close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Углеводородокисляющие бактерии и ассимиляционный потенциал морской воды Северного Каспия

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Соколова Вера Владимировна Шифр научной специальности: 03.02.08 - экология Шифр диссертационного совета: Д 307.001.05 Название организации: Астраханский государственный технический университет Адрес организации: 414025, г.Астрахань,
 На правах рукописи
СОКОЛОВА ВЕРА ВЛАДИМИРОВНА
Углеводородокисляющие бактерии и ассимиляционный потенциал морской воды Северного Каспия 03.02.08. - Экология (биология)
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Астрахань - 2012
Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории
микробиологического мониторинга ФГБОУ ВПО "Астраханский
Государственный Технический Университет"
Научный руководитель:Дзержинская Ирина Станиславовнадоктор биологических наук, профессор кафедры "Гидробиология и общая экология" Астраханского государственного технического университета (г. Астрахань)
Официальные оппоненты:Филенко Олег Федоровичдоктор биологических наук, профессор кафедры "Гидробиология" Биологический факультет Московского государственного университета им. М. Ломоносова (г. Москва)Курочкина Татьяна Федоровнадоктор биологических наук, профессор кафедры "Экология, природопользование, землеустройство и безопасность жизнедеятельности" Астраханского государственного университета (г. Астрахань) Ведущая организация: Институт биологии Уфимского Научного Центра РАН (г. Уфа) Защита состоится 6 июня 2012 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета_Д.307.001.05 при Астраханском Государственном Техническом Университете по адресу: 414025, г. Астрахань, ул. Татищева, 16
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Астраханского Государственного Технического Университета по адресу: 414025, г. Астрахань, ул. Татищева, 16.
Автореферат разослан " " 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук, доцент Э.И. Мелякина
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Ассимиляционный потенциал экосистемы моря - это лимитированная способность нейтрализовать и обезвреживать в определенных пределах вредные выбросы, поступающие в морскую среду в результате хозяйственной деятельности (Гусев, 2002). Эта способность лежит в основе процесса самоочищения, который при современном антропогенном воздействии на морскую среду имеет важное значение. Нефть и нефтепродукты являются одним из крупномасштабных загрязнителей гидросферы, ежегодное попадание которых в окружающую среду оценивается в десятки миллионов тонн. Однако нефтяные углеводороды являются неотъемлемым природным компонентом морской среды и в процессе эволюции выработался довольно эффективный механизм их деструкции (Миронов, 2002). Самоочищение морских акваторий - комплексный процесс, протекающий под действием физических, химических и биологических факторов, где трансформация нефти и нефтепродуктов гетеротрофным пикопланктоном, а именно входящими в его состав углеводородокисляющими бактериями, является основным (Миронов, 1973, 2002; Ильинский, 1979, 2000; Morgan, 1989; Израэль, 1989; Leahy, 1990; Коронелли, 1993; Немировская, 2000; Рубцова, 2004; Куликова, 2008). Мощная, разнообразная и подвижная ферментативная система, позволяющая переключаться на потребление с одних на другие источники углерода и энергии, высокая пластичность обменных процессов, быстрая адаптация к изменяющимся условиям позволяет углеводородокисляющим бактериям активно деструктировать нефть и нефтепродукты (Ильинский, 1979; Миронов, 2002; Куликова, 2004). Особую опасность представляет нефтяное загрязнение в замкнутых водоемах, например, таких как Каспийское море. В Северном Каспии оно возникает в результате разведки, добычи, транспортировки нефти и нефтепродуктов и речного стока, выносящего такого рода загрязнения в море. При нефтяном загрязнении опасными являются не только нефтяные пятна в морской акватории, но и выбросы их в прибрежную зону, которые негативно влияют на прибрежные сообщества и на состав микроценоза почвы, где повышается общая численность фитопатогенных грибов (Коряжкина, 2009). При избытке нефтезагрязняющих веществ, естественные процессы самоочищения могут не справляться с нагрузкой, что может привести к нарушению функционирования морских сообществ, вплоть до их гибели (Миронов, 2002).
В связи с этим, особую актуальность приобретают исследования состава и свойств углеводородокисляющих бактерий, создающих ассимиляционный потенциал морской воды Северного Каспия. Цель исследования. Исследовать углеводородокисляющие бактерии и создаваемый ими ассимиляционный потенциал морской воды в северной части Каспийского моря.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1.Изучить численность углеводородокисляющих бактерий в составе гетеротрофного пикопланктона в районе исследований;
2.Оценить ассимиляционный потенциал морской воды по величине микробной деградации и потенциальную окислительную способность углеводородокисляющих бактерий в составе гетеротрофного пикопланктона;
3.Выделить, изучить углеводородокисляющие бактерии морской воды и выявить активных нефтедеструкторов;
4.Определить токсичность активных нефтедеструкторов по биотестированию их суспензий и очищенной ими от нефти морской воды в микроэкосистемах;
5.Исследовать фунгицидную активность и фитотоксичность активных нефтедеструкторов;
6.Идентифицировать активный штамм-нефтедеструктор с хозяйственно-полезными свойствами.
Научная новизна работы. Впервые проведена оценка ассимиляционного потенциала морской воды по величине микробной биодеградации акватории Северного Каспия. Исследованы углеводородокисляющие бактерии в составе гетеротрофного пикопланктона, среди которых выделен и изучен штамм Serratia grimesii, обладающий высокой эмульгирующей активностью, способный к деструкции нефти, моторного масла и парафина. Положения, выносимые на защиту:
1.Ассимиляционный потенциал морской воды, создаваемый углеводородокисляющими бактериями, в районе исследования составляет 0,047-0,092 гУВ/м3 в сутки;
2.Выделен и изучен новый штамм Serratia grimesii, способный к деструкции нефтяных углеводородов, нетоксичный по отношению к гидробионтам, обладающий фунгицидной и фитостимулирующей активностями. Практическая значимость. Расчеты ассимиляционного потенциала по величине микробной деградации нефтяных углеводородов могут использоваться организациями, которые производят расчет баланса нефтепродуктов и оценку нефтяного загрязнения морских вод при осуществлении государственного и производственного экологического мониторинга на Северном Каспии. Предложен новый штамм Serratia grimesii, который может быть использован для активизации процессов деструкции нефти в морской среде и прибрежной зоне.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на 13-ой международной Пущинской школе-конференции молодых учёных "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2009), Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых "Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы" (Белгород, 2009 г), международной научно-практической конференции "Perspektywiczne opracowania sa nauka i tecnhnikami - 2009" (Przemysl, 2009), на всероссийском симпозиуме с международным участием "Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов" (Москва, 2009), Всероссийской научно- практической конференции с международным участием "Актуальные проблемы современной науки и образования. Биологические науки" (Уфа, 2010), на международной конференции "Первые международные Беккеровские чтения" (Волгоград, 2010), 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых "Биология - наука ХХI века" (Пущино, 2010), Международной научной конференции "Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности "АСТИНТЕХ- 2010" (Астрахань, 2010), Международной отраслевой научной конференции профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященной 80-летию основания АГТУ (Астрахань, 2010), 1-ой научно-практической конференции "Новейшие технологии освоения месторождений углеводородного сырья и обеспечение безопасности экосистем Каспийского шельфа" (Астрахань, 2010), V-ой международной конференции "Биология: от молекулы до биосферы" (Харьков, 2010), Международной конференции с элементами научной школы "Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии" (Астрахань, 2010), Всероссийском симпозиуме с международным участием "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 научная работа, в том числе 6 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень ВАК.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 159 страницах машинописного текста, иллюстрированы 12 таблицами и 17 рисунками. Список использованной литературы включает 216 источников, из них 47 на иностранных языках.
Автор выражает огромную благодарность и признательность за неоценимую помощь в работе и поддержку научному руководителю доктору биологических наук, профессору Дзержинской И.С., доценту Куликовой И.Ю. за консультации при проведении лабораторных исследований, а также всем сотрудникам кафедры "Прикладная биология и микробиология" Астраханского Государственного Технического Университета.
ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основным объектом исследования являлись углеводородокисляющие микроорганизмы, в том числе штамм Serratia grimesii, выделенные из морской воды Северного Каспия.
Материалом для написания работы послужили данные экспедиционных и экспериментальных исследований, проводившихся в 2008-2011 гг. Экспериментальные исследования выполнялись в лаборатории микробиологического мониторинга Астраханского государственного технического университета. Экспедиционные исследования выполнялись в северной части Каспийского моря. Пробы морской воды отбирались в 3-х зонах (мелководной, свале глубин и приглубой зоне) на 12 станциях в двух горизонтах - поверхностном и придонном по общепринятым методам (Родина, 1965; Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005). На рисунке 1 представлена схема отбора проб. Станции 1, 2, 3, 4 находятся в мелководной зоне, станции 5, 6, 7, 8 - на свале глубин, станции 9, 10, 11, 12 - в приглубой зоне. Всего было исследовано 124 пробы.
Рисунок 1 -Схема отбора проб
Гидрохимические анализы воды, в том числе экстракцию суммарных углеводородов четыреххлористым углеродом с последующим анализом экстрактов (методом ИК-спектрометрии), проводили согласно общепринятым методам (Руководство по методам биологического анализа..., 1980; Руководство по химическому анализу морских вод, 1993; Другов, 2000). Численность сапротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов определяли методом предельных разведений и проращиванием их на плотных питательных средах: питательном агаре для сапротрофов и среде Миллса с добавлением нефти для углеводородокисляющих бактерий (Mills, 1974; Теппер, 2004; Нетрусов, 2005).
Интенсивность минерализации нефтяных остатков рассчитывали по потенциальной способности морской воды к их окислению (ПОС) по методике Г.Л. Марголиной (Марголина, 1989). Оценку ассимиляционного потенциала воды (величину бактериальной биодеградации нефтяных углеводородов или "потоки самоочищения") определяли по формуле:
Б= N*K, (1)
где Б - величина бактериальной биодеградации нефтяных углеводородов (мгУВ/г*сут или 1*103 гУВ/м3*сут), N - численность нефтеокисляющих бактерий (КОЕ/мл), К - количество углеводородов, окисленных одной бактериальной клеткой, рассчитанное ЗоБеллом (3,76*10-8 мг/кл*сут) (Рубцова, 2003).
Выделение углеводородокисляющих микроорганизмов, изучение их культуральных, морфологических и физиолого-биохимических свойств, а также получение чистых культур проводили по классическим методам с использованием жидких минеральных сред М9, МКД, среда Чапека, Миллса, в которые добавляли нефть, дизельное топливо и керосин как единственный источник углерода и энергии (Mills et al., 1978; Методы почвенной микробиологии, 1991; Практикум по микробиологии, 2005; Тумайкина, 2007; Павлова, 2008; Дзержинская, 2008). Культивирование проводили при температуре 25-28 С для мезофильных и при 6-8 С для психроактивных микроорганизмов на качалке при 190 об/мин в течение 14 суток. Способность чистых культур усваивать жидкие нелетучие углеводороды определяли методом лунок по Егорову (Руководство к практическим занятиям, 1983).
Предварительную идентификацию выделенных микроорганизмов проводили по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам, используя "Определитель бактерий Берджи" (1997), "Краткий определитель бактерий Берджи" (1980), монографии Скворцовой И.Н "Методы выделения и идентификации бактерий рода Pseudomonas"" (1981) и "Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus" (1983), монографию Нестеренко О.А. "Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии" (1985), монографию Рубан Е.Л. "Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas" (1986), а также монографии Смирнова В.В. "Бактерии рода Pseudomonas" (1990) и Логинова О.Н. "Бактерии Pseudomonas и Azotobacter как объекты сельскохозяйственной биотехнологии" (2005).
Литические свойства выделенных изолятов (липолитическую, амилолитическую и протеолитическую активности) определяли согласно общепринятым методам (Егоров, 1995; Практикум по микробиологии, 2005). Эмульгирующую активность выделенных штаммов определяли методом Купера (Cooper, 1987). Гидрофобно-гидрофильную активность определяли качественно по отталкиванию поверхностями, смоченными бактериальными фильтратами, гидрофобных жидкостей (нефть, масляная краска, подсолнечное масло, окрашенное суданом) (пат. № Ru 2112033) и количественно по методу разработанному И. Розенбергом в модификации Е.В. Серебряковой (Серебрякова, 2002).
Деструктивную активность штаммов по отношению к сырой нефти и моторному маслу изучали на стерильной морской воде с внесением 1% нефти и 2% суспензий исследуемых штаммов. Содержание нефтепродуктов в воде определяли гравиметрическим методом (Другов, 2000; Белоусова, 2002).
Для выявления способности штаммов разлагать парафин использовали агаризованную среду Маккланга с внесением стерильного расплавленного парафина (Теппер, 2004). Для определения степени токсичности суспензий активных штаммов и токсичности воды, очищенной от нефти с помощью отобранных наиболее активных штаммов-нефтедеструкторов проводили биотестирование согласно общепринятым методам (Михеев, 2001; СанПиН 2.1.7.573-96; Приказ МПР РФ от 15 июня 2001 г № 511). В качестве тест-объектов использовали солоноватоводные рачки Artemia sаlina и водоросли Scenedesmus quadricauda (Тurp) Breb. Штаммы вносили в количестве 106-107 кл/мл по объему. При биотестировании воды из микроэкосистем пробы отбирались в момент постановки опыта, через 5, 15 и 30 суток экспозиции. Тестирование проводилось в наборе разведений 1, 10, 50, 100 %-ной концентрации.
Фунгицидные свойства штаммов исследовались с помощью модифицированного метода диффузии в агар с использованием лунок (Моисейченко, 1996). Фитотоксичность и фитостимулирующую активность штаммов определяли с помощью метода на прорастание семян кресс-салата сорта "Весенний" во влажных камерах (Методы экспериментальной микологии, 1982; Ганнибал, 2007). При определении филогенетического положения наиболее активного штамма-нефтедеструктора проводился анализ секвенсов вариабельных участков 16S rDNA (Edwards et all., 1989). Статистическую обработку данных гидробиологических, микробиологических и токсикологических исследований проводили с помощью программы STATISTICA 6.0, Microsoft Excel Office XP.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оценка ассимиляционного потенциала морской воды Северной части Каспийского моря Изучение численности сапротрофной и углеводородокисляющей части гетеротрофного пикопланктона
При изучении морской воды в районе исследования установлено, что содержание нефтепродуктов находится в пределах от 0,005 до 0,068 мг/л. На большей части станций не отмечено превышения ПДК (0,05 мг/л), кроме 3-х станций: ст. 5 в летний период в поверхностном слое на свале глубин, где концентрация нефтепродуктов составляет 0,057 мг/л (1,14 ПДК), ст. 10 и ст. 12 в летний период поверхностном слое приглубой зоны, где концентрация нефтепродуктов составляет 0,052 и 0,068 мг/л (1,04 и 1,36 ПДК) соответственно.
Таким образом, для исследуемого участка Северного Каспия не отмечено повышенного нефтяного загрязнения.
В процессе самоочищения воды участвует гетеротрофный пикопланктон, который является важным начальным звеном в трофических цепях. Ведущая роль в процессе самоочищения водоемов от нефтяного загрязнения принадлежит бактериальному сообществу, а именно углеводородокисляющей части гетеротрофного пикопланктона (Найдин, 1993; Миронов, 2002).
При изучении сапротрофов и углеводородокисляющих бактерий Северного Каспия установлено, что на численность сапротрофов оказывало влияние изменение температуры и глубины исследуемой акватории. Общая численность сапротрофов в исследуемый период колебалась в пределах от 11,5 тыс. до 50 тыс. КОЕ/мл (таблица 1). Снижение температуры воды (с 25,4-30,3 С летом до 9,8-17,4 С зимой и осенью) вызывает снижение численности сапротрофов в 2 и более раз. С увеличением глубины (от поверхностного горизонта к придонному и с мелководных станций к приглубым) также наблюдается снижение численности сапротрофов. Углеводородокисляющие микроорганизмы присутствовали во всех исследуемых пробах воды. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов колебалась от 12,5*102 до 24,5*102 КОЕ/мл (таблица 1). Для углеводородокисляющих микроорганизмов четкой зависимости численности от глубины не отмечено. Понижение температуры воды до 11,4-17,4 С (осенний период) вызывает снижение численности углеводородокисляющих микроорганизмов на 18-38%, а дальнейшее понижение температуры до 9,8-13,9 С (зимний период) не влияет на численность данной группы микроорганизмов. Полученные данные свидетельствуют о том, что углеводородокисляющие микроорганизмы являются постоянными компонентами микроценоза воды и составляют 4,4 - 11,4 % от численности сапротрофов. Таблица 1 - Численность сапротрофных и углеводородокисляющих бактерий в составе пикопланктона в исследуемом районе Северного Каспия Зона исследованияТемпература воды, ССапротрофы, КОЕ/мл*103Углеводородокисляющие микроорганизмыКОЕ/мл*102% от сапротрофовГоризонт ПоверхностныйПридонныйПоверхностныйПридонныйПоверхностныйПридонныйПоверхностныйПридонныйЛетоМелководная 30,329,450,82,248,02,324,11,224,50,64,75,1Свал глубин29,127,948,62,644,33,622,70,420,41,44,74,6Приглубая 29,125,444,21,443,41,821,11,619,00,84,84,4ОсеньМелководная 11,411,523,21,319,80,918,00,616,80,57,88,5Свал глубин14,114,222,50,916,71,0 17,50,912,50,17,87,5Приглубая 17,417,419,11,217,30,416,50,814,20,38,68,2ЗимаМелководная 9,810,720,30,814,70,419,70,916,70,99,711,4Свал глубин11,411,418,51,312,70,718,21,714,60,79,811,5Приглубая 13,613,917,50,811,50,515,50,513,50,78,910,9 Установлено, что с понижением температуры воды процент углеводородокисляющих микроорганизмов от сапротрофных возрастает. Изучение потенциальной окислительной способности морской воды
Потенциальная окислительная способность морской воды (ПОС) показывает активность углеводородокисляющей части гетеротрофного пикопланктона и, следовательно, интенсивность процесса минерализации нефтяных остатков и определяется по изменению концентрации растворенного кислорода в морской воде при внесении в нее нефти. Как известно, окисление углеводородов сопровождается значительным потреблением кислорода. С.Е. ZoBell (1964) считает, что 1 мг кислорода окисляет от 0,5 до 1,4 мг нефти. Если допустить, что 1 мг кислорода окисляет в среднем 1 мг нефти (Марголина, 1989; Куликова, 2004), то величина ПОС (мг О2/л в сутки) соответствует скорости микробной деградации нефтяных углеводородов, выраженной в мгУВ/л в сутки или, что то же самое, гУВ/м3 в сутки.
Изучение потенциальной окислительной способности микроценозов морской воды исследуемых зон Северного Каспия показало, что летом и осенью значения потенциальной окислительной способности в поверхностном горизонте составляют от 0,010,0008 до 0,950,0927 мг О2/л*сут, что выше чем в придонном, где показатели от 0,020,0014 до 0,760,0254 мг О2/л*сут. Зимой наблюдаемая картина меняется: в мелководной зоне соотношения остается прежним, то есть в поверхностном горизонте ПОС выше (0,320,02100 мг О2/л*сут), чем в придонном (0,270,0176 мг О2/л*сут), а на свале глубин и в приглубой зоне значения ПОС выше в придонном горизонте (от 0,220,0380 до 0,430,1359 мг О2/л*сут), чем в поверхностном, где показатели не превышают 0,220,0123 мг О2/л*сут. Важно отметить, что для всех исследуемых зон северной части Каспийского моря осенью отмечено снижение значений ПОС (0,02-0,21 мг О2/л в сутки), а зимой показатели повышаются (0,20-0,43 мг О2/л в сутки).
Значение ПОС, как указывалось выше, прямо соответствует значению деградации нефтяных углеводородов, выраженной в гУВ/м3 в сутки. Из этого следует, что скорость деградации нефти на исследуемой акватории находилась от в пределах от 0,02 до 0,95 гУВ/м3 в сутки.
По мнению Миронова (2002) активность пикопланктона летом связана с интенсивным развитием автотрофной части, которая также участвует в процессе минерализации нефтяных углеводородов. Оценка ассимиляционного потенциала морской воды по величине биодеградации нефтяных углеводородов
Для оценки ассимиляционного потенциала воды Северного Каспия использовали величину бактериальной деградации нефтепродуктов ("потоки самоочищения"), которую рассчитывали по численности углеводородокисляющих микроорганизмов морской воды (таблица 2). Установлено, что максимальные значения бактериальной биодеградации нефтяных углеводородов в сутки наблюдаются в летний период в мелководной зоне в поверхностном и придонном горизонтах (0,091 и 0,092 гУВ/м3 соответственно), а также в летний период в поверхностном горизонте свала глубин (0,085 гУВ/м3). Осенью отмечается снижение величины биодеградации во всех исследуемых зонах и составляет 0,047-0,068 гУВ/м3 в сутки. В зимний период величина биодеградации углеводородов превышает осенние показатели и возрастает до 0,051-0,074 гУВ/м3 в сутки (таблица 2). Такое распределение показателей биодеградации нефтепродуктов может быть объяснено наличием в морской воде психроактивной и психрофильной микрофлоры, для которой низкие температуры являются оптимальными для процессов окисления углеводородов, а также подтоком Средне-Каспийских вод в придонный слой приглубой зоны и свала глубин. Следовательно, во все исследуемые периоды в воде данного участка Северного Каспия протекают процессы самоочищения от углеводородов. Активнее всего данные процессы протекают в мелководной зоне летом. Таблица 2 - Бактериальная деградация нефтепродуктов ("потоки самоочищения", Б, гУВ/м3 в сутки) в воде Северного Каспия Исследуемая зона Северного КаспияПоверхностный горизонтПридонный горизонтN*102 (КОЕ/мл)Б (гУВ/м3 в сутки)N*102 (КОЕ/мл)Б (гУВ/м3 в сутки)ЛетоМелководная зона24,11,20,09124,50,60,092Свал глубин22,70,40,08520,41,40,077Приглубая зона21,11,60,07919,00,80,071ОсеньМелководная зона18,00,60,06816,80,50,063Свал глубин17,50,90,06712,50,10,047Приглубая зона16,50,80,06214,20,30,053ЗимаМелководная зона19,70,90,07416,70,90,062Свал глубин18,21,70,06814,60,70,054Приглубая зона15,50,50,05813,50,70,051 Таким образом, скорость микробной деградации нефтяных углеводородов в пределах исследуемой акватории составляет 0,047-0,092 гУВ/м3 в сутки. Микробная деградация нефтяных углеводородов в водах исследуемой акватории по данным, приведенным в таблице 2, среднем на порядок ниже, чем по данным, рассчитанным по потенциальной окислительной способности. Это объясняется тем, что при определении ПОС кислород расходуется не только на окисление нефтепродуктов, но и на окисление других органических веществ, а также на процессы дыхания гидробионтов. Однако характер сезонной изменчивости и пространственного распределения микробной деградации нефтяных углеводородов в обоих случаях аналогичен.
Таким образом, можно предположить, что в исследуемой акватории Каспийского моря в 1 м3 морской воды может деструктироваться в среднем от 0,047 до 0,092 г углеводородов в сутки при определенных условиях, таких как уровень загрязнения, активность микроценоза, температура. Скрининг морских бактерий, обладающих углеводородокисляющими свойствами
Выделение углеводородокисляющих бактерий, исследование их культуральных, морфологических и физиолого-биохимических свойств Для выделения углеводородокисляющих микроорганизмов были поставлены 32 накопительные культуры, с использованием минеральных сред (ср. Миллса, М-9, магниево-калиево-дрожжевая среда (МКД), Чапека) с добавлением нефти, дизельного топлива и керосина (1 % по объему) как единственных источников углерода и энергии и морской воды (1 % по объему). Обнаружено, что из 32 накопительных культур только в 3-х накопительных культурах отсутствуют признаки готовности, то есть не наблюдается рост углеводородокисляющих микроорганизмов. Также установлено, что присутствие дополнительных источников углерода в среде (дрожжевая вода) повышает устойчивость микроорганизмов по сравнению с развитием на минеральных средах с нефтепродуктами. Из 29 накопительных культур, в которых отмечен рост микроорганизмов, производился глубинный высев разведений на плотные минеральные среды с нефтепродуктами. Всего выявлено 84 изолята (учитывались только бактериальные штаммы). Установлено, что все изоляты различаются по культурально-морфологическим свойствам.
При периодических пересевах отобраны 43 мезофильных и 5 психроактивных изолятов, способных образовывать колонии на минеральных средах с исследуемыми углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии.
При исследовании изолятов на способность окислять жидкие не летучие углеводороды установлено, что из 48 исследуемых изолятов только 31 чистая культура способна окислять нефть и нефтепродукты, из них 26 мезофильных и 5 психроактивных штаммов. При изучении культуральных и морфологических свойств выделенных углеводородокисляющих штаммов все полученные на минеральных средах с нефтью и нефтепродуктами колонии мезофильных бактерий были условно разделены на 8 групп, которые были ближе не идентифицированы как представители рода Nocardia, Staphylococcus, Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, Serratia, Arthrobacter, Rhodococcus. Психроактивные бактерии были ближе не идентифицированы как представители рода Bacillus, Micrococcus, Serratia и Arthrobacter.
Изучение углеводородокисляющих свойств При изучении литических свойств активных штаммов установлено, что липолитической, амилолитической и протеолитической активностями обладают 10 штаммов - Serratia sp. 16, Serratia sp. 18, Bacillus sp. 23, Bacillus sp. 34, Bacillus sp. 69, Arthrobacter sp. 12, Micrococcus sp. 6, Pseudomonas sp. 15, Pseudomonas sp. 17 и Rhodococcus sp. 29, липолитической и амилолитической активностью - 6 изолятов, липолитической и протеолитической - 2, амилолитической и протеолитической - 1, только одним из исследуемых литических свойств - 11 штаммов.
Для исследования эмульгирующих свойств, штаммы были выращены на жидкой минеральной среде. В качестве гидрофобной фазы для эмульгирования использовали керосин, бензин и дизельное топливо. Изучение способности бактерий к синтезу естественных поверхностно-активных веществ (ПАВ, биосурфактантов, биоэмульгаторов), которые снижают поверхностное натяжение и способствуют повышению степени биодеградации, показало, что индекс эмульгирования при смешивании с керосином, бензином и дизельным топливом для всех штаммов различен. Среди исследуемых мезофильных штаммов эмульгирующими свойствами по отношению ко всем исследуемым углеводородам обладают штаммы Nocardia sp. 1, Staphylococcus sp. 2, Bacillus sp. 3, Pseudomonas sp. 4, Serratia sp. 16, Serratia sp. 28 и Rhodococcus sp. 29, индекс эмульгирования для данных штаммов составляет от 30 до 59 % по каждому нефтепродукту. Среди психроактивных штаммов только представитель рода Serratia sp. 62 оказался способен эмульгировать все исследуемые углеводороды (от 32,50,24 % до 35,11,23 %). Штамм Micrococcus sp. 61 способен к эмульгации только бензина (31,61,44 %). Таким образом, установлено, что у 9 мезофильных и 2 психроактивных штаммов отмечена высокая эмульгирующая активность. Исследования гидрофобно-гидрофильной активности проводились с 11 наиболее активными мезофильными и психроактивными культурами, отобранными ранее.
В результате исследования гидрофобно-гидрофильной активности по отталкиванию различных поверхностей, смоченных бактериальными фильтратами, гидрофобных жидкостей установлено, что 2 штамма Bacillus sp. 3 и Bacillus sp. 22 обладают высокими гидрофилизирующими свойствами и способны вытеснять гидрофобные жидкости с поверхностей различного типа. Остальные бактерии оказались гидрофобны.
При исследовании гидрофобных свойств методом И. Розенберга в модификации Е.В. Серебряковой (2002) установлено, что штаммы Bacillus sp. 3 и Bacillus sp. 22 обладают гидрофильными клеточными стенками, показатель гидрофобности штаммов составил 0 и 3,4 % соответственно. Для штаммов Pseudomonas sp. 30, Pseudomonas sp. 35, Micrococcus sp. 61 и Serratia sp. 62 характерен средний показатель гидрофобности составляет от 47,6 до 51,2 %. Остальные отобранные штаммы Nocardia sp. 1, Staphylococcus sp. 2, Pseudomonas sp. 4, Serratia sp. 16, Serratia sp. 28, Rhodococcus sp. 29 характеризуются высоким показателем гидрофобности клеточных стенок от 63 до 89,5%. Наиболее высокий показатель гидрофобности характерен для штамма Serratia sp. 16 и составляет 89,5 %.
При исследовании отобранных штаммов на способность к деструкции нефти установлено, что среди мезофильных бактерий максимальная степень деструкции нефти характерна для штамма Serratia sp. 16 и составляет 49,11,44 % относительно контроля. Высокие показатели степени деструкции проявляли штаммы: Nocardia sp. 1 - степень деструкции составила 44,22,31 %, Bacillus sp. 3 - 45,61,38 %, Serratia sp. 28 - 430,94 % (рисунок 2). Рисунок 2 - Деструкция нефти мезофильными и психроактивными штаммами-нефтедеструкторами
Степень деструкции в пределах 30-40 % проявляли штаммы Staphylococcus sp. 2 (36,11,02 %), Pseudomonas sp. 4 (341,45 %), Rhodococcus sp. 29 (33,80,84 %) и Pseudomonas sp. 30 (33,50,73 %) (рисунок 2). При исследовании психроактивных штаммов установлено, что для них характерна степень деструкции 29,40,93 % для Micrococcus sp. 61 и 21,90,85 % для Serratia sp. 62 (рисунок 2). Отмечено, что наиболее активные микроорганизмы - деструкторы нефти являются также наиболее активными эмульгаторами нефтепродуктов. Таким образом, для дальнейших исследований отобраны мезофильные штаммы, показавшие степень деструкции нефти более 30 %, то есть штаммы Nocardia sp. 1, Staphylococcus sp. 2, Bacillus sp. 3, Pseudomonas sp. 4, Serratia sp. 16, Serratia sp. 28, Rhodococcus sp. 29 и Pseudomonas sp. 30 и психроактивные бактерии Micrococcus sp. 61 и Serratia sp. 62.
Биохимическое разложение основной массы разлитой нефти протекает очень медленно, так как в природе не существует какого-либо определенного вида микроорганизма, способного разрушить все компоненты нефти. Легче всего протекает микробиологическое разложение парафинов. Установлено, что из исследуемых мезофильных штаммов все бактерии обладают способностью к деструкции парафина. Однако, 2 штамма Staphylococcus sp. 2 и Pseudomonas sp. 30 обладают средней парафинокисляющей активностью, то есть рост бактерий наблюдается вокруг парафиновых пленок, а не на них. Штаммы Nocardia sp. 1, Pseudomonas sp. 3, Bacillus sp. 3, Serratia sp. 16, Serratia sp. 28, Rhodococcus sp. 29 по результатам эксперимента обладают высокой парафинокисляющей активностью, колонии данных микроорганизмов разрастаются вокруг пленок парафина, покрывая их сплошным слоем. Из исследуемых психроактивных бактерий оба штамма Micrococcus sp. 61 и Serratia sp. 62 обладали высокой способностью к деструкции парафина.
При микробиологическом разрушении нефти окисляются преимущественно парафины нефти, в то время как другие фракции (циклопарафины, ароматические углеводороды, смолы) менее доступны микробным ферментам (Звягинцева, 2001). Моторные масла, присутствующие в двигателях судов, относятся к числу трудноокисляемых фракций нефти, и могут попадать в морскую акваторию при аварийных ситуациях.
В результате исследования способности отобранных штаммов к деструкции моторного масла установлено, что активным деструктором данного нефтепродукта является штамм Serratia sp. 16, процент убыли нефтепродукта которого составляет 40,42,41% относительно контроля (рисунок 3). Также активными деструкторами моторного масла являются штаммы Bacillus sp. 3, утилизирующий масло на 33,51,32 %, и Rhodococcus sp. 29, для которого характерна деструкция 27,40,87 % (рисунок 3). При исследовании деструкционных свойств психроактивных бактерий также отмечена высокая степень деструкции при низких температурах инкубации - Micrococcus sp. 61 разрушал моторное масло на 14,30,72 %, Serratia sp. 62 на 12,60,03 % относительно контроля (рисунок 3). Рисунок 3 - Деструкция моторного масла активными штаммами-нефтедеструкторами
Таким образом, среди изученных штаммов обладают высокой эмульгирующей активностью по отношению ко всем исследуемым нефтепродуктам и деструктирующими свойствами мезофильные бактерии Bacillus sp. 3, Serratia sp. 16 и Rhodococcus sp. 29 и психроактивные штаммы Micrococcus sp. 61 и Serratia sp. 62, которые были отобраны для дальнейших исследований.
Оценка токсичности нефтедеструкторов и очищенных ими модельных микроэкосистем При определении токсичности суспензий активных штаммов-нефтедеструкторов на представителях зоопланктона - науплиальных стадиях жаброногого ракообразного Artemia salina L. установлено, что суспензии мезофильных культур Bacillus sp. 3, Serratia sp. 16 и Rhodococcus sp. 29 не оказывают токсического действия на тест-объект. Величина погибших науплиусов артемий в суспензии по отношению к контролю составляет 12,50,24, 70,31 и 6,50,04% соответственно. Психроактивные штаммы Micrococcus sp. 61 и Serratia sp. 62 оказывают токсическое действие на тест-объект, величина погибших науплиусов артемий в суспензиях данных штаммов составляет 632,36 и 511,84% относительно контроля. Критерием острой летальной токсичности воды является гибель 50% и более науплиусов в опыте по сравнению с контролем за 72 ч эксперимента, то есть психроактивные штаммы токсичны для исследуемого тест-объекта.
Не токсичными для одноклеточных зеленых протококковых водорослей Scenedesmus quadricauda (Тurp) Breb. являются суспензии штаммов Bacillus sp. 3 и Serratia sp. 16, численность клеток водорослей в эксперименте с данными штаммами выше, чем в контроле и составляла 69,32,21 и 844,15 % по отношению к контролю. Для штаммов Rhodococcus sp. 29 и Serratia sp. 62 значения численности составляют 562,69 и 532,55 % относительно контроля, то есть острой летальной токсичности не обнаружено, но данный показатель находится на границе между токсичностью и безопасностью суспензии. В эксперименте со штаммом Micrococcus sp. 61 отмечено, что численность клеток водорослей по отношению к контролю составляет 80,05 %, что свидетельствует о наличие острой токсичности данной суспензии по отношению к фитопланктону. Таким образом, для дальнейших исследований были отобраны не токсичные к тест-объектам мезофильные штаммы Bacillus sp. 3, Serratia sp. 16, и Rhodococcus sp. 29 При нефтяном загрязнении наибольшее значение для самоочищения водоемов имеет биологическая детоксикация нефти. Для изучения способности штаммов к детоксикации нефти (1% по объему) был поставлен эксперимент с 6 микроэкосистемами на морской воде: 1) с нефтью и суспензией штамма Rhodococcus sp. 29; 2) с нефтью и суспензией штамма Bacillus sp. 3; 3) с нефтью и суспензией штамма Serratia sp. 16; 4) с нефтью и суспензией штаммов Bacillus sp. 3, Serratia sp. 16 и Rhodococcus sp. 29; 5) только с нефтью; 6) без добавок (контроль). Определение токсичности микроэкосистем на науплиальных стадиях жаброногого ракообразного Artemia salina L. показало, что очищенная вода в микроэкосистемах при добавлении суспензий штаммов менее токсична для тест-объектов по сравнению с микроэкосистемой с нефтью, но без внесения микроорганизмов. Также отмечено, что процентная концентрация летальной кратности разбавления (ЛКР50-96) морской воды в эксперименте во всех вариантах опыта увеличивается в течение первых 15 суток, при этом токсичность воды без штаммов (2 %) намного превышала токсичность воды с суспензиями исследуемых бактерий (от 20,89 до 50,5%). К 30-м суткам экспозиции ЛКР50-96 в микроэкосистемах с суспензиями снижалась (24,55-56,2 %), а без них ЛКР50-96 составляла 3,6 %. Важно отметить, что в течение всего периода исследования меньшей токсичностью по отношению к науплиусам артемий обладала вода микроэкосистемы 3 со штаммом Serratia sp. 16 (от 24,56 до 56,2 %). Таким образом, данный штамм активнее всего понижает токсичность загрязненной нефтью воды.
При исследовании токсичности воды микроэкосистем на одноклеточных зеленых водорослях Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. отмечено, что все исследуемые штаммы Bacillus sp. 3, Serratia sp. 16 и Rhodococcus sp. 29 в той или иной степени способны снижать токсичность воды (ИК50-72), загрязненной нефтью. Так за весь период исследования в микроэкосистеме 1 ИК50-72 составляла от 17 до 46,8 %, в микроэкосистеме 2 - от 20 до 55 %, в микроэкосистеме 3 - от 23,4 до 43,7, в микроэкосистеме 4 - от 24,6 до 46,77, а в микроэкосистеме 5 - от 18,6 до 1,86 %. Таким образом, во всех микроэкосистемах со штаммами наблюдается постепенное снижение токсичности очищенной воды по отношению к водорослям, а в микроэкосистеме с нефтью без микроорганизмов (микроэкосистема 5) токсичность увеличивается. В результате проведенных исследований токсичности воды из микроэкосистем, загрязненных нефтью, с добавлением суспензий штаммов установлено, что внесение всех исследуемых штаммов снижает токсичность исследуемой воды для выбранных тест-обьектов. Большую активность по снижению токсичности проявил штамм Serratia sp. 16. Исследование хозяйственно-полезных свойств нефтедеструкторов При попадании нефти на прибрежные территории в почве происходит изменение микроценоза: снижается общая численность микроорганизмов, но увеличивается общая численность фитопатогенных грибов (Марфенина, 1999; Пархоменко, 2008). Поэтому для уменьшения численности и ослабления активности таких грибов при ремедиации нефтезагрязненных территорий рекомендовано использовать микроорганизмы с фунгицидными свойствами. Фунгицидную активность определяли по отношению к фитопатогенным грибам Fusarium graminearum, F. sporotrichoides и Alternaria tenuissima, предоставленным лабораторией технологии микробных препаратов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН. Отмечено, что по отношению ко всем исследуемым микромицетам штамм Rhodococcus sp. 29 проявляет слабые фунгицидные свойства (от 6 до 8 мм). Для штамма Serratia sp. 16 характерны более высокие показатели фунгицидной активности: в эксперименте с микромицетом A. tenuissima диаметр зоны ингибирования составляет 130,2 мм, F. graminearum - 180,6 мм и F. sporotrichoides - 150,3 мм. Наибольшей фунгицидной активностью по отношению ко всем исследуемым грибам-фитопатогеннам обладает штамм Bacillus sp. 3, который вызывает полное подавление роста фитопатогенов в зоне ингибирования, усиленное спороношение, видоизменение мицелия. Диаметр зон ингибирования составляет: для F. graminearum - 502,1 мм, для F. sporotrichoides - 351,5 мм и для A. tenuissima - 210,9 мм. Таким образом, из выделенных бактерий штаммы Serratia sp. 16 и Bacillus sp. 3, которые являются не только активными нефтедеструкторами, но и перспективными фунгицидами, отобраны для дальнейших исследований.
При определении фитотоксичности подсчитывали число проросших семян кресс-салата. Для штамма Bacillus sp. 3 процент всхожести семян составил 983,4 % относительно проросших семян в контроле. Для штамма Serratia sp. 16 отмечено, что всхожесть семян в эксперименте составила 1345,7 %, то есть количество проросших семян с данным штаммом выше, чем в контроле на 34%. Таким образом, установлено, что исследуемые штаммы не токсичны для растений.
При исследовании фитостимулирующей активности измеряли общую длину проросших семян кресс-салата. Так, Serratia sp. 16 стимулирует рост кресс-салата на 215,48,7 %, а штамм Bacillus sp. 3 - на 198,47,4 % по сравнению с контролем.
Таким образом, в результате проведенных исследований можно сделать вывод, что штаммы Bacillus sp. 3 и Serratia sp. 16 способны к активной стимуляции роста растений. Идентификация активного штамма-нефтедеструктора, обладающего хозяйственно-полезными свойствами
При анализе всех полученных данных по скринингу углеводородокисляющих микроорганизмов установлено, что штамм Serratia sp. 16 обладает всеми изученными литическими и гидрофобными свойствами, высокой эмульгирующей и парафинокисляющей активностями, является активным деструктором нефти и нефтепродуктов, не токсичен по отношению к исследуемым гидробионтам, обладает фунгицидными свойствами по отношению к фитопатогенным грибам и фитостимулирующей активностью. Таким образом, штамм Serratia sp. 16 отобран для дальнейших филлогеннетических исследований, которые были выполнены в ФГУП "ГосНИИГенетика". При проведении секвенирования вариабельных участков 16S rDNA штамма Serratia sp. 16 получена нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма. Уровень сходства последовательностей 16S rDNA штамма Serratia sp. 16 с видом Serratia grimesii составил 99%. Выводы
1. Численность углеводородокисляющих бактерий гетеротрофного пикопланктона составляла от 4,4 до 11,5% от общего количества сапротрофов (от 11*103 до 50,8*103 КОЕ/мл) в зависимости от сезона, рельефа дна и глубины исследуемого участка. 2. Значения ассимиляционного потенциала морской воды по величине бактериальной деградации составляют от 0,047 до 0,092 г углеводородов в сутки в 1 м3 морской воды, а потенциальной окислительной способности от 0,02 до 0,95 гУВ/м3 в сутки в зависимости от сезона года и глубины.
3. Выявлено 84 изолята с углеводородокисляющими свойствами. Наиболее активными явились штаммы Bacillus sp. 3, Serratia sp. 16 и Rhodococcus sp. 29, обладающие липолитической, амилолитической, протеолитической, эмульгирующей активностями (от 32 до 59 %), способностью к деструкции нефти (от 38 до 49,1 %), парафина, моторного масла (от 27,4 до 40,4 %). 4. Биотестирование суспензий активных штаммов, а также очищенной ими морской воды в микроэкосистемах показало, что бактерии Bacillus sp. 3, Serratia sp. 16 и Rhodococcus sp. 29 не токсичны по отношению к исследуемым тест-объектам. 5. Установлено, что штаммы Bacillus sp. 3, Serratia sp. 16 и Rhodococcus sp. 29 обладают фунгицидной активностью, набольшие зоны ингибирования обнаружены у штаммов Bacillus sp. 3 и Serratia sp. 16 (от 13 до 50 мм). Данные штаммы не фитотоксичны и обладают фитостимулирующей активностью (Bacillus sp. 3 стимулирует рост кресс-салата на 198,47,4 %, Serratia sp. 16 - на 215,48,7 %).
6. Активный штамм-нефтедеструктор, не токсичный по отношению к гидробионтам и обладающий хозяйственно-полезными свойствами генетически идентифицирован как Serratia grimesii.
Публикации в изданиях, включенных в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени кандидата наук, рекомендованные Высшей аттестационной комиссией:
1. Куликова И.Ю., Гриднева В.В. Выделение, селекция и исследование углеводородокисляющих микроорганизмов Каспийского моря // Бюллетень Московского Общества испытателей природы. Отдел биологический, том 114, выпуск 2, 2009, Приложение 1 "Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах". Москва, 2009. - С. 231-233. 2. Гриднева В.В., Куликова И.Ю. Аборигенные углеводородокисляющие микроорганизмы в биоремедиации Северного Каспия от нефтяного загрязнения // Юг России: экология, развитие. - 2010 - №4. - С. 78-80.
3. Курапов А.А., Умербаева Р.И., Гриднева В.В. Микроорганизмы в процессах деструкции нефти в водоемах // Юг России: экология, развитие. - 2010 - №4. - С. 86-88.
4. Соколова В.В., Дзержинская И.С. Скрининг мезофильных и психроактивных углеводородокисляющих микроорганизмов шельфовых вод Северного Каспия / Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. - 2011. - № 4. - С. 38-42.
5. Оценка ассимиляционного потенциала и ассимиляционной емкости Северного Каспия по отношению к нефтяному загрязнению / В. В. Соколова [и др. ] // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. - 2011. - № 10. - С. 40-44.
6. Соколова В.В. Экспериментальная оценка токсичности суспензии нефтеокисляющих бактерий и очищенных ими морских вод / В. В. Соколова, И. С. Дзержинская, А. А. Курапов // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. - 2011. - № 10. - С. 55-59.
Публикации в научных журналах и изданиях:
7. Гриднева В.В. Свойства углеводородокисляющих штаммов как перспективных объектов экологической биотехнологии // Биология - наука XXI века: 13-ая международная Пущинская школа-конференция молодых учёных, (Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009 года). Сборник тезисов. - С. 161- 162. 8. Куликова И.Ю., Гриднева В.В. Микробиологический мониторинг Северного Каспия в условиях поиска и разработки морских нефтегазовых месторождений // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. - 2009. - № 9. - С. 61-65.
9. Гриднева В.В. Биосурфактанты микроорганизмов Северного Каспия / Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы // сб. тезисов Всерос. шк.-семинара для студ., аспир. и молод. ученых (Белгород, 14-17 октября 2009 г) // под ред. д.х.н. О.Е. Лебедевой. - Белгород: Изд-во БелГУ, 2009. - 76 с, С. 13-16. 10. Гриднева В.В., Куликова И.Ю. Исследование мезофильного и психрофильного микробного сообщества Северного Каспия, способного к деструкции нефти и нефтепродуктов / "Perspektywiczne opracowania sa nauka i tecnhnikami - 2009" // Materialy v miedzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji, 07-15 listopada 2009 roku, Voliume 8. Medycyna. Nauk biologicznych. - Przemysl: Sp.zo.o. "Nauka I studia", 2009. - 80 str., Str. 48 - 50.
11. Гриднева В.В., Куликова И.Ю. Деструкция нефтяных углеводородов микроорганизмами Северного Каспия в условиях пониженных температур / Альманах современной науки и образования. Тамбов: Грамота, 2009. № 11 (30): в 2-х ч. Ч. 1. - С. 116-118. 12. Гриднева В.В., Куликова И.Ю. Поиск и изучение микроорганизмов Северного Каспия, способных к деструкции углеводородов // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Всероссийский симпозиум с международ. участием, Москва, МГУ им. Ломоносова, биолог. фак., 24-27 декабря 2009 г.: Материалы. - М.: МАКС Пресс, 2009. - С. 51. 13. Гриднева В.В. Скрининг углеводородокисляющих микроорганизмов Северного Каспия и изучение их свойств // Актуальные проблемы современной науки и образования. Биологические науки: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Т.II. - Уфа: РИЦ БашГУ, 2010. - С. 335- 339. 14. Гриднева В.В. Изучение нефтедеструктивной активности микрофлоры шельфовых вод Северного Каспия // Первые междунар. Беккеровские чтения. Сборник научн. трудов по материал. конференции (27-29 мая 2010). - Волгоград. - 2010. - С. 94-96. 15. Гриднева В.В. Деградация нефтяных углеводородов морскими бактериями // Биология - наука ХХI века: 14-ая Пущинская международ. школа-конференц. молод. ученых (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.). - С. 239.
16. Гриднева В.В. Выделение и исследование микроорганизмов, обладающих углеводородокисляющими свойствами // Инновационные технологии в управлении, образовании, промышл. "АСТИНТЕХ- 2010": материал. Международ. Научн. Конф. 11-14 мая 2010 г.-Т. 3. - С. 20-21. 17. Гриднева В.В. Микроорганизмы-деструкторы нефтяных углеводородов // Международная отраслевая научная конференция профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященная 80-летию основания АГТУ (54 ППС): тез. докл. в 2 т / под общ. ред. Н.Т. Берберовой, А.В. Котельникова - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2010. - Т.1. - С. 296. 18. Гриднева В.В. Биодеградация нефтяных углеводородов микроорганизмами Северного Каспия // материал. I-ой научно-практическ. конференции "Новейшие технологии освоения месторождений углеводородного сырья и обеспечение безопасности экосистем Каспийского шельфа". - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2010. - С. 121-124.
19. Гриднева В.В. Активность морской микрофлоры в условиях нефтяного загрязнения // материал. V междунар. конфер. "Биология: от молекулы до биосферы". - Харьков: Оперативная полиграфия, 2010- С. 186-187.
20. Соколова В.В. Биодеградация углеводородов нефти микроорганизмами шельфовых вод Северного Каспия // материал. междунар. конфер. с элементами научн. шк. "Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии", сост.: В.Н. Пилипенко, А.В. Федотова. - Астрахань: Изд. дом "Астраханский университет", 2010. - С. 291- 294.
21. Соколова В.В. Биоиндикация морских штаммов-нефтедеструкторов // Всеросс. симпозиум с междунар. участием "Автотрофные микроорганизмы"; ред.: Нетрусов А.И., Колотилова Н.Н. - М.: МАКС Пресс, 2010. - С. 90.
Подписано в печать 28.02.2012 г. Тираж 100 экз. Заказ № 158.
Типография ФГБОУ ВПО "АГТУ", тел. 61-45-23
г. Астрахань, Татищева 16 ж
6
2
Документ
Категория
Биологические науки
Просмотров
205
Размер файла
1 800 Кб
Теги
кандидатская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа