close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Экспрессия гена Il6ST и роль белка gp130 у мышей с наследственной каталепсией

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Синякова Надежда Александровна Шифр научной специальности: 03.01.03 - молекулярная биология Шифр диссертационного совета: Д 003.045.01 Название организации: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Адрес организ
На правах рукописи
СИНЯКОВА НАДЕЖДА АЛЕКСАНДРОВНА
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА Il6ST И РОЛЬ БЕЛКА gp130 У МЫШЕЙ С
НАСЛЕДСТВЕННОЙ КАТАЛЕПСИЕЙ
03.01.03 - молекулярная биология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск - 2012
Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН
Научный руководитель:
д.б.н. Куликов Александр Викторович
Официальные оппоненты:
Морозова Ольга Владимировна, д.б.н.
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, с.н.с.
Феде
Шишкина Галина Трифоновна, д.б.н.
Институт Цитологии и генетики СО РАН, в.н.с.
Ведущая организация:
Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО
РАМН
Защита состоится « 15» ___июня________ 2012 г. в __11:30___ часов
на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Института химической
биологии и фундаментальной медицины СО РАН
по адресу: 630090, Новосибирск, пр-кт, академика Лаврентьева, 8
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Автореферат разослан « ___ » ______________ 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета
к.х.н., доцент
Коваль В. В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
проблемы.
Выявление
молекулярных
механизмов
наследственных психических заболеваний и поиск путей их коррекции являются
ключевой
проблемой
нейрогеномики
поведения
и
молекулярной
нейрофармакологии. Многие тяжелые нарушения нервной системы сопровождаются
каталепсией (реакцией замирания) - состоянием длительной неподвижности с
пластическим тонусом мускулатуры, неспособностью изменить приданную позу
(Sanberg et al., 1988; Weder et al. 2008; Daniels 2009). В клинике каталепсия чаще
всего проявляется при злокачественном экстрапирамидном синдроме, вызванном
лечением пациентов блокаторами дофаминовых D2 рецепторов (нейролептиками)
(Ahlenius and Hillegaart 1986; Klemm 1989; Wadenberg 1996; Caroff et al. 2000; Lee
2007; 2010; Paparrigopoulos et al. 2009; Porsolt et al. 2010). Выяснение молекулярногенетического механизма каталепсии является актуальной задачей молекулярной
биологии и медицины.
Моделью патологической реакции замирания является щипковая каталепсия
у мышей (Amir et al., 1981; Kulikov et al., 1993). Была установлена ассоциация
предрасположенности щипковой каталепсии у мышей
с «депрессивным»
состоянием (Куликов, 2004; Базовкина и др., 2005; Kulikov, Popova, 2008) и со
сниженным порогом судорожной активности нейронов гиппокампа (Лисачев и др.,
2008). Щипковая каталепсия довольно редкое явление и не обнаружена у мышей
большинства линий, таких как AKR/J, C57BL/6, DBA/2 и др. В то же время, она
наблюдается у половины мышей линии CBA/LacJ (Куликов и др., 1989; Kulikov et
al., 1993). Гипертрофированная предрасположенность к каталепсии у мышей
CBA/LacJ была значительно усилена у мышей линии ASC (Antidepressant Sensitive
Catalepsy), полученной длительной селекцией гибридов между CBA и
некаталептической линией AKR/J (Kondaurova et al., 2006). Методами Quantative
trait loci-анализа (QTL) (Куликов и др., 2003; Куликов, Базовкина, 2003) и
длительной селекции (Kondaurova et al., 2006) главный ген каталепсии был
локализован в дистальном фрагменте хромосомы 13. С помощью переноса
дистальных фрагментов хромосомы 13 от каталептической линии CBA/LacJ в геном
некаталептической линии AKR/J главный ген каталепсии был локализован во
фрагменте 111.35 – 116.14 Мб хромосомы 13. Была создана конгенная линия
AKR.CBA-D13Mit76, отличающаяся от AKR/J наличием CBA-фрагмента
хромосомы 13 в геноме AKR/J и высокой предрасположенностью к каталепсии
(Kulikov et al., 2008).
Среди генов, локализованных в данном фрагменте, наиболее вероятным
геном кандидатом является ген Il6st, кодирующий белок gp130, осуществляющий
трансдукцию сигнала от рецепторов цитокинов группы интерлейкина-6 (IL-6). Это
1
чрезвычайно важная группа интерлейкинов (IL), включающая IL-6, IL-11, IL-27,
leukaemia inhibitory factor (LIF), ciliary neurotropic factor (CNTF), онкостатин М,
кардиотропин-1 и др. (Chesnokova and Melmed 2002; Fasnacht and Muller 2008;
Heinrich et al. 2003), играет ключевую роль в нейрогенезе, нейрональной
дифференциации, иммунном ответе и воспалении (Naka et al. 2002). Ряд авторов
предполагает участие IL-6 в механизме депрессии (Bluthe et al. 2000; Hayley et al.
2005; Leonard, Myint, 2009). На этом основании была сформулирована гипотеза, что
причиной наследственной каталепсии у мышей CBA/LacJ могут быть мутации в
гене Il6st или регуляторных областях гена, изменяющие его экспрессию или
функцию белка gp130 (Kulikov et al., 2008).
Цель работы состояла в изучении структуры и экспрессии гена Il6st, а также
функциональной активности белка gp130, а также в установлении их возможной
ассоциации с наследственной каталепсией у лабораторных мышей, различающихся
по предрасположенности к каталепсии.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Определить нуклеотидные последовательности экзонов гена Il6st мышей
некаталептической линии AKR/J и каталептической линии CBA/LacJ.
2. Изучить уровни транскрипции гена Il6st в головном мозге у животных
каталептических линий СBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76, ASC и устойчивой к
каталепсии линии AKR/J.
3. Исследовать уровень трансляции и долю гликозилированной формы белка
gp130 в мозге у животных линий СBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76, ASC и
AKR/J.
4. Исследовать влияние липополисахарида (ЛПС) на поведение и экспрессию
генов Il6st и его гена-мишени Gfap в головном мозге у мышей конгенных
линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.
5. Исследовать влияние IL-6 на поведение у мышей конгенных линий AKR/J и
AKR.CBA-D13Mit76.
6. Изучить влияние IL-6 ex vivo на экспрессию генов Il6st и Gfap в срезах
гиппокампа мышей линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые:
1. Определены нуклеотидные последовательности кодирующей области гена
Il6st у мышей линии AKR/J (номер доступа в базе данных GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) – JQ085376) и CBA/LacJ (номер доступа в базе
данных GenBank – JQ085377).
2. Выявлена зависимость экспрессии гена Il6st от структуры мозга у мышей
линий AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76, ASC.
2
3. Обнаружено увеличение уровня мРНК гена Il6st у мышей линии AKR.CBAD13Mit76 в стриатуме по сравнению с линиями AKR/J, CBA/LacJ и ASC.
4. Выявлена зависимость уровня белка gp130 и степени его гликозилирования
от структур мозга у мышей линий AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76,
ASC.
5. Установлена положительная ассоциация CBA - фрагмента 111.35 – 116.14 Мб
хромосомы 13 c чувствительностью к ЛПС у мышей.
6. Показано участие CBA-фрагмента 111.35 – 116.14 Мб хромосомы 13 в
каталептогенном действии IL-6 у мышей.
Теоретическая и научно-практическая ценность работы. Основным
вкладом данного исследования в изучение генетических и молекулярных
механизмов нарушений поведения является экспериментальное доказательство
ассоциации наследственной каталепсии с чувствительностью к ЛПС и IL-6. Другим
важным положением, продемонстрированным в работе, является экспериментальное
доказательство участия белка gp130 в механизме каталепсии мышей. Несмотря на
то, что полученные экспериментальные результаты не подтвердили гипотезу о том,
что наследственная каталепсия у мышей CBA/LacJ вызвана мутацией в гене Il6st,
изменяющей его экспрессию или функцию белка gp130, проделанная работа
позволила сократить первоначальный список генов-кандидатов, ассоциированных с
наследственной каталепсией у мышей CBA/LacJ. Была показана научнопрактическая ценность конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 как модели для
экспериментального изучения молекулярных механизмов действия ЛПС и IL-6.
Полученные результаты используются в курсе лекций «Молекулярные механизмы
поведения» для студентов 4 курса факультета естественных наук НГУ.
Положения, выносимые на защиту:
1. Наследственная каталепсия у мышей линии CBA/LacJ не ассоциирована с
изменениями в кодирующей части гена Il6st, а также с изменениями в экспрессии
гена Il6st и функциональной активности gp130.
2. Конгенная линия мышей AKR.CBA-D13Mit76 обладает повышенным
уровнем мРНК гена Il6st в стриатуме по сравнению с линиями AKR/J, CBA/LacJ и
ASC.
3. Наибольший уровень мРНК гена Il6st для мышей линий AKR.CBAD13Mit76, AKR/J, CBA/LacJ и ASC обнаружен в среднем мозге и гипоталамусе.
Наибольший уровень обеих форм (гликозилированной и негликозилированной)
белка gp130 наблюдался в среднем мозге у мышей этих линий.
4. Фрагмент 111.35 – 116.14 Мб хромосомы 13 влияет на чувствительность
мышей к липополисахариду (ЛПС) и IL-6.
3
5. Стимуляция gp130 экзогенным IL-6 или эндогенным IL-6,
секретированным в ответ на введение липополисахарида (ЛПС) вызывает
каталептогенное действие у мышей.
Апробация результатов. Полученные результаты были представлены и
обсуждены на XLVIII Международной научной студенческой конференции
«Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010), 5-ой
международной конференции «Биологические основы чувствительности к
психотропным средствам» (Москва, 2010), XXI съезде физиологического общества
им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), Первой всероссийской молодежной научной
конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии»
(Томск, 2010), 13ой ежегодной встрече интернационального общества поведческой
и нейрональной генетики Genes, Brain and Behavior 2011 (Италия, Рим, 2011), 15ой
Международной конференции по нейронаукам и биологической психиатрии
«Стресс и поведение» (Санкт-Петербург, 2011) и VII съезде Казахского
физиологического общества с международным участием «Современная
физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной – основа здоровья и
долголетия» (Казахстан, Алматы, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них четыре
статьи из списка журналов, рекомендованных ВАК, в отечественных (2) и
международных (2) журналах, 4 тезиса на всероссийских и 3 на международных
конференциях.
Соавторство и благодарности. Автор выражает глубокую признательность
к.б.н. П.Д. Лисачеву (лаборатория биомедицинской информатики конструкторскотехнологического института вычислительной техники СО РАН) за приготовление и
инкубацию срезов гиппокампа, к.б.н. Д.В. Базовкиной (лаборатория нейрогеномики
поведения ИЦиГ СО РАН) за помощь в проведении тестов на каталепсию и
секвенировании, к.б.н. М.А. Тихоновой (лаборатория нейрогеномики поведения
ИЦиГ СО РАН) за помощь в обработке поведенческих тестов и к.б.н. Кондауровой
Е.М (лаборатория нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за совместную работу
по Вестерн блоттингу.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор
литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список
цитируемой литературы (301 наименований) и приложение. Работа изложена на 99
страницах, содержит 29 рисунков, из которых 15 оригинальные, и 9 таблиц, из
которых 4 оригинальные. В приложениях помещены 10 оригинальных таблиц,
которые поясняют рисунки 14 – 29.
4
Материалы и методы
Животные
Эксперименты проводили на половозрелых самцах (3-4 мес., массой 28 ± 0.5
г) инбредных линий AKR/J (n = 181), CBA/LacJ (n = 64), ASC (n = 66) и AKR.CBAD13Mit76 (n = 211). Линия ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy) создана в
лаборатории нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН в результате длительной
селекции бэккроссов CBA x (CBA x AKR) на каталепсию. Эта линия включает 75%
генома CBA и 25% генома AKR и характеризуется чрезвычайно высокой
предрасположенностью к каталепсии (Базовкина и др., 2005; Kondaurova et al., 2006;
Kulikov et al., 2008). Линия AKR.CBA-D13Mit76 была получена в лаборатории
нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН переносом фрагмента 111.35 – 116.14
Мб
хромосомы 13
от линии CBA/LacJ в геном AKR/J с помощью 9
последовательных возвратных скрещиваний на линию AKR/J. Линия AKR.CBAD13Mit76 обладает выраженной предрасположенностью к каталепсии на уровне
CBA/LacJ (Kulikov et al., 2008). Животных отсаживали от матерей в возрасте 30 дней
и содержали по 6 особей в клетках 40 х 25 х 15 см в стандартных условиях вивария.
За два дня до начала экспериментов животных изолировали в клетках того же
размера, чтобы устранить влияние эффекта группы.
Введение препаратов
Мышей линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76 разделяли на выровненные по
весу животных группы: контрольным группам вводили физиологический раствор, а
экспериментальным группам - растворенный в физиологическом растворе ЛПС (E.
coli 055:B5, Sigma, USA; чистота препарата >97%) в дозах 50 или 200 мкг/кг или IL6 (Sigma, USA) в дозе 3 мкг/кг. Все препараты вводили внутрибрюшинно. Через 3 ч
после введения ЛПС или через 1 ч после введения IL-6 изучали поведение мышей в
тестах открытого поля и каталепсию. Затем через 4 ч после введения ЛПС животных
декапитировали, быстро на холоду вынимали мозг, выделяли переднюю кору,
гиппокамп, гипоталамус и средний мозг, замораживали их жидким азотом и
хранили при -70оС до экстракции РНК.
Исследование поведения мышей
Тест открытого поля проводили по стандартной методике (Kulikov et al.,
2008). Горизонтальную двигательную активность измеряли автоматически как
суммарное расстояние, пройденное животными, вертикальную - по числу стоек на
задних лапках, а амбивалентное поведение – по числу актов умывания. Тревожность
оценивали по времени пребывания (%) в центральной области арены.
Исследование выраженности каталепсии проводили по стандратной
процедуре (Kulikov et al., 1993) и оценивали по среднему времени замирания в трех
тестах.
5
Определение нуклеотидной последовательности гена Il6st
Нуклеотидная последовательность кодирующей области гена Il6st была взята
в базе данных Ensemble (http://www.ensemble.org). Праймеры подбирали, пользуясь
программами Oligo (Molecular biology insights, inc, США), OligoAnalyzer
(http://idtdna.com); проверяли праймеры на специфичность по базе данных Blast
(http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov). Автоматическое определение нуклеотидных
последовательностей полученных продуктов ПЦР проводили в центре
коллективного пользования автоматического секвенирования ДНК ИХБФМ-ИЦиГ
СО РАН. Секвенограммы анализировали при помощи программы CodonCode
Aligner (СodonCode corporation, США).
Выделение РНК и ОТ-ПЦР
Выделение общей РНК проводили при помощи гуанидин тиоционатного
лизиса с последующей фенольной депротеинизацией и спиртовым осаждением
(Chomczynski, Sacchi, 1987), полученную фракцию РНК обрабатывали ДНКазой,
разводили обработанной диэтилпирокарбонатом водой РНК до концентрации 0.125
мкг/мкл и проводили обратную транскрипцию с помощью вырожденного
гексамерного олигодезоксирибонуклеотида.
Концентрацию примесей геномной ДНК в препаратах кДНК измеряли с
помощью ПЦР с праймерами, специфичными для 5 и 6 экзонов гена
триптофангидроксилазы 1 мыши, который не экспрессируется в головном мозге
(Науменко, Куликов, 2006). Ни в одной из исследуемых проб концентрация
геномной ДНК не превышала 80 копий на мкл.
Концентрацию мРНК генов определяли методом полуколичественной ОТПЦР с использованием известных количеств геномной ДНК мыши (линия
C57BL/6J) в качестве внешнего стандарта и оценивали по числу копий кДНК на 100
копий кДНК РНК полимеразы II, используемой в качестве внутреннего стандарта
(Науменко, Куликов, 2006; Naumenko et al., 2008).
Вестерн блоттинг gp130.
Экстракты белка из структур мозга разделяли в 10% разделяющем и 4%
концентрирующем ПААГ гелях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану
(Hybond-ECL (Amersham, США). Белок gp130 выявляли с помощью первичных
поликлональных антител кролика к gp130 мыши. Полосы с молекулярной массой
ок.130 кДа относили к гликозилированной форме gp130, ок. 100 кДа – к
негликозилированной, что соответствовало теоретически ожидаемым результатам
(Taga et al., 1989). Экспрессию белка выражали в относительных единицах и
нормировали на экспрессию тубулина, которая конститутивна в мозге (Bauer et al.,
2009).
6
Сравнение действия IL-6 ex vivo на экспрессию генов в срезах
гиппокампа
Работа проводилась совместно с сотрудником лаборатории информационной
биологии КТИ ВТ СО РАН П.Д. Лисачевым. Срезы гиппокампа (400 мкм) мышей
AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76 инкубировали в 100 мл искусственной
спинномозговой жидкости с IL-6 (нг/мл) или без него (контроль) в течение 3 ч в
СО2-инкубаторе при температуре 32оС. После инкубации срезы замораживали в
азоте и хранили при -70оС до экстракции РНК.
Статистический анализ данных.
Данные представляли как средние ± ошибка средней и сравнивали при
помощи одно-/двухфакторного дисперсионного анализа с последующим
множественным сравнением по Фишеру. Уровень мРНК гена Il6st у нативных
животных сравнивали при помощи дисперсионного анализа с множественными
парными сравнениями.
Результаты
Анализ нуклеотидных последовательностей кДНК гена Il6st у мышей
AKR/J и CBA/LacJ.
Ген Il6st имеет 15 экзонов; кодирующей части гена соответствует кДНК
размером 5207 п.н. Для изучения связи наследственной каталепсии с возможными
изменениями в нуклеотидной последовательности кодирующей области гена Il6st
проводили секвенирование кДНК этого гена у мышей родительских линий AKR/J и
CBA/LacJ. Всего секвенировали по три образца кДНК для каждой линии, поскольку
мыши этих линий являются инбредными. Полученные последовательности были
депонированы в базу данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) с
номерами доступа JQ085376 для AKR/J линии и JQ085377 для линии CBA/LacJ. Не
было обнаружено отличий нуклеотидных последовательностей кДНК для этих
линий.
Таким образом, различия в предрасположенности к каталепсии у
родительских линий не были связаны с наличием мутации в кодирующей части гена
Il6st. Однако функциональный полиморфизм мог быть вызван нуклеотидными
заменами в интронах или регуляторных областях гена, расположенных в области,
предшествующей 5’- концу, изменяя его экспрессию на транскрипционном или
трансляционном уровнях.
7
Влияние фрагмента 111.35-116.14 Мб хромосомы 13 на экспрессию гена
Il6st.
Было обнаружено влияние линии (p<0,05), структуры (p<0,001) и эффект их
взаимодействия (p<0,05) на уровень мРНК гена Il6st. Выявлено достоверное
увеличение экспрессии гена у мышей AKR.CBA-D13Mit76 в стриатуме по
сравнению с остальными линиями мышей (p<0,001) (Рис.1). Кроме того, для каждой
линии мышей минимальный уровень мРНК гена наблюдался в коре и гиппокампе.
Рис.1.
Уровень
транскрипции
гена
Il6st
у
мышей
с
различной
предрасположенностью к каталепсии. ***p<0,001 по сравнению с AKR/J, CBA/LacJ
и ASC.
Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии ассоциации между
уровнем мРНК и наследственной каталепсией и
делают маловероятным
предположение о том, что мыши каталептических линий отличаются от AKR/J
наличием функциональной мутации (мутаций) в промоторном районе гена Il6st,
способной регулировать транскрипцию данного гена. В связи с этим, мы
предположили возможное наличие мутации в некодирующей части гена (в интронах
или 3’-фланкирующей области), изменяющей функциональную активность белка
gp130.
Изучение соотношения гликозилированной и негликозилированной
форм белка gp130 у мышей, различающихся по предрасположенности к
каталепсии.
Было обнаружено, что содержание как негликозилированной (рис.2) (p<0,001
для всех линий), так и гликозилированной (для линии AKR/J – p<0,001; для
CBA/LacJ - p<0,01; для AKR.CBA-D13Mit76 - p<0,05; для ASC- p<0,01) (рис.3) форм
белка достоверно выше в среднем мозге по сравнению с другими отделами мозга.
8
Кроме
того,
была
выявлена
зависимость
процентного
соотношения
гликозилированных молекул от общего числа молекул gp130 от структуры мозга снижение этого соотношения наблюдалось в стриатуме (для линии AKR/J – p<0,001;
для CBA/LacJ - p<0,05; для AKR.CBA-D13Mit76 - p<0,01; для ASC - p<0,01).
Не было обнаружено разницы между линиями по содержанию
негликозилированной (для всех структур p>0,05), гликозилированной (для всех
структур p>0,05) форм белка, а также по процентному количеству
гликозилированного белка gp130 (для всех структур p>0,05).
Рис. 2. Относительное количество негликозилированной формы p100 в различных
отделах мозга мышей линий AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76 и ASC.***
p<0,001 по сравнению с корой, гиппокампом, гипоталамусом и стриатумом.
Таким образом, мы показали, что предполагаемый функциональный
полиморфизм не влияет на уровень трансляции гена Il6st и на важную
пострансляционную модификацию – гликозилирование.
Следующим шагом было изучение функциональной активности белка
gp130 в физиологическом эксперименте по изучению поведения мышей и
экспрессии генов при его активации неспецифическим агентом – ЛПС и при
непосредственной активации IL-6.
9
Рис. 3. Относительное количество гликозилированной формы gp130 в различных
отделах мозга мышей линий AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76 и ASC. *
p<0,05, **p<0,01,*** p<0,001 по сравнению с корой, гиппокампом, гипоталамусом и
стриатумом.
Изучение влияния липополисахарида на поведение и экспрессию гена
Il6st и его гена-мишени Gfap в мозге мышей конгенных линий AKR/J и
AKR.CBA-D13Mit76.
В этом эксперименте для активации gp130 использовали неспецифический
индуктор секреции IL-6 – липополисахарид (ЛПС) (50 и 200 мкг/кг).
В тесте на каталепсию время замирания у контрольных мышей конгенной
линии было значительно выше, чем у контрольных мышей линии AKR/J (p<0,001).
Были выявлены эффекты ЛПС (p<0,006) и взаимодействия фрагмента и ЛПС
(p<0,032). ЛПС (мкг/кг) не влиял на время неподвижности у мышей AKR/J, но
значительно увеличивал его у мышей AKR.CBA-D13Mit76 (с 72 ± 7,2 с у
контрольных животных до 110 ± 6,9 с у опытных животных, p<0,0005). Таким
образом, непрямая активация gp130 эндогенным IL-6, обладает каталептогенным
эффектом.
В тесте открытого поля, являющимся стандартным тестом на тревожность и
двигательную активность, не было выявлено эффекта фрагмента 111.35-116.14 Мб
хромосомы 13 на двигательную активность (p>0,05), время пребывания в центре
(p>0,05), число стоек (p>0,05) и продолжительность груминга (p>0,05). Не
обнаружено влияния ЛПС на время пребывания в центре (p<0,05). Однако был
выявлен эффект препарата на двигательную активность (p>0,05), число стоек
(p<0,01) и продолжительность груминга
(p<0,01). Не обнаружено эффекта
взаимодействия фрагмента
хромосомы 13 мыши и ЛПС на двигательную
10
активность (p>0,05), время пребывания в центре (p>0,05) и число вертикальных
стоек (p>0,05). В то же время, обнаружено достоверное влияние взаимодействия на
выраженность груминга (p<0,001) (рис.4).
При введении ЛПС большой дозы (200 мкг/кг) у мышей линии AKR/J
наблюдалось достоверное снижение пройденного пути (p<0,02), числа стоек
(p<0,02) и интенсивности груминга (p<0,03). В то же время, даже малая доза (50
мкг/мг) ЛПС вызывала снижение пройденного пути (p<0,03), числа стоек (p<0,02) и
времени груминга (p<0,001) у конгенных мышей, но не у AKR/J. (Рис. 4). Очевидно,
что большей чувствительностью к ЛПС обладают конгенные мыши, имеющие CBAаллель.
гена
Рис.4. Пройденный путь (A), число стоек (B), время пребывания в центре (С) и
продолжительность груминга (D) в тесте открытого поля у мышей линий AKR/J и
AKR.CBA-D13Mit76 при введении ЛПС (50, 200 мкг/кг). *p<0,05, **p<0,01,
***p<0,001 по сравнению с соответствующим контролем, ##p<0,01 по сравнению с
контролем AKR/J.
Не обнаружено эффекта фрагмента 111.35-116.14 Мб хромосомы 13 (p>0,05),
эффекта ЛПС (p>0,05) и взаимодействия эффектов фрагмента хромосомы и ЛПС (50
мкг/кг) (p>0,05) на экспрессию гена Il6st у животных AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.
Однако установлено влияние фрагмента на экспрессию гена глиального белка
Gfap, являющегося геном-мишенью, активируемым IL-6, в коре (p<0,05) и среднем
11
мозге (p<0,05). Экспрессия гена Gfap в этих структурах у животных AKR была
выше, чем у мышей AKR.CBA-D13Mit76. В то же время фрагмент 111.35-116.14 Мб
хромосомы 13 не влиял на экспрессию гена Gfap в гиппокампе (p>0,05). ЛПС (50
мг/кг) увеличивал экспрессию Gfap среднем мозге (p<0,04), но не в коре (p>0,05) и в
гиппокампе (p>0,05). В среднем мозге ЛПС активировал экспрессию Gfap только у
животных AKR.CBA-D13Mit76 (p<0.01), но не AKR/J (рис.5).
Несмотря на то, что активация gp130 вызывала поведенческие различия у
мышей каталептической линии AKR.CBA-D13Mit76, она не приводила к
достоверному изменению уровня мРНК гена Il6st, но влияла на уровень мРНК его
гена-мишени Gfap в среднем мозге. Следующим этапом работы было выяснение
различий на поведенческом, а также на транскрипционном уровне у мышей этих
линий при активации gp130 экзогенным IL-6.
Рис.5. Влияние ЛПС (50 мкг/кг) на уровень транскрипции мРНК гена Gfap в
различных отделах мозга у мышей линий AKR/J (1) и AKR.CBA-D13Mit76 (2).
#
p<0,05 по сравнению с контролем AKR/J, **p<0,01 по сравнению с контролем
AKR.CBA-D13Mit76.
Изучение влияния IL-6 на поведение мышей линий AKR/J и AKR.CBAD13Mit76.
Введение IL-6 (3 мкг/кг) не влияло на время замирания у мышей AKR/J
(17,39±5,52 сек у контрольных животных против 24,82±7,59 сек у опытных, p>0,05),
но увеличивало его у конгенных мышей (с 67,73±9,92 сек до введения препарата до
93,73±6,04 сек после введения, p<0,001). Таким образом, как и в случае с
12
эндогенным, экзогенный IL-6 оказывает каталептогенное действие у мышей,
имеющих CBA-аллель гена Il6st.
Было обнаружено влияние фрагмента 111.35-116.14 Мб хромосомы 13
(p<0,05) и IL-6 (3 мкг/кг) (p<0,05) на двигательную активность в тесте открытого
поля, но не был выявлен эффект их взаимодействия (p>0,05). Введение IL-6 не
влияло на двигательную активность мышей AKR/J, но снижало двигательную
активность мышей AKR.CBA-D13Mit76 (p<0,05) (Рис.6), что также согласуется с
предыдущим опытом.
Рис.6. Пройденный путь в тесте открытого поля у мышей AKR/J и AKR.CBAD13Mit76 линий при введении IL-6 (3 мкг/кг, в/б). * p<0,05 по сравнению с
контролем AKR.CBA-D13Mit76.
Влияние IL-6 на экспрессию генов Il6st и Gfap в срезах гиппокампа ex
vivo.
Для того, чтобы оценить влияние IL-6 на экспрессию генов Il6st и Gfap, были
исследованы срезы гиппокампа. При анализе экспрессии этих генов не было
обнаружено ни эффекта линии (p>0,05), ни препарата (p>0,05), ни их совместного
воздействия (p>0,05).
В опытах по фармакологической активации gp130 была выявлена разница в
поведении мышей – активация gp130 как при помощи ЛПС, так и при помощи IL-6,
увеличивала время каталептичекой неподвижности у животных AKR.CBAD13Mit76, но не у AKR/J, а также изменяла их двигательную активность. Однако мы
не обнаружили различий экспрессии гена Il6st на транскрипционном уровне. Что
касается его гена-мишени Gfap, его экспрессия изменялась только в среднем мозге
при введении ЛПС конгенных мышей.
13
Обсуждение результатов
Важной проблемой современной молекулярной генетики является изучение
последовательности молекулярных событий, ведущей от гена к сложному
физиологическому признаку. Особую актуальность эта проблема приобретает при
изучении молекулярных механизмов нарушения поведения и психики.
Наследственная каталепсия у мышей, несомненно, является проявлением патологии
функции мозга. Во-первых, это чрезвычайно редкий признак, обнаруженный пока у
единственной линии мышей CBA/LacJ (Куликов и др., 1989; Куликов, 2004; Kulikov
et al., 1993). Во-вторых, наследственная каталепсия у мышей ASC ассоциирована с
депрессивно-подобным поведением (Bazovkina et al., 2005; Дубровина и др., 2008),
со сниженным порогом судорожной активности нейронов гиппокампа (Лисачев и
др., 2008) и супрессией специфического иммунитета (Альперина и др., 2008). Втретьих, каталепсия у мышей CBA/LacJ имеет простое наследование и, вероятнее
всего, возникла в результате мутации в одном локусе (Kulikov et al., 1993).
Ранее было установлено, что главный ген, определяющий высокую
предрасположенность к каталепсии, локализован между 111.35 и 116.14 Мб
хромосомы 13 (Kulikov et al., 2008). В этом участке генома обнаружено 6 генов,
продукты которых выполняют сигнальные функции в мозге, каждый из которых
можно рассматривать как потенциальный ген-кандидат каталепсии. К сожалению, в
настоящее время не существует универсального молекулярно-генетического метода
для выбора гена каталепсии среди этого множества генов и, следовательно,
выяснение участия каждого из этих генов в регуляции наследственной каталепсии у
мышей требует собственного исследования.
При планировании экспреримента было предположено, что наиболее
вероятным геном-кандидатом является ген Il6st, кодирующий белок gp130, так как
он экспрессируется в клетках мозга, участвует в сигнальных процессах, выживании
нейронов, нейрогенезе и воспалении. Не последнюю роль в выборе гена Il6st в
качестве объекта данного исследования сыграла простота фармакологической
активации gp130 с помощью ЛПС или IL-6. До начала этой работы не было никаких
данных, указывающих на то, что данный ген может контролировать каталепсию,
поэтому была сформулирована гипотеза, о том, что высокая предрасположенность к
каталепсии может быть связана с мутацией в гене Il6st, изменяющей экспрессию его
продукта – gp130 или его функциональную активность.
На первом этапе нами были определены нуклеотидные последовательности
кДНК у мышей родительских линий – AKR/J и CBA/LacJ. Не было обнаружено
никаких различий в кодирующей области у мышей этих линий, различающихся по
проявлению каталепсии. Однако функциональный полиморфизм мог быть вызван
мутацией в интронах или регуляторных областях гена, расположенных в области,
14
предшествующей 5’- концу, изменяя его экспрессию на транскрипционном или
трансляционном уровнях.
Для проверки предположения исследовали ассоциацию наследственной
каталепсии с экспрессией гена Il6st на транскрипционном уровне в головном мозге
мышей. Для этого определяли уровень мРНК гена Il6st в коре, гиппокампе,
гипоталамусе, стриатуме и среднем мозге мышей каталептических линий с CBAаллелем гена CBA/LacJ, ASC и AKR.CBA-D13Mit76 и мышей некаталептичской
линии AKR/J. Было обнаружено изменение уровня мРНК этого гена только в
стриатуме у мышей конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 по сравнению с другими
линиями,
что
свидетельствует
об
отсутствии
ассоциации
между
предрасположенностью к каталепсии и уровнем транскрипции гена Il6st.
Полученные негативные результаты делают маловероятным предположение о том,
что мыши каталептических линий отличаются от AKR/J наличием функциональной
мутации в промоторном районе гена Il6st, способной регулировать экспрессию
данного гена (Kondaurova et al., 2010).
Тогда мы предположили возможное наличие мутации в регуляторных частях
гена, изменяющей количество и функциональную активность белка gp130. Однако
у мышей AKR/J, CBA/LacJ, ASC и AKR.CBA-D13Mit76 не было обнаружено
различий по концентрации белка gp130 и по процентному соотношению его
гликозилированной формы в коре, гиппокампе, гипоталамусе, стриатуме и среднем
мозге, что опровергало эту гипотезу.
Следующей была гипотеза о том, что мыши с различной
предрасположенностью к каталепсии различаются фунциональной активностью
белка gp130.
Прежде всего, нами было установлено, что малые дозы ЛПС (Kulikov et al.,
2010) и IL-6 увеличивают время каталептического замирания у мышей линии
AKR.CBA-D13Mit76. Этот каталептогенный эффект ЛПС и IL-6 был подтвержден
нашими коллегами на мышах устойчивой к каталепсии линии С57BL/6 (Bazovkina et
al., 2011). Следовательно, наши исследования и исследования наших коллег
доказывают потенциальное участие белка gp130 в механизме каталепсии мышей.
В ходе исследования было установлено, что CBA-фрагмент 111.35 – 116.14
Мб хромосомы 13, перенесенный в геном AKR/J, увеличивал чувствительность
мышей конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 к ЛПС по сравнению с AKR/J.
Действительно, ЛПС в дозе 50 мкг/кг достоверно увеличивал время каталепсии, и
уменьшал выраженность двигательной активности (пройденный путь) и
исследовательского поведения (вертикальные стойки) у мышей AKR.CBAD13Mit76, но не влиял на выраженность этих параметров поведения у мышей AKR/J
(Синякова, Куликов, 2010; Kulikov et al., 2010). Снижение двигательной активности
15
у мышей AKR.CBA-D13Mit76, но не у AKR/J, вызванное введением IL-6 (3 мкг/кг),
подтверждает этот результат.
Поскольку из всех генов, входящих в генную сеть, опосредующую действие
ЛПС и IL-6, мыши линии AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76 различаются только по гену
Il6st, полученные данные указывают на участие гена Il6st и белка gp130 в
наблюдаемом увеличении чувствительности к ЛПС и IL-6 у мышей конгенной
линии. Важно отметить, что высокая чувствительность к ЛПС и IL-6 у мышей
AKR.CBA-D13Mit76 сопровождается высокой экспрессией гена Il6st в стриатуме –
структуре, регулирующей двигательную активность.
Таким образом, результаты работы свидетельствуют об участии ЛПС и IL-6 в
механизме каталепсии и о важной роли фрагмента 111.35 – 116.14 Мб хромосомы 13
в регуляции чувствительности к ЛПС и IL-6. Однако мы не подтвердили гипотезу о
том, что причиной каталепсии является мутация, изменяющая экспрессию гена Il6st
или активность белка gp130 и, следовательно, имеются все основания для
исключения гена Il6st из списка генов-кандидатов, определяющих высокую
предрасположенность к каталепсии у мышей CBA/LacJ.
1.
2.
3.
4.
5.
Выводы
Впервые определены нуклеотидные последовательности кодирующей
области гена Il6st у мышей каталептической CBA/LacJ и некаталептической
AKR/J линий, инбридинг которых поддерживается в институте цитологии и
генетики СО РАН в течение 40 лет, и показана их абсолютная гомология у
мышей CBA/LacJ и AKR/J линий.
Выявлена зависимость экспрессии гена Il6st от структуры мозга.
Минимальный уровень мРНК гена обнаружен в коре и гиппокампе, а
максимальный – в среднем мозге и гипоталамусе Il6st у мышей линии AKR/J,
CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76 и ASC.
Обнаружено увеличение уровня мРНК гена Il6st у мышей линии AKR.CBAD13Mit76 в стриатуме по сравнению с линиями AKR/J, CBA/LacJ и ASC.
Выявлена зависимость относительного количества белка gp130 и степени его
гликозилирования
от
структуры
мозга.
Максимальный
уровень
негликозилированной, а также гликозилированной формы белка gp130
наблюдается в среднем мозге у мышей линий AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBAD13Mit76 и ASC. Процент гликозилированных молекул белка минимален в
стриатуме у мышей данных линий.
Ассоциации между предрасположенностью к наследственной каталепсии и
уровнем, а также степенью гликозилирования белка gp130 в пяти структурах
16
головного мозга мышей AKR/J, CBA/LacJ, ASC и AKR.CBA-D13Mit76 не
обнаружено.
Мыши конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76, отличающиеся от
родительской линии AKR/J CBA-фрагментом 111.35 – 116.14 Мб хромосомы
13, характеризуются повышенной чувствительностью к липополисахариду по
сравнению с животными AKR/J: введение липополисахарида в дозе 50 мкг/кг
достоверно снижает двигательную и исследовательскую активности,
интенсивность груминга и увеличивает экспрессию гена Gfap в среднем мозге
мышей AKR.CBA-D13Mit76, но не AKR/J.
Активация белка gp130 экзогенным IL-6 (3 мкг/кг) не вызывает изменения
экспрессии генов Il6st и Gfap в срезах гиппокампа мышей AKR/J и
AKR.CBA-D13Mit76, однако экзогенный IL-6 усиливает каталепсию и
снижает двигательную активность у мышей конгенной линии AKR.CBAD13Mit76, но не у AKR/J.
6.
7.
Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:
Куликов А. В., Науменко В. С., Цыбко А. С., Синякова Н. А., Базовкина Д.
В., Попова Н. К. Роль гликопротеида gp130 в регуляции серотониновой
медиаторной системы головного мозга мышей // Молекуляр. биология. −
2010. − Т. 44. − С. 904−910.
2. Синякова Н. А., Куликов А. В. Участие белка gp130 в механизме действия
бактериального липополисахарида на поведение и нервную систему мышей
// Труды ТГУ. −2010. − С. 230−233.
3. Kulikov A. V., Sinyakova N. A., Naumenko V. S., Bazovkina D. V., Popova N.
K. Association of glycoprotein gp130 with hereditary catalepsy in mice // Genes
Brain Behaiv. −2010. − V. 9.− P. 997−1003.
4. Kondaurova E. M., Naumenko V. S., Sinyakova N. A., Kulikov A. V. Map3K,
IL6ST, GZMK, and HSPB3 genes coexpression network in the mechanism of
freezing reaction in mice // J. Neurosci. Res. −2011. − V. 89. − P. 267−273.
1.
17
Документ
Категория
Биологические науки
Просмотров
46
Размер файла
294 Кб
Теги
кандидатская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа