close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Биологическая характеристика протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Попова Полина Юрьевна Шифр научной специальности: 03.02.03 - микробиология Шифр диссертационного совета: Д 208.078.01 Название организации: Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Адрес организации: 410005
 На правах рукописи
Попова Полина Юрьевна
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА, СИНТЕЗИРУЕМОГО АСПОРОГЕННЫМ РЕКОМБИНАНТНЫМ ШТАММОМ BACILLUS ANTHRACIS 03.02.03 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Саратов - 2012
Работа выполнена в ФКУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научный руководитель:
доктор медицинских наук Микшис Наталья Ивановна
Официальные оппоненты: Бойко Андрей Виталиевич, доктор медицинских наук, доцент, ФКУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора, зав. отделом образовательных программ и подготовки специалистов
Замараев Валерий Семенович, доктор медицинских наук, профессор, ФКУЗ "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора, главный научный сотрудник лаборатории функциональной геномики
Ведущая организация: ФКУЗ "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Защита состоится 30 мая 2012 г. в 1300 часов на заседании совета Д 208.078.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при ФКУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46)
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб".
Автореферат разослан ____________________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук,
старший научный сотрудник А.А. Слудский г. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Сибирская язва - особо опасное инфекционное заболевание, поражающее людей и восприимчивых животных. Потенциальная возможность заражения человека вирулентными штаммами Bacillus anthracis поддерживается периодически возникающими эпизоотиями болезни, а также существованием множественных почвенных очагов сибиреязвенной инфекции на территории многих стран, в том числе Российской Федерации - более 43 тысяч (Черкасский Б.Л., 2002). Кроме того, B. anthracis отнесен к категории А агентов биотерроризма (Онищенко Г.Г. с соавт., 2006). Патогенность возбудителя сибирской язвы обусловлена синтезом капсулы и экзотоксина (Mock M., Fouet A., 2001). Токсин B. anthracis состоит из трех компонентов: отечного фактора (ОФ), летального фактора (ЛФ) и протективного антигена (ПА). Участвуя в реализации вирулентных свойств, ПА в то же время является основным иммуногеном сибиреязвенного микроба.
Эффективной превентивной мерой в отношении сибирской язвы является вакцинация населения групп риска и сельскохозяйственных животных. В России для профилактики сибирской язвы у людей лицензированы две вакцины - сибиреязвенная живая сухая для накожного и скарификационного применения и сибиреязвенная комбинированная - жидкая и сухая для подкожного применения. Комбинированная вакцина состоит из клеток вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 и полученного из него препарата ПА (Пименов Е.В. с соавт., 2002). В США и Великобритании для вакцинопрофилактики людей с начала 50-х годов ХХ века производятся химические вакцины, основой которых является адсорбированный на гидроокиси алюминия ПА, выделенный из культуральных фильтратов некапсулообразующих сибиреязвенных штаммов. Однако получение иммуногенного антигена из природных или аттенуированных штаммов B. anthracis проблематично ввиду трудностей хроматографического разделения компонентов токсина, имеющих близкие значения молекулярных масс. Наличие в химических сибиреязвенных вакцинах ненормированных примесей ОФ и ЛФ приводит к возникновению, примерно в 20 % случаев, побочных эффектов различной степени выраженности (Centers for disease control and prevention, 2000). Для вакцинации людей предпочтительнее использовать ПА, получаемый из генно-инженерных штаммов с клонированным геном pag, кодирующим его синтез. За рубежом разработаны эффективные генно-инженерные продуценты ПА (Baillie L. et al., 1998; Cohen S. et al., 2000; Chauhan V. et al., 2001). На основе синтезируемого ими иммуногенного белка разрабатываются усовершенствованные химические вакцины, некоторые из них в настоящее время проходят клинические испытания (Campbell J. et al., 2007; Brown B. et al., 2010; www. clinicaltrials. gov).
В лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ "Микроб" был сконструирован аспорогенный штамм B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-), содержащий гибридную плазмиду с клонированной детерминантой синтеза ПА (Микшис Н.И., 2009). Использование его в качестве продуцента ПА позволяет создать технологию получения иммуногенного сибиреязвенного антигена без микробной контаминации лабораторных и производственных помещений и оборудования. Всестороннего исследования влияния синтезируемого штаммом ПА на макроорганизм не проводилось. При разработке прототипов химических сибиреязвенных вакцин следует также учитывать иммуностимулирующее действие отдельных клеточных компонентов, например, белков S-слоя B. anthracis (Ariel N. et al., 2003; Baillie L. et al., 2003; Гончарова А.Ю., 2007). Все вышеизложенное определяет актуальность диссертационной работы, целью которой является оценка перспективности использования протективного антигена, синтезируемого генно-инженерным штаммом B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-), в качестве основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.
Задачи исследования:
1. Изучить стабильность характерных свойств аспорогенного штамма B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-). Оптимизировать условия культивирования рекомбинантного продуцента для увеличения выхода протективного антигена сибиреязвенного микроба.
2. В экспериментах на лабораторных животных (кролики, морские свинки, мыши линии BALB/c) определить динамику титров специфических антител и индексы иммунитета для рекомбинантного протективного антигена, полученного из культурального фильтрата штамма B. anthracis 55∆ТПА1(Spo-). Сравнить иммунизирующую активность рекомбинантного протективного антигена и вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1.
3. При экспериментальной сибиреязвенной инфекции выявить иммуностимулирующее действие белка S-слоя B. anthracis - ЕА1. Исследовать влияние сибиреязвенных антигенов - рекомбинантного протективного антигена и ЕА1, на экспрессию толл-подобных рецепторов. 4. Оценить реактогенность и токсичность препаратов, содержащих рекомбинантный протективный антиген, в экспериментах in vivo и in vitro.
5. Определить компонентный состав прототипов химических сибиреязвенных вакцин, подобрать оптимальные дозы и схемы введения лабораторным животным.
Научная новизна исследования. Впервые установлено, что оптимизация условий культивирования аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-) - добавление в бульон Хоттингера триптона в концентрации 20 мг/мл и сокращение продолжительности выращивания с 24 часов до 16 часов, приводит к увеличению в 5 раз выхода протективного антигена. В экспериментально подобранных условиях штамм B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-) синтезирует в 20 раз больше протективного антигена, чем вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1.
Впервые осуществлено сравнение иммунизирующей активности вакцинного штамма возбудителя сибирской язвы B. anthracis СТИ-1 и препарата протективного антигена, полученного из аспорогенного генно-инженерного продуцента B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-). Установлено, что продукция анти-ПА антител при двукратном введении биомоделям рекомбинантного протективного антигена характеризуется более высокими титрами, с превышением значений до 30 раз - для линейных мышей и морских свинок, и до 20 раз - для кроликов. На модели кроликов максимальные титры анти-ПА антител регистрировались через 1 месяц после последней инъекции препарата рекомбинантного протективного антигена, у морских свинок и линейных мышей - через 2,5 и 2 месяца, соответственно. Двукратная иммунизация биомоделей препаратом очищенного протективного антигена в сочетании с адъювантом обеспечивает защиту от заражения тест-штаммом B. anthracis 71/12, сопоставимую с протективностью живой сибиреязвенной вакцины B. anthracis СТИ-1. На модели мышей линии BALB/c значения ЛД50 тест-заражающего штамма для интактных и иммунизированных рекомбинантным протективным антигеном животных различались на два порядка, в экспериментах на морских свинках - на четыре порядка. Индексы иммунитета препарата рекомбинантного протективного антигена и вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 сопоставимы. Впервые установлено, что добавление к рекомбинантному протективному антигену очищенного протеина S-слоя сибиреязвенного микроба - ЕА1, приводит к повышению в 2,5 раза индекса иммунитета на модели линейных мышей. Препараты рекомбинантного протективного антигена и ЕА1 не токсичны и не оказывают повреждающего действия на тимоциты и спленоциты лабораторных животных. Введение линейным мышам сибиреязвенных антигенов, рекомбинантного протективного антигена и ЕА1, достоверно увеличивает экспрессию толл-подобных рецепторов 2 и 6 типа. Впервые получены данные, свидетельствующие о перспективности использования препарата рекомбинантного протективного антигена для бустерной иммунизации с целью уменьшения на порядок вводимой дозы живой сибиреязвенной вакцины. Практическая значимость. По материалам диссертации составлены методические рекомендации: "Технологии выделения и очистки рекомбинантного протективного антигена и белка S-слоя (ЕА1) сибиреязвенного микроба", одобренные Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" и утвержденные директором РосНИПЧИ "Микроб" (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" № 7 от 22.12.2011 г.); "Определение экспрессии генов Toll-подобных рецепторов 2 и 4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей и экспериментальных животных", одобренные Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" и утвержденные директором РосНИПЧИ "Микроб" (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" № 7 от 16.12.2010 г.). Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ "Микроб" и биотехнологическом факультете Саратовского государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова. Основные положения, выносимые на защиту:
1. Аспорогенный рекомбинантный штамм B. anthracis 55∆ТПА1(Spo-) синтезирует 640 мкг/мл протективного антигена при выращивании в течение 16 часов в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера), содержащей триптон в концентрации 20 мг/мл. В оптимизированных условиях культивирования продукция протективного антигена генно-инженерным штаммом B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-) и вакцинным штаммом B. anthracis СТИ-1 различается в 20 раз. Более высокая продукция протективного антигена рекомбинантным штаммом является следствием отсутствия негативного регулятора синтеза протективного антигена pagR и увеличения числа копий кодирующего гена pag за счет мультикопийности векторной плазмиды.
2. Протективный антиген, синтезируемый аспорогенным генно-инженерным штаммом B. anthracis 55DТПА-1(Spo-), эффективно защищает лабораторных животных при экспериментальном моделировании сибиреязвенного инфекционного процесса. Показатели ЛД50 тест-заражающего штамма для морских свинок, двукратно иммунизированных дозой 25 мкг рекомбинантного протективного антигена в сочетании с адъювантом, и интактных особей, различаются на четыре порядка. Индексы иммунитета рекомбинантного протективного антигена при двукратной иммунизации морских свинок (дозой 25 мкг) и мышей линии BALB/c (дозой 10 мкг) сопоставимы с индексами иммунитета живой вакцины B. anthracis СТИ-1 для тех же биомоделей.
3. Препарат протективного антигена, полученный из аспорогенного продуцента B. anthracis 55DТПА-1(Spo-), индуцирует выраженное образование анти-ПА антител при двукратном подкожном введении кроликам, морским свинкам и мышам линии BALB/c. На протяжении всего срока наблюдения (до 4,5 месяцев) у биомоделей отмечается более высокий уровень синтеза специфических антител, чем при однократном введении споровой культуры вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1. 4. В комбинированной схеме специфической профилактики сибиреязвенной инфекции, включающей однократную инъекцию споровой культуры штамма B. anthracis СТИ-1 и последующее однократное введение рекомбинантного протективного антигена в сочетании с адъювантом, доза вакцинного штамма снижается на порядок (с 5 · 107 спор до 5 · 106 спор для морских свинок).
5. Очищенный препарат протективного антигена, выделенный из культурального фильтрата аспорогенного рекомбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55DТПА-1(Spo-), не обладает реактогенностью и токсичностью для линейных мышей и морских свинок. В тестируемой дозе 10 мкг он не оказывает повреждающего действия на тимоциты и спленоциты мышей линии BALB/c и не изменяет их пролиферативную активность. Введение лабораторным животным препаратов, содержащих рекомбинантный протективный антиген и белок S-слоя сибиреязвенного микроба (ЕА1), приводит к достоверному усилению экспрессии толл-подобных рецепторов врожденного иммунитета 2 и 6 типов на клетках селезенки и тимуса. Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней" (Москва, 2008); научно-практических школах-конференциях молодых ученых и специалистов "Современные технологии обеспечения биологической безопасности" (Оболенск, 2010, 2011); Международной конференции "Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями" (Санкт-Петербург, 2010); X Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ "Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств - участников СНГ" (Ставрополь, 2010); Х съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации" (Москва, 2012), а также на ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2009-2012). Работа выполнена в рамках плановой НИР "Конструирование современных средств специфической профилактики и иммунодиагностики сибирской язвы" (2009 - 2013 гг.), шифр 41-3-09; Федеральной целевой программы "Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации", темы: "Совершенствование специфической профилактики чумы, сибирской язвы и туляремии".
Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, из них - 4 статьи в рекомендованных ВАК изданиях. Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 31 отечественный и 171 зарубежный источник. Общий объем диссертации составляет 140 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 5 таблицами и 22 рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы. При проведении собственных исследований были использованы рекомбинантные штаммы В. anthracis 55ΔТПА-1(Spo-) (КМ97) и В. anthracis СТИDТПА-1 (КМ96) (Государственная коллекция патогенных бактерий (ГКПБ) "Микроб", г. Саратов); вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1 и тест-заражающий штамм В. anthracis 71/12 (2-я вакцина Ценковского) (Государственный институт стандартизации и контроля им. Л.А. Тарасевича, г. Москва). В качестве питательных сред использовали бульон и агар Хоттингера, L-бульон и L-агар (Маниатис Т. с соавт., 1984), в которые при необходимости добавляли канамицин (25 мкг/мл), триптон (20 мг/мл). Для выделения ПА штаммы B. anthracis выращивали в бульоне Хоттингера с добавлением триптона и канамицина или среде, предложенной J. Farchaus et al. (1998). Способность штаммов B. anthracis продуцировать ПА тестировали на казаминовой среде C. Thorne and F. Belton (1957) с добавлением кроличьих анти-ПА антител. Определение протеолитической активности проводили на полусинтетической среде с казеином (Микшис Н.И. с соавт., 2010). В качестве биомоделей использовали линейных мышей BALB/с массой от 18 до 20 г, морских свинок массой от 250 до 300 г, кроликов массой от 2,5 до 3 кг. Микробиологические методы. Протеолитическую активность и способность к продукции ПА штамма В. anthracis 55ΔТПА-1(Spo-) определяли путем переноса изолированных колоний на специальные среды, содержащие, соответственно, казеин или кроличьи антитела к ПА (Кудрявцева О.М., 2007). Для выяснения способности к образованию спор культуру штамма В. anthracis прогревали при температуре 65 0С в течение 30 минут с последующим высевом на агар Хоттингера. Для получения споровых взвесей сибиреязвенные культуры выращивали на агаре Хоттингера до 7 суток, клеточную массу смывали стерильной дистиллированной водой, прогревали при температуре 65 0С в течение 30 минут и дважды отмывали стерильной дистиллированной водой. Концентрацию спор определяли путем высевов из последовательных десятикратных разведений исходной культуры, подсчет числа выросших колоний проводили после 24 часов инкубации при 37 0С. Для получения ПА выращивание аспорогенного штамма В. anthracis 55ΔТПА-1(Spo-) проводили в жидкой питательной среде при температуре 37 0С с аэрацией в течение 16 часов. После периода инкубации добавляли ингибиторы протеаз. Клеточную массу осаждали центрифугированием в течение 30 минут при 7000 об/мин и температуре 4 0С. Супернатант, содержащий ПА, стерилизовали, пропуская через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore, США). Стабильность рекомбинантного штамма оценивали по стандартным методикам в модификациях J. Barnard, A. Friedlander (1999) и S. Cohen et al. (2000). Биохимические методы. ПА выделяли из культурального фильтрата рекомбинантного штамма B. anthracis 55DТПА-1(Spo-). Очистку ПА проводили на хроматографической системе BioLogic Duo Flou(tm) (BioRad, США) с использованием MacroPrep 50Q и Sephacryl-HR300 (Bio-Rad, США) в качестве носителей. Белок ЕА1 экстрагировали из клеточных стенок штамма B. anthracis СТИ-1, очищали двухэтапной ионно-обменной хроматографией на колонке с гидроксиапатитом (Bio-Rad, США). Электрофоретическое разделение протеинов осуществляли в 10 % полиакриламидном геле (SDS-ПААГ) в вертикальной камере (Amersham, США) в соответствии с инструкцией производителя. Иммунохимические методы. Титр антител к ПА и белку ЕА1 в сыворотках иммунизированных животных и количественную оценку уровня продукции ПА штаммами B. anthracis определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА). Для анализа иммунореактивности ПА проводили иммуноблотинг с использованием нитроцеллюлозных мембран Hybond-C (Amersham, США). Иммунологические методы. Определение ЛД50 проводили в соответствии с методическими рекомендациями "Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей" (2002). Индексы иммунитета рассчитывали как отношение ЛД50 заражающей культуры иммунизированных особей к ЛД50 интактных биомоделей. Распределение иммунокомпетентных клеток по фазам клеточного цикла устанавливали цитофлуориметрическим методом. Фиксированные в этиловом спирте тимоциты и спленоциты линейных мышей и лейкоциты крови человека окрашивали раствором, содержащим бромид этидия и митрамицин, в течение 20 минут. На проточном цитофлуориметре ICP-22 PHYWE (Германия) анализировали не менее 30000 клеток в каждой пробе (Кравцов А.Л., 1997; Kravtsov A.L. et al., 2001).
Молекулярно-генетические методы. Полимеразную цепную реакцию с праймерами на нуклеотидные последовательности гена pag проводили в модификации И.В. Тучкова с соавт. (2005). Праймеры на нуклеотидные последовательности гена pagR рассчитывали в программе Vector NTI. Праймеры к генам TLRs были синтезированы в лаборатории генодиагностических препаратов РосНИПЧИ "Микроб" на основе известных последовательностей. Выделение РНК из клеток селезенки и тимуса иммунизированных линейных мышей и реакцию обратной транскрипции осуществляли с помощью комплектов реагентов "РИБО-сорб" и "Реверта" (ИнтерЛабСервис, Россия) согласно инструкциям фирмы-производителя. Полимеразную цепную реакцию ставили на программируемом амплификаторе "Терцик" ("ДНК-технология", Россия). Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов проводили в горизонтальной камере (Bio-Rad, США) в 2 % агарозном геле. Визуализацию полос ДНК осуществляли в ультрафиолетовом свете и регистрировали с помощью системы гель-документирования "ViTran" (ДНК-технология, Россия). Экспериментальные материалы обрабатывали посредством статистических методов, описанных И.П. Ашмариным, А.А. Воробьевым (1962). Определяли среднее значение (M), стандартную ошибку (m).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Используемые в практике здравоохранения и вновь разрабатываемые живые и химические сибиреязвенные вакцины основаны на действии ПА - одного из компонентов экзотоксина бинарного действия. Получение ПА из штаммов, содержащих клонированную детерминанту его синтеза (pag), обеспечивает отсутствие реактогенных примесей ОФ и ЛФ в иммунизирующем препарате. Депонированный в 2006 г. в ГКПБ РосНИПЧИ "Микроб" генно-инженерный штамм B. anthracis 55DТПА-1(Spo-) с включенным в состав гибридной плазмиды pUB110PA-1 геном pag, не способен к образованию спор, вследствие чего имеет преимущество при организации технологического процесса получения из него иммуногенного сибиреязвенного антигена. В начале нашего исследования оценивали стабильность основных свойств штамма B. anthracis 55DТПА-1(Spo-) после длительного хранения в лиофилизированном состоянии. Проведя 20 последовательных пассажей штамма в жидкой питательной среде с добавлением селективного антибиотика, культуру рассевали до единичных колоний, а затем осуществляли их анализ по характерным биологическим свойствам. На среде с белковым субстратом (казеином) не было отмечено зон лизиса вокруг всех 20 произвольно выбранных клонов. На среде, содержащей антитела к ПА, напротив, все исследуемые клоны образовывали широкие кольца преципитации. Результаты экспериментов свидетельствовали о сохранении низкой активности протеолитических ферментов и способности к продукции ПА штамма B. anthracis 55DТПА-1(Spo-). Сравнение жизнеспособности культур до и после прогрева при 65 0С в течение 30 минут ни в одном из случаев не выявило реверсии к спорообразующему фенотипу. При электрофоретическом исследовании ДНК произвольно выбранных клонов во всех случаях регистрировали наличие плазмиды соответствующего размера (6,5 т.п.н.). Проведенные эксперименты подтвердили стабильность биологических свойств рекомбинантного продуцента B. anthracis 55DТПА-1(Spo-) при многократном пассировании in vitro после хранения в лиофилизированном состоянии.
На следующем этапе исследовали возможность оптимизации параметров культивирования аспорогенного рекомбинантного продуцента для увеличения выхода иммуногенного белка. В проведенных ранее экспериментах концентрация ПА в культуральном фильтрате штамма B. anthracis 55DТПА-1(Spo-), выращенного в течение 24 часов в жидкой питательной среде с высоким содержанием триптона и дрожжевого экстракта (Farchaus J. et al.,1998), составила 80 мкг/мл, что в 5 раз больше значений, установленных для вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 (Шулепов Д.В., 2009). Количественную оценку уровней продукции ПА штаммами B. anthracis 55DТПА-1(Spo-) и B. anthracis СТИ-1 проводили в процессе их выращивания: а) в среде, описанной J. Farchaus et al.; б) в бульоне Хоттингера с добавлением 20 мг/мл триптона и в) в бульоне Хоттингера без дополнительных ингредиентов. Выращивание осуществляли до достижения поздней логарифмической (16 часов) или стационарной (24 часа) фаз роста. При культивировании рекомбинантного штамма в питательную среду вносили селективный антибиотик канамицин в концентрации 25 мкг/мл. Для вакцинного штамма обеспечивали повышенное содержание СО2 в среде выращивания. Добавление в питательную среду триптона приводило к значительному увеличению уровня продукции ПА рекомбинантным штаммом - приблизительно в 1,5 - 2 раза. Ответ вакцинного штамма на внесение дополнительного ингредиента оказался нейтральным. По результатам ТИФА максимальные концентрации ПА в культуральных фильтратах обоих штаммов отмечались через 16 часов выращивания: 640 мкг/мл для B. anthracis 55DТПА-1(Spo-) и 30 мкг/мл для B. anthracis СТИ-1 (рис. 1). Через 18 часов инкубации концентрация ПА снизилась до 480 мкг/мл для рекомбинантного продуцента и 15 мкг/мл для вакцинного штамма. Наименьшие значения отмечали через 24 часа культивирования - 150 мкг/мл для B. anthracis 55DТПА-1(Spo-) и 10 мкг/мл для B. anthracis СТИ-1. Вероятно, после 16 часов инкубации количество протеолитических ферментов в среде достигает критического уровня, и, несмотря на то, что оба штамма характеризуются резко сниженной их активностью, происходит постепенная деградация белкового антигена. Нами установлено, что в равнозначных условиях рекомбинантный штамм продуцирует в 20 раз больше ПА по сравнению с вакцинным штаммом. Рисунок 1 - Концентрация ПА в культуральных фильтратах рекомбинантного B. anthracis 55DТПА-1(Spo-) (пунктирные линии) и вакцинного B. anthracis СТИ-1 (сплошные линии) штаммов, выращенных в различных питательных средах: 1 и 4 - среда, описанная J. Farchaus et al.; 2 и 5 - бульон Хоттингера с добавлением триптона (20 мг/мл); 3 и 6 - бульон Хоттингера без триптона.
Как известно, в клетках природных штаммов B. anthracis или их аттенуированных производных детерминанта синтеза ПА экспрессируется слабо из-за наличия сложной системы взаимодействия контролирующих генов. Позитивную регуляцию осуществляет главным образом плазмидная область AtxA, однако у рекомбинантного штамма с pUB110PA-1 область позитивной регуляции AtxA отсутствует. Высокий уровень продукции им ПА, возможно, обеспечен увеличением числа копий гена pag за счет мультикопийности вектора pUB110 и/или дефектом негативного регулятора pagR (Кудрявцева О.М., 2007). Эффект дозы гена pag исследовали при помощи ПЦР с праймерами на основе его нуклеотидных последовательностей (Тучков И.В., 2005). В результате, при равном количестве исходной ДНК тестируемых штаммов - B. anthracis 55DТПА-1(Spo-) и B. anthracis СТИ-1, количество наработанных в ПЦР-реакции специфических ампликонов отличалось в несколько раз.
Для обнаружения в составе гибридной плазмиды регуляторного гена pagR (300 п.н.) нами в программе Vector NTI были рассчитаны праймеры, фланкирующие область с 36 по 234 п.н. от начала гена. Постановка ПЦР с использованием данных праймеров выявила наличие интактного гена pagR в геноме вакцинного штамма и продемонстрировала отсутствие негативного регулятора в геноме рекомбинантного продуцента. Таким образом, высказанное ранее предположение подтверждено экспериментально.
На следующем этапе из аспорогенного генно-инженерного продуцента B. anthracis 55DТПА-1(Spo-) с использованием ранее разработанной методики (Шулепов Д.В., 2009) был выделен и очищен белок, имеющий по результатам SDS-ПААГ электрофореза молекулярную массу 83 кДа и специфично реагирующий с поликлональными анти-ПА антителами в иммунохимических реакциях - иммуноблоте, дот-анализе и ТИФА. Биологическую активность очищенного препарата ПА, его иммуногенность, протективность, реактогенность и токсичность исследовали на различных биомоделях - мышах линии BALB/с, морских свинках и кроликах. Наиболее часто в качестве маркера иммуностимулирующего действия антигенных препаратов используют титры анти-ПА антител. Динамику антител у иммунизированных рекомбинантным ПА биомоделей изучали в сравнении с антителообразованием при использовании живой сибиреязвенной вакцины B. anthracis СТИ-1. Лабораторным животным опытных групп вводили двукратно препарат ПА в сочетании с полным адъювантом Фрейнда или культуру вакцинного штамма - линейным мышам и морским свинкам однократно в дозе 5 · 106 спор, а кроликам двукратно в дозе 1 · 107 спор. Отмечены следующие особенности образования антител у мышей линии BALB/c. После двукратной иммунизации дозой 10 мкг ПА происходило постепенное нарастание титров специфических антител. К 21 дню иммуногенеза титр анти-ПА антител составил 1/2560, а через 2 месяца он достигал максимального значения - 1/40000. Вслед за пиком отмечали снижение титров до уровней 1/20000 - через 2,5 месяца, 1/5120 - через 3 - 3,5 месяца, и 1/640 - через 4,5 месяца. В сыворотках животных, вакцинированных однократно B. anthracis СТИ-1 (5 · 106 спор), максимум анти-ПА антител выявлялся на 28 сутки - титр 1/5120. На протяжении всего срока наблюдения количество антител к ПА у мышей, иммунизированных антигенным препаратом, было выше. Различия показателей колебались в пределах от 2 до 30 раз (рис. 2).
Аналогичная тенденция выявлена в экспериментах на морских свинках. После двукратной иммунизации биомоделей дозой 25 мкг рекомбинантного ПА отмечали повышение титров анти-ПА антител. Пик антителогенеза (титр антител 1/40000) регистрировали через 2,5 месяца. После этого срока титры постепенно снижались до следующих значений: 1/10000 - через 3 месяца, 1/8000 - через 3,5 месяца, 1/1280 - к концу срока наблюдения (4,5 месяца).
Рисунок 2 - Динамика титров анти-ПА антител при иммунизации линейных мышей BALB/c: пунктирная линия - препаратом ПА в дозе 10 мкг (двукратно); сплошная линия - споровой взвесью штамма B. anthracis СТИ-1 в дозе 5 · 106 спор (однократно). На графике приведены средние значения данных, полученных от 5 особей животных. В случае однократной иммунизации споровой взвесью штамма B. anthracis СТИ-1 (5 · 106 спор) максимальный титр антител к ПА в сыворотках животных регистрировали через 1,5 месяца - 1/2560. В целом у морских свинок, иммунизированных антигенным препаратом, во все сроки отмечали более выраженный антителогенез с максимальным 30-кратным превышением титров в сравнении с биомоделями, вакцинированными B. anthracis СТИ-1. В течение первых 35 суток поствакцинального периода у кроликов, двукратно иммунизированных B. anthracis СТИ-1, отмечали более высокие титры анти-ПА антител. Пик антителообразования (титр антител 1/24000) у них регистрировали на 35 сутки. Впоследствии тенденция резко менялась, у биомоделей, иммунизированных антигенным препаратом, происходил "всплеск" выработки специфических антител. Их количество достигало максимума (титр антител 1/128000) через 1,5 месяца от начала иммунизации, затем происходило постепенное уменьшение значений титров до 1/33000 - через 2 месяца и 1/9000 - через 2,5 месяца. В отдаленные сроки (2 - 2,5 месяца) отмечали значительное (в отдельных случаях почти 20-кратное) превышение количества антител к ПА у кроликов, иммунизированных ПА.
Таким образом, ПА, полученный из аспорогенного рекомбинантного продуцента B. anthracis 55DТПА-1(Spo-), вызывает у лабораторных животных - линейных мышей, морских свинок, кроликов, выраженную продукцию специфических антител.
На следующем этапе определяли способность рекомбинантного ПА защищать мышей линии BALB/с и морских свинок от заражения тест-штаммами возбудителя сибирской язвы. Группам лабораторных животных (по 20 особей в каждой) вводили очищенный препарат рекомбинантного ПА двукратно в сочетании с полным адъювантом Фрейнда (в объемном соотношении 2:1) в дозах 10 мкг для линейных мышей и 25 мкг для морских свинок. Контролем служили интактные животные. В качестве препарата сравнения выбрали вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1, которым иммунизировали подкожно однократно в дозе 1-2 · 106 спор для линейных мышей, 5 · 106 или 5 · 107 спор для морских свинок. В поствакцинальный период среди морских свинок, иммунизированных живой вакциной, регистрировали 20 - 25 % летальных случаев, среди линейных мышей аналогичной группы этот показатель достигал 10 %. Гибели животных, получивших инъекцию антигенного препарата, не наблюдали.
Через 21 день от последней инъекции осуществляли заражение животных споровой взвесью штамма B. anthracis 71/12. Линейным мышам вводили по 0,2 мл тест-штамма в четырех возрастающих дозах (по 5 животных каждой группы на дозу): от 1  103 до 1  106 спор - для иммунизированных, и от 1  102 до 1  105 спор - для интактных. Морским свинкам вводили по 0,5 мл споровой взвеси тест-штамма в четырех возрастающих дозах (по 5 животных каждой группы на дозу): от 1  104 до 1  107 спор - для иммунизированных, и от 1  104 до 1  101 спор - для интактных). Наблюдение за зараженными животными осуществляли в течение десяти дней, учитывали павших особей и подсчитывали ЛД50 B. anthracis 71/12, а также индексы иммунитета. Эксперимент по данной схеме повторяли трехкратно.
В результате обработки данных значение ЛД50 тест-штамма для интактных мышей в первом опыте составило 5,0 · 102 (1002512) спор. Тот же показатель для животных, получивших антигенный препарат, оказался на два порядка выше - 7,9 · 104 (15849501187) спор. Значение ЛД50 заражающего штамма для линейных мышей, иммунизированных вакцинным штаммом, было 3,1 · 104 (6310158489) спор. Соответственно, в этом эксперименте индекс иммунитета рекомбинантного ПА - 158,5, аналогичный показатель штамма B. anthracis СТИ-1 - 63,1 (рис. 3, А). В следующих двух повторах опыта прослеживались те же тенденции. Индексы иммунитета или совпадали - 63,1 и 63,1, или отличались незначительно - 25,1 и 39,8. Колебания значений индексов иммунитета в различных экспериментах, очевидно, могут быть связаны с условиями проведения экспериментов (сезон года) и индивидуальными особенностями животных (Колесов С.Г., 1976; Бывалов А.А., 2011).
В экспериментах на морских свинках определены следующие значения ЛД50 тест-заражающего штамма: для контрольных животных - 5 · 103 (1585398107) спор; для морских свинок, получивших 25 мкг рекомбинантного ПА - 1,9 · 107 спор; для биомоделей, иммунизированных B. anthracis СТИ-1 (5 · 107 спор), - 1,9 · 107 спор. В результате индексы иммунитета рекомбинантного ПА и вакцинного штамма (3980,0) совпадали (рис. 3, Б). В следующих двух повторах опыта прослеживались те же закономерности. Рисунок 3 - Результаты экспериментов по сравнительному анализу индексов иммунитета рекомбинантного ПА (1) и вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 (2) на модели линейных мышей (А) и морских свинок (Б). Полученные результаты свидетельствуют о способности рекомбинантного ПА стимулировать формирование у лабораторных животных эффективного иммунного ответа. На основании сравнения индексов иммунитета можно сделать вывод о способности рекомбинантного протективного антигена обеспечивать защиту биомоделей, сопоставимую по уровню с протективностью вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1. Острую токсичность оценивали на иммунизированных препаратом ПА животных по данным мониторинга общего состояния и осмотра места инъекции. Мышам линии BALB/c (по 10 особей в группе) однократно подкожно вводили по 0,2 мл ПА без адъюванта в дозах 10 и 50 мкг, морским свинкам (по 5 особей в группе) по 0,5 мл препарата в дозах 25, 50 и 100 мкг. Контрольные животные получили по 0,2 и 0,5 мл физиологического раствора. При взвешивании животных всех групп не наблюдали снижения массы тела. Локальных морфологических изменений в области введения препаратов не фиксировали. Для оценки повреждающего действия препарата in vitro осуществляли мониторинг состояния лейкоцитов крови человека после взаимодействия с рекомбинантным ПА. По окончании инкубации антигенного препарата с цельной дефибринированной кровью людей проводили выделение и окраску лейкоцитов раствором, содержащим митрамицин и бромид этидия. Цитотоксическое действие ПА контролировали по количеству клеток в состоянии апоптоза методом проточной цитофлуориметрии. Установлено, что испытуемый препарат не оказывал повреждающего действия на лейкоциты крови.
Цитофлуориметрический мониторинг применяли также для оценки пролиферативной активности лимфоцитов органов центрального (тимус) и периферического (селезенка) иммуногенеза линейных мышей BALB/c, иммунизированных однократно подкожно ПА без адъюванта. Апоптотическая и пролиферативная активности клеток тимуса существенно не отличались от аналогичных показателей в группе контрольных особей. В пробах селезенки регистрировали небольшое повышение пролиферативной активности клеток на 7 и 14 сутки, что может быть обусловлено пролиферацией В-клеток и антителопродукцией. Введение мышам ПА не влияло на апоптотическую активность спленоцитов. Индекс соотношения клеток селезенки и тимуса в стадии апоптоза и пролиферации не превышал единицы, что соответствует норме. Несмотря на доминирующее значение ПА в процессе формирования иммунного ответа, в настоящее время не подвергается сомнению участие в иммуногенезе других антигенов возбудителя, в том числе белков S-слоя (Ariel N. et al., 2003; Baillie L. et al., 2003; Гончарова А.Ю., 2007). В связи с этим, представлялось обоснованным определить возможность использования одного из белков S-слоя - ЕА1 в качестве дополнительной составляющей химической сибиреязвенной вакцины. Участие ЕА1 в формировании адаптивного иммунного ответа в первую очередь проверяли, оценивая титры анти-ПА и анти-ЕА1 антител у кроликов, иммунизированных вакцинным штаммом B. anthracis СТИ-1. Кроликам (три особи в группе) вводили подкожно 1 · 107 спор бактериальной культуры. На 21 сутки осуществляли повторную иммунизацию той же дозой. Максимум антител как к ПА (среднее значение титров антител 1/24000), так и к белку S-слоя (среднее значение титров антител 1/6500) отмечали в сыворотках, взятых на 35 сутки после начала иммунизации. Спустя 2,5 месяца уровень антител к ПА и ЕА1 снижался до средних значений титров 1/4000 и 1/100, соответственно. На следующей стадии проводили оценку эффективности иммунизации лабораторных животных препаратом, содержащим ПА в качестве основного иммуногенного вещества, а ЕА1 - в качестве иммуномодулирующего компонента. Мышам двукратно вводили сочетание ПА в дозе 10 мкг с белком ЕА1 в дозе 5 мкг, морским свинкам - 25 мкг очищенного рекомбинантного ПА и 10 мкг белка ЕА1. Антигенные препараты использовали в сочетании с адъювантом. Иммунобиологическую перестройку оценивали по показателям ЛД50 тест-штамма B. anthracis 71/12 и индексов иммунитета. На модели линейных мышей были определены следующие значения ЛД50 заражающего штамма: 5 · 102 (1002512) спор - для неиммунизированных особей, 3,1 · 104 (6310158489) спор - при иммунизации B. anthracis СТИ-1, 1,9 · 105 (398111000000) спор - при введении комплексного препарата. Индексы иммунитета были следующими: 398,2 - для препарата ПА с ЕА1, 63,1 - для штамма B. anthracis СТИ-1. Ранее установленное значение индекса иммунитета для препарата рекомбинантного ПА в дозе 10 мкг составило 158,5. В сыворотках крови линейных мышей, иммунизированных комплексным препаратом, на 14 и 21 сутки иммуногенеза определялись специфические антитела к ЕА1.
Следовательно, добавление белка ЕА1 в иммунизирующий препарат на основе ПА повышает устойчивость линейных мышей к заражению тест-штаммом возбудителя сибирской язвы в 2,5 раза.
Эксперимент на морских свинках воспроизводили дважды на разных выборках животных. Для особей контрольной группы показатель ЛД50 заражающего штамма оказался равен 5 · 103 (1585398107) или 3,1 · 102 (631585) спор. У морских свинок, получивших инъекцию препарата, содержащего ПА и ЕА1, в первом случае значение составило 1,9 · 106 (50118719952623) спор, во втором случае - 3,1 · 107 спор. Для животных, иммунизированных вакцинным штаммом в дозе 5 · 106 спор, значение ЛД50 B. anthracis 71/12 было 3,1 · 106 (79432850118723) спор. В повторном эксперименте иммунизирующая доза вакцинного штамма составляла 5 · 107 спор, значение ЛД50 тест-штамма - 3,1 · 107 спор. Индексы иммунитета при иммунизации биомоделей комплексным препаратом ПА с ЕА1 - 398,0 и 100072,0, при введении B. anthracis СТИ-1 в концентрации 5 · 106 спор - 630,9, в концентрации 5 · 107 спор - 100072,0.
Отсутствие у протеина S-слоя цитотоксического действия по отношению к лейкоцитам крови человека подтверждали с использованием метода проточной цитометрии. Количество тимоцитов в состоянии апоптоза у лабораторных животных, иммунизированных белком S-слоя, не увеличивалось по сравнению с контролем. Число пролиферирующих клеток тимуса также соответствовало контрольным значениям. Коэффициент отношения апоптотических клеток к пролиферирующим был меньше единицы. Иммунизация белком ЕА1 приводила к увеличению числа апоптотических клеток селезенки на 7 сутки после иммунизации, к концу срока наблюдения показатель возвращался к исходному значению. Показатель баланса был меньше единицы. Из вышеизложенного следует, что создание прототипа химической вакцины целесообразно на основе сочетания рекомбинантного ПА и белка S-слоя ЕА1 сибиреязвенного микроба. При оценке иммуногенного действия кандидатных химических вакцин необходимо уделить внимание взаимодействию антигенов со структурами врожденного иммунитета, в частности, толл-подобными рецепторами (TLRs). Известно, что ПА является лигандом толл-подобных рецепторов 2 и 6 типов (Triantafilou M. et al., 2007); данные о взаимодействии белков S-слоя с TLRs отсутствуют. Для исследования брали клетки тимуса и селезенки биомоделей в различные сроки после однократного введения изучаемых антигенных препаратов без адъюванта. С использованием коммерческих наборов была получена кДНК, послужившая матрицей для проведения ПЦР со специфическими праймерами к генам TLRs. Положительным контролем служили ампликоны, образующиеся в ПЦР с праймерами к фрагменту гена "домашнего хозяйства", кодирующего синтез β-актина. После электрофоретического разделения полученных ампликонов проводили учет результатов эксперимента. При исследовании в ПЦР проб, взятых через 4 часа, на 1, 3, 7 и 14 сутки после однократной иммунизации рекомбинантным ПА (10 мкг) или белком ЕА1 (10 мкг), во всех случаях образовывались специфичные ампликоны, что свидетельствует об экспрессии TLRs 2 и 6 типов на клетках тимуса и селезенки линейных мышей. Интересно, что и у неиммунизированных животных отмечали экспрессию TLRs 2 и 6-го типа, хотя и слабо выраженную. Данный факт согласуется с представлениями о том, что клетки макроорганизма конститутивно экспрессируют рецепторы врожденного иммунитета (Janssens S., Beyaert R., 2003). В связи с этим дополнительно осуществили сравнительный полуколичественный анализ экспрессии TLRs на иммунокомпетентных клетках иммунизированных особей и интактных животных. Наработанные в ПЦР образцы титровали в двукратных разведениях и наносили в лунки агарозного геля. При электрофоретическом исследовании было установлено, что экспрессия TLRs у линейных мышей, иммунизированных сибиреязвенными антигенами, в несколько раз больше, чем у животных, которым ПА и ЕА1 не вводили. Проведенные эксперименты показывают, что при иммунизации линейных мышей ПА, выделенным из аспорогенного рекомбинантного продуцента, происходит активация врожденного звена иммунной системы, что выражается в достоверном значительном увеличении экспрессии TLRs 2 и 6 типа на клетках селезенки и тимуса. Установлено, что белок ЕА1 также, как и ПА, способен взаимодействовать с рецепторами врожденного иммунитета. При конструировании современных вакцин необходимо стремиться к соблюдению одного из основополагающих принципов вакцинологии - максимально возможному уменьшению дозы и кратности введения препарата. Ввиду этого обстоятельства, нами были проведены эксперименты по подбору доз и схем введения рекомбинантного ПА, обеспечивающих наилучшую защиту лабораторных животных. Сравнение защитных свойств препаратов, различающихся по содержанию иммуногенного белка, проводили на модели мышей линии BALB/с. Животных отдельных групп, по 20 особей в каждой, иммунизировали рекомбинантным ПА в различных дозировках - 5, 10, 20 и 30 мкг. ПА использовали в сочетании с адъювантом. Расчетное значение ЛД50 тест-штамма для мышей контрольной группы составило 5 · 102 спор. Показатели ЛД50 заражающего штамма для животных, получивших различные дозы рекомбинантного ПА, были выше: 5 · 104, 7,9 · 104, 3,1 · 104, 1,2 · 104 спор при дозировке ПА 5 мкг, 10 мкг, 20 мкг, 30 мкг, соответственно. Индексы иммунитета варьировали следующим образом. Самое высокое значение оказалось у мышей, иммунизированных 10 мкг рекомбинантного ПА - 158,5. Как при увеличении, так и при уменьшении количества ПА отмечали снижение индекса иммунитета - до 100,0 для вводимой дозы ПА 5 мкг, и до 63,2 - для дозы 20 мкг ПА. Наименьшей протективной активностью обладал препарат, содержащий 30 мкг ПА, в этом случае индекс иммунитета был 25,6. По-видимому, увеличение антигенной нагрузки на макроорганизм ведет к супрессии иммунного ответа. Обобщая эти экспериментальные данные и результаты, полученные на предыдущих этапах исследования, можно сделать вывод, что оптимальная иммунизирующая доза рекомбинантного ПА для мышей линии BALB/c составляет 10 мкг, для морских свинок - 25 мкг, для кроликов - 50 мкг.
На модели линейных мышей нами также установлено, что изменение схемы иммунизации за счет повышения кратности введения препарата не приводит к увеличению протективности. У линейных мышей, иммунизированных трехкратно (с одинаковым интервалом в 14 дней) 10 мкг ПА, показатель ЛД50 составил 1,9 · 104 спор, индекс иммунитета - 39,8. При двукратной схеме иммунизации той же дозой ПА индекс иммунитета был равен 158,5. Принципиальным моментом оценки эффективности создаваемых вакцин является определение продолжительности создаваемого ими иммунитета. Нами показано, что иммунизация линейных мышей, морских свинок и кроликов препаратом ПА, полученного из генно-инженерного продуцента B. anthracis 55DТПА-1(Spo-), стимулирует развитие иммунного ответа с относительно высокими титрами анти-ПА антител в период от 2 до 4,5 месяцев (срок наблюдения). Зарегистрированные значения существенно превышали титры специфических антител у животных, вакцинированных B. anthracis СТИ-1. Протективную активность в отдаленные сроки исследовали на модели линейных мышей. Лабораторных животных иммунизировали двукратно препаратом ПА в дозе 10 мкг в сочетании с адъювантом. Заражение тест-штаммом B. anthracis 71/12 осуществляли через 21 день (первая группа), 2 месяца (вторая группа) и 4 месяца (третья группа) от последней инъекции антигенного препарата. Значение ЛД50 заражающего штамма для мышей первой группы составило 1,9 · 104 (3981100000) спор, второй группы - 1,2 · 104 (158563096) спор, третьей группы - 1,0 · 104 (199550119) спор. Индекс иммунитета в случае заражения биомоделей через 21 день был равен 39,8, через два месяца - 25,1, через четыре месяца - 19,9.
На следующем этапе определяли оптимальные компонентные составы прототипов химических сибиреязвенных вакцин. Основываясь на совокупности результатов проведенных нами экспериментов, прототип химической сибиреязвенной вакцины обязательно должен содержать очищенный ПА, синтезированный генно-инженерным штаммом B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-). Кроме того, в его состав целесообразно включить белок S-слоя ЕА1. Однако для снижения антигенной нагрузки на макроорганизм в комбинированном препарате дозу ЕА1 целесообразно уменьшать в 2 раза относительно содержания ПА. Обычно вакцины на основе высокоочищенных гомогенных продуктов требуют включения в рецептуру веществ, неспецифически усиливающих иммунный ответ на антигены (Perrier Y. et al., 2008; Mbow M. et al., 2010). Мы также исходили из необходимости добавления адъюванта к препарату рекомбинантного ПА во всех экспериментах по изучению его протективности. При использовании комплексного препарата ПА с ЕА1 в иммунизирующую смесь также вносили полный адъювант Фрейнда, так как наличие у белков S-слоя иммуномодулирующих свойств, как оказалось, не исключает потребности в адъюванте. Особенно четко эта особенность прослеживалась в экспериментах на морских свинках. Равному количеству животных (по 20 морских свинок в группе) вводили по 25 мкг ПА и 10 мкг ЕА1. В одном случае сочетание антигенов смешивали с равным объемом адъюванта, в другом адъювант не использовали. В первом варианте показатель ЛД50 составил 1,9 · 106 спор тест-штамма, индекс иммунитета - 398,1. Во втором значение ЛД50 было существенно ниже - 1,2 · 104 спор, индекс иммунитета - 2,5. Использование адъювантов, разрешенных для использования у людей - альгидрогеля, монофосфорилированного липида А, является одной из перспектив нашей работы.
На модели морских свинок тестировали комбинированную схему иммунизации. Лабораторным животным сначала вводили 5 · 106 спор штамма B. anthracis СТИ-1, а в конце поствакцинального периода (через 21 день) 25 мкг очищенного рекомбинантного ПА в сочетании с адъювантом. В этом случае значение ЛД50 регистрировали на уровне 1,7 · 107 спор, индекс иммунитета составил 3548,0. Значение ЛД50 тест-штамма для биомоделей, вакцинированных B. anthracis СТИ-1 в дозе 5 · 107 спор, оказалось 2 · 107 спор, а в дозе 5 · 106 спор - 3,1 · 106 спор. Следовательно, индексы иммунитета у животных, иммунизированных по комбинированной схеме, а также вакцинным штаммом в дозе 5 · 107 спор, были почти одинаковыми - 3548,0 и 3980,1. Полученные результаты свидетельствуют о возможности уменьшения вводимой дозы вакцинного штамма на порядок при дополнительной однократной иммунизации рекомбинантным антигеном. Таким образом, комплекс проведенных нами исследований подтверждает перспективность использования протективного антигена, полученного из аспорогенного штамма B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-), в качестве основного компонента прототипа химической сибиреязвенной вакцины. ВЫВОДЫ
1. Установлено, что для эффективной продукции протективного антигена культивирование аспорогенного штамма B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-) необходимо осуществлять в течение 16 часов в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера), обогащенной триптоном. В оптимизированных условиях рекомбинантный штамм синтезирует около 640 мкг/мл иммуногенного белка, что в 20 раз больше продукции протективного антигена вакцинным штаммом B. anthracis СТИ-1.
2. Высокий уровень продукции протективного антигена рекомбинантным штаммом B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-) является следствием отсутствия в его геноме негативного регулятора синтеза протективного антигена pagR и увеличения числа копий кодирующего гена pag за счет мультикопийности векторной плазмиды pUB110PA-1.
3. Показано, что у лабораторных животных, иммунизированных двукратно препаратом протективного антигена, происходит более интенсивное антителообразование по сравнению с биомоделями, вакцинированными однократно B. anthracis СТИ-1 (с превышением титров анти-ПА антител до 30 раз - для линейных мышей и морских свинок, и до 20 раз - для кроликов). Максимальные количества антител к протективному антигену регистрируются у кроликов через 1 месяц после начала иммунизации (титр 1/128000), у морских свинок - через 2,5 месяца (титр 1/40000), у мышей линии BALB/c - через 2 месяца (титр 1/40000). 4. Показано, что двукратная иммунизация мышей линии BALB/c и морских свинок рекомбинантным протективным антигеном (в дозировке 10 и 25 мкг, соответственно, в сочетании с адъювантом) обеспечивает эффективную защиту от заражения тест-штаммом B. anthracis 71/12. Значения ЛД50 тест-заражающего штамма для иммунизированных и интактных морских свинок различаются на четыре порядка, для иммунизированных и интактных линейных мышей - на два порядка. Индексы иммунитета антигенного препарата и B. anthracis СТИ-1 для конкретного вида лабораторных животных сопоставимы.
5. Установлено, что на модели мышей линии BALB/c белок S-слоя сибиреязвенного микроба ЕА1 при совместном введении с рекомбинантным протективным антигеном стимулирует выработку анти-ЕА1 антител и повышает индекс иммунитета в 2,5 раза. 6. Определены компонентные составы прототипов химических сибиреязвенных вакцин и иммунизирующие дозы для разных видов биомоделей. Препарат очищенного протективного антигена, синтезированного генно-инженерным штаммом B. anthracis 55∆ТПА-1(Spo-), эффективен в сочетании с адъювантом или с адъювантом и белком S-слоя ЕА1. Оптимальная иммунизирующая доза рекомбинантного протективного антигена для мышей линии BALB/c составляет 10 мкг, для морских свинок - 25 мкг, для кроликов - 50 мкг. 7. Определена возможность уменьшения на порядок дозы живой сибиреязвенной вакцины B. anthracis СТИ-1 (до 5 · 106 спор для морских свинок) при дополнительной однократной иммунизации препаратом рекомбинантного протективного антигена (25 мкг для морских свинок) в сочетании с адъювантом.
8. При подкожном пути введения препарат рекомбинантного протективного антигена не токсичен в дозах 50 мкг - для линейных мышей, и 100 мкг - для морских свинок. Рекомбинантный протективный антиген и белок ЕА1 не оказывают влияния на пролиферативную активность клеток тимуса и селезенки лабораторных животных и не индуцируют гибель тимоцитов и спленоцитов по типу апоптоза. Введение препаратов, содержащих рекомбинантный протективный антиген и белок S-слоя ЕА1, приводит к достоверному увеличению экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 6 типов на тимоцитах и спленоцитах мышей линии BALB/c. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Щуковская Т.Н., Козлова Е.А., Саяпина Л.В., Осина Н.А., Попова П.Ю., Кутырев В.В. Оптимизация экстренной и специфической профилактики особо опасных инфекций: новые перспективы // Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы Всеросс. науч.-практ. конф. - Москва, 2008. - С. 129.
2. Попова П.Ю., Микшис Н.И. Определение защитных свойств протективного антигена, синтезируемого рекомбинантными штаммами B. anthracis // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Матер. науч.-практ. школы-конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2010. - С. 296-298. 3. Попова П.Ю., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Гончарова А.Ю., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Каштанова Т.Н., Попов Ю.А. Изучение способности протективного антигена, синтезируемого генно-инженерными штаммами B. anthracis, вызывать развитие адаптивного иммунитета у лабораторных животных // Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями: Матер. междунар. конф./ под ред. А.Б. Жебруна. - СПб.: ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, 2010. - С. 128. 4. Попова П.Ю., Гончарова А.Ю., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Попов Ю.А. Иммуногенная активность поверхностных антигенов возбудителя сибирской язвы // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: Матер. X Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Ставрополь, 2010. - С. 261-262. 5. Попова П.Ю., Микшис Н.И., Гончарова А.Ю., Кудрявцева О.М., Попов Ю.А. Изучение иммуногенности сибиреязвенного рекомбинантного протективного антигена на модели морских свинок // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Матер. III науч.-практ. школы-конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2011.- С. 332-335.
6. Микшис Н.И., Попова П.Ю., Гончарова А.Ю., Кудрявцева О.М., Новикова Л.В., Каштанова Т.Н., Живова Ю.Н., Попов Ю.А., Щуковская Т.Н., Кутырев В.В. Прототип сибиреязвенной химической вакцины на основе рекомбинантного протективного антигена // Материалы Х съезда ВНПОЭМП "Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации". - Москва, 2012. - Инфекция и иммунитет. - Т. 2. - № 1-2. - С. 105.
7. Микшис Н.И., Попова П.Ю., Кудрявцева О.М., Гончарова А.Ю., Попов Ю.А., Кутырев В.В. Иммуногенность протективного антигена, выделенного из аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунопрофилактики. - 2011. - №1. - С. 44-48. (журнал из перечня ВАК).
8. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Гончарова А.Ю., Попова П.Ю., Живова Ю.Н., Попов Ю.А. , Кутырев В.В. Оценка эффективности продукции протективного антигена аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis // Биотехнология. - 2011 - №5. - С. 38-43. (журнал из перечня ВАК).
9. Попова П.Ю., Микшис Н.И., Щуковская Т.Н., Попов Ю.А. Взаимодействие возбудителя сибирской язвы с паттерн-распознающими рецепторами врожденного и адаптивного иммунитета // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 4 (110). - С. 12-17. (журнал из перечня ВАК).
10. Попова П.Ю., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Гончарова А.Ю., Новикова Л.В., Каштанова Т.Н., Попов Ю.А., Смолькова Е.А., Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н. Влияние протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis, на иммунную систему экспериментальных животных // Проблемы особо опасных инфекций. - 2012. - Вып. 1 (111). - С. 84-87. (журнал из перечня ВАК).
2
2
Документ
Категория
Медицинские науки
Просмотров
84
Размер файла
414 Кб
Теги
кандидатская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа