close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

МИКРОФЛЮИДНЫЕ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ МЕТОДАМИ ФЛУОРОМЕТРИИ И ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Евстрапов Анатолий Александрович Шифр научной специальности: 01.04.01 - приборы и методы экспериментальной физики Шифр диссертационного совета: Д 002.034.01 Название организации: Институт аналитического приборостроения РАН - Учрежден
На правах рукописи
Евстрапов Анатолий Александрович
МИКРОФЛЮИДНЫЕ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ МЕТОДАМИ ФЛУОРОМЕТРИИ И
ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ
специальность 01.04.01 – Приборы и методы экспериментальной
физики
Автореферат
диссертации на соискание ученой
степени доктора технических наук
Санкт-Петербург – 2012
Работа выполнена в лаборатории «информационно-измерительных
биои
хемосенсорных
микросистем»
Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Института
аналитического приборостроения Российской академии наук
Научный консультант:
доктор технических наук, профессор
Курочкин
Владимир Ефимович
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук,
профессор, ведущий научный сотрудник
ФТИ РАН
Зегря Георгий
Георгиевич
Доктор технических наук, профессор,
ведущий специалист ООО «Научные
приборы»
Доктор биологических наук,
заведующий лабораторией Института
цитологии РАН
Гуревич Борис
Симхович
Негуляев Юрий
Алексеевич
Ведущая организация:
Химический факультет Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова
Защита диссертации состоится «12» октября 2012 г. в «15» часов на
заседании диссертационного совета Д002.034.01 на базе
Федерального государственного бюджетного учреждения науки
Института аналитического приборостроения Российской академии
наук (ИАП РАН) по адресу 198095, Санкт-Петербург, ул. Ивана
Черных, д. 31/33
С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической
библиотеке ИАП РАН по адресу: 190103, Санкт-Петербург, Рижский
пр., д. 26. Отзывы на диссертацию и автореферат направлять по
адресу: 190103, Санкт-Петербург, Рижский пр., д. 26.
Автореферат разослан «___» ____________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д002.034.01,
кандидат физико-математических наук, с.н.с.
А.П. Щербаков
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Развитие и доступность технологий микроэлектроники привели к
появлению аналитических систем на основе микрофлюидных
устройств (МФУ), позволяющих осуществлять уникальные
манипуляции с микроколичествами жидкой или газообразной пробы.
Такие системы получили название «лаборатория на чипе» (lab on a
chip). Объединение всех стадий и этапов аналитического определения в одном компактном устройстве дает возможность проводить
анализ пробы в микроформате с высокой чувствительностью,
точностью и экспрессностью определения компонентов.
Современными тенденциями развития МФУ являются: а) миниатюризация; б) интеграция в устройства новых функциональных
модулей; в) увеличение числа измерительных каналов; г) применение наноразмерных элементов; д) управление и контроль за всеми
стадиями анализа; е) увеличение информативности измерений.
Создание аналитической системы на МФУ связано с решением
ряда научных, методических, технических и технологических задач.
Анализируемый компонент пробы и метод его анализа (или способ
обнаружения) определяют топологию и конструкцию устройства,
ассортимент применяемых материалов, технологии изготовления
устройства, методы детектирования. Только комплексный подход,
увязывающий выбор материалов, конструирование, способы
изготовления, интеграцию новых элементов, внедрение оригинальных принципов управления движением и разделением компонентов
пробы, дает возможность создавать современные приборы на МФУ.
Известные зарубежные конструкции МФУ защищены патентами и
режимами коммерческой тайны (know-how). Поэтому требуется
проведение собственных исследований и разработок, которые
позволят создавать аналитические системы на основе МФУ.
Наиболее востребованными при исследованиях многокомпонентных биологических проб являются электрофоретические методы
анализа. При разнообразии конфигураций (конструкций) МФУ,
применяемых для электрофоретических методов, существуют общие
требования к этим устройствам. Поэтому перспективной является
разработка универсальной и простой топологии, которая могла бы
использоваться для решения различных исследовательских задач.
3
Применение оптически прозрачных материалов (стекол,
полимеров) в микрогидродинамике (микрофлюидике) дает
возможность использовать высокочувствительные оптические
методы детектирования компонентов пробы. Востребованными
являются исследования по изучению возможности применения
отечественных марок стекол для МФУ, адаптация технологий
изготовления и способов герметизации для этих материалов,
изучение влияния различных факторов на свойства и характеристики
устройств. В качестве альтернативных, относительно дешевых
материалов могут применяться полимеры (поликарбонат, полиимид,
полиметилметакрилат и др.). В этой связи важной задачей является
исследование
режимов
воспроизводимого
формирования
микроразмерных структур с заданными характеристиками в
полимерных материалах при использовании коммерческих
технологических установок.
Интеграция в МФУ новых функциональных микро- и
наноразмерных элементов и систем (микро- и наноэлектродов,
наноразмерных каналов, нанопроволок, нанопористых сред и т.д.)
представляется перспективным, так как дает возможность
значительно расширить круг решаемых задач за счет использования
новых физических принци-пов и методик анализа, улучшить
аналитические характеристики устройств. Все это требует
проведения комплексных исследований по изучению: способов
создания наноразмерных элементов, взаимодействия наноструктур с
жидкими средами, определению возможностей детектирования
аналита.
Внедрение МФУ в практику лабораторных исследований все еще
ограничено,
так
как
рынок
оснащен
альтернативными
аналитическими системами и приборами. Только немногие фирмы
производят коммерческие аналитические системы на МФУ, среди
них: Agilent Technologies Inc., Caliper Technologies Inc., Bio-Rad,
Shimadzu Corp. и др. Разработка и создание отечественной
приборной базы на основе МФУ позволила бы отказаться от
импорта дорогостоящего оборудования и создать системы с
техническими характеристиками, не уступающими лучшим
зарубежным образцам.
Вышеизложенное определяет актуальность данного направления
исследований, развивающего комплексный подход к созданию
4
аналитических систем на основе МФУ и оптических методов
детектирования.
Цель работы: создание микрофлюидных устройств для
исследований биологических проб методами флуорометрии и
оптической микроскопии высокого разрешения.
Для достижения поставленной цели решались следующие
основные задачи:
1. Теоретические и экспериментальные исследования влияния
геометрических и конструктивных параметров устройств, физикохимических свойств используемых материалов, технологий их
обработки на характеристики МФУ;
2. Создание МФУ и приборно-аппаратных средств для
электрофоретического разделения пробы и методов анализа на
основе полимеразной цепной реакции (ПЦР);
3. Обоснование и реализация новых принципов исследований
биологических проб с применением микро- и наноразмерных
структур
(нанопористых
стекол,
массива
нитевидных
нанокристаллов – ННК, наноразмерных каналов, микроэлектродов),
как новых функциональных элементов МФУ (оптического сенсора,
гидродинамических и диэлектрофоретических ловушек);
4. Апробация актуальных методик на МФУ: электрофоретического
анализа пробы; ПЦР в реальном времени; изучения микрообъектов
методами оптической микроскопии высокого разрешения.
Научная новизна диссертационной работы состоит в оригинальном
методологическом подходе к проектированию приборно-аппаратных
средств на основе МФУ, заключающемся в проведении комплексной
системной разработки с учетом: специфики исследуемого объекта,
методики анализа, свойств применяемых материалов, технологий
формирования микро- и наноструктур, конструктивных элементов
устройства,
физико-химических
свойств
поверхности
функциональных элементов,
метода детектирования. Все это
позволяет расширить область функциональных возможностей МФУ
и улучшить аналитические характеристики создаваемых на их
основе устройств.
В работе впервые:
1. Предложена и реализована новая универсальная топология
микрофлюидного чипа (МФЧ), обеспечивающая возможность
5
дозирования разных объемов пробы электрокинетическими и
гидродинамическими способами.
2. Экспериментально установлено, что отражательные свойства
массива ННК из GaAs определяются формой вершины
нанокристаллов. Обнаружено спектрально-селективное воздействие
лазерного излучения на наноструктуры GaAs, приводящее к
«слипанию»
нанокристаллов
и
вызывающее
изменение
отражательной способности.
3. На примере обнаружения инсулина в пробе продемонстрирована
возможность использования пористых стекол (в частности 8B-MAP),
как основы нового оптического сенсорного элемента для
регистрации конкурентной иммунной реакции.
4. Получены результаты теоретических и экспериментальных
исследований, позволяющие осуществлять оценки влияния
конструкционных, технологических, методических факторов при
применении МФУ для анализа биологических проб, что является
основой для решения задач оптимизации топологий или/и режимов
анализа (управления).
Практическое значение определяется
1. Разработанными
и
созданными
макетными
образцами
аналитических систем на МФУ с флуоресцентными детекторами,
которые используются в ИАП РАН при проведении научноисследовательских работ.
2. Изготовленными стеклянными МФЧ, предназначенными для
электрофоретических
и
диэлектрофоретических
методов
исследований биологических проб, а также для методов ПЦР (за
последние пять лет совместно с ЗАО «Светлана-полупроводники», г.
Санкт-Петербург создано более 250 штук).
3. Отработанными режимами формирования микроразмерных
структур с заданными геометрическими характеристиками в
полиметилметакрилате методом лазерной абляции (ЛА) и
полученными
экспериментальными
образцами
МФЧ
для
электрофоретического разделения пробы (совместно с ООО
«Лазерный центр», г. Санкт-Петербург).
4. Обнаруженным эффектом спектрально-селективного воздействия
лазерного излучения на массив ННК, пригодным для применения в
новых технологиях обработки наноструктур и при изготовлении
6
конструкций
МФЧ
с
наноразмерными
функциональными
элементами.
5. Внедрением результатов работы в учебный процесс в форме
авторских курсов лекций для бакалавров и магистров: «Микро- и
нано- технологии в биологических и медицинских исследованиях» в
СПб АУ НОЦНТ РАН, «Микро- и наноаналитические методы
исследования жидких сред», «Биоаналитические системы на основе
микрочиповых технологий» в НИУ ИТМО.
Положения, выносимые на защиту
1. Конфигурации МФЧ и аналитических систем, содержащие новые
технические решения: МФЧ с универсальной топологией для
электрофоретического разделения пробы, с гидродинамическими
ловушками и флуорометрические системы детектирования.
2. Экспериментальные
результаты
разделения
и
анализа
биологических проб (в частности, фрагментов ДНК) на МФЧ,
подтверждающие достижение аналитических характеристик,
превосходящих соответствующие макроаналоги: уменьшение
объема анализируемой пробы (в 2-5 раз) и времени определения (~ в
10 раз) при сопоставимых пределе обнаружения и динамическом
диапазоне.
3. Новые
эффекты,
выявленные
при
экспериментальных
исследованиях взаимодействия электромагнитного излучения с
массивом ННК (зависимость отражательной способности массива от
формы вершин кристаллов) и взаимодействия молекул флуорофора с
ННК (образование пространственных регулярных структур), их
интерпретация и применение в устройствах на основе МФУ.
4. Результаты экспериментальных исследований, подтверждающие
возможность использования пористых стекол, как основы
оптического сенсорного элемента в МФЧ для регистрации
конкурентной иммунной реакции на примере обнаружения инсулина
в пробе.
5. Результаты экспериментальных измерений рельефа поверхности
структур при кислотном травлении и термической обработке стекла,
полученные
при
исследовании
технологий
изготовления
микроструктур в стеклянных материалах, и оценка их влияния на
характеристики МФЧ.
6. Результаты экспериментальных исследований по выбору
режимов ЛА для формирования микроразмерных каналов заданной
7
геометрии (шириной от 30 до 300 мкм и аспектным отношением <1)
в полимерных материалах.
7. Способы управления движением и фиксацией микрочастиц
размером от 1 до 6 мкм на МФЧ с микро- и наноструктурами для
последующей их визуализации методами конфокальной лазерной
сканирующей микроскопии и их практическая реализация.
Личный вклад автора
Автор является одним из инициаторов работ по созданию и
развитию МФУ и приборов на их основе для анализа биологических
проб. Вклад автора состоит в формировании направления
исследований, постановке цели и задач, разработке приборов и
устройств, проведении экспериментальных, технологических и
методических работ, интерпретации полученных результатов. Все
экспериментальные результаты, представленные в работе, их
обработка и анализ получены непосредственно при участии автора.
Диссертация
представляет
собой
обобщение
материалов
исследований и разработок, выполненных автором лично, с
сотрудниками лаборатории, с коллегами из СПб АУ НОЦ НТ РАН
(д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлин), ИХС РАН (д. хим. наук Т.В.
Антропова), ФТИ РАН,
НИУ ИТМО, ЗАО «Светланаполупроводники», ООО
«Лазерный центр». В
работах,
опубликованных в соавторстве, автору принадлежат результаты,
сформулированные в защищаемых положениях и выводах.
Связь с государственными программами и НИР
Тематика исследований поддержана:
Межведомственной научно-технической программой “Вакцины
нового поколения и диагностические системы будущего” проекты
«Микроаналитические системы: портативные и лабораторные
экспресс-анализаторы и биосенсоры на основе чип-реализации
одноканального и мультиканального приборов капиллярного
электрофореза» (2000-2001 гг.) и «Новые принципы детекции и
разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторнодиагностических методов исследования» (2002-2006 гг.);
Научными
Программами
СПб
НЦ
РАН,
проекты
«Микрофлюидные чип-анализаторы» (2001 г.), «Аналитические
приборы на основе микрофлюидных технологий» (2003 г.);
«Микрофлюидные
чип-анализаторы
с
интегрированными
8
наноструктурами (нановискерами)» (совместно с лаб. д. физ-мат.
наук Г.Э. Цырлина, 2005-2006 гг.), «Микрофлюидные аналитические
системы с интегрированными наноструктурами (пористыми
стеклами)» (совместно с ИХС РАН, 2009г.);
Грантом РФФИ-ГФЕН 03-01-39003_а «Теоретические и
экспериментальные
исследования
явлений
переноса
и
взаимодействия биологических объектов в микрофлюидных
устройствах» (2004-2005гг);
Грантом РФФИ 05-02-08090 офи_а “Микроаналитические
системы с интегрированными нитевидными кристаллическими
наноструктурами” (совместно с лаб. д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлина,
2005-2006 гг.);
Программой фундаментальных исследований ОХМН РАН
«Создание и совершенствование методов химического анализа и
исследования структуры веществ и материалов», проекты «Создание
наноструктурных пористых элементов функционального назначения
для микроаналитических систем» (совместно с ИХС РАН, 20062008гг.), «Микрофлюидные чипы для анализа биополимеров» (20102011 гг.);
Аналитической ведомственной целевой программой "Развитие
научного потенциала высшей школы" проект «Исследования и
диагностика клеточных структур: новые методические подходы и
инструментальные решения на основе сканирующей зондовой
микроскопии и микрочиповых технологий» (НИУ ИТМО, 20092011гг.)
Апробация работы
Основная часть разработок и результатов исследований,
изложенных в диссертации, докладывалась и обсуждалась на
Всероссийских и международных конференциях и симпозиумах:
SPIE Conference BiOS 2002 (San Jose, USA, 2002); 1-ой
Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (СанктПетербург, Россия, 2002 г); Всероссийской конференции
«Актуальные проблемы аналитической химии» (Москва, Россия,
2002 г); 14-th International Symposium Boron, Borides and Related
Compounds (St Petersburg, Russia, 09–14 June 2002); XIV и XVI
Российских конференциях по использованию синхротронного
излучения (Новосибирск, 2002, 2006 гг); 3rd Int. Symposium on
Separations in BioSciencies SBS-2003 (Moscow, Russia, 2003);
9
Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж,
Россия, 2003 г); Seventh, Eight, Night Seminars on Porous GlassesSpecial Glasses (PGL’2005, 2007, 2009, Szklarska Poręba, Poland); 2-ой
Международной научно-практической конференции «Исследования,
разработки и применение высоких технологий в промышленности»
(Санкт-Петербург, Россия, 2006 г); XIV Int. Symposium
«Nanostructure: Phys&Techn» (Репино, Россия, 2006 г); European
conference on surface science ECOSS 24 (Paris, 2006); Сессии
Научного совета РАН по аналитической химии. Школа-конференция
«Успехи аналитической химии» (Звенигород, 2006 г); XVIII и XIX
Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (Москва,
2007 г, Волгоград, 2011 г); VIII и IX Международных конференциях
«Прикладная оптика» (Санкт-Петербург, 2008, 2009 гг); XX
Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2008 г);
Spring Meeting European Materials Research Society (EMRS Spring2011, Nice, France, 2011); International Conference on Materials for
Advanced Technologies (ICMAT 2011, Singapore, 2011); Lab-on-a-Chip
European Congress (Hamburg, Germany, 2011); семинарах по
микрочиповым технологиям, организованных в МГУ (Химический
факультет) и Институте аналитического приборостроения РАН.
Публикации
Основные результаты работы представлены в 105 научных
трудах, в том числе 45 работ опубликовано в рецензируемых
отечественных и зарубежных научных изданиях, рекомендованных
ВАК для защиты докторских диссертаций.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, списка
литературы из 551 наименования. Текст диссертации изложен на 353
стр., включая 104 рисунка и 9 таблиц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы диссертации, ее
практическое значение, сформулированы цель и задачи
исследований. Изложены научная новизна работы, сформулированы
защищаемые положения, приведены сведения об апробации
10
диссертации, личном вкладе автора, указаны объем диссертации и
другие выходные данные.
Первая глава представляет собой аналитический обзор
исследований и разработок приборов на основе МФУ, основных
терминов и определений.
Для создания МФУ для аналитических систем необходимо
проведение комплексных исследований и работ, включающих:
расчет топологии и разработку конструкции устройства; выбор
материалов; исследования влияния технологических процессов и
условий обработки материала на свойства МФУ; разработку
технологий воспроизводимого изготовления устройств; адаптацию
методик анализа; создание приборно-аппаратного обеспечения.
Анализ топологий и конструкций МФУ, широко применяемых
при электрофоретическом разделении пробы, показал, что
существуют общие требования: устройство должно обеспечивать
воспроизводимый ввод пробы разных объемов с минимальной
дисперсией; возможность использования различных способов
дозирования; быть простым и дешевым. Поэтому, актуальной
задачей является разработка топологии и создание конструкции
устройства, отвечающего этим требованиям.
При изготовлении МФУ используются, в основном, кремний,
стекло, полимерные материалы. Наиболее распространенной
технологией формирования микро- и наноразмерных структур в
стеклянных
и
кремниевых
материалах
является
метод
фотолитографии и жидкостного травления, который хорошо
отработан для небольшого ассортимента материалов (высокочистого
кремния, стекол Corning, Пирекс и др.). При создании МФУ,
ориентированных на отечественные материалы, приоритетными
задачами являются выбор материалов, адаптация для них
существующих способов и технологий обработки, исследование
характеристик и оценка свойств получаемых структур.
Методы лазерного микроизготовления (в частности, лазерной
абляции – ЛА) в полимерах являются перспективной и доступной
техникой формирования микроструктур, поэтому актуальным
представляется определение условий и режимов изготовления
микроструктур с заданными характеристиками с применением
коммерческих установок.
Термическое связывание – самый распространенный способ
герметизации стеклянных МФУ. Однако, применение высоких
11
температур приводит к изменению характеристик и свойств
поверхности
материалов,
влияющих
на
аналитические
характеристики микрочипа, что обуславливает необходимость
проведения исследований поверхности. Способы герметизации
полимерами (в том числе, склеивание) являются достойной заменой
термического связывания, а развитие этих способов считается одной
из востребованных задач.
Перспективным направлением совершенствования МФУ является
интеграция в них новых функциональных наноразмерных элементов
и структур. Многие функциональные возможности наноструктур
связаны с воздействием на них электромагнитного излучения. Эта
область исследований недостаточно хорошо изучена, что определяет
актуальность исследований оптических свойств наноструктур, в
частности ННК и пористых стекол, и изучения влияния на них
лазерного излучения.
Среди технологий изготовления наноразмерных структур
выгодно выделяется метод сфокусированного ионного пучка (СИП).
Получение наноструктур в стеклянных материалах методом СИП
обуславливает необходимость исследования режимов и определения
условий формирования структур с заданными характеристиками.
Сочетание микрофлюидных технологий и микроскопии высокого
разрешения
является
новым
направлением
развития
исследовательских приборов для изучения биологических объектов в
естественном состоянии, позволяющее получить уникальную
информацию о влиянии среды окружения на объект. Поэтому
разработка и создание МФУ для микроскопии высокого разрешения
в настоящее время является актуальной и востребованной задачей.
Таким образом, в главе 1 сформулированы основные актуальные
задачи и проанализированы способы их решения.
Вторая глава состоит из трех разделов и в ней рассмотрены
основы создания аналитических систем на МФУ с оптическими
методами детектирования. Приводится общая схема анализа
биологической пробы на МФУ в виде последовательности операций
с образцом пробы, которым соответствуют определенные методы и
элементы микро- и нанофлюидных устройств.
В разделе 2.1 проанализированы процессы и явления наиболее
существенные при реализации методов капиллярного электрофореза
(КЭ) на МФУ, в частности, капиллярного зонного электрофореза
(КЗЭ) и капиллярного гель-электрофореза (КГЭ). Электроки12
нетические процессы определяют разрешение, достигаемое при
разделении компонентов пробы. Из множества факторов,
определяющих разрешение, наиболее значимы составляющие,
обусловленные: продольной диффузией, размерами зон инжекции и
детектирования, температурными эффектами. В некоторых случаях,
при нелинейной геометрии сепарационного канала, существенной
составляющей является дисперсия пробы за счет геометрии.
В этом же разделе представлен сравнительный анализ вариантов
(способов и топологий) инжекции пробы в канал МФУ. Для
получения высокого разрешения при разделении компонентов пробы
необходимо создать условия для ввода небольшого объема пробы
(зоны образца) с минимальной дисперсией. Технологичным и
автоматизируемым считается электрокинетический ввод. Самой
простой топологией инжектора является система в виде креста из
двух пересекающихся каналов – подводящего и сепарационного.
При заполнении системы буферным раствором и последовательной
подаче напряжения на подводящий, а затем – на сепарационный
каналы, создается электрокинетический поток, с помощью которого
проба вводится в область пересечения каналов. Для предотвращения
утечки пробы в сепарационный канал используют запирающие
напряжения. Увеличение запирающих напряжений позволяет
сформировать узкую зону вводимой пробы, но при этом
увеличивается неоднородность вводимой в канал зоны образца. Для
уменьшения неоднородности предпринимаются дополнительные
меры, в частности применяют процедуру стэкинга сразу после ввода
пробы в канал.
На основе анализа наиболее
используемых
топологий
МФЧ
разработана
универсальная конструкция,
обеспечивающая инжекцию
пробы различных объемов в
сепарационный канал двумя
способами – электрокинетическим и гидродинамическим (рис. 1). Для сохранения
Рисунок 1. Универсальная топология
МФЧ и способы инжекции пробы: а –
ламинарности
потока
и
по схеме «крест», б – по Z-схеме, в –
ускорения процесса ввода
по П-схеме
пробы организованы подво13
дящие переходные каналы с шириной, соотносящей к ширине
рабочего канала как 7:1. При средней ширине канала 50 мкм и
глубине 20 мкм такая топология позволяет обеспечить дозирование
разных объемов пробы: по схеме «крест» - объемом 50 пл (рис. 1а),
или по Z – схеме (по П – схеме) – объемом 800 пл (рис. 1б,в).
В разделе 2.2 обсуждаются особенности расчета характеристик
флуоресцентного
детектора
для
МФУ.
В
детекторах,
ориентированных на методы КЭ, размер области детектирования
определяет разрешающую способность и чувствительность
измерений (величину аналитического сигнала). Для улучшения
аналитических характеристик и уменьшения фонового сигнала
целесообразно строить конфокальные схемы детектирования,
позволяющие осуществить принцип пространственного сопряжения
возбуждающего и регистрирующего каналов детектора. В
микроканалах
с
ограниченными
размерами
в
условиях
многократных отражений от границ раздела сред происходит
усиление, как фонового, так и полезного сигнала. Другими
источниками фонового сигнала при детектировании флуоресценции
являются: а) релеевское рассеяние от оптических элементов,
материала и др. структур; б) рамановское рассеяние растворителя; в)
люминесценция от оптических элементов; г) автофлуоресценция
материалов. Эффективная оптическая фильтрация возбуждающего
излучения и флуоресценции позволяет существенно уменьшить
фоновый сигнал. Это не касается релеевского и рамановского
рассеяния растворителя. Сложность фильтрации рамановского
излучения заключается в том, что разным растворителям присущи
разные спектры, а создать универсальную систему фильтрации не
удается. В отдельных случаях на фоновый сигнал оказывают
влияние потоки жидкости в канале МФУ, создающие условия для
дополнительного рассеяния.
В разделе 2.3 изложены методы и способы фиксации
биологических объектов в МФУ. Показано, что наиболее простыми
устройствами, реализуемыми в МФУ, являются механические и
гидродинамические ловушки с микро- и наноструктурами, а также
планарные электроды для диэлектрофореза (ДЭ).
Принцип работы гидродинамической ловушки, обеспечивающей
фиксацию и удерживание микрочастиц в каналах МФЧ для их
дальнейшего исследования, заключается в том, что микрочастицы
двигаются в потоке транспортной жидкости до тех пор, пока не
14
встречают препятствия в виде сети каналов или ячеек, имеющих
размеры меньшие, чем размеры частиц. Препятствия задерживают
частицы, а поток жидкости создает давление, фиксирующее частицы
у препятствий. Диапазон размеров, предполагаемых для
исследований частиц – от 1 до 6 мкм, соответствует размерам
некоторых клеток и бактерий. В работе рассмотрены и
смоделированы в рамках гипотезы сплошной среды при ламинарном
потоке жидкости варианты топологий ловушек для микрочастиц: с
прямоугольными препятствиями разной ширины и ячеечные
ловушки с наноканалами.
В разделе также рассматриваются особенности фиксации и
удерживания микрочастиц методами ДЭ на МФЧ с планарной
квадрупольной конфигурацией электродов. Оценка ДЭ силы для
квадрупольной ловушки с пленочными электродами дает величину
вертикальной силы ~10−9 Н (на расстояние 50 мкм при напряжении
20В и электрической проводимости раствора 1 Смм−1). Недостатком
такой ловушки является ее маленькая «жесткость», вызванная тем,
что в вертикальном направлении ДЭ сила компенсируется только
гравитационной силой. Для эффективного манипулирования
клетками требуются высокие напряженности электрического поля
(~103В/см) и буферные растворы с высокой проводимостью, что
приводит к нагреву раствора. Обсуждаются проблемы, связанные с
влиянием электрических полей на объекты исследования.
Третья глава диссертации посвящена экспериментальным
исследованиям способов формирования микро- и наноразмерных
структур в стеклянных и полимерных материалах, процессов
герметизации при изготовлении МФЧ.
В разделе 3.1 проводится анализ химических, теплофизических и
оптических свойств стекол К8 и Ф1, с целью выявления их
пригодности для использования в МФУ, исходя из требований:
химической стойкости (к щелочам и слабым кислотам), оптической
прозрачности в спектральном диапазоне от 400 до 700 нм, низкой
фоновой флуоресценции. В состав К8 входят окислы металлов в
достаточно высокой концентрации, что придает этому стеклу
хорошую химическую стойкость. Для Ф1 характерно высокое
содержание PbO, что обеспечивает возможность термического
связывания стекол К8 и Ф1 при относительно низкой температуре.
В разделе 3.2 рассмотрены методы фотолитографии и кислотного
травления стекла и техника СИП при получении микро- и нано15
размерных структур в стекле К8. Изучались возможности методов,
их особенности и достигаемые при травлении характеристики
структур. Для изготовления микроструктур использовался процесс
травления стекла в буферном травителе (ЗАО «Светланаполупроводники», СПб). При изотропном травлении стекла наряду с
глубинным травлением имеет место и боковое протравливание, что
ограничивает минимальный размер формируемых микроструктур
(3-5мкм) и достигаемые аспектные соотношения (<1). При травлении
происходит удаление материала и образование новой поверхности с
присущими ей структурными особенностями и физико-химическими
характеристиками. Для стекла К8 в работе получена
экспериментальная зависимость глубины травления (мкм) от
времени t (с) для времен от 10 до 600 с:
.
б
На рис. 2 представлены а
изображения
поверхности стекла К8 до и
после
травления,
полученные
на
сканирующем ближнепольном
микроскопе
(СБОМ)
«NTEGRA Рисунок 2. Изображения поверхности
Solaris»
(НТ-МДТ, стекла К8 до (а) и после (б) кислотного
Россия)
в
режиме травления. (а) – размер 5х5 мкм, (б) –
размер 25х25 мкм
поперечно-силовой
микроскопии (ПСМ). Показано, что после травления стекла
образуется поверхность (с шероховатостью Ra<7 нм), которая не
влияет на ламинарность потока и является оптически прозрачной,
что позволяет применить оптические методы детектирования.
Эксперименты по изготовлению наноразмерных каналов в стекле
К8 методом СИП проводились на установке CrossBeam Neon (Carl
Zeiss, Германия) в НИУ ИТМО. Под действием пучка заряженных
частиц на поверхности стекла скапливается нескомпенсированный
заряд, влияющий на исходный пучок, что делает невозможным
формирование структур с субмикронными размерами. Поэтому
образец стекла покрывался слоем проводящего материала (золото,
углерод и хром). Исследованы режимы травления стекла К8 при
разных ионных токах от 5 до 500 пА и временах травления от 5 до
200 с. Выявлена экспериментальная зависимость формируемого
16
диаметра единичной поры D (нм) от ионного тока i (пА), которая
может быть аппроксимирована параболой:
.
В МФУ между микроканалами методом СИП была изготовлена сеть
наноразмерных каналов (шириной 250 нм, глубиной более 2 мкм) с
заходами для удержания исследуемых микрообъектов (рис. 3).
В разделе 3.3 рассмотрены методы и способы герметичного
соединения стеклянных пластин. Особое внимание уделяется методу
термического связывания (thermal bonding) стекол.
а
б
Рисунок 3. Изображение
канала с заходами (а) и сети
наноразмерных каналов (б)
гидродинамической ловушки
МФЧ
Качество и прочностные характеристики соединения зависят от
температуры и скорости нагревания, давления, длительности, от
присутствия на поверхностях инородных частиц. Воздействие
высоких температур на материал соединяемых образцов приводит к
структурным изменениям поверхности материала.
В случае пары К8-Ф1 ожидалось, что соединение будет
происходить при температурах 560-5800С, что являлось мотивацией
изучения поверхности стекла после его нагрева до температур 4006000С. Результаты измерений топологии поверхности микроканала в
стекле К8 до и после воздействия температур (4000 С, 5000 С и 6000 С
в течение 5 час) представлены на рис. 4. При температуре 4000С на
поверхности стекла проявляются структурные образования.
Повышение температуры приводит к увеличению их числа и
укрупнению размеров. Имеются все основания предположить, что в
диапазоне 400-6000С происходит фазовое разделение компонентов,
приводящее к образованию структурных неоднородностей.
Анализ температур плавления компонентов стекла К8 позволяет
сделать вывод, что при таких условиях возможно выделение и уход
на поверхность оксидов металлов, содержащихся в стекле. Эти
исследования позволили отработать технику термического
связывания пластин К8 и Ф1 как способ герметизации МФЧ при
нормальном давлении. Из-за длительного воздействия высоких
температур поверхность стекла становится обезвоженной, что влияет
17
на
величину
электроосмотического
потока
и
создает
неблагоприятные условия для модификации поверхности. Среди
известных способов восстановления гидроксильных групп промывка каналов раствором NaOH.
а
в
б
Рисунок 4. Изображения
поверхности
канала, вытравленного
в стекле К8, до (а) и
после (б, в, г) температурного воздействия:
б – 4000C, в – 5000C,
г – 6000C.
Изображение получено
на СБОМ «NTEGRA
Solaris», ПСМ, размер
кадра 5х5 мкм
г
Альтернативным методом герметизации является склеивание
фотоотверждаемыми полимерами, к достоинствам которого
относится слабая чувствительность к присутствию на поверхности
инородных частиц и возможность соединять пластины с
функциональными покрытиями. Условием герметизации является
обеспечение полной полимеризации соединяющего слоя, контроль
которой может быть осуществлен прямыми методами тестирования
на герметичность или косвенными методами (например, оптической
спектроскопии). Динамика полимеризации может отслеживаться по
трансформации полос поглощения и люминесценции полимера,
поэтому в работе исследовалась возможность использования
методов оптической спектроскопии для контроля полимеризации
МФЧ. Изучались пластины К8, соединенные слоем (толщиной от 10
до 80 мкм) фотоотверждаемого клея Rite Lock UV02 (Chemence Ltd,
UK). На рис. 5 приведена зависимость изменения флуоресценции
слоя, свидетельствующая о том, что процесс отверждения слоя к 20–
ой минуте практически завершился.
Раздел 3.4 посвящен исследованию методов ЛА для получения
микроразмерных структур с воспроизводимыми характеристиками в
полимерных материалах. Применялся метод прямой обработки, при
котором осуществляется перемещение по поверхности материала
18
сфокусированного лазерного луча. Для оценки размеров каналов при
ЛА, использована модель, где принимается, что световой поток с
энергией Ein, превышающий пороговое значение Eth поглощения
бесконечно тонкого слоя полимера, приводит к его удалению.
Если луч лазера перемещается дискретно с шагом, равным
размеру светового пятна, то глубина формируемого канала h зависит
от падающей мощности in как:
h
E 12k in th d v
d ,
где k – коэффициент пропорциональности, обусловленный
энергиями связей в макромолекулах полимера, - коэффициент
поглощения полимера, ρ – плотность материала, ν – скорость
перемещения луча, d – размер светового пятна.
Были изучены режимы,
позволяющие изготовить в
полиметилметакрилате
(ПММА) марки ТОСП
каналы с требуемыми
характеристиками
на
установке
фирмы
TROTEC «Speedy II» с
лазером Synrad (25 Вт,
длина волны 10.6 мкм).
Время, мин
Полученные результаты
Рисунок 5. Изменение флуоресценции подтверждают
адекватполимерного слоя на длине волны 320 нм
ность
выбранной
в
данной
(при возбуждении на 290 нм)
работе модели. Если на
начальном участке (3000 Гц) зависимости (рис. 6) формируется
широкий и неглубокий канал с аспектным соотношением
(глубина/ширина) 1:5, то при высоких частотах (10000 Гц)
отношение становится равным 1:2, т.е. формируется глубокий канал,
а ширина увеличивается только на 40%. Варьируя частоту
импульсов, можно менять геометрические характеристики канала,
заметно увеличивая глубину и незначительно изменяя ширину, что
является оригинальным способом регулирования геометрии канала.
При герметизации полимерных материалов спеканием на прочность
получаемых
соединений
влияет
обработка
поверхности,
температура, время спекания и удельное давление. Для МФЧ из
Флуоресценция, отн. ед.
40
30
20
10
0
0
10
20
30
19
ПММА приемлемое отклонение глубины канала (с вариацией 15%)
достигается при спекании каналов с глубиной свыше 200 мкм.
Другим перспективным материалом для МФУ является
поликарбонат (ПК), обладающий биологической устойчивостью,
оптической прозрачностью и более высокой, чем у ПММА
температурой стеклования
(150OC).
2
Изготовление микроструктур в пластинах ПК
фирмы
BARLO
1
(Германия)
осуществлялось на технологической
установке
«OOO
Мултитех» (СПб, Россия)
с длиной волны лазера
частота, Гц
1.06 мкм. Приемлемые для
Рисунок 6. Зависимость глубины (1) и МФУ каналы с аспектным
ширины (2) канала от частоты импульсов соотношением 1 были
лазера при мощности излучения 1.25 Вт, сформированы
при
скорости перемещения луча 0.4% (от энергии
излучения на
максимальной)
импульс 151 мкДж. При
изготовлении каналов с шириной до 30 мкм наблюдался
значительный разброс по глубине (~50%), для широких каналов
(свыше 40 мкм) разброс значений по глубине составил менее 10%.
Экспериментальные исследования ЛА полиимидных пленок
различного состава и с добавками фуллерена С60 показали, что
наличие фуллерена приводит к увеличению порогового значения Eth.
Четвертая глава состоит из трех разделов. В первом разделе
рассматриваются конструкции МФУ для анализа биологических
проб методами электрофореза и аналитические системы с
флуоресцентным детектированием компонентов пробы. Отдельный
раздел посвящен микрочипам для молекулярной диагностики проб
на основе методов ПЦР и флуоресцентного детектирования. Особое
внимание уделено конструкциям МФЧ для исследований
биологических объектов методами микроскопии высокого
разрешения.
В разделе 4.1 рассматриваются МФЧ из стеклянных и
полимерных материалов созданные для электрофоретических
методов исследований биологических проб (рис. 7а,б,в). Для
280
260
размер, мкм
240
220
200
120
80
40
2000
4000
6000
8000
10000
20
проведения анализа на этих МФЧ были разработаны и изготовлены
прототипы аналитических систем (рис. 7г), в состав которых
входили оптико-электронный блок с детектором лазериндуцированной флуоресценции (1) и программно-управляемый
прецизионный блок высокого напряжения (2).
а
б
в
г
Рисунок 7. Микрофлюидные чипы из стекла (а, б) и ПММА (в), прототип
аналитической системы (г)
Создание аналитических систем потребовало разработки
оптических схем детектирования, в которых были реализованы
принципы, рассмотренные в разделе 2.2.
В разделе 4.2 приводятся результаты работ по созданию
прототипа прибора для постановки ПЦР в реальном времени (ПЦРРВ) на МФЧ. В состав прибора входят: устройства
термоциклирования,
четырехканальный
флуориметрический
детектор,
микропроцессорная
система
и
блок
питания,
объединенные в единую конструкцию (рис. 8а). Прототип прибора
ПЦР-РВ использовался с МФЧ, имеющими две реакционные камеры
и отличающиеся объемами, топологией и размерами (рис. 8 б и в).
а
б
в
Рисунок 8. Прототип прибора для ПЦР РВ на микрочиповой платформе (а),
МФЧ для ПЦР на 10 мкл (б) и на 2 мкл (в)
21
Раздел 4.3 посвящен обсуждению результатов работ по созданию
экспериментальной установки для исследований микрообъектов на
основе оптического инвертированного микроскопа и МФУ.
Особенностью методов микроскопии высокого разрешения
является необходимость фиксации исследуемого объекта на время
измерений. Для биологических объектов (например, клеток) метод
фиксации должен обеспечивать сохранность объекта и не влиять на
его свойства. Другим, существенным требованием, является
возможность выделения из группы одинаковых объектов или частиц,
движущихся в ламинарном потоке, объекта анализа. Для
исследований возможности фиксации и удерживания микрочастиц с
размерами от 1 до 6 мкм были изготовлены МФЧ с гидродинамическими ловушками (см. рис. 3б), с U – образной ловушкой (с
нанопротоками) и МФЧ для ДЭ. Проверка работоспособности,
изучение режимов и условий фиксации частиц методом ДЭ
осуществлялись на созданной экспериментальной установке на
основе оптического микроскопа Axio Observer D1m Carl Zeiss
(Германия).
В пятой главе приведены результаты экспериментальных
исследований наноразмерных структур, перспективных для
применения в МФУ: полупроводниковых кристаллических
наноструктур и пористых стекол.
В разделе 5.1 рассматривается возможность использования ННК
в МФЧ в качестве оптического элемента биосенсора, что являлось
мотивацией изучения спектральных зависимостей отражательной
способности массива ННК и влияния на них лазерного излучения.
Объектами исследований были образцы легированных ННК из GaAs,
выращенные методом молекулярно-пучковой эпитаксии (МПЭ) на
легированных
подложках
GaAs
(111)В,
отличающиеся
структурными особенностями (высотой, плотностью, формой
острия). GaAs буферный слой и ННК GaAs в процессе МПЭ
легировались кремнием с концентрацией электронов ~1018 см-3
(буферный слой) и 5*1017 см-3 (ННК) для создания проводимости nтипа. Диаметр нанокристаллов варьировался от 50 до 80 нм. При
измерении отражательной способности образцов ННК были
получены две характерные группы спектральных зависимостей. В
первой группе для образцов с каплевидной вершиной наблюдалось
уменьшение отражения с увеличением высоты ННК. Из полученных
данных также следует, что: а) легирование подложки приводит к
22
увеличению отражательной способности по сравнению с
отражением исходного материала; б) спектральные зависимости
имеют сходный характер с зависимостью отражения подложки; в)
увеличение высоты ННК приводит к трансформациям пиков
отражения в областях 2.9-3.1 эВ и 5.2 эВ. Во второй группе для
образцов с остроигольчатой формой вершины установлено
монотонное уменьшение отражательной способности. Можно
предположить, что не одинаковый характер зависимостей
отражательной способности определяется разными процессами
взаимодействия электромагнитного излучения с остроигольчатой и
каплевидной формой вершин. Кроме того, вероятно, что в процессе
поглощения фотонов ННК GaAs происходят запрещённые переходы
электронов из валентной зоны в зону проводимости. В результате
исследований образцов методами конфокальной лазерной
сканирующей микроскопии (КЛСМ) было выявлено, что лазерное
излучение на длине волн 488 нм и 633 нм с плотностью мощности
свыше 100 мВт/мм2 приводит к изменению структуры ННК даже при
малом времени воздействия (несколько секунд). Обнаруженный
эффект носит спектрально-селективный характер: при воздействии
на ННК излучением с мощностью того же порядка на длинах волн
476 нм и 543нм видимого изменения структур не наблюдалось.
Изображения площадок поверхности, полученные методом
сканирующей электронной микроскопии, свидетельствуют, что при
воздействии лазерного излучения на ННК происходит «слипание»
верхушек наноструктур и частичное их разрушение, что увеличивает
отражательную способность образца (рис. 9). Следует отметить, что
этот эффект может использоваться при формировании дорожек и
площадок в массиве ННК с отличающимися свойствами.
При изучении взаимодействия ННК с жидкими средами, в
частности, с раствором флуоресцеина было обнаружено образование
регулярных пространственных (дендридных) флуоресцирующих
структур. В первом приближении, на качественном уровне
предложено объяснение эффекта формирования регулярных
структур
в
предположении
доминирования
кулоновского
взаимодействия молекул флуоресцеина с ННК над другими
эффектами (поверхностное натяжение и т.п.). Форма и размеры
образующихся
структур
сложным
образом
связаны
с
характеристиками массива ННК и среды.
23
Наблюдаемый эффект в перспективе может быть использован для
создания сенсорного устройства, в котором на основании анализа
изображений можно судить о концентрации искомого аналита.
а
б
1,0
Отражение, R
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Время, с
Рисунок 9. Область воздействия лазерного излучения (размер - 47x47 мкм)
на ННК (a) и изменение отражательной способности образца массива ННК
(высотой - 1300 нм) при воздействии лазерного излучения (б)
Раздел 5.2 посвящен изучению возможности применения
пористых стекол (ПС) в качестве функциональных элементов МФУ,
в частности – оптических сенсорных элементов, что обусловило
необходимость исследования спектральных свойств ПС. Образцы
двухфазных (8В, NFF-I и NK-I) и полученных из них ПС (PG2, PG9 и
PG12, соответственно), а также двухфазного стекла ДВ-1Ш и
полученных из него ПС MIP и MAP были изготовлены в ИХС РАН
(д. хим. наук Антропова Т.В.). Для двухфазных и ПС измерены
спектральные зависимости светопропускания и отражения, на
основании которых получены зависимости коэффициентов
поглощения и дисперсии показателей преломления. Эти результаты
использовались для оценки пористости и размера пор ПС при
применении моделей эффективной среды (например, Бруггемана).
Оценки пористости образцов составили для PG2 – 0.30, PG9 – 0.29,
что соответствует экспериментальным результатам порометрии и
электронной микроскопии (для PG2 и PG9) ≈30%.
В этом же разделе рассмотрен вариант создания сенсора,
основанного на постановке конкурентной иммунной реакции на
твердофазной поверхности ПС. Первоначально на поверхности
стекла осуществлялась иммобилизация иммуноглобулина IgG
(антител), затем – его связывание с меченым флуоресцеинизотиоцианатом (fluorescein isothiocyanate - FITC) инсулином Ins24
FITC, приводящее к образованию комплекса IgG – (Ins – FITC). По
изменению сигнала флуоресценции относительно первоначального
уровня можно судить о количестве новых образовавшихся
комплексов (IgGIns). Создание в ПС чувствительного слоя связано
с выбором способов активации поверхности стекла, модификации и
иммобилизации чувствительного вещества, которые влияют на
оптические и структурные характеристики образцов.
Изучение особенностей иммобилизации биологических веществ
проводилось на образцах, изготовленных из двухфазного стекла 8В.
На разных стадиях иммобилизации и после проведения иммунной
реакции образцы исследовались методами флуоресцентной
спектроскопии, КЛСМ, СБОМ и атомно-силовой микроскопии. Рис.
10 иллюстрирует изменение спектра флуоресценции ПС после
проведения иммунной реакции. Показано, что оптимизация режимов
иммобилизации позволяет увеличить чувствительность сенсора. В
результате иммобилизации инсулина, на поверхности образца в
режиме ПСМ визуализированы частицы и агломераты частиц со
средним радиусом 0,6 мкм.
После
проведения
иммунной реакции на
поверхности образца в
1
режиме отраженного света
проявляется
оптически
2
неоднородная структура,
которая
может
быть
обусловлена появлением
пленки с более крупными
Длина волны, нм
неоднородностями,
чем
поры самого стекла. Это
подтверждается спектраРисунок 10. Спектры флуоресценции ПС
льными
зависимостями
8В-МАП до (1) и после (2) проведения
светопропускания
образконкурентной иммунной реакции с
-6
инсулином (C=10 M)
цов, а именно тем фактом,
что после проведения
иммунной реакции светопропускание образцов возрастает. Такой
эффект позволяет регистрировать иммунную реакцию без
применения специальных флуоресцентных меток.
В шестой главе приведены результаты анализа биологических
проб на МФЧ с использованием созданных аналитических приборов.
Флуоресценция, отн. ед.
3000
2000
1000
0
-1000
500
525
550
575
600
25
Раздел 6.1 посвящен реализации метода КЭ биологических проб
на МФЧ. Особое внимание уделено развитию методов экспрессанализа полинуклеотидов на МФЧ. На рис. 11 приведены
электрофореграммы разделения образца Аmix100 (концентрация С
=10-10М) содержащего фрагменты 10, 20, 30, 40, 50, 75 и 100
оснований (ЗАО "Синтол", г. Москва) на МФЧ и приборе КЭ
НАНОФОР 02 (ИАП РАН).
а
Преимуществами
2
RFU
использования
МФУ
3
2043
4
5
перед
традиционным
6
1
методом КЭ являются,
7
в частности: а) высокая
скорость анализа (~10
раз); б) меньший объем
пробы (по крайней мере
60
120
180
240
300 сек
в 2 раза); в) меньший
б
расход реагентов и
300
других материалов (в
250
несколько
раз).
200
Показано, что качество
150
электрофоретического
100
анализа
олиго50
нуклеотидов, фрагментов реестрикции ДНК,
400
800
1200
1600
сек
0
продуктов
ПЦР,
Рисунок 11. Разделения фрагментов
фрагментов
секвенса
образцов Аmix100 (а, б) полученные на МФЧ
ДНК на МФЧ в
(а) и приборе КЭ НАНОФОР 02 (б).
существенной степени
зависит от выбора сепарационной среды — полимерной матрицы.
В разделе также приведены результаты работ по подбору
сепарационной матрицы (раствора полидиметилакриламида –
ПДМАА с различными молекулярной массой и концентрацией
полимера) для разделения смеси маркеров молекулярного веса ДНК
на стеклянном МФЧ. Исследования показали, что эффективное
разделение достигается при концентрациях полимера 15-20% (Мw ~
30000) и 10% (Мw ~ 66000) (рис. 12).
Известно, что иммунный анализ является методом, основанным
на высокочувствительном и специфическом взаимодействии
антигенов (АГ) и антител (АТ). Иммунологические методы
RFU
104
1
5
4
6
2
7
3
2000
26
используются для количественного определения белков и малых
молекул в медицинской диагностике, фармацевтических и
биологических исследованиях.
Одной
из
задач
медицинского
приборостроения является создание
систем для высокочувствительного
экспрессопределения инсулина в
биопробах. В работе была
продемонстрирована
возможность электрофореРисунок 12. Разделение компонентов
тического разделения на
маркера молекулярного веса (150, 200,
МФЧ иммунного комплекса
300, 350, 400, 450, 500 п.о.)
и
свободного
АГ
(инсулина), что позволяет: а) упростить количественное определение
АГ, б) исключить проблемы, связанные с иммобилизацией АГ и
многочисленные стадии промывки, в) уменьшить время инкубации.
Полученные результаты подтверждают, что сочетание иммунных
методов с микрофлюидными технологиями дают возможность
создавать новые аналитические системы для высокочувствительного
экспрессного определения биологических веществ. Например,
методом электрофореза аффинных (иммунных) проб на МФЧ было
определено присутствие инсулина за время менее 160 с.
Соединения с функциональными аминными группами (в том
числе сульфаниламиды) находят широкое применение в
медицинской практике как
препараты
с разнообразной
фармакологической активностью. Так как такие лекарственные
соединения способны оказывать негативное воздействие на организм
человека, то в лабораторную практику введен контроль над их
содержанием в организме, в фармакологических препаратах и в
продуктах питания. Была продемонстрирована возможность
определения сульфадиазина методом электрофореза на МФЧ.
Флуоресцеин - меченые производные сульфадиазина (трейсеры)
были синтезированы на кафедре химической энзимологии
Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (д.х.н. Еремин
С.А.). Воспроизводимые результаты количественного анализа, при
которых информативный сигнал пропорционален концентрации
450 bp
.
.
.
1
500 bp
400 bp
300 bp
350 bp
.
150 bp
200 bp
2500 rfu
ch1
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
27
сек
сульфадиазина, получены для концентраций от 0,30 до 1,50 мкг/мл.
При этом коэффициент вариации не превышал 10%.
Количественный анализ аминокислот (АК) имеет большое
значение при исследованиях в медицине, фармацевтике и пищевой
промышленности.
Была
продемонстрирована
возможность
разделения смесей АК. В экспериментах семь аминокислот
(аспарагиновая кислота - Asp, аланин - Ala, валин - Val, лейцин Leu, серин - Ser, аргинин - Arg и тирозин - Tyr) метили
флуоресцентной меткой – FITC. Использовали схему ввода пробы
«крест». Методом КЗЭ было получено разделение модельной смеси
трех АК (Asp, Ala, Arg), имеющих наиболее различающиеся времена
выхода пиков (время разделения – 180 с). Результаты разделения АК,
имеющих близкие времена выхода пиков (Asp – Ala – Val), показали
необходимость увеличения длины сепарационного канала (на 20%)
по сравнению с базовой (38 мм) для улучшения качества разделения.
В разделе 6.2 приведены результаты исследований связанных с
постановкой жидкостной ПЦР в реальном времени на МФЧ из
стеклянных материалов. Показано, что состав стекол (К8 и Ф1), а
также методы герметизации (термического связывания, склеивания
фотоотверждаемыми полимерами или полидиметилсилоксаном)
после проведения обработки внутренней поверхности не оказывают
существенного влияния на эффективность ПЦР. Исследованы
способы очистки и регенерации стеклянного МФЧ после проведения
ПЦР. Для МФЧ из стекла К8, герметизированных методом
термического связывания, получены кинетические зависимости для
концентраций ДНК-мишени (103 - 107 копий/мкл).
В седьмой главе приводятся результаты экспериментальных
исследований на МФЧ с гидродинамическими наноразмерными
ловушками и с ДЭ системой фиксации и удерживания частиц для
методов оптической микроскопии, в том числе КЛСМ. Исследования
по удержанию полимерных сферических частиц диаметром 6мкм
(Sigma-Aldrich)
меченых
флуорофором,
как
имитаторов
биологических объектов, в МФЧ с диэлектрофоретической системой
фиксации осуществлялись на частоте ~100 кГц, при напряжении на
электродах от 1 до 10 В в 0,5 % растворе KOH. При приложении
электрического поля в рабочей области наблюдался
захват
отдельных частиц (рис. 13а) или групп, состоящих из нескольких
частиц (рис. 13б), обусловленный наличием минимума
потенциальной энергии на оси симметрии электродов.
28
а
б
Рисунок 13. Изображения частиц в камере
МФЧ для ДЭ: а - фиксация отдельной
частицы, б - группы частиц
Результаты экспериментов
подтверждают
возможность управления
движением и фиксацией
микрочастиц
методом
ДЭ
на
МФЧ
с
точностью, достаточной
для методов оптической
микроскопии (не хуже
0.2 мкм).
Изучение функционирования МФЧ с гидродинамическими
ловушками проводилось на суспензии полимерных микрочастиц
диаметром 3 мкм и 6 мкм меченых FITC в боратном буферном
растворе с pH = 9.18. Регистрация потоков жидкости и микрочастиц
проводилась на КЛСМ Leica TSC SL при длине волны возбуждения
– 488 нм в диапазоне детектирования 510-540 нм.
Результаты, полученные при
фиксации частицы в ловушке из
сети наноразмерных каналов с
заходами (изображение каналов
см. на рис. 3а) представлены на
рис. 14. Частица стабильно
удерживалась
даже
при
изменении скорости потока
жидкости в несколько раз. В
разделе
также
приведены
Рисунок 14. Изображение
гидродинамической ловушки с
результаты исследований МФЧ с
сетью каналов и удерживаемой
гидродинамической ловушкой с
флуоресцирующей частицы 3мкм.
пониженным
гидравлическим
Изображение получено на КЛСМ
сопротивлением.
Leica TSC SL
Проведенные исследования
позволили осуществить широкую апробацию МФЧ и макетов
созданных приборов на различных биологических пробах и
имитаторах биологических объектов (полимерных частицах).
Продемонстрирована возможность управления движением и
фиксацией частиц для последующего их изучения методами
оптической микроскопии высокого разрешения, что позволяет
расширить круг задач, реализуемых на МФУ.
29
В заключении представлены основные результаты работы и
выводы.
Основные результаты и выводы
1. На основе исследований факторов различной природы
(конструктивных, геометрических, физико-химических), влияющих
на разрешающую способность при электрофоретическом разделении
многокомпонентной пробы на МФУ, выявлено, что наибольшую
значимость имеют продольная диффузия компонентов, размеры
областей детектирования и инжекции пробы, отклонение геометрии
канала от линейной, а также свойства поверхности канала. Таким
образом, сформулированы методические основы оптимизации
конструкции и режимов электрофоретического разделения
биологических проб.
2. Разработана
универсальная
топология
МФЧ
для
электрофоретического
разделения
пробы,
основанная
на
модернизации традиционных технических решений, позволяющая
инжектировать различные объемы проб электрокинетическим и
гидравлическим способами.
3. Экспериментальные исследования свойств и анализ физикохимических характеристик стекол К8 и Ф1 позволили выявить
наличие у этих материалов химической стойкости, оптической
прозрачности, низкого уровня флуоресценции при возбуждении в
спектральном диапазоне 400-700 нм, возможности термического
связывания при температурах 560-5800С, что обосновывает их
применимость при изготовлении МФУ, предназначенных для
методов оптической микроскопии и флуорометрии.
4. Адаптированы и апробированы технологии формирования
микро- и наноразмерных структур с воспроизводимыми
геометрическими характеристиками для стекла К8 методом
фотолитографии и кислотного травления, а также методом
сфокусированного ионного пучка, что позволило определить
режимы формирования структур, выявить особенности и области
применимости методов.
5. На основе теоретического изучения и экспериментальных
исследований физико-химических процессов, происходящих при
температурной обработке стекла К8, разработаны и проверены
технологии герметизации МФЧ: а) способом термического
30
связывания с защитной пластиной из стекла Ф1; б) соединением
фотоотвержаемым клеем с контролем качества полимеризации
спектрофлуорометрическим методом, которые были использованы
при создании конструкций МФУ для электрофоретических методов
анализа, для ПЦР-РВ и для фиксации и удерживания микрочастиц.
6. Метод лазерной абляции полимеров применен для
формирования микроразмерных каналов и реакционных камер для
МФЧ. При этом экспериментально определены режимы
изготовления каналов в ПММА на длине волны 10,6 мкм и в ПК на
длине волны 1,06 мкм, что дало возможность изготовить прототипы
МФЧ (для электрофоретического разделения пробы и для ПЦР)
7. На основе экспериментальных исследований оптических и
структурных характеристик образцов массива ННК из GaAs
методами оптической спектроскопии, КЛСМ и электронной
микроскопии подтверждено, что отражательные свойства массива
определяются формой вершин ННК, и впервые выявлено, что
воздействие лазерного излучения с плотностью мощности свыше 100
мВт/мм2 на длинах волн 488 и 633 нм приводит к «слипанию» и
разрушению вершин ННК.
8. Экспериментальные данные, полученные при изучении
оптических свойств и структурных характеристик пористых стекол
методами оптической спектроскопии и микроскопии высокого
разрешения, позволили обосновать перспективность использования
стекла 8-В MAP в качестве оптического чувствительного элемента
для регистрации конкурентной иммунной реакции.
9. Созданы новые конструкции МФЧ с интегрированными микрои наноразмерными функциональными элементами для разделения и
фиксации частиц (с точностью не хуже 0.2 мкм) на заданном участке
микрочипа с целью их дальнейших исследований методами
микроскопии высокого разрешения.
10. Созданы действующие макеты аналитических систем на основе
МФУ: для электрофоретического разделения пробы и для
реализации ПЦР в реальном времени, позволяющие при
сопоставимых пределе обнаружения и динамическом диапазоне по
сравнению с макроаналогами значительно (до 10 раз) сократить
время определения при анализе нуклеиновых кислот, уменьшить
объем реагентов и пробы (более, чем в 2 раза).
31
Основные публикации по теме диссертации
1. Евстрапов А.А., Курочкин В.Е. Оценка поглощения
тонкослойных чувствительных элементов ограниченного размера в
отраженном свете // Оптический журнал. 1995. №5. С.50-53.
2. Курочкин В.Е., Евстрапов А.А., Буляница А.Л. и др.
Микрофлюидная аналитическая система с детектором лазериндуцированной флуоресценции // Аллергология и иммунология.
2000. Т. 1. № 3. С. 101 – 102.
3. Беленький Б.Г., Евстрапов А.А., Комяк Н.И. и др.
Микрофлюидные аналитические системы. Часть I // Научное
приборостроение. 2000. Т. 10. № 2. С. 57-64.
4. Беленький Б.Г., Евстрапов А.А., Комяк Н.И. и др.
Микрофлюидные аналитические системы. Часть II // Научное
приборостроение. 2000. Т. 10. № 3. С. 3-16.
5. Antropova T.V., Drozdova I.A., Yastrebov S.G., Evstrapov A.A.
Porous glass: inhomogeneities and light transmission // Optica Applicata.
2000. Vol. XXX. N 4. P. 553-567.
6. Беленький Б.Г., Курочкин В.Е., Евстрапов А.А. и др.
Микрофлюидные
аналитические
системы
на
основе
электрофоретических методов анализа // Новости науки и техники.
Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2001. № 1. С. 190-193.
7. Беленький Б.Г., Козулин Р.А., Евстрапов А.А. Влияние
отраженного капилляром излучения лазера на чувствительность
флуориметра
капиллярного
электрофореза
//
Научное
приборостроение. 2001. Т. 11. № 2. С. 21-25.
8. Евстрапов А.А., Антропова Т.В., Муравьев Д.О., Ястребов С.Г.
Изучение оптических свойств двухфазных и микропористых стекол
// Оптический журнал. 2001. Т. 68. № 1. С. 34-40.
9. Evstrapov A.A., Antropova T.V., Drozdova I.A., Yastrebov S.G.
Optical properties and structure of porous glasses // Optica Applicata.
2003. Vol. 33. N 1. P. 45-50.
10. Евстрапов А.А., Буляница А.Л., Рудницкая Г.Е. и др.
Особенности применения алгоритмов цифровой фильтрации
электрофореграмм при анализе веществ на микрочипе // Научное
приборостроение. 2003. Т. 13. № 2. С. 57-63.
11. Буляница А.Л., Евстрапов А.А., Рудницкая Г.Е. Метод моментов
при расчете параметров каналов в микроразмерных системах //
32
Научное приборостроение. 2003. Т. 13. № 4. С. 28-40.
12. Евстрапов
А.А.,
Курочкин
В.Е.
Микрофлюидные
аналитические системы // Журнал аналитической химии. 2003. Т. 58.
№ 7. С. 743-744.
13. Евстрапов А.А., Буляница А.Л., Рудницкая Г.Е. и др.
Микрофлюидные аналитические системы на основе методов
капиллярного электрофореза и микрочиповых технологий //
Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2003. Т. 7. № 9. С. 205211.
14. Евстрапов А.А., Буляница А.Л., Курочкин В.Е. и др. Экспрессанализ олигонуклеотидов на планарном микрофлюидном чипе //
Журнал аналитической химии. 2004. Т. 59. № 6. С. 587-594.
15. Евстрапов А.А. Физические методы управления движением и
разделением микрочастиц в жидких средах. Часть 1.
Диэлектрофорез, фотофорез, оптофорез, оптический пинцет //
Научное приборостроение. 2005. Т. 15. № 1. С. 8-21.
16. Поздняков
А.О.,
Евстрапов
А.А.,
Лишевич
И.В.
Микрофлюидные устройства с точки зрения технологии полимерных
композитов // Научное приборостроение. 2005. Т. 15. № 2. С. 67-71.
17. Евстрапов А.А., Рудницкая Г.Е., Петухова Н.А. Микрочиповые
технологии в биологических исследованиях. Экспресс-анализ ДНК:
сепарационные матрицы для разделения ДНК // Научное
приборостроение. 2005. Т. 15. № 2. С. 27-40.
18. Евстрапов А.А., Лукашенко Т.А., Горный С.Г., Юдин К.В.
Микрофлюидные чипы из полиметилметакрилата: метод лазерной
абляции и термического связывания // Научное приборостроение,
2005. Т. 15. № 2. С. 72-81.
19. Евстрапов А.А., Буляница А.Л., Лукашенко Т.А.
и др.
Микрофлюидные аналитические системы на основе методов
электрофореза
и
микрочиповых
технологий:
управление
микропотоками вещества с помощью тепловых полей, получение
микрофлюидных чипов с интегрированными элементами //
Физиология и патология иммунной системы. 2005. № 8. С. 52-57.
20. Евстрапов А.А., Поздняков А.О., Горный С.Г., Юдин К.В.
Формирование края микроразмерного канала в полиимидах методом
лазерной абляции // Письма в ЖТФ. 2005. Т. 31. Вып. 13. С. 10-17.
21. Evstrapov A.A., Esikova N.A., Antropova T.V. Spectral
characteristics and structure of porous glasses // Optica Applicata. 2005.
Vol. XXXV. N 4. P. 32-39.
33
22. Неучева О.А., Евстрапов А.А., Самсоненко Ю.Б., Цырлин Г.Э.
Взаимодействие оптического излучения с массивом нитевидных
кристаллов GaAs // Письма в ЖТФ. 2007. Т. 33. Вып. 21. С. 56-62.
23. Тупик А.Н., Евстрапов А.А. Исследование движения потоков
вещества в микрофлюидных чипах // Научно-технический вестник
СПб ГУ ИТМО. 2007. № 44. С. 165-169.
24. Буляница А.Л., Рудницкая Г.Е., Евстрапов А.А. Информативные
сигналы при электрофорезе на микрочипе: математические модели и
оценки // Научное приборостроение. 2007. Т. 17. № 3. С. 31-39.
25. Евстрапов А.А., Есикова Н.А., Антропова Т.В. Исследование
пористых стекол методами оптической спектроскопии // Оптический
журнал. 2008. Т. 75. № 4. С. 71 -77.
26. Розанов В.В., Евстрапов А.А. Высокоразрешающие методы
микроскопии при анализе структуры неоднородностей на
поверхности органических пленок // Письма в ЖТФ. 2008. Т. 34.
Вып. 15. С. 43-48.
27. Рудницкая Г.Е., Евстрапов А.А. Микрочиповые устройства для
полимеразной цепной реакции. Часть 1: Основные принципы ПЦР.
Конструкция и материалы микрочипов // Научное приборостроение.
2008. Т. 18. № 3. С. 22-40.
28. Evstrapov A.A., Esikova N.A., Rudnitskaja G.E., Antropova T.V.
Application of porous glasses in microfluidic devices // Optica Applicata.
2008. Vol. XXXVIII. N 1. P. 31-38.
29. Евстрапов А.А., Есикова Н.А., Клоков М.В. и др. Исследование
пористых стекол методами конфокальной лазерной сканирующей
микроскопии и оптической микроскопии ближнего поля // Научное
приборостроение. 2009. Т. 19. № 2. С. 52-65.
30. Евстрапов А.А., Тупик А.Н. Обработка поверхности стеклянных
микрочипов после анализа биологических проб // Научнотехнический вестник СПб ГУ ИТМО. 2009. № 4. С. 42-47.
31. Евстрапов А.А., Лукашенко Т.А., Тупик А.Н. Применение
фотоотверждаемых
оптических
клеев
для
герметизации
аналитических микрочипов // Научное приборостроение. 2010. Т. 20.
№ 1. С. 29-38.
32. Евстрапов А.А., Есикова Н.А., Рудницкая Г.Е. и др., Разработка
оптического сенсорного элемента для микрофлюидных чипов на
основе натриево-боросиликатного пористого стекла // Научное
приборостроение. 2010. Т. 20. № 1. С. 52-58.
34
33. Evstrapov A., Esikova N., Rudnitskaya G., Antropova T. Porous
Glasses as a Substrate For Sensor Elements // Optica Applicata. 2010.
Vol. XL. N 2. P. 333-340.
34. Евстрапов А.А., Мухин И.С, Кухтевич И.В., Букатин А.С.
Применение ионной литографии для формирования наноразмерных
каналов микрофлюидных чипов в стеклянных подложках // Научнотехнический вестник СПб ГУ ИТМО. 2010. Т. 68. № 4. С. 59-63.
35. Кухтевич И.В., Евстрапов А.А. Статистический анализ
структуры нанопористых стекол по изображениям, полученным
методом конфокальной сканирующей лазерной микроскопии //
Научно-технический вестник СПб ГУ ИТМО. 2010. Т. 69. №5. С.
101-105.
36. Кухтевич И.В., Букатин А.С., Евстрапов А.А., Мухин И.С.
Создание
аналитической
установки
для
биологических
исследований на основе оптического микроскопа Axio Observer D1 и
микрочиповых технологий. Часть 1 // Научное приборостроение.
2010. Т. 20. № 3. С. 3–8.
37. Курочкин В.Е., Евстрапов А.А., Буляница А.Л., и др. Разработка
микрочиповых устройств для проведения ПЦР в геле // Научное
приборостроение. 2010. Т. 20. № 4. С. 127-131.
38. Antropova T., Drozdova I., Kukhtevich I., Evstrapov A. et al.
Application of high resolution microscopy and optical spectroscopy for
study of phase separation in phosphorus- and fluorine-containing sodium
borosilicate glasses // Optica applicata. 2010. Vol. XL. N 2. P. 293-304.
39. Евстрапов А.А., Мухин И.С., Кухтевич И.В. , Букатин А.С.
Метод сфокусированного ионного пучка при формировании
наноразмерных структур в микрофлюидных чипах // Письма в ЖТФ.
2011. Т. 37. Вып. 20. С. 32-40.
40. Евстрапов А.А. Наноразмерные структуры в микрофлюидных
устройствах // Научное приборостроение. 2011. Т. 21. №3. С. 3-16.
41. Кухтевич И.В., Букатин А.С., Мухин И.С., Евстрапов А.А.
Микрофлюидные чипы с интегрированными наноразмерными
структурами для фиксации биологических объектов // Научное
приборостроение. 2011. Т. 21. № 3. С. 17- 22.
42. Евстрапов А.А. Микрофлюидные чипы для биологических и
медицинских исследований // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им.
Д.И. Менделеева). 2011. Т. LV. № 2. С. 99-110.
43. Кухтевич И.В., Букатин А.С., Мухин И.С., Евстрапов А.А.
Микрофлюидные чипы для исследования биологических объектов
35
методами микроскопии высокого разрешения // Научно-технический
вестник СПб ГУ ИТМО. 2012. Т. 77. № 1. С. 111-115.
44. Evstrapov A.A., Mukhin I.S., Bukatin A.S., Kukhtevich I.V. Ion and
electron beam assisted fabrication of nanostructures integrated in
microfluidic chips // Nuclear Instruments and Methods in Physics
Research B. 2012. N 282. P. 145–148.
45. Евстрапов А.А., Лукашенко Т.А., Рудницкая Г.Е. и др.
Микрофлюидные чипы из стеклянных материалов // Научное
приборостроение. 2012. Т. 22. № 2. С. 27-43.
36
Документ
Категория
Технические науки
Просмотров
276
Размер файла
928 Кб
Теги
Докторская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа