,05U0,052±0,009 P1-4>0,05UПримечание: Диеновые коньюгаты - первичные продукты ПОЛ (Е 232/Е220).
Кетодиены и сопряженные триены - вторичные продукты ПОЛ (Е278/Е220).
Шиффовы основания - конечные продукты ПОЛ (Е 400/Е232). U - Mann Whitney U test; WW - Wald-Wolfowitz runs test. Различия во всех группах достоверны (р<0,05), кроме: ДК P2-3; P3-4; КДиСТ P2-3 ШО P1-2; P2-3; P3-4 у пациентов 20-39 лет и ДК P2-3; P2-3; P3-4; КДиСТ P2-3; P3-4 и ШО P1-2; P1-3; P1-4; P2-3; P3-4 у пациентов 40-59 лет.
Данная картина может объяснить прогредиентное течение тяжелой черепно-мозговой травмы и свидетельствует о необходимости проведения коррекционной терапии. При анализе динамики содержания изопропанолрастворимых продуктов ПОЛ в сыворотке крови и ликворе у пациентов с летальным исходом выявлена схожая тенденция с выжившими пациентами (повышение содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ), за исключением конечных продуктов изопропанольной фазы (ИПФ), где летальному исходу предшествовало увеличение Шиффовых оснований (ШО). В динамике изменения содержания гептанрастворимых продуктов ПОЛ более отчетливо видны различия между пациентами с благоприятным и летальным исходами (рис. 1). Таблица 2 Содержание продуктов ПОЛ изопропанольной фазы ликвора у больных различных возрастных категорий в острый период тяжелой
черепно-мозговой травмы
Группы1234Возраст20-39 лет ПоказательКонтроль
(N=9)1-3 сутки
(N=22)4-7 сутки
(N=22)8-14 сутки
(N=20)Диеновые конъюгаты0,356±0,0381,474±0,108
P1-2<0,05U1,482±0,106
P1-3<0,05U1,168±0,010
P1-4<0,05U P3-4<0,05UКетодиены и сопряжённые триены0,30±0,0261,290±0,108
P1-2<0,05U1,473±0,113
P1-3<0,05U0,974±0,008
P1-4<0,05U P3-4<0,05UШиффовы основания0,022±0,0030,085±0,012
P1-2<0,05U0,112±0,024
P1-3<0,05U0,089±0,011
P1-4<0,05UВозраст40-59 летПоказательКонтроль
(N=9)1-3 сутки
(N=18)4-7 сутки
(N=16)8-14 сутки
(N=18)Диеновые конъюгаты0,377±0,0431,240±0,066
P1-2<0,05U1,324±0,050
P1-3<0,05U1,013±0,044
P1-4<0,05U P3-4<0,05UКетодиены и сопряжённые триены0,346±0,0291,146±0,077
P1-2<0,05U1,147±0,034
P1-3<0,05U
P2-3<0,05WW0,922±0,029
P1-4<0,05U
P3-4<0,05UШиффовы основания0,026±0,0030,093±0,004
P1-2<0,05U0,083±0,008
P1-3<0,05U0,076±0,015
P1-4<0,05UПримечание: Диеновые коньюгаты - первичные продукты ПОЛ (Е 232/220).
Кетодиены и сопряженные триены - вторичные продукты ПОЛ (Е 278/220).
Шиффовы основания - конечные продукты ПОЛ (Е 400/232). U - Mann Whitney U test; WW - Wald-Wolfowitz runs test. Различия во всех группах достоверны (р<0,05), кроме: ДК P2-3; КДиСТ P2-3 ; ШО P2-3 ;P3-4 у пациентов 20-39 лет и ДК P2-3; ШО P2-3 ;P3-4 у пациентов 40-59 лет.
У пациентов с летальным исходом содержание гептанофильных липопероксидов в сыворотке крови было ниже контрольных значений. В ликворе концентрация всех гептанрастворимых продуктов ПОЛ у пациентов с летальным исходом превышала значения контроля, но была ниже чем у пациентов с благоприятным исходом. Обращал на себя внимание тот факт, что содержание всех категорий липопероксидов у пациентов с летальным исходом во все сроки исследования и во всех исследуемых средах было ниже, чем у пациентов с благоприятным исходом (за исключением конечных изопропанолрастворимых продуктов). Свободные радикалы повреждают не только липиды, но и белковые молекулы, но в подавляемом большинстве работ, посвященных изучению СРО при ЧМТ, исследование ограничивается только определением процессов ПОЛ без определения ОМБ. Вместе с тем, одновременная оценка ПОЛ и ОМБ позволяет дать полную характеристику повреждающему действию СРО, более адекватно оценить эффективность АОС, что в свою очередь предоставляет большие возможности для оценки степени тяжести пациентов, прогнозирования течения и исхода травмы, контроля за течением заболевания и эффективностью терапии. Рис. 1. Сравнительное содержание гептанофильных липопероксидов сыворотки крови в острый период тяжелой черепно-мозговой травмой у пациентов с летальным и благоприятным исходом
В ходе исследования установлено, что в остром периоде ЧМТ, на 1-3 сутки от момента получения травмы, происходит снижение содержания карбонилированных белков (КБ) в ответ на индукцию в системе Н2О2. Данный факт сопровождается снижением карбонилирования белков и на базальном уровне. Эта тенденция устанавливается с первых суток от момента получения травмы и сохраняется в течение всего острого периода (до 14 суток от момента получения травмы). При этом к 14 суткам от момента получения травмы показатели ОМБ постепенно приходят к уровню контрольной группы. Подобная динамика карбонилирования белков может быть объяснена при сопоставлении её с данными, касающимися процесса липопероксидации в сыворотке крови в динамике ЧМТ (рис. 2). Рис. 2. Сравнительная динамика изменений ОМБ, ИРДК и АОА-1 в сыворотке крови у пациентов разных возрастных групп с тяжелой ЧМТ.
Белки и липиды, как объекты свободно-радикального окисления состоят в, своего рода, конкурирующих отношениях за активные формы кислорода. Поэтому в случае выраженной атаки АФК на ацильные остатки липидов и выраженной активации липопероксидации, происходит ограничение карбонилирования белков. Указанная взаимосвязь особенно отчетливо заметна в первые сутки получения травмы: в данном временном интервале расхождение между карбонилированием белков и липопероксидацией максимально. Наличие реципрокных отношений между ПОЛ и ОМБ при ЧМТ подтверждается коэффициентом корреляции Спирмена. Так, у больных 20-39 лет при тяжелой ЧМТ коэффициент корреляции между ШО ГФ и КБсп на 1-3 сутки после ЧМТ составил Rs= -0,700 (p<0,05), коэффициент корреляции между КД и СТ ГФ и КБсп Rs= -0,943 (p<0,05) на 4-7 сутки после ЧМТ. На более отдаленных сроках, при включении в схему лечения антиоксидантных препаратов, происходит постепенная и синхронная нормализация показателей ПОЛ и ОМБ, коэффициент корреляции КД и СТ ИПФ и КБсп у больных 40-59 лет на 8-14 сутки Rs = 0,665 (p<0,05).
Уровень аскорбатиндуцированного ПОЛ в крови и ликворе больных с ЧМТ. Интенсификация свободнорадикальных процессов в тканях может быть следствием гиперпродукции АФК и свободных радикалов и/или дефицита антиоксидантов и снижения активности других защитных систем клетки, включая антиоксидантные ферменты.
Несмотря на хорошую сбалансированность про- и антиоксидантных систем и стабильность окислительного равновесия, постоянно сохраняется опасность сдвига этого равновесия за счет перекисного окисления липидов и аутокаталитического возрастания его продуктов. Активность антиокислительной системы во многом является тем адаптационным механизмом, который позволяет ограничивать активность СРО при травматическом повреждении головного мозга. Исследование уровня индуцированного ПОЛ, позволяющего косвенно судить о суммарной антиокислительной активности (АОА) показало, что острый период тяжелой ЧМТ сопровождается повышением уровня АОА. Наиболее выраженное увеличение уровня АОА (как АОА-I, так и AOA-II) у пациентов с благоприятным исходом в сыворотке крови выявлено в возрастной группе 20-39 лет, а в ликворе АОА - у пациентов 40-59 лет.
На протяжении всего исследования уровень АОА у всех пациентов с благоприятным исходом превышал значения контрольной группы, в то время как у 3-х из 32-х пациентов с летальным исходом АОА снижалась до нулевых значений, что свидетельствует о невозможности индукции ПОЛ, вероятнее всего, вследствие исчерпания субстратных систем. У остальных пациентов с летальным исходом содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ после индукции Fe2+/аскорбатом в сыворотке крови имели однонаправленную тенденцию к нарастанию при поступлении с последующим снижением перед летальным исходом. Выявленное, раннее у пациентов с летальным исходом снижение содержания липопероксидов и уменьшение уровня АОА является неблагоприятным прогностическим критерием, свидетельствующим о необратимости повреждений. Возможно, что в острый период тяжелой ЧМТ, интенсификация СРО носит адаптивный характер, облегчая работу мембраносвязанных ферментов, однако в дальнейшем компенсаторное увеличение АОА оказывается неэффективным для предотвращения активации СРО.
Активность антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы (ГП), каталазы и супероксиддисмутазы (СОД), а также прооксидантного фермента- ксантиноксидазы при тяжелой ЧМТ. У пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой, было отмечено, что при поступлении происходит повышение активности ГП до 112%, относительно контрольной группы. К 14 суткам у пациентов с благоприятным исходом продолжался рост (р<0,005) активности ГП, которая к 8-14 суткам достигала 176% по отношению к контрольной группе. У пациентов с летальным исходом активность ГП на 1-3 сутки была значительнее выше, чем у пациентов с благоприятным исходом ЧМТ, превысив значения контроля в 1,44 раза. Анализируя данный факт, можно предположить о том, что резкое повышение активности ГП в 1-3 сутки от момента получения ЧМТ является прогностически неблагоприятным фактором. Статистически значимой межвозрастной разницы в динамике изменения активности глутатионпероксидазы выявлено не было.
В динамике изменения активности каталазы выявлено следующее: в первые сутки у пациентов резко повышалась активность каталазы до 443%. К 8-14 суткам у пациентов с благоприятным исходом отмечалось снижение активности каталазы до 403%, по отношению к контрольной группе. У пациентов с летальным исходом активность каталазы на 1-3 сутки была ниже, чем у пациентов с благоприятным исходом -420% от уровня контроля. Статистически значимой межвозрастной разницы в динамике изменения активности каталазы выявлено не было.
Динамика изменения активности СОД у пациентов с тяжелой ЧМТ выявила снижение активность СОД на 47,5% на 1-3 сутки с дальнейшим снижением до 55,6% на 8-14 сутки от уровня контрольной группы. При летальных исходах (которые происходили чаще на 1-3 сутки) снижение СОД было более выраженным - до 53%. В исследуемых возрастных группах наблюдалась разная динамика СОД. Так, в группе пациентов 20-39 лет падение активности СОД на 1-3 сутки было более выраженным по сравнению с пациентами 40 -59 лет и составляло 40% относительно контрольной группы, с незначительным повышением к 14 суткам до 42%. У пациентов 40-59 лет активность СОД составляла 70% от контроля на 1-3 сутки с дальнейшим снижением к 8-14 суткам до 48% от уровня контроля. Анализируя "среднюю" активность СОД у пациентов с благоприятным исходом и летальным исходом, можно отметить, что у пациентов с неблагоприятным исходом активность СОД была ниже, чем у выживших. Выявленное нами снижение активности СОД происходило на фоне увеличения активности каталазы. Данный факт можно рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на элиминацию избытка Н2О2 за счет роста каталазной активности и накопления церулоплазмина, обладающего СОД-подобным действием (Санина О.Л., Бердинских Н.К., 1996), концентрация которого возрастала в крови при ЧМТ в 1,5-2 раза, в ликворе в 9-11 раз (Кучин Д.Г., 2005, Садова В.А., 2007). Если компенсаторного прироста каталазы и церулоплазмина недостаточно, возникающий дисбаланс в системе ПОЛ-АОЗ является важным фактором интенсификации ПОЛ и нарастания чувствительности к оксидативному стрессу. Активность прооксидантного фермента - ксантиноксидазы в крови исследуемых групп пациентов с тяжелой ЧМТ увеличивалась вне зависимости от возраста пациентов (табл. 3). На 8-14 сутки, на фоне проводимой терапии, включающей антиоксиданты и антигипоксанты, активность ксантиноксидазы у пациентов 20-39 лет уменьшалась до значений близких к контрольным. В том случае, если в исходе заболевания развивалось критическое состояние, приводящее к летальному исходу на 8-14 сутки от момента получения травмы, уровень ксантиноксидазной активности увеличивался до 420%. Таким образом, значения активности ксантиноксидазы в венозной крови достоверно выше у умерших впоследствии пациентов. Данный факт может быть связан с активацией пуринового катаболизма и активацией анаэробных процессов в предагональный и агональный периоды. Таблица 3
Активность ксантиноксидазы крови в остром периоде ЧМТ
Период ЧМТАктивность ксантиноксидазы
(mU/ml/min)Пациенты 20-39 летПациенты 40-59 летПациенты
с летальным исходом Контроль0,233±0,018
(n=24)0,254±0,023
(n=17)0,243±0,021
(n=41)1-3 сутки0,616±0,045*
(n=38)0,817±0,055*
(n=34)0,763±0,114*
(n=29)4-7 сутки0,598±0,0116
(n=36)0,632±0,032* **
(n=35)0,896±0,097*
(n=21)8-14 сутки0,262±0,033
(n=35)0,402±0,044
(n=35)1,034±0,154*
(n=11)Примечание: активность фермента исследовалась в цельной, стабилизированной гепарином крови. Данные представлены в виде средней и ей стандартной ошибки (M±m). Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни и Вальда - Вольфовица для независимых групп. * - статистически значимые отличия от значений контрольной группы (р<0,05). ** - межвозрастные различия (р<0,05). Полученные данные указывают на перспективность исследования активности ксантиноксидазы при ЧМТ с прогностической целью. Активация ксантиноксидазы в первые сутки от момента травмы ассоциирована с приростом большинства продуктов ПОЛ и тяжестью состояния пациентов, что подтверждает весомый вклад фермента в активацию свободно-радикальных процессов при ЧМТ. Так, выявлена корреляция между активностью ксантиноксидазы и ДК ИПФ - Rs= 0,559 (p<0,005), с ШО ГФ - Rs= 0,670 (p<0,005) и степенью тяжести - Rs= 0,786 (p<0,005).
Фосфолипидный состав плазмы крови при тяжелой ЧМТ. Активация ПОЛ при тяжелой ЧМТ сопряжена с изменением липидного состава плазмы крови. Исследование фосфолипидного спектра плазмы крови позволило нам выделить некоторые особенности изменений различных фосфолипидных фракций в динамике ЧМТ. Не обнаружено статистически значимых отличий по содержанию фосфолипидных фракций плазмы крови при ЧМТ в зависимости от возраста пациентов. Изменения фосфолипидного спектра при тяжелой ЧМТ на 1-3 сутки характеризовались снижением общих фосфолипидов на 24%, фосфатидилхолина на 40%, увеличением сфингомиелина на 30%, фосфатидилсерина на 100%, кардиолипина на 17%, лизофосфатидилхолина на 20%, что свидетельствует об усилении микровязкости и ригидности клеточных мембран. К 8-14 суткам была выявлена отчетливая тенденция к возвращению показателей фосфолипидного спектра плазмы к контрольным значениям.
Таким образом, с первых по 14 сутки при тяжелой ЧМТ наблюдались реципрокные отношения между липопероксидацией и ОМБ. С 1 по 7 сутки тяжелой ЧМТ происходило увеличение уровня суммарной АОА, сопровождающееся ростом активности ГП, каталазы на фоне снижения активности СОД, наиболее выраженного на 1-3 сутки у пациентов 20-39 лет. Изменения ФЛ состава крови свидетельствовали об увеличении ригидности, жесткости клеточных мембран. У пациентов с последующим развитием летальных исходов "среднее" содержание липопероксидов в крови и ликворе было ниже по сравнению с благоприятными исходами. Наступлению летальных исходов предшествовало снижение гептанофильных липопероксидов в сыворотке крови ниже контрольного уровня, а так же снижение уровня АОА в крови и ликворе, ассоциированного с резким падением активности СОД и выраженным приростом активности ксантиноксидазы. ВЫВОДЫ
1. Тяжелая ЧМТ сопровождается повышением всех категорий липопероксидов в крови и ликворе во всех исследованных возрастных группах. Наиболее выраженным был прирост гептанофильных продуктов ПОЛ в ликворе у пациентов 20-39 лет: ДК возрастали до 691%, КТ и СТ до 703%. Максимальный прирост ШО определен в гептановой фазе ликвора на 1- 3 сутки после тяжелой ЧМТ у пациентов 40-59 лет (662% от контрольной группы).
2. Содержание всех категорий липопероксидов у пациентов с летальным исходом во все сроки исследования и во всех исследуемых средах ниже, чем у пациентов с благоприятным исходом (за исключением ШО ИПФ сыворотки крови). 3. В динамике 14 суток острого периода тяжелой ЧМТ наблюдается усиление ПОЛ в крови и ликворе на фоне снижения базального уровня ОМБ. 4. Динамика карбонилирования белков плазмы крови у пациентов с тяжелой ЧМТ имеет различия в зависимости от возраста: у пациентов 20-39 лет происходит постепенное нарастание КБсп с 69% на 1-3 сутки до 160% на 8-14 сутки, относительно контрольной группы, а у пациентов 40-59 лет карбонилирование белков имеет волнообразное течение: на 1-3 сутки отмечается снижение КБсп до 53%, с последующим увеличением на 4-7 сутки до 95% и с повторным снижением до 80% на 8-14 сутки.
5. Острый период тяжелой ЧМТ сопровождается повышением уровня АОА. Возрастная группа пациентов 20 - 39 лет с тяжелой ЧМТ характеризовалась более выраженным увеличением уровня АОА (как АОА-I, так и AOA-II) в сыворотке крови. Возрастная группа пациентов 40-59 лет с тяжелой ЧМТ характеризуется более выраженным увеличением уровня АОА (как АОА-I, так и AOA-II) в ликворе. Перед наступлением летального исхода наблюдается снижение АОА (АОА-1 и АОА-2) в сыворотке крови и АОА-2 в ликворе.
6. У пациентов с благоприятным исходом тяжелой ЧМТ активность антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы и каталазы максимально повышалась: глутатионпероксидазы до 176% на 8-14 сутки; каталазы до 443% на 1-3 сутки от уровня контроля. Данные изменения происходили на фоне резкого снижения СОД (до 55,6% на 8-14 сутки после ЧМТ). В случае летальных исходов наблюдалось более выраженное увеличение активности ГП (выше на 32% по сравнению с благоприятным исходом), более выраженное снижение активности каталазы (ниже на 23% по сравнению с благоприятным исходом) и СОД (до 53% от уровня контроля). 7. При тяжелой ЧМТ происходит прирост активности прооксидантного фермента - ксантиноксидазы, наиболее выраженный в возрастной группе 40-59 лет (на 1-3 сутки - 321%, на 8-14 сутки - 430%). Активность ксантиноксидазы в случае развития летальных исходов достоверно выше по сравнению с благоприятными исходами (с 7-14 суток). 8. Изменение фосфолипидного спектра плазмы крови при тяжелой ЧМТ на 1-3 сутки характеризовалось: снижением содержания общих фосфолипидов (на 24%), фосфатидилхолина (на 40%), увеличением сфингомиелина (на 30%), фосфатидилсерина (на 100%), кардиолипина (на 17%), лизофосфатидилхолина (на 20%), что свидетельствует об усилении микровязкости, ригидности клеточных мембран.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Рекомендуется определять содержание продуктов ПОЛ и ОМБ, уровень АОА, активность ГП, СОД, КО у больных с тяжелой ЧМТ для контроля за течением заболевания и эффективностью терапии.
2. Высокий уровень липопероксидов на фоне снижения ОМБ является показанием для назначения препаратов с антиоксидантной активностью.
3. Продолжающееся нарастание активности ксантиноксидазы на 7 сутки у больных с тяжелой ЧМТ свидетельствует о высокой вероятности развития летального исхода у пациента.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Садова, В.А. Мозговая межполушарная асимметрия и иммуно-биохимические показатели в остром периоде сочетанных травм / В.А. Садова, Д.Г. Кучин, И.Ю. Сорвилов, Н.В. Держинский, М.Ю. Воронков, В.Г. Дрягин, Д.Б. Сумная, Е.И. Львовская // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2009. - № 2 (25) С. 126-127.*
2. Садова, В.А. Содержание молекулярных продуктов перекисного окисления липидов при тяжелой черепно-мозговой травме в разных биологических средах. / В.А. Садова, Е.И. Львовская, Н.В. Держинский, Д.Б. Сумная // Вестник Южно-Уральского государственного университета Серия "Образование, здравоохранение, физическая культура" . - 2009. - №27 (160) - С. 81-83.*
3. Львовская, Е.И. Состояние процессов липидной пероксидации в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы. / Е.И. Львовская, В.А. Садова, Д.Б. Сумная, Н.В. Держинский. // Вестник Южно-Уральского государственного университета Серия "Образование, здравоохранение, физическая культура". - 2010. - №6 (182) - С. 82-84.*
4. Львовская, Е.И. Система "Перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита" в острый период тяжелой ЧМТ / Е.И. Львовская,В.А. Садова, Д.Б. Сумная, Н.В. Держинский // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии. Российская конференция, посвященная 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. Челябинск. - 2009. С.57-60.
5. Держинский, Н.В. Липидная пероксидация и фосфолипидный состав в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы / Н.В. Держинский, Е.И. Львовская // Сборник научных трудов молодых ученых УралГУФК №8. Челябинск. - 2009. С.243-246.
6. Держинский, Н.В. Изменение ксантиноксидазной активности крови в остром периоде тяжелой ЧМТ / Н.В. Держинский, Е.И. Львовская, А.И. Синицкий // Седьмая международная научно-практическая конференция "Новые достижения Европейской науки - 2011". Том 31. Лекарство. София. "Бял Град-БГ" ОДД - 2011. С 100-102.
7. Львовская, Е.И. Процессы перекисного окисления липидов в острый период тяжелой черепно-мозговой травмы / Е.И. Львовская, Н.В. Держинский, В.А. Садова, Д.Б. Сумная // Вестник международной академии наук экологии и безопасности жизнедеятельности. Том 16 №3. Санкт-Петербург. - 2011. С.145-147. 8. Держинский, Н.В. Соотношение процессов свободно-радикального окисления липидов, белков, изменение содержания фосфолипидов у пациентов с тяжелой ЧМТ. / Н.В. Держинский, Е.И. Львовская. // Вестник уральской медицинской академической науки 2012.- № 2 С. 106-108.*
*- издания из перечня ВАК РФ
Список использованных сокращений
АОА - антиокислительная активность АОС - антиоксидантная система
АФК - активные формы кислорода
ГП - глутатионпероксидаза ГР - гептанрастворимый ГФ - гептановая фаза
ДК - диеновые коньюгаты
ИПФ - изопропанольная фаза
ИР - изопропанолрастворимый
КБсп - карбонилированные белки, спонтанные
КДиСТ - кетодиены и сопряженные триены
КО - ксантиноксидаза
ОМБ - окислительная модификация белков
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СРО - свободно-радикальное окисление
СРП - свободно-радикальные процессы
СОД - супероксиддисмутаза ЧМТ - черепно-мозговая травма
ШО - Шиффовы основания
ЦНС - центральная нервная система
ЭХО-ЭГ - эхоэнцефалография
NO - оксид азота
ДЕРЖИНСКИЙ
Николай Владимирович
ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ И СОСТОЯНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ С ТЯЖЕЛОЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМОЙ
03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук Подписано в печать 1.03.2012 г.
Формат 60х84 1/16. Бумага офсетная.
Усл.печ.л.1,0. Тираж 100 экз.
Отпечатано в типографии "Печатник"
Лицензия ПД № 17-0027
2
Документ
Категория
Медицинские науки
Просмотров
68
Размер файла
142 Кб
Теги
кандидатская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа