close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Исследование нейропротекторных свойств фуллеренов С60 на модели болезни Альцгеймера у крыс

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Макарова Екатерина Григорьевна Шифр научной специальности: 03.03.01 - физиология Шифр диссертационного совета: Д 002.093.01 Название организации: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН Адрес организации: 142290, г.П
На правах рукописи
Макарова Екатерина Григорьевна
ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ ФУЛЛЕРЕНОВ С60 НА МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
У КРЫС
03.03.01 - физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пущино - 2012
Работа выполнена в лаборатории системной организации нейронов им. О.С. Виноградовой Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук и Пущинском Государственном естественно-научном институте, г. Пущино.
Научный руководитель:кандидат медицинских наук Подольский Игорь Яковлевич
Научный консультантдоктор биологических наук
Гордон Рита Яковлевна
Официальные оппоненты:доктор биологических наук
Полетаева Инга Игоревна
(в.н.с. кафедры ВНД биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва)
кандидат биологических наук
Гудков Сергей Владимирович
(с.н.с. лаборатории изотопных исследований ИТЭБ
РАН, г.Пущино)
Ведущая организация:Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук, Москва.
Защита состоится " 30 " мая2012 г. в __15-30___ на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН.
Автореферат диссертации разослан " " 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
к.ф.-м.н.Ланина Н.Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Болезнь Альцгеймера (БА) - наиболее распространенное нейродегенеративное заболевание людей пожилого и старческого возраста, которое характеризуется прогрессивным нарушением памяти и деменцией. Одним из ключевых факторов в патогенезе БА являются бета-амилоидные пептиды (Aβ) 39-43, которые образуются в результате последовательного внутримембранного амилоидогенного протеолиза белка предшественника бета-амилоида β- и γ- секретазами. В норме тоже образуются эти пептидные фрагменты, однако при патологии их концентрация сильно возрастает, они начинают полимеризоваться и приобретают токсические свойства. Нейротоксическое действие растворимых олигомеров Aβ и их фибрилл приводит к гибели синапсов и нейронов в гиппокампе и неокортексе (Haass and Selkoe, 2007; Selkoe, 2008; Citron, 2010).
Существенный вклад в патогенез ранних стадий БА вносит окислительный стресс, индуцированный Aβ (Kaminsky et al., 2010; Степаничев и Гуляева, 2010; Nunomura et al., 2001), основной мишенью которого являются компоненты белкового синтеза (мРНК, рибосомы, тРНК и хроматин) (Shan et al., 2007; Ding et al., 2007).
Одним из ранних симптомов БА является прогрессирующее нарушение оперативной и эпизодической памяти, в том числе пространственной памяти (Burgess et al., 2001; Lindeboom and Weinstein, 2004). На моделях БА широко применяется изучение пространственной памяти в водном лабиринте Морриса с использованием разнообразных протоколов обучения (Morris, 2001; Chen et al. 2000; D'Hooge and De Deyn, 2001; Bast et al., 2009; Подольский и Щеглов, 2004; Podolski et al., 2007).
Ни одна из современных экспериментальных моделей БА не является универсальной. Введение в центральную нервную систему (в желудочки мозга, непосредственно в гиппокамп или в кору) агрегированного бета-амилоидного пептида или его токсического фрагмента Аβ25-35 позволяет исследовать непосредственно его действие на морфофункциональное состояние нейронов и когнитивные процессы (Selkoe, 2008; Stepanichev et al., 2000). Исследование ранних нейротоксических эффектов центрального введения Aβ играет важную роль в понимании патогенеза БА и представляет большой интерес для изучения антиамилоидного действия лекарственных средств (Fiala, 2007; Haass and Selkoe, 2007; Makarova et al., 2011; Podolski et al., 2010; Nie et al., 2010).
Лечение БА - наиболее сложная проблема психиатрии и неврологии. Несмотря на интенсивные исследования многих ведущих лабораторий мира лекарства, тормозящие развитие или вызывающие долговременные ремиссии БА отсутствуют. Новым направлением в разработке лекарств для лечения БА являются фуллерены С60. Международные фармацевтические компании, C Sixty and Merck Co., начали разработку на основе фуллеренов антиоксидантов и лекарств для терапии болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний (Small times magazine, 2007). Одними из наиболее перспективных являются подходы, нацеленные на создание антиамилоидных лекарственных веществ, предупреждающих образование и агрегацию Aβ (Citron, 2010; Scherzer-Attali et al., 2010). Однако фуллеренам не уделялось внимание в этих исследованиях.
Фуллерены C60 - углеродные наночастицы с уникальными физико-химическими и биологическими свойствами. Одним из основных биологических свойств C60 является способность присоединять реактивные формы кислорода и вести себя как "губка свободных радикалов" (Krusic et al., 1991; Piotrovsky and Kiselev, 2006; Andrievsky et al., 2009; Ali et al., 2008). В ряде работ показано, что фуллерены накапливаются в печени, селезенке и других органах экспериментальных животных (Yamago et al, 1995; Bullard-Dillard et al, 1996; Kubota et al, 2011). Фуллерены могут выводиться из организма (Yamago et al, 1995; Gharbi et al., 2005). Фуллерены действуют на разнообразные клеточные и молекулярные мишени (Piotrovsky and Kiselev, 2006; Dugan et al., 1997; Huang et al., 2000).
Флуоресцентный анализ in vitro показал, что производное фуллерена эффективно снижает агрегацию Aβ1-40. Авторы объяснили такой эффект связыванием фуллереном центрального гидрофобного мотива Aβ KLVFF (Kim and Lee, 2003). Недавно методом высокоразрешающей электронной микроскопии было показано, что фуллерены C60 способны предотвращать агрегацию и разрушать Aβ25-35 и Aβ1-42 фибриллы (Подлубная и др., 2006; Podolski et al., 2007; Бобылев и др., 2010; Bobylev et al., 2011). Эти данные позволили нам предположить, что Aβ пептиды представляют собой одну из мишеней для фуллерена (Podolski et al., 2010). Однако не было известно, будут ли фуллерены защищать нейроны от токсического действия Aβ in vivo.
Таким образом, многие принципиальные вопросы остаются открытыми. Действие фуллеренов С60 на экспериментальных моделях БА in vivo не были изучены. Особый интерес представляет исследование действия фуллеренов на амилоидогенез, нейродегенерацию, синтез белка в нейронах и состояние пространственной памяти на ранних стадиях действия Аβ.
Цели и задачи исследования
Целью работы являлось исследование способности водорастворимого фуллерена С60 предупреждать нейротоксичность бета-амилоида in vivo.
Задачи исследования:
1.Исследовать влияние предварительного введения С60HyFn на пространственную память при случайном положении цели в водном лабиринте Морриса, морфологическое состояние пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа и синтез белка в этих нейронах, нарушенные на ранней стадии после интравентрикулярного введения агрегированного Аβ25-35 у крыс.
2.Исследовать влияние предварительной инкубации переживающих срезов гиппокампа в среде, содержащей С60HyFn, на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа, нарушенное инкубацией с Аβ25-35.
3.Исследовать влияние предварительного введения С60HyFn на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа и синтез белка в этих нейронах, нарушенные на ранней стадии после интрагиппокампальной микроинъекции Аβ25-35.
4.Исследовать влияние предварительного введения С60HyFn на пространственное обучение и память, нарушенные в результате интрагиппокампальной микроинъекции Аβ1-42.
Научная новизна
Впервые обнаружено, что предварительное введение водорастворимого фуллерена С60 в гиппокамп предупреждает сильные нарушения пространственной памяти, развитие нейродегенерации, образование депозитов Аβ и нарушение синтеза белка пирамидных нейронов гиппокампа, вызванные интрагиппокампальной микроинъекцией агрегированного Аβ.
Показана разная динамика нарушения синтеза белка, морфологических изменений, образования депозитов Aβ в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа и нарушения пространственной памяти после интравентрикулярной и интрагиппокампальной микроинъекций агрегированного Aβ. Продемонстрировано, что интрагиппокампальное введение Aβ приводит к более раннему развитию выраженных нейродегенеративных и когнитивных нарушений, чем интравентрикулярное введение.
Научно-практическая значимость работы
Полученные результаты показали, что С60 гидратированный фуллерен (С60HyFn) предупреждает нарушение пространственной памяти, развитие нейродегенерации и нарушение синтеза белка пирамидных нейронов гиппокампа, вызванные интрагиппокампальной микроинъекцией Аβ. Эти результаты подтверждают заключение нашей группы, что водорастворимые фуллерены С60 представляют чрезвычайный интерес для разработки эффективной профилактики и терапии БА.
Показано преимущество интрагиппокампальной микроинъекции Aβ для исследования ранних цитологических нарушений в гиппокампе и нарушения когнитивных функций по сравнению с интравентрикулярным введением.
Обнаружено, что нарушение синтеза белка пирамидных нейронов гиппокампа, вызванное интрагиппокампальной микроинъекцией Aβ, происходит гораздо раньше проявления других нейротоксических свойств Aβ и, по-видимому, связано с развитием окислительного стресса.
Материалы диссертационной работы вошли в учебный видеофильм "Нейрон и Память", ред. Ф.А. Филиппов, А.М. Черноризов. Министерство образования и науки России, Тюмень-Москва, 2009. http://www.eurasion.ru/
Апробация диссертации
Основные положения диссертации доложены на 7-ом и 8-ом Международных симпозиумах "Фуллерены и Атомные кластеры" (Санкт-Петербург, 2005, 2007), конференциях по программе Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" (Москва, 2006, 2007, 2010). Международном симпозиуме "Гиппокамп и память" (Пущино, 2006), Всероссийской конференции с международным участием "Гиппокамп и память: норма и патология (Пущино, 2009), 37-ом Neuroscience Meeting, (Сан-Диего, Калифорния, 2007), 6-ом Международном Форуме FENS Forum of European Neuroscience (Женева, Швейцария, 2008), III и VII Международных и Междисциплинарных Конгрессах "Нейронаука для медицины и психологии" (Судак, Украина, 2007, 2011), Всеукраинской конференции "Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии" (Днепропетровск, 2008), Международном форуме "Rusnanotech" (Москва, 2010), 9-ой Международной конференции AD/PD "Alzheimer's and Parkinson's Diseases: Advances, Concepts and New Challenges" (Прага, Чехия, 2009), 1-ой Международной научной школе "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах" (Москва, 2009), 10-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука ХХI века" (Пущино, 2006).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ___ страницах, иллюстрирована ___ рисунками и ___ таблицами. Список литературы включает ___ источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследований
Животные
Исследование выполнено на 204 взрослых (3 месяца) и 25 старых (20 месяцев) самцах крыс Вистар, выращенных в питомнике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН и содержащихся в стандартных условиях при свободном доступе к пище и воде, с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕС).
Вещества и способы введения
Аβ25-35, Аβ1-42 или Аβ35-25 (Sigma, USA) растворяли в стерильной воде в концентрации 1,6 нмоль/мкл, 0,4 нмоль/мкл и 1,6 нмоль/мкл соответственно и инкубировали в течение 24 часов при температуре 37˚С. Формирование фибриллярных агрегатов подтверждали визуально методом электронной микроскопии (х50000) в лаборатории "Структуры и функций мышечных белков". Высоко стабильный водный коллоидный раствор фуллерена С60HyFn был получен в Институте физиологически активных соединений по методу Г.В. Андриевского в концентрации 0,46 нмоль/мкл. В соответствии с эти методом фуллерен был перенесен из органического растворителя в водную фазу при помощи обработки ультразвуком без использования солюбилизаторов и стабилизаторов. Растворы C60HyFn, в зависимости от концентрации, содержат как единичные молекулы C60HyFn, так и их лабильные кластеры размером 3-72 нм. Ультрафиолетовый спектр препарата приведен на рисунке 1. Препарат сохраняет стабильность в течение нескольких лет (Andrievsky et al., 1995).
В качестве контроля использовали 0,9%-ый раствор NaCl и нетоксичный пептид Aβ35-25.
Рисунок 1. Ультрафиолетовый спектр C60HyFn - типичный спектр фуллерена С60 в воде (коллоидные растворы) (Andrievsky et al., 2002).
Операции осуществляли в стереотаксическом аппарате в стерильных условиях под комбинированным наркозом. Вещества вводили однократно билатерально по следующим координатам: поле СА1 дорзального гиппокампа, АР = -4 мм; L = ± 3 мм; Н = 3 мм или боковые желудочки мозга, АР = -0,8 мм; L = ± 1,5 мм; Н = 3 мм (Paxinos and Watson, 1982). С60HyFn вводили за два часа до введения Аβ в тех же концентрациях. Для гистологических исследований декапитация проводилась на 14-ый, 30-ый или 45-ый день после интравентрикулярного введения и на 2-ой, 7-ой и 14-ый день после интрагиппокампального введения. Локализация мест инъекций веществ осуществлялась на 40 мкм парафиновых срезах гиппокампа, окрашенных крезиловым фиолетовым.
Изучение пространственной памяти начинали на 14-ый, 30-ый или 45-ый день после интравентрикулярного введения и на 14-ый день после интрагиппокампального введения.
Переживающие срезы
Эксперименты выполнены на гиппокампальных срезах толщиной 300 мкм от 18 животных. Введение веществ в перфузионную среду осуществлялось в следующих экспериментах: (1) Контроль, в перфузионную среду вещества не вводились, n=6; (2) Аβ25-35 в концентрации 2 × 10-7 M (Chen et al., 2000), n=6; (3) С60HyFn в концентрации 10-7 M до введения Аβ25-35, n=6. Длительность перфузии каждого вещества составляла 20 минут.
Приготовление образцов ткани
После декапитации часть мозга фиксировали в фиксаторе Карнуа (этанол - хлороформ - уксусная кислота 6:3:1 соответственно), другую часть мозга фиксировали в 4% параформальдегиде на PBS, рН 7,4 и заключали в парафин. Фронтальные срезы толщиной 7 мкм использовали для световой и флуоресцентной микроскопии. Все морфологические исследования проводились на пирамидных клетках поля СА1 дорзального гиппокампа, поскольку они составляют основную массу нейронов поля СА1 (Monje et al., 2000).
Исследование состояния рРНК
Для исследования состояния рРНК в цитоплазме нейронов был использован метод окрашивания акридиновым оранжевым (АО) (Fluka Chemia AG, Buchs, Switzerland) в условиях оптимального взаимодействия красителя с РНК. После депарафинирования и регидратации срезы промывали в цитратно-фосфатном буфере в течение 4 минут, окрашивали АО в концентрации 3 × 10-4 М в цитратно-фосфатном буфере, рН 4,2 в течение 10 минут по методике, описанной ранее (Gordon et al., 1997). Измерения проводились на микроспектрофлуориметре ДМФ-2 (Пущино, Россия) (Карнаухов, 2001). Флуоресценция измерялась только в цитоплазме с помощью зондов диаметром 6,5 мкм и объектива ×85. Измерения и обработка данных проводились с использованием программного обеспечения Microfluor (Пущино, Россия).
Для анализа цитоплазмы использовался коэффициент K=(I640)/(I530), представляющий собой отношение интенсивностей красной и зеленой флуоресценции при окрашивании АО. Мономеры АО образуют комплексы с двунитевыми участками РНК, которые флуоресцируют в области 530 нм (I530), а димеры АО связываются с однотяжевыми участками РНК и флуоресцируют в области 640 нм (I640). Ранее было показано, что K отражает состояние рРНК в рибосомах и коррелирует с долей активно функционирующих рибосом (полирибосом) по отношению к неактивным моносомам, что позволяет оценить интенсивность белкового синтеза. (Gordon et al., 1997). Измерения проводили в отдельной клетке, исследовали по 100 пирамидных клеток поля СА1 гиппокампа каждой крысы.
Световая микроскопия и иммуногистохимия
Дегенерацию нейронов выявляли окрашиванием срезов 0,25% крезиловым фиолетовым (Fluka, USA) (по Нисслю). Иммуногистохимическое исследование было выполнено по стандартной процедуре (Gong et al., 2005; Nie et al., 2010). Срезы инкубировали с первичными кроличьими поликлональные антителами: анти - Аβ1-42 (1:1000, Sigma, USA) при температуре +4º в течение 15 часов. Затем срезы инкубировали с вторичными козьими биотинилироваными анти-кроличьими антителами (1:800, Sigma, USA) в течение 1,5 часов при температуре +37º и стрептавидин/пероксидазным комплексом (1:800, Sigma, USA) в течение 1,5 часов при температуре +37º. Иммуногистохимическую реакцию визуализировали 0,06% раствором 3,3'-диаминобензидина (Sigma, USA). В качестве негативного контроля первичные антитела заменяли буфером.
Для количественного анализа проводили подсчет морфологически интактных пирамидных клеток поля СА1 гиппокампа для срезов, окрашенных крезиловым фиолетовым и пирамидных клеток поля СА1, содержащих в цитоплазме депозиты Аβ1-42, для иммуногистохимии. Критерием отбора являлись морфологически интактные нейроны поля СА1 со следующими характеристиками: равномерно окрашенная цитоплазма и нуклеоплазма, четкая плазматическая и ядерная мембраны, хорошо определяемое ядрышко. Подсчет нейронов выполняли с использованием микрофотографий (25-30 от каждого животного) полученных с помощью цифровой камеры, соединенной с микроскопом Axio Imager M1optical (Zeiss, Germany) (объектив ×40) и программного обеспечения Image J 1.44 (USA) на площади 200×50 мкм (0,01 мм2).
Исследование пространственной памяти в водном лабиринте Морриса
Водный лабиринт Морриса представлял собой круглый бассейн диаметром 140 см, высотой 50 см, заполненный на 30 см непрозрачной водой (t=21±1°C). В тесте на пространственное обучение с одной пробы внелабиринтными ориентирами служили две лампы по 40 Вт, расположенные в противоположных концах комнаты. В нашей модификации метода бассейн был разделен на 8 виртуальных секторов и кольца Т (зона тигмотаксиса - от греч. thigma - прикосновение и taxis - расположение - виртуальная зона в районе бортиков бассейна), C, B, А, что позволяло более детально анализировать траекторию движения животного. Остальные детали методики были такими же, как в стандартном тесте Морриса (Morris, 1984).
Установка состояла из водного бассейна, персонального компьютера, видеокамеры, установленной над бассейном и подключенной к компьютеру, и оригинальной программы А.А. Деева, которая фиксировала крысу и строила траекторию движения в каждой пробе. Табличные результаты анализа включали длину пройденного пути, среднюю скорость движения, время решения задачи, а также время пребывания в каждом секторе и кольце.
Крысу помещали в воду вблизи стенки бассейна в один из восьми виртуальных секторов. Пространственное обучение тестировалось с использованием двух протоколов обучения.
Вероятностная задача
Пространственное обучение тестировалось с помощью нового когнитивного теста (Подольский и Щеглов 2004; Щеглов и др., 2003; Podolski et al., 2007; Mugantseva and Podolski, 2009). Животные должны были запомнить пространство в виде кольца, в котором локализация цели изменялась псевдослучайным образом. Каждый сеанс навигационного обучения состоял из 4 проб. Продолжительность пробы была 120 с. Через 60 с крысу удаляли с платформы и через 2-3 с помещали в воду. Каждый последующий сеанс повторялся через 24 часа после предыдущего. Через 24 ч после последнего сеанса обучения проводили тест на сохранение пространственной информации. Тест на сохранение информации состоял в следующем: платформу убирали из бассейна и регистрировали траекторию движения крысы в течение 60 с. Тест на сохранение считался положительным, если время пребывания животного в заданном пространстве, статистически значимо превышало случайное значение времени в заданном кольце (Steele and Morris, 1999; Bast et al., 2009).
Тест на пространственное обучение с одной пробы
Стилом и Моррисом был разработан тест на оперативную пространственную память Delayed Matching-to-Place (DMP): в первой пробе каждого сеанса положение платформы изменялось случайным образом и не изменялось в последующих пробах. Интервал между сеансами составлял 24 часа. Длительность пробы была равна двум минутам. Каждый сеанс навигационного обучения состоял из 4 проб. На платформе крыса находилась 30 секунд. Поскольку во второй пробе теста DMP время решения задачи сокращалось в несколько раз, авторы теста сделали заключение о том, что пространственное обучение происходит с первой пробы (Steele and Morris, 1999). На трансгенных моделях болезни Альцгеймера было показано нарушение оперативной памяти в этом тесте (Chen et al., 2000).
Мы модифицировали протокол DMP: увеличили длительность пробы с двух до пяти минут и ввели семи дневные перерывы между сеансами обучения. При двух минутной длительности пробы, крысы часто не могли находить платформу в первой пробе, и экспериментатор направлял их к платформе. По нашему мнению представляется очень существенным изучить поиск платформы без участия экспериментатора. Введение перерывов с нашей точки зрения позволяет параллельно изучать эпизодическую и пространственную память.
Продолжительность обучения составляла пять сеансов. Положение платформы в первой пробе третьего, четвертого и пятого сеансов менялось случайным образом, так же как в тесте DMP. Интервал между пробами составлял 10 минут. Через 1,5 и 48 ч после второго, третьего, четвертого и пятого сеансов проверяли сохранение пространственной информации по методике, описанной ранее.
Эксперименты по изучению пространственного обучения с одной пробы начинались через 14 дней после интрагиппокампального введения на пяти группах животных: (1) введение 0,9% NaCl (первый контроль); (2) введение нетоксичного Аβ35-25 (второй контроль); (3) введение С60HyFn; (4) введение Аβ1-42; (5) введение С60HyFn за 2 часа до введения введение Аβ1-42.
В качестве стандартного критерия обучения использовали время решения задачи (латентный период) и проводили описание траектории движения крысы в каждом сеансе.
Статистический анализ
Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий средних значений оценивалась по t-критерию Стьюдента. Изменения считались статистически значимыми при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Влияние предварительного введения С60HyFn на пространственную память при случайном положении цели в водном лабиринте Морриса, морфологическое состояние пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа и синтез белка в этих нейронах у взрослых и старых крыс на ранней стадии после интравентрикулярного введения Аβ25-35.
Согласно литературным данным введение Аβ в латеральные желудочки мозга вызывало гибель нейронов в поле СА1, окислительный стресс и нарушение пространственной памяти (Nitta et al., 1994; Delobette et al., 1997; Stepanichev et al., 2004; Степаничев и др., 2004; Степаничев и Гуляева, 2010).
В тестах с использованием стандартного протокола Морриса во многих случаях не были выявлены нарушения пространственной памяти при центральном введении Аβ и на трансгенных моделях БА (Chen et al., 2000; Harkany et al., 1998, Morris, 2001). Поэтому первая задача, которую мы поставили, было применение модели пространственной памяти при случайном положении цели, разработанной в нашей группе (Подольский и Щеглов 2004; Щеглов и др., 2003; Podolski et al., 2007; Mugantseva and Podolski, 2009).
1.1. Влияние предварительного введения С60HyFn на пространственную память при случайном положении цели в водном лабиринте Морриса у взрослых и старых крыс на ранней стадии действия Аβ25-35.
Для исследования ранних токсических свойств бета-амилоида животным в боковые желудочки мозга вводили Аβ25-35 в концентрации 22,5 нмоль/ 15 мкл. В контроле вводили 0,9% NaCl.
Исследование пространственной памяти проводили в водном лабиринте Мориса в новом когнитивном тесте при случайном положении цели на следующих группах животных: взрослые крысы Вистар через 14 дней (контроль, n = 8; введение Аβ25-35, n = 10), взрослые крысы Вистар через 30 дней (контроль, n = 10; введение Аβ25-35, группа необучившихся крыс, n = 16; введение Аβ25-35, группа обучившихся крыс, n = 13), старые крысы Вистар через 45 дней (контроль, n = 7; введение Аβ25-35, группа необучившихся крыс, n = 9; введение Аβ25-35, группа обучившихся крыс, n = 6).
В новом когнитивном тесте применялся протокол обучения, в котором местоположение платформы менялось псевдослучайным образом в каждой пробе, при этом платформа всегда располагалась на равном расстоянии от стенок бассейна. Поэтому животному необходимо было запомнить пространство в виде кольца и расстояние от бортиков.
В контроле все группы животных обучились в новом когнитивном тесте. В тесте на сохранение памяти происходило сохранение пространственной информации. Крысы Вистар через 14 дней после интравентрикулярного введения Аβ25-35 достоверно обучились только в четвертом сеансе, во втором и третьем сеансах обучались гораздо медленнее контроля (рис. 2, А). В тесте на сохранение памяти нарушений не происходило (рис. 2, Б).
Через 30 дней после интравентрикулярного введения Аβ25-35 наблюдались индивидуальные различия при обучении крыс Вистар в четвертом сеансе: 55% крыс Вистар обучились, а у 45% животных никаких нарушений не происходило (рис. 2, А). При этом в тесте на сохранение нарушения не наблюдались (рис. 2, Б).
Старые крысы Вистар (20 месяцев) обучались в пяти сеансах, длительность пробы составляла 60 с. Через 45 дней после интравентрикулярного введения Аβ25-35 у старых крыс Вистар также наблюдались индивидуальные различия: у 60 % животных наблюдались грубые нарушения пространственной памяти, достоверные различия с контролем в третьем, четвертом и пятом сеансах (p < 0,05), а у 40% никаких нарушений не происходило (рис. 2, А). Однако нарушение сохранения информации происходило, и у обучившихся и у необучившихся крыс (достоверные различия с контролем, p < 0,05) (рис. 2, Б).
Рисунок 2. А. Кривые обучение крыс Вистар в новом когнитивном тесте при случайном положении цели через разные сроки после интравентрикулярного введения веществ. *- значимые различия между контролем (введение 0,9% NaCl) и опытом (введение Аβ25-35), p < 0,05.
Б. Сохранение пространственной информации в тесте без платформы. *- значимые различия между контролем (введение 0,9% NaCl) и опытом (введение Аβ25-35), p < 0,05. Пунктирной линией отмечено случайное значение времени в заданном кольце.
14 дней, 30 дней и 45 дней обозначают время начало поведенческих опытов после интравентрикулярного введения Аβ25-35 или 0,9% NaCl (контроль).
Применение теста на пространственную память при случайном положении цели не показало однозначных результатов и не позволило получить ясные результаты по влияние действия фуллеренов на нарушения, вызванные Аβ.
1.2. Влияние предварительного введения С60HyFn на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа и синтез белка в этих нейронах у взрослых и старых крыс на ранней стадии после интравентрикулярного введения Аβ25-35 Морфологические и гистохимические исследования проводились через 14, 30 и 45 дней на тех же группах животных после интравентрикулярного введения Аβ в той же концентрации, что и в предыдущем разделе.
Основную часть гиппокампальных СА1 нейронов составляют пирамидные клетки (Monje et al., 2000). Показано, что пирамидные клетки поля СА1 гиппокампа являются наиболее чувствительными к действию Аβ25-35 (Stepanichev et al., 2000; Nie et al., 2010).
В контроле в нейронах, окрашенных крезиловым фиолетовым, выявлялась равномерно окрашенная цитоплазма и нуклеоплазма, четкая плазматическая и ядерная мембраны, хорошо определяемое ядрышко (рис. 3, А, Б).
Рисунок 3. Микрофотографии гиппокампа (поле СА1), окрашенного крезиловым фиолетовым, А, Б - контроль (интактная крыса), В, Г - через 30 дней после микроинъекции Aβ25-35 (22,5 нмоль/ 15 мкл) в латеральные желудочки мозга.
Через 14 и 30 дней после введения Aβ25-35 морфологическая структура большинства пирамидных нейронов, окрашенных крезиловым фиолетовым, не отличалась от контроля на протяжении всего поля СА1, редко встречались темные и дегенеративные клетки у всех групп животных (рис. 3, В, Г). Это согласуется с литературными данными, в которых показано, что существенная гибель нейронов гиппокампа возникает примерно через три месяца после введения Аβ25-35 в латеральные желудочки мозга (Степаничев и др., 2004; Stepanichev et al., 2004) и сохраняется по меньшей мере в течении шести месяцев после инъекции (Stepanichev et al., 2000). Количественный анализ не выявил отличий числа морфологически интактных клеток после введения Aβ25-35 от контроля (0,9% NaCl). У старых животных через 45 дней после введения Аβ25-35 происходило значительное снижение числа морфологически интактных клеток на 37% по сравнению с контролем (р < 0,05), в результате появления в основной массе клеток поля СА1 нейродегенеративных признаков: разбухших клеток с выраженной вакуолизацией цитоплазмы.
Однако при окрашивании AO через 14 и 30 дней после введения Aβ25-35, было выявлено значительное снижение значения Kα, в пирамидных нейронах у всех животных (рис. 4). Ранее было показано, что Kα является индикатором интенсивности белкового синтеза и коррелирует с долей транслирующих полирибосом (Gordon et al., 1997). Введение 0,9% NaCl не вызывало изменений Kα, его значение не отличалось от интактного контроля.
Рисунок 4. Изменение величины коэффициента Kαэксперимент/Kαконтроль (где контроль - интактное животное), коррелирующего с изменением интенсивности белкового синтеза в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа после билатеральной микроинъекции Aβ25-35 в боковые желудочки мозга (22,5 нмоль/ 15 мкл). *- значимые различия между контролем (введение 0,9% NaCl) и экспериментом (введение Аβ25-35), p < 0,05. Исследования проводились на 100 клетках от каждого животного (n=9, в каждой группе животных, где n - количество животных).
Таким образом, после интравентрикулярного введения Аβ25-35 снижение белоксинтезирующей активности наблюдалось, и у взрослых и старых крыс Вистар. При этом у старых крыс происходило снижение количества морфологических интактных клеток в поле СА1. Нарушение пространственной памяти было обнаружено только у 60% старых крыс Вистар (20 месяцев).
В наших предварительных исследованиях было показано, что однократная интравентрикулярная микроинъекция С60HyFn предупреждала нарушение пространственной памяти (Podolski et al., 2007), снижение синтеза белка (Makarova et al., 2009) у отдельных животных. Такой результат мог быть связан с тем, что интравентрикулярное введение Аβ не вызывало постоянных нарушений памяти и морфологических изменений и в этом смысле было неподходящей моделью БА для исследования действия фуллерена.
2. Влияние предварительной инкубации переживающих срезов гиппокампа в среде, содержащей С60HyFn, на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа, нарушенное инкубацией с Аβ25-35.
Интравентрикулярная инъекция Аβ25-35 не привела к однозначным результатам. Чтобы исследовать прямое действие Аβ25-35 и действие предварительной инкубации с С60HyFn, предшествующее инкубации с Аβ25-35 на пирамидные нейроны поля СА1, была использована модель переживающих срезов гиппокампа.
При инкубации переживающих срезов в среде Кребса-Рингера (контроль) не происходило гибели клеток (рис. 5, А, Б). Инкубация переживающих срезов в среде, содержащей Aβ25-35, уже через 20 минут приводила к выраженной дегенерации пирамидных клеток поля СА1 (рис. 5, В, Г), количество морфологически интактных клеток снижалось на 73% (р < 0,05) (рис. 6). Предварительная инкубация переживающих срезов в среде с С60HyFn предупреждала развитие нарушений (рис. 5, Д, Е), число пирамидных нейронов поля СА1 сохранялось на уровне контроля (рис. 6).
Рисунок 5. Микрофотографии пирамидных нейронов дорзального гиппокампа (поле СА1), окрашенного крезиловым фиолетовым, после инкубации в течение 20 минут в контроле (А, Б) и в среде с Aβ25-35 (2×10-7 M) (В, Г), и предварительной инкубацией с С60HyFn (10-7 M) с последующим добавлением в среду Aβ25-35 (Д, Е).
Рисунок 6. Количественный подсчет числа морфологически интактных клеток дорзального гиппокампа крыс (поле СА1) в контроле (n=6), после инкубации с Aβ25-35 (2×10-7 M) (n=6) и после предварительной инкубации с С60HyFn (10-7 M) с последующим добавлением в среду Aβ25-35 (n=6). *- значимые различия между контролем (введение 0,9% NaCl) и экспериментом (введение Аβ25-35), p < 0,05.
3. Влияние предварительного введения С60HyFn на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа и синтез белка в этих нейронах у взрослых крыс на ранней стадии после интрагиппокампальной микроинъекции Аβ25-35.
Предварительная инкубация переживающих срезов в среде с С60HyFn предупреждала нейродегенерацию клеток поля СА1. Для исследования влияния предварительного введения С60HyFn на синтез белка и морфологическое состояние пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа in vivo, осуществляли микроинъекцию Аβ25-35 (1,6 нмоль/ 1 мкл) и С60HyFn (0,46 нмоль/ 1 мкл), предшествующую микроинъекции Аβ25-35 в поле СА1 дорзального гиппокампа и проводили морфологическое исследование пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа на 2, 7 и 14 день.
На 2-ой день после введения Aβ25-35. во всех пирамидных нейронах поля СА1 наблюдалось значительное снижение величины Кα (55% от значения в контроле) в морфологически интактных клетках (p < 0,05). Аналогичное явление имело место и на 14-й день после интравентрикулярного введения. Подчеркнем, что С60HyFn, предшествующий введению Aβ25-35, не вызывал изменений величины Кα (рис. 7). Ранее было показано, что Kα является индикатором интенсивности белкового синтеза и коррелирует с долей транслирующих полирибосом (Gordon et al., 1997). Методом электронной микроскопии после интравентрикулярной инъекции Aβ (Gordon et al., 2012), а также на культуре нейронов показано (Shan et al., 2007), что преобладание тяжелых полирибосом является причиной снижения белоксинтезирующей активности в исследуемых клетках.
Количественный анализ не выявил отличий числа морфологически интактных клеток на 2-ой день после введения Aβ25-35 или С60HyFn, предшествующий введению Aβ25-35 от контроля (0,9% NaCl) (рис. 8).
Рисунок 7. Значение коэффициента Kαэксперимент/Kαконтроль, (где контроль - интактное животное) коррелирующего с изменением интенсивности белкового синтеза в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа в контроле (n=6, где n - количество животных), после интрагиппокампальной микроинъекции Aβ25-35 (1,6 нмоль/ 1 мкл) (n=6) и после микроинъекции С60HyFn (0,46 нмоль/ 1 мкл, предшествующей введению Aβ25-35 (n=6). *- значимые различия между контролем (введение 0,9% NaCl) и экспериментом (введение Аβ25-35), p < 0,05. Исследования проводились на 100 клетках от каждого животного.
На ранних стадиях развития БА больший вклад в повреждение нейронов вносит окислительный стресс (Nunomura et al.; 2001; Ding et al., 2007; Shan et al., 2007; Su et al., 2008). Белковый синтез является одним из ранних клеточных процессов, наиболее уязвимых к окислительным повреждениям при БА (Ding et al. , 2007; Shan et al., 2007). Показано, что окислительный стресс индуцирует повышенной уровень экспрессии β- и γ- секретаз, как следствие образование эндогенного Аβ и сильную нейродегенерацию (Tong et al., 2005; Tamagno et al., 2005, 2008; Su et al., 2008). Основываясь на этих данных, мы предполагаем, что причиной снижения синтеза белка на первые дни после инъекции Аβ является окислительный стресс. Отсутствие изменений в белковом синтезе в случае инъекции C60HyFn, предшествующей Aβ, можно объяснить его антиоксидантным действием.
Рисунок 8. Количественный подсчет числа морфологически интактных клеток дорзального гиппокампа крыс (поле СА1) в контроле (n=6), после интрагиппокампальной микроинъекции Aβ25-35 (1,6 нмоль/ 1 мкл) (n=6) и после предварительной микроинъекции С60HyFn (0,46 нмоль/ 1 мкл), предшествующей введению Aβ25-35. *- значимые различия между контролем (введение 0,9% NaCl) и экспериментом (введение Аβ25-35), p < 0,05.
Через 14 дней после введения в гиппокамп Aβ25-35 на протяжении всего поля СА1 наблюдались многочисленные расплывчатые, нечеткие, а также полностью разрушенные клетки, значительное набухание и вакуолизация цитоплазмы, что является морфологическими признаками некроза (рис. 9, В, Г), в отличие от контроля (рис. 9, А, Б). Количественный анализ показал значительное снижение на 78% числа морфологически интактных нейронов после однократной интрагиппокампальной микроинъекции Aβ25-35 по сравнению с контролем (p < 0,05) (рис. 8). Микроинъекция C60HyFn, предшествующая введению Aβ, предупреждала массовую нейродегенерацию пирамидных клеток поля СА1 (рис. 9, Д, Е), число морфологически интактных нейронов было на уровне контроля (рис. 8). Величина Kα составила 148% от контроля, p < 0,05 (рис. 7). Значительное увеличение Kα в некротических клетках поля СА1 через 14 дней после введения Aβ25-35 является результатом деградации рРНК, а не увеличения белкового синтеза. Окрашивание АО в этом случае было неспецифическим, отражая степень деструкции рибосом, и как следствие повышение доступности рРНК к АО. При интрагиппокампальном введении C60HyFn, предшествующем введению Aβ, величина Kα оставалась на уровне контроля (рис. 7).
Иммуногистохимическое исследование выявило присутствие диффузных депозитов Aβ в цитоплазме всех пирамидных нейронов поля СА1 на 14 день. В контроле депозиты Aβ отсутствовали (рис. 10). Накопление Aβ в нейронах может происходить, как в результате проникновения экзогенного Aβ, вследствие повреждения клеточной мембраны, так и в результате формирования эндогенного Aβ (Klementiev et al., 2007; Nie et al., 2010). Однако в данной работе в цитоплазме нейронов накапливается, по-видимому, эндогенный Aβ, поскольку животным был введен A25-35, а в цитоплазме депозиты Aβ идентифицировались антителами к Aβ1-42. Рисунок 9. Микрофотографии поля СА1 крысы, окрашенного крезиловым фиолетовым после введения в гиппокамп А, Б - контроль; В, Г - Aβ25-35 (1,6 нмоль/ 1 мкл); Д, Е - С60HyFn (0,46 нмоль/ 1 мкл) с дальнейшим введением Aβ25-35. После введения С60HyFn, предшествующего введению Aβ25-35, не наблюдалось нарушений в большей части пирамидных клеток (рис. 9, Г, Д, Е), иммуноокрашивание наблюдалось только в 17% клеток по сравнению с введением Aβ25-35 (рис. 10). После введения 0,9% раствора NaCl или С60HyFn не наблюдалось отличий от контрольного уровня.
Aβ приводит к развитию окислительного стресса на ранних стадиях БА (Nunomura et al. , 2001; Ding et al., 2007; Shan et al., 2007; Su et al., 2008). На поздних стадиях накопление депозитов Aβ приводит к выраженной нейродегенерации (Su et. al., 2008). Методом трансмиссионной электронной микроскопии впервые была показана способность C60HyFn предотвращать формирование фибрилл Aβ и разрушать сформированные фибриллы in vitro (Подлубная и др., 2006; Podolski et al., 2007; Бобылев и др., 2010; Bobylev et al., 2011). Отсутствие выраженной нейродегенерации и отложений Aβ, наблюдаемое в случае предварительной инъекции C60HyFn, по-видимому, связано с антиамилоидным действием водорастворимых фуллеренов.
Рисунок 10. Количественный подсчет числа нейронов дорзального гиппокампа крыс (поле СА1), содержащих в цитоплазме депозиты Аβ1-42. В контроле депозиты отсутствуют (n=6), после интрагиппокампальной микроинъекции Aβ25-35 (1,6 нмоль/ 1 мкл) (n=6) и после предварительной микроинъекции С60HyFn (0,46 нмоль/ 1 мкл), предшествующей введению Aβ25-35. *- значимые различия между введением С60HyFn, предшествующем введению Aβ25-35 и введением Аβ25-35, p < 0,05.
Антиамилоидное действие in vitro и in vivo оказывают химически немодифицированные фуллерены, поэтому мы предполагаем, что фуллереновый каркас обладает сильным антиамилоидным действием.
4. Влияние предварительного введения С60HyFn на пространственное обучение и память у взрослых крыс на ранней стадии после интрагиппокампальной микроинъекции Аβ1-42.
Мы модифицировали протокол Delayed Matching-to-Place (DMP) (Steele and Morris, 1999), позволяющий исследовать оперативное пространственное обучение с одной пробы. Была увеличена длительность пробы с двух до пяти минут и введены семидневные перерывы между сеансами обучения. При двух минутной длительности пробы, крысы часто не могли находить платформу в первой пробе, и экспериментатор направлял их к платформе. Мы считаем существенным изучение поиска платформы без помощи экспериментатора. Введение перерывов по нашему мнению позволяет параллельно изучать эпизодическую и пространственную память.
Продолжительность обучения составляла пять сеансов. Положение платформы в первой пробе третьего, четвертого и пятого сеансов менялось случайным образом, так же как в тесте DMP. Через 1,5 и 48 ч после второго, третьего, четвертого и пятого сеансов проверяли сохранение пространственной информации (подробности см. в методике).
В группе с интрагиппокампальным введением физиологического раствора в первой пробе первого сеанса крысы находили платформу в среднем за 180 с. Во второй пробе время решения задачи уменьшилось в 9 раз и незначительно снизилось при дальнейшем повторении проб первого и второго сеансов (рис. 11, А, рис. 12, А). Таким образом, после введения физиологического раствора наблюдалось пространственное обучение с одной пробы. В первых пробах третьего, четвертого и пятого сеансов, в которых положение платформы менялось случайным образом, крысы быстро находили платформу, почти за такое же время как во второй пробе первого сеанса (рис. 11, А, рис. 12, А). Исследование сохранения пространственной информации в тесте без платформы показало, что после каждого сеанса обучения информация сохранялась как в оперативной (1,5 ч) так и в долговременной (48 ч) памяти (рис. 12, Б).
После введения нетоксического пептида Aβ35-25 крысы достоверно обучились только ко второй пробе второго сеанса. В первых пробах третьего, четвертого и пятого сеансов крысы быстро находили платформу, положение которой не было заранее известно (рис. 12, А). Таким образом, различия между контролем с введением физиологического раствора и нетоксического Aβ35-25 были не существенны. Также как и в предыдущей группе оперативная и долговременная пространственная информация сохранялись после каждого сеанса обучения (рис. 12, Б).
Результаты наших опытов совпадают с результатами группы Р. Морриса о том, что пространственное обучение может быть очень быстрым, после одной пробы. Более того, в наших опытах в заданном кольце бассейна крысы находили скрытую цель, вероятность локализации которой составляла 0,125 в течение нескольких секунд. В группе после интрагиппокампального введения Аβ1-42 в первой пробе первого сеанса крысы находили платформу в среднем за 220 с, гораздо медленнее чем в контроле. В первом и втором сеансах обучение происходило значительно хуже, чем контроля (р < 0,05) (рис. 12, А, В). На рис. 11, Б показан пример траектории движения крысы после интрагиппокампального введения Аβ1-42: животное долгое время не находило платформу, у него был резко выражен тигмотаксис, особенно в первой и второй пробах. Тем ни менее, при последующих пробах происходило обучение, но в несколько раз хуже, чем в контроле (рис. 11, А, Б, рис. 12, А, В). Обучение с одной пробы было нарушено только в четвертом сеансе (рис. 11, А, рис. 12, В). Сохранение оперативной памяти было нарушено в третьем и пятом сеансах, а долговременной пространственной информации во всех сеансах (рис. 12, Г). Таким образом, через 14, 21, 30 и 45 дней после однократного интрагиппокампального введения Аβ1-42 у всех крыс наблюдалось более медленное пространственное обучение, чем в контроле. Сохранение долговременной информации после каждого сеанса было нарушено.
Интересно, что в контроле в первых пробах третьего, четвертого и пятого сеансов, в которых положение платформы было случайным, крысы быстро решали задачу в течение 20 - 40 с (рис. 11, А, рис. 12, А). Это позволяет сделать заключение, что крысы помнили повторения сеансов, несмотря на длительные временные интервалы между ними. Способность крыс запоминать информацию о повторении сеансов обучения, мы рассматриваем как характеристику эпизодической памяти. После введения Аβ1-42 крысы решали задачу за 120-160 с, то есть в несколько раз медленнее, чем в последней пробе предыдущего сеанса по сравнению с контролем (рис. 11, А, Б, рис. 12, А, В). Этот результат показывает, что интрагиппокампальное введение Аβ1-42 нарушает эпизодическую память. Интересно, что в отличие от эпизодической памяти, обучение с одной пробы было нарушено только в одном (четвертом) сеансе.
Рисунок 11. Примеры формирования пространственной памяти в водном лабиринте Морриса. Показана траектория движения крысы и время решения задачи. А - в контроле (введение 0,9% NaCl); Б - после введения в гиппокамп Aβ1-42 (1,6 нмоль/ 1 мкл); В - после введения в гиппокамп С60HyFn (0,46 нмоль/1мкл) с дальнейшим введением Aβ1-42.
Рисунок 12. А, В. Обучение крыс Вистар в пяти сеансах по четыре пробы в стандартном водном лабиринте Морриса. А, Б - NaCl, n=7, Aβ35-25, n=9; В, Г - C60HyFn + Aβ1-42, n=13, Aβ1-42, n=12. В 1 и 2 сеансах положение платформы одинаковое. В последующих сеансах положение платформы меняется. *- разница между соответствующими пробами после введения NaCl и Aβ35-25 (р < 0,05) (А); *- значимые различия между соответствующими пробами после введения С60HyFn + Aβ и Aβ1-42 (р < 0,05) (Б).
Б, Г. Сохранение пространственной информации через 1,5 (кратковременная память) и 48 (долговременная память) часов после обучения. Пунктирной линией отмечено случайное значение времени в заданном кольце. *- значимые различия между соответствующими пробами после введения С60HyFn + Aβ1-42 и Aβ1-42 (р < 0,05) (Г).
Ранее впервые было показано, что введение аддукта фуллерена С60 с поливинилпирралидоном (С60/ПВП) в гиппокамп предупреждало нарушение пространственной памяти, вызванное блокадой синтеза белка (Podolski et al., 2002, 2004). Позднее было показано, что карбоксифуллерен C63(С(COOH)2)3, действуя как антиоксидант, улучшал пространственную память у старых мышей (Quick et al., 2008). В нашей группе были получены предварительные данные о том, что микроинъекция С60HyFn в желудочки мозга крыс улучшала пространственную память, нарушенную интравентрикулярным введением Аβ (Podolski et al., 2007).
В данной работе показано, что после однократной интрагиппокампальной микроинъекции C60HyFn (0,46 нмоль/ 1 мкл), предшествующей интрагиппокампальному введению Аβ1-42, у всех крыс не нарушалось пространственное обучение, обучение с одной пробы и эпизодическая память через 14, 21, 30 и 45 дней (рис. 11, В, рис. 12, В). В эти же сроки не нарушались оперативная и долговременная память (рис. 12, Г).
Таким образом мы обнаружили, что предварительное введение С60HyFn предупреждало нарушение пространственной и эпизодической памяти, вызванное интрагиппокампальным введением Аβ1-42.
Следовательно, C60HyFn оказывает сильное нейропротекторное действие. Механизмы этого эффекта требуют дальнейшего изучения. До настоящего времени нейропротектоное действие водорастоворимых фуллеренов объяснялось их анитиоксидантной активностью (Dugan et al., 1997; Quick et al., 2008). Наши данные in vitro с помощью электронной микроскопии показали, что фуллерены С60 предупреждают образование и разрушают сформированные фибриллы Аβ (Подлубная и др., 2006; Podolski et al., 2007; Бобылев и др., 2010; Bobylev et al., 2011). Недавно мы показали, что интрагиппокампальное введение C60HyFn предупреждает нарушение синтеза белка, накопление амилоида и развитие нейродегенерации в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа крыс (Makarova et al., 2012). Эти результаты подтверждают наше предыдущее предположение о том, что водорастворимые фуллерены оказывают антиоксидантное и антиамилоидное действие (Podolski et al., 2007; Подольский и др., 2010; Подольский и. Подлубная, 2010).
Пирамидные клетки поля СА1 гиппокампа являются наиболее чувствительными к действию Аβ25-35 (Stepanichev et al., 2000; Nie et al., 2010). Мы предполагаем, что защищая пирамидные клетки поля СА1 гиппокампа от нейротоксического действия Аβ, однократное введение C60HyFn предупреждает нарушение пространственной и эпизодической памяти в течении длительного времени (более полутора месяцев).
На основании этих данных мы выдвигаем предположение, что водорастворимые фуллерены С60 представляют чрезвычайный интерес для разработки профилактики и терапии БА.
ВЫВОДЫ
1. На ранней стадии (14, 30 и 45 дней) после однократной интравентрикулярной микроинъекции Аβ25-35 нарушение пространственной памяти при случайном положении цели в водном лабиринте Морриса наблюдалось не более чем у 50% животных. При этом происходило нарушение синтеза белка в морфологически интактных пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа. Изучение действия фуллерена на этой модели не давало однозначных результатов.
2. Инкубация переживающих срезов в среде, содержащей Aβ25-35, приводила к выраженной дегенерации пирамидных клеток поля СА1. Предварительная инкубация переживающих срезов в среде с гидратированным фуллереном С60 (С60HyFn) предупреждала развитие нейродегенерации.
3. Предварительная однократная интрагиппокампальная микроинъекция С60HyFn в невысокой концентрации (0,46 нмоль/ 1мкл) предупреждала нарушение синтеза белка, образование депозитов Аβ и массовую нейродегенерацию клеток в поле СА1 гиппокампа, вызванные интрагиппокампальным введением Аβ25-35 на 2, 7 и 14 дни.
4. Предварительная однократная интрагиппокампальная микроинъекция С60HyFn предупреждала нарушение пространственной памяти, обучения с одной пробы и эпизодической памяти, вызванные интрагиппокампальным введением Аβ1-42. Этот эффект сохранялся в течение полутора месяцев.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи:
1. Podolski I.Ya., Podlubnaya Z.A., Kosenko E.A., Mugantseva E.A., Makarova E.G., Marsagishvili L.G., Shpagina M.D.,. Kaminsky Yu.G., Andrievsky G.V., Klochkov V.K. Fullerene effects on amyloid β-peptide fibrillization in vitro and performance of the cognitive task. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2007, Vol. 7, № 4-5, p. 1479-1485.
2. Makarova E.G., Gordon R.Ya., Podolski I.Ya. Fullerene C60 prevents neurotoxicity induced by intrahippocampal microinjection of amyloid-β peptide. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2012, Vol. 12, № 1, p. 119-126.
3. Гордон Р.Я., Макарова Е.Г., Подольский И.Я., Рогачевский В.В., Кордонец О.Л. Нарушение белкового синтеза - раннее проявление действия амилоида-β в нейронах. Нейрохимия, 2012, том 29, № 2, С. 139-149.
Тезисы:
1. Podolski I.Ya., Kosenko E.A., Mugantseva E.A., Makarova E.G., Kaminsky Yu.G., Andrievsky G.V., Klochkov V.K. and Derevyanchenko L.I.. Hydrated C60 fullerenes and an animal model of Alzhemer's disease. 7th Biennial International Workshop "Fullerenes and Atomic Clusters", St. Petersburg, Russia, 2005, p. 241.
2. Макарова Е.Г., Муганцева Е.А., Косенко Е.А., Марсагишвили Л.Г., Подлубная З.А., Подольский И.Я. "Бета-амилоидная модель болезни Альцгеймера у крыс", Х Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наукаXXI века", Пущино, 2006, С. 151.
3. Mugantseva E.A., Makarova E.G., Deev A.A., Shcheglov I.V., Lebedinsky A.A. and Podolski I.Ya. "Spatial memory of rats performing a probabilistic cognitive task", International Symposium "Hippocapus and memory", Pushchino, 2006, p. 90.
4. Подольский И. Я., Муганцева Е.А., Макарова Е.Г., Казанович Я.Б., Жунина В.В., Лежнева И.Э., Ройтберг Е.Г. Исследование действия фуллеренов на когнитивные процессы на модели нейротоксичности, вызванной бета-амилоидом. Разработка компьютерных тестов на решение пространственных задач для диагностики слабых когнитивных расстройств. Тезисы конференции "Фундаментальные науки - медицине", Москва, 2006, С. 23-24.
5. Муганцева Е.А., Макарова Е.Г., Подольский И.Я. Анализ острой нейротоксичности, вызванной бета-амилоидным пептидом у крыс. Третий Международный Междисциплинарный Конгресс "Нейронаука для медицины и психологии", Судак, Крым, Украина, 2007, С. 164-165.
6. Макарова Е.Г., Кордонец О.Л., Муганцева Е.А., Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А., Годухин О.В., Подольский И.Я. Влияние С60 фуллерена на экспериментальных моделях болезни Альцгеймера in vitro и in vivo. Третий Международный Междисциплинарный Конгресс "Нейронаука для медицины и психологии", Судак, Крым, Украина, 2007, С. 149-150.
7. Podolski I.Ya., Podlubnaya Z.A., Mugantseva E.A., Makarova E.G., Marsagishvili L.G., Shpagina M.D., Kordonets O.L., Godukhin O.V.,Andrievsky G.V., and Klochkov V.K. Effects of hydrated C60 fullerene on animal models of Alzheimer's disease. 8th Biennial International Workshop "Fullerenes and Atomic Clusters" IWFAC, St. Petersburg, Russia 2007, p.172.
8. Podolski I.Ya., Podlubnaya Z.A., Mugantseva E.A, Makarova E.G., Kordonets O.L., Marsagishvili L.G., Shpagina M.D., Kosenko E.A., Godukhin O.V. Impairment of cognitive processes induced Aβ peptides and C60 fullerenes. Neuroscience Meeting, San Diego, 884.23/K21. 2007. http://www.abstractsonline.com.
9. Подольский И.Я., Макарова Е.Г., Муганцева Е.А., Кордонец О.Л., Годухин О.В., Гордон Р.Я, Казанович Я.Б., Ильясов Ф.Э., Жунина В.В., Khirug L. Механизмы нарушения когнитивных процессов на моделях болезни Альцгеймера и фуллерены. Тезисы конференции "Фундаментальные науки - медицине", Москва, 2007, С. 22-23.
10. Mugantseva E.A., Makarova E.G., Pavlik V.D. and Podolski I.Ya. Impairment of cognitive processes and spatial synchronization of the electric activity of the frontal cortex and the hippocampus on an animal model of Alzheimer's disease in rats. Forum Neuroscience, Geneva, Switzerland, 2008, vol.4, 217.20.
11. Podolski I.Ya., Podlubnaya Z.A., Mugantseva E.A., Makarova E.G., Kordonets O.L., Marsagishvili L.G., Godukhin O.V., Shpagina M.D. Fullerenes and creation of drugs for therapy of Alzheimer's disease. The second International Conference on NanoBioTechnologies, St. Petersburg, Russia, 2008, p.171.
12. Подольский И.Я., Годухин О.В., Гордон Р.Я., Кордонец О.Л., Макарова Е.Г., Марсагишвили Л.Г., Подлубная З.А. Фуллерены C60 и болезнь Альцгеймера. Всеукраинская конференция "Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии", Днепропетровск, Украина, 2008, С. 20.
13. Makarova E., Muganceva K., Kordonets O., Gordon R., Podolski I. Effect of aqueous solutions of С60 fullerene on the impairment of protein synthesis spatial memory induced by β-amyloid peptide. "Alzheimer's and Parkinson's Diseases: Advances, Concepts and New Challenges", Prague, Czech Republic, 2009, p. 831.
14. Макарова Е.Г., Муганцева Е.А., Гордон Р.Я., Подольский И.Я. Влияние фуллеренов С60 на синтез белка в гиппокампе и пространственную память на модели болезни Альцгеймера. 1-ая Международная научная школа "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах", Московская область, Ступинский район, 2009, С. 282.
15. Макарова Е.Г., Гордон Р.Я., Подольский И.Я. Фуллерен С60 нормализует нарушения синтеза белка в гиппокампе и пространственную память, вызванные амилоид - β пептидом. Всероссийская конференция с международным участием "Гиппокамп и память: норма и патология", Пущино, Россия, 2009, С. 103-104.
16. Makarova E.G., Gordon R.Ya., Kordonets O.L., Godukhin O.V., Podolsky I.Ya. Possible neuroprotective properties of fullerenes C60. Nanotechnology international forum "Rusnanotech", Moskow, 2010. http://www.rusnanoforum.ru.
17. Подольский И.Я., Подлубная З.А., Гордон Р.Я, Макарова Е.Г., Муганцева Е.А., Кордонец О.Л., Бобылева (Марсагишвили) Л.Г., Гехт А.Б., Пиотровский Л.Б., Мишулина О.А., Эйдлин А.А. Фуллерены С60 для разработки антиамилоидной терапии болезни Альцгеймера. Тезисы конференции "Фундаментальные науки - медицине", Москва, 2010, С. 164-165.
18. Подольский И.Я., Гордон Р.Я., Макарова Е.Г. Фуллерены для разработки терапии болезни Альцгеймера. Седьмой Международный Междисциплинарный Конгресс "Нейронаука для медицины и психологии", Судак, Крым, Украина, 2011, С. 339.
Работа выполнена при поддержке гранта Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" 2010, 2011; гранта Министерства образования и науки РФ 2009-2010 (грант № 2.1.1./3876); Государственного контракта № П1052.
2
23
Документ
Категория
Биологические науки
Просмотров
400
Размер файла
3 756 Кб
Теги
кандидатская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа