close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

«Ферментные системы катаболизма органофосфонатов у почвенных бактерий Achromobacter sp. и Ochrobactrum anthropi GPK 3»

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Свиридов Алексей Владимирович Шифр научной специальности: 03.01.04 - биохимия Шифр диссертационного совета: Д 002.121.01 Название организации: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К.Скрябина РАН Адрес организации: 1422
На правах рукописи
Свиридов Алексей Владимирович
ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ КАТАБОЛИЗМА
ОРГАНОФОСФОНАТОВ У ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ
Achromobacter sp. и Ochrobactrum anthropi GPK 3
03.01.04 Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пущино – 2012
Работа выполнена в лаборатории микробной энзимологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук, Пущино
Научный руководитель
доктор биологических наук
Леонтьевский Алексей Аркадьевич
Официальные оппоненты
Бурьянов Ярослав Иванович
доктор биологических наук, профессор,
Филиал Института биоорганической химии
им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН,
заведующий лабораторией
Кулаковская Татьяна Валентиновна
доктор биологических наук,
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г. К. Скрябина РАН,
заведующая лабораторией
Ведущая организация
Московский государственный университет
им. М. В. Ломоносова, Биологический факультет
Защита диссертации состоится « 29 » июня 2012 г. в 10 часов 00 мин на
заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Институте биохимии и
физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН по адресу: 142290,
г. Пущино Московской области, Проспект Науки, 5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и
физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН. Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed.gov.ru и http://www.ibpm.ru,
Автореферат разослан «_____»________________2012 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
доктор биологических наук
Доронина Нина Васильевна
Актуальность проблемы
Неизбежным результатом технологического прогресса является поступление в окружающую среду различных типов ксенобиотиков. К их числу относятся фосфонаты, содержащие прямую ковалентную связь углерод-фосфор
(С–Р). Такая связь чрезвычайно устойчива к химическим и физическим воздействиям, вследствие чего фосфонаты способны накапливаться в окружающей среде. Синтетические фосфонаты входят в состав многих пестицидов,
могут поступать в среду как отходы химической индустрии и продукты детоксикации фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ).
Глифосат (ГФ) является одним из наиболее распространенных синтетических фосфонатов и применяется как действующий компонент популярных
гербицидов (Roundup, Ground-Bio и др.). К 2010 г. объемы поступления ГФ в
среду превысили 800 тыс. тонн в год. По данным независимых исследований,
ГФ способен сохраняться в почвах в течение многих лет, изменяя состав почвенной микрофлоры, проникая в культурные растения и просачиваясь в водоемы. У животных ГФ может вызывать поражения печени, иммунной системы и нарушения эмбрионального развития.
Метилфосфоновая кислота (МФК) ― один из основных продуктов переработки ФОВ и побочный продукт ряда промышленных процессов, крайне
стабильна в окружающей среде и может сохраняться в почве в течение десятков лет, проявляя фитотоксические свойства.
В связи с этим актуален поиск способов ремедиации почв и водоемов,
загрязненных фосфонатами. Из-за высокой стойкости подобных соединений
единственный рациональный подход к решению данной проблемы предполагает применение микроорганизмов-деструкторов. Однако разработка подобных технологий затрудняется недостатком сведений об организации путей
метаболизма фосфонатов.
Считается, что С–Р связь большинства фосфонатов, в том числе МФК,
неспецифически расщепляется ферментным комплексом «С–Р лиаза», необратимо инактивирующимся при дезинтеграции клеток. Известно единствен1
ное сообщение о возможном существовании разновидности С–Р лиазы, специфически разлагающей ГФ (в настоящей работе обозначенной как C–Р лиаза II). Существует предположение об альтернативном пути разложения ГФ,
где начальную реакцию расщепления ГФ может катализировать фермент
глифосат-оксидоредуктаза с образованием аминометилфосфоновой кислоты
(АМФК). Однако ГФ-оксидоредуктаза не была очищена и охарактеризована.
Путь дальнейшего метаболизма АМФК, связанный с разрывом С–Р связи,
также неясен.
Дефицит знаний о метаболизме фосфонатов во многом объясняется отсутствием доступных и достоверных методов идентификации активности соответствующих ферментов, а также анализа их метаболитов. Разработка подобных методов и исследование метаболизма синтетических фосфонатов
бактериями-деструкторами является одной из приоритетных задач современной биохимии.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было изучение путей катаболизма глифосата и
метилфосфоновой кислоты у почвенных бактерий-деструкторов фосфонатов.
Для достижения цели работы необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработка методов количественного и качественного анализа исследуемых фосфонатов и их метаболитов, а также методик измерения активности ферментов их деструкции.
2. Подбор объектов исследования – штаммов, обладающих наибольшей
эффективностью деструкции в отношении изучаемых фосфонатов.
3. Изучение возможности адаптации штамма, выделенного под селективным давлением метилфосфоновой кислоты к утилизации глифосата.
4. Выявление путей метаболизма фосфонатов у отобранных штаммовдеструкторов.
5. Очистка нового фермента первичной атаки глифосата – глифосатоксидоредуктазы.
6. Характеристика глифосат-оксидоредуктазы.
2
Научная новизна
Разработаны новые методы идентификации и измерения активности
ферментов метаболизма ГФ и МФК с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии (ТСХ) и спектрофотометрического определения, отличающиеся высокой достоверностью.
Впервые показана возможность адаптации штамма-деструктора МФК
(Achromobacter sp. MPS 12), первоначально не способного утилизировать ГФ,
к использованию этого соединения как единственного источника фосфора.
Адаптированный штамм Achromobacter sp. MPS 12A по показателям деструкции ГФ был близок к O. anthropi GPK 3.
Доказано существование двух С–Р лиазных систем с различающейся субстратной специфичностью: С–Р лиаза I разлагала МФК, C–Р лиаза II – ГФ.
Впервые выявлено различие в путях метаболизма ГФ у штаммов, выделенных под селективным давлением двух разных фосфонатов: Achromobacter
sp. MPS 12А разлагал этот фосфонат с помощью ГФ-специфичной С–Р лиазы
II с образованием саркозина. Ферментом первичной атаки ГФ у O. anthropi
GPK 3 была ГФ-оксидоредуктаза; продуктами этой реакции были АМФК и
глиоксилат.
У O. anthropi GPK 3 был идентифицирован ранее не описанный путь метаболизма АМФК, который включал стадии переаминирования и разрыва
С–Р связи при вероятном участии фермента фосфоноацетальдегидгидролазы
(фосфонатазы).
ГФ-оксидоредуктаза O. anthropi GPK 3 была впервые очищена до электрофоретически гомогенного состояния. Изучены ее основные характеристики, определен кофактор, выявлены параметры, способствующие повышению
выхода фермента.
Практическая значимость
Разработанные высокоточные методы анализа фосфонатов и продуктов
их метаболизма отличаются универсальностью и могут применяться для обнаружения фосфонатов в природных образцах почвы и грунтовых вод, сточ3
ных водах, а также в лабораторных исследованиях при анализе гомогенатов
клеток и культуральной жидкости.
Изученные физиологические и биохимические особенности отобранных
штаммов-деструктров ГФ и МФК позволяют давать точную оценку деструктивного потенциала таких микроорганизмов. Обнаруженный эффект адаптации изучаемых бактерий к утилизации фосфонатов разных типов открывает
новые возможности селекции универсальных и высокоэффективных деструкторов, активных в отношении широкого диапазона этих соединений.
Данные о различиях в путях деструкции ГФ у штаммов, выделенных под
селективным давлением разных фосфонатов, позволяют осуществлять более
эффективный скрининг и отбор микроорганизмов, пригодных для последующего дальнейшего применения их в технологиях очистки природных
сред от загрязнения фосфонатами. Сведения о факторах, способствующих
индукции ГФ-оксидоредуктазы у O. anthropi GPK 3, дают возможность подобрать
условия,
способствующие
наибольшей
экспрессии
данно-
го фермента.
Впервые полученные сведения об организации и распределении ферментных систем катаболизма фосфонатов у бактерий являются основой для
разработки биотехнологий очистки и восстановления природных сред, загрязненных фосфонатами.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из 7 разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа изложена на 152 страницах, содержит 10 таблиц и 42 рисунка.
Библиографический указатель содержит 294 источника литературы.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: 10th International UFZ-Deltares/TNO conference on soilwater systems «ConSoil 2008» (Milan, Italy, 2008), 12-я международная школаконференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2008),
4
5-я международная конференция «Наука и образование для целей биобезопасности» (Пущино, 2008), Международная школа-конференция «Генетика
микроорганизмов и биотехнология» (Пущино, 2008), Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009.
Современные биоаналитические системы, методы и технологии» (ПущиноТула, 2009), 3rd International conference on Environmental, Industrial and Applied
Microbiology «BioMicroWorld 2009» (Lisbon, Portugal, 2009), Пущинская научно-практическая конференция «Системная биология» (Пущино, 2009),
Международный молодежный научный форум «Ломоносов-2010» (Москва,
2010), 14-я международная школа-конференция молодых ученых «Биология
– наука XXI века» (Пущино, 2010), 2-й международный конкресс-партнеринг
и выставка по биотехнологии и биоэнергетике «EurasiaBio» (Москва, 2010),
VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в изданиях из списка, рекомендованного ВАК и 10 тезисов в
сборниках отечественных и зарубежных конференций.
Исследования поддерживались грантом Российского фонда фундаментальных исследований 09-04-00320 «Глифосат-оксидоредуктаза бактерии
Ochrobactrum anthropi GPK 3» и в рамках проекта РНП 2.1.1.9227 «Создание
ассоциаций грибов и бактерий для биодеструкции устойчивых гетероциклических соединений».
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Среды для культивирования бактерий. Для культивирования бактерий использовали минеральную среду MS1 (Ермакова с сотр., 2008). Источниками фосфора служили МФК в концентрации 0,3 г/л, ГФ в концентрации
0,05-20 г/л в составе гербицида Roundup, 2-аминоэтилфосфоновая кислота (2АЭФ) и АМФК в концентрации 0,2 г/л, неорганический фосфат (Pi) в концентрации 0,3 г/л. Источниками углерода служили глутамат натрия, сукцинат
натрия, глицерин и глюкоза в концентрации 10 г/л.
5
Микроорганизмы. Использовали два штамма бактерий-деструкторов
фосфонатов: Ochrobactrum anthropi GPK 3 (ВКМ B-2554D), выделенный из
почв, загрязненных ГФ, и Achromobacter sp. MPS 12 (ВКМ B-2694), выделенный из сайтов загрязнения метилфосфоновой кислотой (МФК). При адаптации последнего к росту на средах с ГФ был получен деструктор МФК и ГФ
Achromobacter sp. MPS 12А.
Условия культивирования. Выращивание культур проводили 1) в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды на качалке при температуре 28 °С; 2) в
ферментерах АНКУМ-2 (ИБП РАН, Россия) объемом 10 л при температуре
28 °С и интенсивности аэрации 50 % от насыщения; 3) в герметически закрытых 15-мл пробирках с 5 мл среды.
Субклеточное фракционирование. Клетки фракционировали по методо Nossal и Heppel (1966) с модификациями: биомассу ресуспендировали в 40
мл 33 мМ Трис-HCl рН 7,65, добавляли 40 мл 33 мМ Трис-HCl рН 7,65, содержавшего 40% сахарозу и 100 мМ ЭДТА. После 10 мин инкубации при 22
°С клетки осаждали (18000 g х 5 мин) и отбирали фракцию периплазмы.
Сферопласты разрушали с помощью ИБФМ-пресса при рабочем давлении 0,9
МПа. Гомогенат помещали в ледяную баню, вносили 100 Ед ДНКазы I, осаждали центрифугированием (120000 g х 1 ч, 4 °С). Отделяли супернатант с
водорастворимыми белками цитоплазмы. Осадок ресуспендировали в 10 мл
буфера 100 мМ Трис-HCl рН 7,65, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 20% глицерин, 0,001 мМ фенилметилсульфонилфторид с 2% Тритон Х-100 и инкубировали 30 мин при 22 °С. Суспензию осаждали (120000 g х 1 ч, 22°С), отбирали
надосадочную жидкость.
Аналитические методы. Хроматографический анализ ГФ и его метаболитов в культуральных жидкостях, бесклеточных экстрактах и реакционных
смесях проводили методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), получая ацильные, бензоильные и дансильные производные (Свиридов с сотр., 2011). Концентрацию фосфонатов и Pi измеряли спектрофотометрическим методом с малахи6
товым зеленым (Hess and Derr, 1975) после гидролиза С–Р связи персульфатом аммония (Schowanek and Verstraete, 1990a).
Определение активности ферментов. Активность С–Р лиазы в интактных клетках I определяли: 1) по выделению метана при культивировании
бактерий на среде с МФК в герметичных пробирках (концентрацию метана
измеряли методом газовой хроматографии с помощью калибровочной кривой); 2) по убыли МФК и накоплению Pi (определяли спектрофотометрически по цветной реакции Pi с молибдатом аммония в присутствии малахитового зеленого) (Sviridov et al., 2012).
Активность С–Р лиазы II в интактных клетках идентифицировали по
присутствию в бесклеточных экстрактах саркозина, который обнаруживали
методом ВЭЖХ в виде ацильных, дансильных и бензоильных производных
(Свиридов с сотр., 2011).
Определение активности ГФ-оксидоредуктазы в субклеточных фракциях
O. anthropi GPK 3 проводили 1) спектрофотометрическим методом по образованию окрашенного комплекса продукта реакции (глиоксилата) с фенилгидразином (Свиридов с сотр., 2011); 2) методом ВЭЖХ, определяя концентрацию глиоксилата и АМФК (в виде производных) в реакционных смесях
(Sviridov et al., 2012).
Убыль
АМФК,
образующейся
при
расщеплении
ГФ
глифосат-
оксидоредуктазой, обнаруживали методом ВЭЖХ в реакционной смеси, содержавшей ГФ, бесклеточный экстракт, пиридоксаль-5’-фосфат и пируват
натрия.
Активность фосфонатазы определяли по окислению НАДН в сопряженной реакции с алкогольдегидрогеназой, восстанавливавшей один из продуктов фосфонатазной реакции – ацетальдегид.
Очистка ГФ-оксидоредуктазы. Белки бесклеточного экстракта осаждали сульфатом аммония до 80% насыщения, осадок отделяли центрифугированием, растворяли в буфере 50 мМ Трис-HCl рН 7,65, 100 мМ NaCl,
10 мМ MgCl2, 0,05 мМ ЭДТА и подвергали гель-фильтрации на колонке
7
Superdex 200 (2,6 х 60 см). Активные фракции наносили на колонку OctylSepharose (1 х 6 см), элюировали буфером, содержавшим 1 М сульфата аммония.
Препарат
затем
подвергали
гель-фильтрации
на
колонке
Toyopearl HW-60 (1,6 х 100 см).
Характеристика ГФ-оксидоредуктазы. Денатурирующий электрофорез проводили по Laemmli (1970), белковые полосы проявляли по Fairbanks
(1971). Нативный электрофорез проводили в полиакриламидном геле
(ПААГ) с градиентом концентрации 4-10% в системе для кислых белков.
Окрашивание белков проводили 0,2% раствором нитратом серебра в 0,4%
растворе формальдегида.
Молекулярную массу (ММ) фермента определяли по электрофоретической подвижности и с помощью гель-фильтрации на колонке Superdex 200,
предварительно калиброванной с помощью набора Gel Filtration Molecular
Weight Markers (Sigma, США).
Изоэлектрофокусировку проводили в 5% ПААГ в градиенте рН 3,0-10,0 с
амфолинами фирмы Pharmacia (pharmalytes). Белковые полосы проявляли последовательной инкубацией геля в смеси уксусной кислоты, этанола и воды
(19 : 25 : 65), содержащей 0,1% CuSO4 и 0,05% кумасси R-250. Изоэлектрическую точку определяли с помощью набора Calibration Kit for pI Determinations
using Isoelectric Focusing Broad Range pI (pH 3-10) (GE Healthcare, США).
Определение зависимости активности ГФ-оксидоредуктазы от рН среды
проводили спектрофотометрически в буфере Britton и Robinson (1931) в интервале рН 6,8-9,6.
Температурный оптимум фермента определяли спектрофотометрически
в диапазоне 20-60 °С при термостатировании измерительной кюветы.
Термостабильность определяли путем инкубирования ферментного препарата при температурах 22, 25, 30, 40, 45, и 50 °С в течение часа; измерения
остаточной активности проводили через 5, 10, 15, 30 и 60 мин после начала
инкубации.
8
Спектры поглощения препаратов ГФ-оксидоредуктазы и реакционных
смесей в диапазоне 300-560 нм записывали на спектрофотометре Shimadzu
UV-1650PC (Япония). Апофермент отделяли от кофактора после инкубации в
буфере 33 мМ Трис-HCl рН 8,05 с помощью ультрафильтрации.
Свободный кофактор получали кипячением препарата ГФ-оксидоредуктазы и анализировали методом ВЭЖХ на колонке Lichrospher 100 RP18
250 x 4 мм (Dr. Maisch, Германия) в подвижной фазе метанол : 5 мМ ацетат аммония рН 6,0 (20 : 80 ) с детектором оптического поглощения при 450 нм.
Значения Km и Vmax определяли с линеаризацией данных в координатах
Хейнса-Вольф. Влияние ионов металлов изучали в реакционных смесях, содержавших очищенный ферментный препарат, 2 мМ ГФ и соли: MgCl2 в
концентрации 1-20 мМ; NiCl2, CuSO4, MnCl2, ZnCl2, FeSO4, CoCl2 в концентрации 10 мМ.
Ингибиторный анализ ГФ-оксидоредуктазы проводили в реакционных
смесях, содержавших очищенный фермент, 2 мМ ГФ и глицин, саркозин,
AgNO3, ФМСФ, p-хлормеркурийбензойную кислоту (рХМБ), MnCl2, CuSO4 в
концентрации 0,1-4 мМ.
Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли с
помощью реактива Брэдфорд (Sigma) в соответствии с рекомендациями производителя.
Статистическая обработка результатов. Все эксперименты проводили в
трех повторностях. На основании полученных выборок определяли стандартное
отклонение и доверительный интервал при уровне значимости 0,95.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Разработка методов анализа ГФ и его метаболитов. Были предложены
новые методы обнаружения и количественного определения ГФ и соединений, образующихся при его деструкции с помощью ВЭЖХ (табл. 1) и ТСХ
(табл. 2). Получение ацильных, бензоильных и дансильных дериватов проб
позволяло значительно снизить предел обнаружения, и достичь высокой дос9
товерности анализа. В рутинных экспериментах использовалось ацилирование проб, требовавшее наименьших временных затрат. Бензилирование и
дансилирование применялось для верификации полученных данных.
Отбор и характеристика штаммов-деструкторов фосфонатов. По результатам скринига лабораторной коллекции микроорганизмов были отобраны:
1) штамм Achromobacter sp. MPS 12, отличавшийся наибольшей эффективностью утилизации МФК (табл. 3); 2) штамм Ochrobactrum anthropi GPK 3 –
лучший деструктор ГФ (табл. 3).
Таблица 1.
Анализ производных ГФ и его метаболитов методом ВЭЖХ
Ацилпроизводные
Бензоилпроизводные
Дансилпроизводные
Соединение
Время
Предел об- Время удер- Предел обна- Время удер- Предел обнаудержания, наружения, жания, мин
ружения,
жания, мин
ружения,
мин
нг/мкл
нг/мкл
нг/мкл-1
ГФ
19,97
0,60
43,16
0,36
4,73
0,16
АМФК
4,98
0,90
6,52
0,44
13,31
0,48
Саркозин
11,00
0,86
21,44
0,74
26,16
0,33
Глицин
9,20
0,40
19,73
0,36
14,67
0,29
Глиоксилат
5,40
0,76
5,40
0,76
н/о
н/о
* н/о – не определяли
Таблица 2.
Хроматографическая подвижность и пределы обнаружения ГФ и его метаболитов методом ТСХ в немодифицированном виде и в виде дансилпроизводных
Без модификации
Дансилпроизводные
Предел обнаружения,
Предел обнаружения,
Соединение Rf (%)
Rf (%)
нг
нг
ГФ
33 ± 1
600
32 ± 1
30
АМФК
25 ± 1
500
49 ± 1
35
Саркозин
54 ± 2
250
-*
1
Глицин
64 ± 2
200
23 ± 1
1
* Определение саркозина проводили методом двумерной ТСХ
Адаптация штамма Achromobacter sp. MPS 12 к утилизации ГФ. В отличие от прочих изученных деструкторов МФК, не способных расти на средах с
ГФ, у Achromobacter sp. MPS 12 был обнаружен крайне слабый рост на среде с
этим фосфонатом (табл. 3), в связи с чем данный штамм был подвергнут адап10
тации к утилизации ГФ путем последовательных пассажей на жидких средах,
содержавших данный фосфонат (рис. 1). После 8 пассажей ростовые характеристики Achromobacter sp. MPS 12 стабилизировались (рис. 1, 8). Адаптированная форма получила обозначение Achromobacter sp. MPS 12A (табл. 3).
Подобный эффект адаптации не описан в литературе и мог объясняться
исходной генетической неоднородностью популяции Achromobacter sp. MPS
12, которая могла содержать незначительную долю клеток, способных утилизировать ГФ и получивших решающее конкурентное преимущество при росте на средах с данным фосфонатом.
Обнаружение активности С–Р лиазы I. Активность МФК-специфичной С–Р
лиазы (обозначена нами как «C-P лиаза I») обнаружена у всех исследованных
штаммов по выделению метана при росте на среде с МФК, но не на среде с ГФ
Выделение метана и убыль МФК в среде были эквимолярными (табл. 4).
Таблица 3.
Ростовые характеристики O. anthropi GPK 3, Achromobacter sp. MPS 12 и
MPS 12A при культивировании на средах с ГФ и МФК
Микроорганизм
1
2
3
4
5
6
O. anthropi GPK 3
Achromobacter sp.
MPS 12
Achromobaсter sp.
MPS 12A
O. anthropi GPK 3
Achromobacter sp.
MPS 12
Achromobacter sp.
MPS 12A
Источник
Максимальная Продол- Удельная дефосфора в Максимальная
удельная ско- жительструкция
среде куль- биомасса, г/л
рость роста,
ность фосфонатов,
тивировачас-1
лаг-фазы мг/г биомассы
ния
ГФ
2,8
0,12
22
51 6
ГФ
0,25
0,03
60
16 1
ГФ
2,2
0,09
24
48 3
МФК
2,5
0,1
14
48 2
МФК
3,4
0,13
19
57 2
МФК
2,7
0,12
20
50 2
11
5
Рисунок 1. Адаптация Achromobacter
4,5
4
ОП560, ед.
sp. MPS 12 к утилизации ГФ в качест-
8
3,5
3
ве единственного источника фосфора
6
4
2
2,5
2
при последовательных пассажах культуры на жидких средах с 0,5 г/л ГФ. 1,
1,5
2, 4, 6, 8 – номера пассажей; пунктир-
1
ная линия – рост культуры MPS 12,
1
0,5
полученной после 8 пассажа, на среде
0
0
50
100
Длительность культивирования, ч
с МФК.
Таблица 4.
Утилизация ГФ и МФК при культивировании штаммов-деструктров в
герметичных пробирках в течение 24 ч
Культивирование в среде с 0,3 г/л МФК
Штаммдеструктор
Культивирование в среде с
0,5 г/л ГФ
Биомасса, г/л
Метан,
мкмоль/г
биомассы*
Потребление
МФК, мкмоль/г
биомассы**
Биомасса,
г/л
Потребление ГФ,
мкмоль/г биомассы**
GPK 3
0,8
293,0 ± 35
270,1 ± 13
0,7
283,8 ± 3
MPS 12
1,6
418,0 ± 3
426,9 ± 2
0,1
0
MPS 12A
1,4
446,0 ± 6
447,8 ± 2
0,4
124,2 ± 2
* Результаты газохроматографического анализа
** По данным спектрофотометрического измерения с малахитовым зеленым
Метаболизм ГФ исследованными штаммами. Деструкция ГФ у
Achromobacter sp. MPS 12A и O. anthropi GPK 3 шла по двум метаболическим путям. Achromobacter sp. MPS 12A обладал ГФ-специфичной С–Р лиазой (обозначена нами как «С-Р лиаза II»), что подтверждалось наличием саркозина в бесклеточном экстракте при культивировании на ГФ, и метаболитов
саркозина – глицина и формальдегида (табл. 5). У Achromobacter sp. MPS 12,
не способного утилизировать ГФ, саркозин отсутствовал, а концентрация
12
глицина была значительно ниже. У O. anthropi GPK 3 основным метаболитом
ГФ была АМФК (табл. 5), что указывало на наличие ГФ-оксидоредуктазы,
катализирующей первичную атаку ГФ (рис. 2, А).
Таблица 5.
Внутриклеточные концентрации ГФ и его метаболитов у штаммов
Achromobacter sp. MPS 12, MPS 12A и O. anthropi GPK 3
Соединение
MPS 12
0,5 ± 0,02 мкМ
0
0
0
0,13 ± 0,04 мМ
0
ГФ
АМФК
Глиоксилат
Саркозин
Глицин
Формальдегид
Штаммы
MPS 12А
0,9 ± 0,02 мкМ
0
0
0,28±0,01 мМ
0,57±0,09 мМ
0,08±0,02 мкМ
GPK 3
0,1 ± 0,002 мМ
0,27 ± 0,04 мМ
0,04 ± 0,01 мМ
0,04 ± 0,02 мкМ
0,09 ± 0,03 мМ
0,12 ± 0,02 мкМ
Фосфонатазный путь минерализации ГФ у O. anthropi GPK 3. В присутствии пиридоксаль-5’-фосфата и пирувата в бесклеточных экстрактах O.
anthropi GPK 3 наблюдалась убыль АМФК, образующейся при расщеплении
ГФ (рис. 2, Б). Такие кофакторы указывали на реакцию переаминирования,
ожидаемым продуктом которой должен был быть фосфоноформальдегид,
близкий по структуре фосфоноацетальдегиду – субстрату фосфоноацетальдегидгидролазы (фосфонатазы).
А
Б
Время
Время реакции,
реакции, мин
мин
Время реакции, мин
Рисунок 2. Убыль ГФ и образование АМФК и глиоксилата в бесклеточных экстрактах
O. anthropi GPK3. А – при рН среды 8,0 (буфер В); Б – при рН среды 8,5 в присутствии
пирувата натрия и пиридоксаль-5’-фосфата. – Глифосат; ▲ – АМФК; – Глиоксилат.
13
Для проверки гипотезы об участии фосфонатазы в деструкции ГФ, активность этого фермента измеряли в бесклеточных экстрактах O. anthropi
GPK 3 выращенных на средах с Pi, МФК, 2-АЭФ (предшественник фосфоноацетальдегида), АМФК и ГФ. В первых двух случаях активность фосфонатазы не обнаружено, в остальных случаях она была практически идентичной
(0,05±0,005 Ед/мг белка). Индукция фосфонатазы происходит: а) при отсутствии иных источников Pi и б) в присутствии подходящего субстрата. Тем
самым подтверждалось предположение об образовании в ходе деструкции
ГФ (и АМФК как его метаболита) субстрата, расщепляемого фосфонатазой с
образованием Pi и формальдегида.
Рисунок 3. Схема путей метаболизма фосфонатов у Achromobacter sp. MPS 12, MPS 12A и
Ochrobactrum anthropi GPK 3.
14
Таким образом, у O. anthropi GPK 3 выявлен не описанный ранее путь
полной минерализации ГФ, не связанный с экскрецией в среду культивирования АМФК, характерной для большинства известных деструкторов ГФ.
Пути деструкции фосфонатов, обнаруженные у исследованных штаммов,
представлены на рис. 3.
Влияние условий культивирования на активность ГФ-оксидоредуктазы.
Удельная активность ГФ-оксидоредуктазы в бесклеточных экстрактах O.
anthropi GPK 3 зависела от таких факторов, как тип источника углерода
(рис. 4, А), фаза роста культуры (рис. 4, Б) и концентрация ГФ в среде. Получение биомассы для исследования ГФ-оксидоредуктазы проводили с помощью сред с глутаматом натрия в фазе замедления роста, так как при росте
культуры на сукцинате натрия, несмотря на несколько большую активность
фермента, наблюдали быстрое защелачивание среды, затруднявшее контроль
рН, а также агрегацию клеток в результате образования слизистых капсул.
Наибольшую
активность
ГФ-оксидоредуктазы
наблюдали
в
лаг-фазе
(рис. 4, Б), однако количество биомассы в лаг-фазе было недостаточным.
Б
Удельная активность
ГФ-оксидоредуктазы,
Ед/мг белка
Удельная активность
ГФ-оксидоредуктазы,
Ед/мг белка
А
Источник углерода
Значение ОП560
Рисунок 4. Активность ГФ-оксидоредуктазы в бесклеточных экстрактах O. anthropi GPK
3. А – Влияние источника углерода в среде; Б – Влияние фазы роста при культивировании
на среде с глутаматом: лаг-фаза (ОП560=0,15), фаза экспоненциального роста (ОП560=2,00),
фаза замедления роста (ОП560=4,20), стационарная фаза (ОП560=4,90)
Очистка ГФ-оксидоредуктазы. Использованная схема очистки позволила
получить электрофоретически гомогенный препарат ГФ-оксидоредуктазы с
15
выходом 33,3% (табл. 6, рис. 5). ММ субъединицы, по данным денатурирующего электрофореза в ПААГ, составила 61,4 кДа (рис. 5, А), в то время
как ММ нативного фермента составляла около 620 кДа (рис. 5, Б), что указывало на гомодекамерную структуру ГФ-оксидоредуктазы.
По данным изоэлектрофокусировки в ПААГ ГФ-оксидоредуктаза имела
изоэлектрическую точку при рН 6,85 (рис. 6).
Таблица 6.
Таблица очистки ГФ-оксидоредуктазы
Стадия очистки
Бесклеточный
экстракт
Высаливание
Superdex 200
Общий белок,
мг
Удельная акОбщая активтивность, Ед/мг
ность, ФЕ
белка
Выход, %
Степень очистки
510,000
0,43
0,0008
100,00
1,00
384,000
2,970
0,40
0,36
0,0010
0,1227
93,28
85,08
1,24
146,10
Octyl-Sepharose
0,214
0,29
1,3765
68,82
1638,66
Toyopearl HW-60
0,082
0,13
1,5833
33,26
1884,92
Очищенный препарат ГФ-оксидоредуктазы имел максимумы оптического поглощения, характерные для флавоферментов (рис. 7, 1). Кофермент реакции (рис. 7, 2) был идентифицирован как ФАД методом ВЭЖХ. Связывание ФАД с молекулой фермента имело нековалентный характер: кофермент
десорбировался в относительно мягких условиях (кипячение, денатурация
мочевиной, инкубирование в буферах с низкой ионной силой) без проведения
реакций пептидолиза, необходимых для выделения ковалентно связанного
ФАД (Mewies, 1998). Восстановления активности после инкубации апофермента в буферах, содержавших различные концентрации ФАД, не происходило. Причиной этого, по-видимому, была характерная для многих флавоферментов крайне низкая стабильность апофермента, лишенного кофактора,
приводящая к необратимому изменению структуры активного центра (Hefti
et al., 2003).
16
кДа
М1
1
2
М2
кДа
Рисунок 5. ПААГ-электрофорез очищенного
препарата
669
97
66
440
А
–
Денатурирующий электрофорез в 10% ПААГ;
–
M1
45
ГФ-оксидоредуктазы.
белки-маркеры:
фосфорилаза
В
(97 кДа), БСА (66 кДа), овальбумин (45 кДа),
карбоангидраза (30 кДа), ингибитор трипсина (20 кДа), α-лактоальбумин (14,4 кДа); ок-
30
232
20,1
рашивание кумасси. Б – Нативный электрофорез в ПААГ с градиентом концентрации 410%; M2 – белки-маркеры: тироглобулин
14,4
140
А
Б
(669 кДа), ферритин (440 кДа), каталаза
(232 кДа), лактатдегидрогеназа (140 кДа);
Окрашивание нитратом серебра. 1, 2 – Очищенный препарат ГФ-оксидоредуктазы.
М
pI
3,50
1
Рисунок 6. Изоэлектрофокусировка ГФ-оксидоредуктазы.
4,55
5,20
5,85
M – белковые маркеры (pI): амилогликозидаза (3,50), со-
6,55
(6,55), кислая цепь миоглобина лошади (6,85), щелочная
7,35
цепь миоглобина лошади (7,35), кислая цепь лектина чече-
евый ингибитор трипсина (4,55), β-лактоголобулин А (5,20),
бычья карбоангидраза В (5,85), карбоангидраза В человека
вицы (8,15), средняя цепь лектина чечевицы (8,45), щелоч8,15
8,45
8,65
ная цепь лектина чечевицы (8,65), трипсиноген (9,30);
1 – ферментный препарат
9,30
Участие ФАД в реакции расщепления ГФ было продемонстрировано
при инкубации фермента в присутствии субстрата без доступа кислорода.
При этом наблюдали изменение максимумов поглощения, что указывало на
восстановление ФАД (рис. 7, 4) (Pedotti et al., 2009). Данный эффект нивелировался в присутствии убихинона Q-10.
17
Рисунок 7. Спектры оптического поглощения ГФ-оксидоредуктазы и ее кофак1
тора: 1 – холофермент; 2 – кофактор
2
(ФАД); 3 – после инкубации холофермента в анаэробных условиях в присутст-
3
вии субстрата; 4 – апофермент
4
ГФ-оксидоредуктаза обладала относительно узким диапазоном оптимальных значений рН (рис. 8); максимальная активность наблюдалась при
Активность ГФоксидоредуктазы, %
значении рН 8,05
120
100
Рисунок 8. Зависимость активности ГФ-
80
оксидоредуктазы от рН среды в буфере
60
Britton-Robinson
40
20
0
6,8
7,8
pH
8,8
9,8
Помимо ГФ, фермент проявлял активность в отношении иминодиацетата (ИДА) и фосфонометилиминодиацетата (ФИА). Для ГФ, ИДА и ФИА были определены основные кинетические константы (табл. 7). ИДА был лучшим субстратом и обладал наибольшим сродством к ферменту. Высокое значение Km для ФИА могло объясняться наличием у этого соединения третичного азота и дополнительной фосфонометильной цепью, в отличие от ИДА,
что
могло
затруднять
узнавание
ФИА
оксидоредуктазы.
18
активным
центром
ГФ-
Таблица 7.
Кинетические характеристики ГФ-оксидоредуктазы
Субстрат
ГФ
ИДА
ФИА
Km, мкМ
211
107
2450
Vmax, Ед/мг белка
3,68
4,64
1,67
Vmax/Km
0,17 • 10-1
0,43 • 10-1
0,68 • 10-3
Температурный оптимум активности ГФ-оксидоредуктазы был равен
40 °С (рис. 9, А); время полуинактивации в этих условиях составляло около
60 мин (рис. 9, Б).
Б
А
Рисунок 9. А. Температурный оптимум глифосат-оксидоредуктазы. Б. Термостабильность
фермента: – 30 °С; – 40 °С; ▲ – 45 °С; – 50° С; – 60 °С.
Ингибиторами ГФ-оксидоредуктазы были ионы Ag+, Cu2+, Mn2+, а также
р-хлормеркурийбензоат (рХМБ), атакующий прежде всего тиоловые группы
белков. Весьма слабыми конкурентными ингибиторами являлись глицин и
саркозин. Впервые описано субстратное ингибирование фермента при больших концентрациях ГФ (табл. 8).
Ионы металлов (Mg2+, Zn2+, Ni2+) могли оказывать не только ингибирующее, но и активирующее действие на ГФ-оксидоредуктазу (рис. 10). Процесс расщепления ГФ шел быстрее всего в присутствии MgCl2, оптимальное
значение концентрации которого составляло 10-15 мМ. Реакция ускорялась в
меньшей степени в присутствии NiCl2 и ZnCl2 (рис. 10). Ионы Fe2+ и Co2+ заметного влияния на скорость реакции не оказывали (данные не приведены).
19
Таблица 8.
Значения IC50 для различных ингибиторов ГФ-оксидоредуктазы
Соединение
Глифосат
Глицин
Саркозин
pХМБ
Ag+
Cu2+
Mn2+
IC50, мМ
14,8
22,9
11,3
0,7
0,6
1,4
0,8
Учитывая данные о способности ГФ связываться с активным центром
алкогольдегидрогеназы через атом цинка (Жемчужин и Горобец, 1989), можно предположить, что различия во влиянии металлов на активность ГФоксидоредуктазы зависят от константы устойчивости возникающих комплексов ГФ-металл-фермент, которые могут как облегчать связывание субстрата
в активном центре, так и препятствовать катализу. Так, в присутствии ионов
Cu2+ и Mn2+, ингибирующих ГФ-оксидоредуктазу, ГФ образует устойчивые
комплексы с рядом органических функциональных групп (Barrett and
McBride, 2005).
Рисунок 10. Активирующее действие ионов некоторых металлов на
процесс
расщепления
глифосата
ГФ-оксидоредуктазой. 1 – контроль;
2 – 10 мМ ZnCl2; 3 – 10 мМ NiCl2; 4
– 1 мМ MgCl2; 5 – 5 мМ MgCl2; 6 –
10 мМ MgCl2; 7 – 15 мМ MgCl2; 8 –
30 мМ MgCl2; 9 – 10 мМ MgCl2 + 10
мМ NiCl2; 10 – 10 мМ MgCl2 + 10
мМ ZnCl2.
20
ВЫВОДЫ
1. Разработаны качественные и количественные методики ВЭЖХ- и ТСХанализа глифосата и его метаболитов, включая их ацил-, бензоил-, дансилпроизводные. Предложен новый спектрофотометрический экспрессметод измерения активности глифосат-оксидоредуктазы, основанный на
образовании фенилгидразона глиоксилата как продукта реакции.
2. Деструктор метилфосфоновой кислоты Achromobacter sp. MPS 12 был
впервые адаптирован к потреблению глифосата как источника фосфора;
биодеструктивные характеристики адаптированного штамма MPS 12А были близки к таковым у O. anthropi GPK 3.
3. Доказано существование у бактерий двух С–Р лиазных систем, специфичных для разных субстратов: С–Р лиаза I (расщепление метилфосфоновой кислоты) и С–Р лиаза II (расщепление глифосата).
4. Изучение путей катаболизма фосфонатов у бактерий показало, что метилфосфоновая кислота и глифосат у Achromobacter sp. MPS 12A расщеплялись, соответственно, С–Р лиазой I и С-Р лиазой II, а у O. anthropi
GPK 3 – С–Р лиазой I и глифосат-оксидоредуктазой.
5. Впервые идентифицирован путь катаболизма глифосата с участием глифосат-оксидоредуктазы, продукт которой – аминометилфосфоновая кислота, минерализовался по ранее не описанному метаболическому пути
с участием аминометилфосфонат-специфичной аминотрансферазы и
фосфонатазы.
6. Впервые очищен до гомогенного состояния и охарактеризован фермент
первичной атаки глифосата – глифосат-оксидоредуктаза. В нативной
форме фермент являлся гомодекамером (ММ 620 кДа); ММ субъединицы 61,4 кДа; кофактор ФАД; оптимум рН 8,05, температуры – 40 °С; pI
6,85; ингибиторы рХМБ, Ag+, Cu2+, Mn2+.
21
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает благодарность сотрудникам ИБФМ РАН Винокуровой
Н. Г. и к.х.н. Зеленковой Н. Ф. за помощь в создании методов анализа органофосфонатов и синтез фосфоноацетальдегида, а также д.б.н. Моргунова И. Г. за помощь в разработке метода измерения активности фосфонатазы.
Автор глубоко признателен к.б.н. Ермаковой И. Т. и д.б.н. Леонтьевскому
А. А. за помощь в подготовке настоящей работы и плодотворное обсуждение
ее этапов.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи
1.
Свиридов А. В., Зеленкова Н. Ф., Винокурова Н. Г., Ермакова И. Т., Леонтьевский
А. А. Новые подходы к идентификации и определению активности ферментов деградации
глифосата. Биохимия. 2011. № 6. C. 880-887.
2.
Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Биодеструк-
ция глифосата почвенными бактериями: оптимизация процесса культивирования и способ
сохранения активной биомассы. Микробиология. 2012. № 1. C. 48-55.
3.
Sviridov, A. V., Shushkova, T. V., Zelenkova, N. F., Vinokurova, N. G., Morgunov, I.
G., Ermakova, I. T., Leontievsky, A. A. Distribution of Glyphosate and Methylphosphonate Catabolism Systems in Soil Bacteria Ochrobactrum anthropi and Achromobacter sp. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 2012. V. 97. P. 787-796.
Тезисы
1.
и
Свиридов А. В., Ермакова И. Т., Шушкова Т. В., Леонтьевский А. А. Обнаружение
очистка
нового
фермента
первичной
атаки
органофосфонатов
–
глифосат-
оксидоредуктазы. Сб. тез. 12-й международной школа-конференции молодых ученых
«Биология – наука XXI века». 2008. Пущино. C. 104-105.
2.
Свиридов А. В., Ермакова И. Т., Шушкова Т. В., Леонтьевский А. А. Ремедиация
загрязненных органофосфонатами почв с помощью микробных биопрепаратов. Материалы 5-й международной конференции «Наука и образование для целей биобезопасности».
2008. Пущино. C. 108-109.
3.
Свиридов А. В., Шушкова, Т. В., Ермакова, И. Т., Леотьевский, А. А. Разработка
научных основ для создания методов ремедиации загрязненных органофосфонатами почв
с помощью микробных препаратов. Сб. тез. международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». 2008. Пущино. С. 78.
22
4.
Свиридов А. В., Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Леонтьевский А. А. Метаболиче-
ские пути деструкции глифосата у почвенных бактерий. Сб. статей всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии». 2009. Пущино-Тула. С. 84-85.
5.
Sviridov A. V., Leontievsky A. A. Enzymes of phosphonates metabolism in soil bacteria.
Abstr. 3rd International conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology
«BioMicroWorld
2009».
2009.
Lisbon.
http://www.formatex.org/biomicroworld2009/abstracts/htm/167.htm
6.
Свиридов А. В., Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Леонтьевский А. А. Биохимиче-
ские основы разработки микробных препаратов для ремедиации загрязненных органофосфонатами почв. Сб. тез. Пущинской научно-практической конференции «Системная
биология». 2009. Пущино. С. 34-35.
7.
Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Характеристика нового фермента первичной
атаки органофосфонатов – глифосат-оксидоредуктазы. Сб. тез. 14-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». 2010. Пущино. Т. 1. С.
59-60.
8.
Свиридов А. В. Глифосат-оксидоредуктаза — новый фермент первичной атаки ор-
ганофосфонатов. Материалы международного молодежного научного форума «Ломоносов-2010». 2010. Москва. С. 62-63.
9.
Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Глифосат-оксидоредуктаза: новый фермент
деструкции органофосфонатов у бактерий. Сб. тез. 2-го международного конгресспартнеринга и выставки по биотехнологии и биоэнергетике «EurasiaBio». 2010. Москва.
С. 161-162.
10.
Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Пути утилизации глифосата почвенными
штаммами-деструкторами Ochrobactrum anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. MPS 12A.
Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 2011. Москва. С. 59-60.
23
Документ
Категория
Биологические науки
Просмотров
73
Размер файла
721 Кб
Теги
кандидатская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа