close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Симбиотические взаимоотношения лактобацилл и микроорганизмов желудочно-кишечного тракта.

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Червинец Юлия Вячеславовна Шифр научной специальности: 03.02.03 - микробиология Шифр диссертационного совета: Д 208.040.08 Название организации: Первый Московский государственный медицинский университет им.И.М.Сеченова - ГБОУВПО Адре
На правах рукописи
ЧЕРВИНЕЦ ЮЛИЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА
СИМБИОТИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЛАКТОБАЦИЛЛ И МИКРООРГАНИЗМОВ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА
03.02.03 - микробиология Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва - 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Тверской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России
Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Даниленко Валерий Николаевич
доктор медицинских наук, профессор Миронов Андрей Юрьевич
Официальные оппоненты:
Митрохин Сергей Дмитриевич Мавзютов Айрат Радикович
Ряпис Леонид Абрамович Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова Минздавсоцразвития России
Защита состоится "_____ "___________ 2012 года в 14.00 на заседании диссертационного совета Д.208.040.08 в ГБОУ ВПО Первом Московском государственном медицинском университете им. И.М. Сеченова по адресу: 119992, Москва, Трубецкая ул., 8, строение 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, 49).
Автореферат разослан "__"____________ 2012 года
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д.208.040.08 Миронов Андрей Юрьевич
доктор медицинских наук, профессор Список сокращений
ВКПМ - Всероссийская коллекция производственных микроорганизмов
ГЭРБ - гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь ЖКТ - желудочно-кишечный тракт КОЕ - колониеобразующая единица
ОСМ по McFarland - оптический стандарт мутности по МакФарланду ПЦР - полимеразная цепная реакция
СПА - средний показатель адгезии
ТСБ - триптиказо-соевый бульон ЦПД - цитопатическое действие
Api WEB для ПК - программное обеспечение для биохимической идентификации микроорганизмов для персонального компьютера
Da - дальтон d - диаметр GasPak - газогенераторные пакеты
MRS - специализированная среда для роста лактобацилл Mr - молекулярная масса p - критический уровень значимости величины
QS - "quorum sensing" - ощущение чувства кворума
Rh - резус фактор 12 п. кишка - двенадцатиперстная кишка
0Т - градусы Тернера
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Воспалительные и эрозивно-язвенные поражения желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) занимают одно из первых мест во всем мире (Ряпис Л.А., 2012). Большинство этих болезней протекают на фоне дисбиоза пищевода, желудка, 12-перстной кишки, тонкого и толстого кишечника (Бондаренко В.М., 2007; Иванова Т.Н., 2007). В настоящее время для коррекции нарушенного микробиоценоза (дисбактериоза, дисбиоза) применяют препараты-пробиотики, проявляющие свой лечебный и профилактический эффекты через регуляцию нормальной микрофлоры организма хозяина (Нилова Л.Ю., 2008; Амерханова, А.М., 2009; Алешкин А.В., 2011; Давыдкин В.Ю., 2011; Митрохин С.Д., 2008, Sirilun S., 2010). Наиболее распространенным подходом в терапии дисбиоза является "метод вытеснения", основанный на применении больших доз лечебных антибактериальных препаратов. Клинико-экспериментальные работы по бактериотерапии дисбактериозов показали, что лучший эффект достигается при индивидуальном подборе донорских штаммов, либо при использовании аутофлоры (Ермоленко Е.И., 2009). Разрабатываемые новые штаммы микроорганизмов из ЖКТ здоровых людей должны расширить и улучшить функциональные характеристики выпускаемых в настоящее время препаратов-пробиотиков для профилактики и лечения социально-значимых заболеваний, сопровождающихся дисбиозом ЖКТ (Жиленкова О.Г., 2011).
Коммерциализация новых пробиотиков составляет от 2 до 23%, однако анализ данных свидетельствует о новизне получаемых исследователями результатов, которые сопоставимы с долей получаемых прав на интеллектуальную собственность. Практически все получаемые научные результаты по выделению новых штаммов пробиотиков обладают новизной и рассматриваются как перспективный коммерческий продукт. Несмотря на то, что указанные микроорганизмы используются в качестве пробиотиков, их биосовместимость с другими пробиотическими препаратами, чувствительность к антимикробным химиотерапевтическим препаратам оставляют желать лучшего. Исходя из анализа данных отечественных и зарубежный исследований можно сделать вывод, что доля интеллектуальной и прикладной продукции новых пробиотиков будет увеличиваться (Корниенко Е.А., 2007, Парфенов А.И., 2009, Чернин В.В., 2011, Sadaf A., 2009, Stamatova I.V.,2010). Создание, изучение и испытание относительно дешевых пробиотических препаратов представляется крайне перспективным и экономически выгодным направлением для профилактики и терапии социально значимых заболеваний. Показано, что организм взрослого человека состоит примерно из 1013 клеток, в то время как в органах, тканях, а также в полостях человека обитает до 1014-1015, а при некоторых патологических состояниях - до 1017 клеток микроорганизмов (Шендеров Б.А., 2003,2005). Микробиота (совокупность микроорганизмов) человека активно участвует в жизнедеятельности человека (пищеварительном процессе, обмене веществ, поддержании иммунного статуса). Несмотря на обилие информации, на данный момент нет точных данных, описывающих качественные и количественные симбиотические взаимоотношения между представителями нормофлоры (лактобацилами), а также условно-патогенными и патогенными микроорганизмами ЖКТ.
Микробиота человека интенсивно изучается (http://nihroadmap.nih.gov/hmp/). В рамках Human Microbiome Project определена полная нуклеотидная последовательность и аннотированы геномы 20 штаммов 14 видов лактобацилл. Работа по определению полной нуклеотидной последовательности генома еще 54 штаммов 22 видов лактобацилл ведется, но еще не завершена (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Последние научные данные указывают на специфичность видового состава кишечной микрофлоры, как у каждого индивидуума, так и у национальных и региональных групп населения. Такие исследования проводятся и в Институте общей генетики им Н.И. Вавилова РАН (http://www.vigg.ru/, http://www.rnnbs.ru/).
Наиболее перспективными препаратами пробиотиками являются лактобациллы, представители нормальной микрофлоры, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, способные синтезировать ряд антибиотикоподобных веществ, таких как органические кислоты (молочную кислоту), перекись водорода, мурамидазу, бактериоцины, микроцины (Бондаренко В.М., 2010). Симбиоз лактобацилл с микроорганизмами осуществляется при формировании единой генетической системы, биоплёнки, определяющей пищевые, энергетические и другие связи между собой и внешним миром по типу "QS", "социального поведения микроорганизмов". В связи с этим представляется актуальным изучение механизмов, обеспечивающих симбиотические взаимоотношения лактобацилл с микроорганизмами ЖКТ, а также пробиотическими штаммами. Это позволит выделить наиболее антагонистически активные штаммы лактобацилл, которые можно использовать для создания перспективных пробиотических препаратов.
Цель исследования - выделить антагонистически активные штаммы лактобацилл от здоровых людей, определить их симбиотические взаимоотношения с микроорганизмами пищеварительного тракта, а также пробиотическими штаммами, и установить механизм пробиотического действия лактобацилл.
Задачи исследования
1. Выделить и идентифицировать представителей нормофлоры, патогенной и условно-патогенной микрофлоры пищеварительного тракта от здоровых людей различных возрастных групп, а также больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ.
2. Выделить и идентифицировать лактобациллы из полости рта, желудка, 12 п. кишки и толстого кишечника здоровых людей различных возрастных групп.
3. Отобрать высокоантагонистические штаммы лактобацилл из различных биотопов пищеварительного тракта здоровых людей для создания новых пробиотиков.
4. Определить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с микроорганизмами нормофлоры пищеварительного тракта.
5. Изучить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с представителями патогенной и условно-патогенной микрофлоры пищеварительного тракта.
6. Установить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с пробиотическими штаммами микроорганизмов (лактобацилл, бифидобактерий).
7. Выяснить механизм пробиотического действия лактобацилл.
8. Определить генетические маркеры антагонистической активности лактобацилл.
9. В эксперименте на животных выявить антагонистическую активность лактобацилл в отношении сальмонелл.
Научная новизна Новизна работы заключается в выделении из пищеварительного тракта здоровых людей новых штаммов лактобацилл, обладающих высокой степенью антагонизма по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, чувствительностью к антибактериальным препаратам, биосовместимостью с применяемыми в настоящее время другими препаратами-пробиотиками.
Лактобациллы, выделенные из полости рта здоровых людей, проявили наиболее выраженные антагонистические свойства по отношению к условно-патогенной и патогенной бактериальной и грибковой микрофлоре ЖКТ.
Показано, что механизм формирования пробиотической активности лактобацилл складывается из совместного действия пробиотического и адаптационного потенциала.
Полученные данные о симбиотических взаимоотношениях лактобацилл с микрофлорой пищеварительного тракта в составе биопленок могут быть использованы для создания перспективных пробиотических препаратов, что позволит практическому врачу оптимизировать лечение заболеваний ЖКТ.
Теоретическая значимость
Лактобациллы, выделенные из определенного биотопа, более активно подавляют патогенную и условно-патогенную микрофлору пищеварительного тракта того же локуса.
Генетическими методами исследования подтверждено, что наличие генов, ответственных за синтез бактериоцинов у лактобацилл, в значительной степени обуславливающих проявление антагонистической активности, не всегда коррелирует с бактериоциногенностью бактерий, выявленной культуральным методом.
Получены новые данные, расширяющие теоретические представления о симбиотических взаимодействиях лактобацилл с условно-патогенными и патогенными микроорганизмами, заселяющими пищеварительный тракт человека, начиная с полости рта, заканчивая кишечником. Эти материалы могут лечь в основу изучения механизмов формирования симбиотических отношений между различными родами и видами микроорганизмов.
Практическая значимость Работа является фрагментом плановой темы НИР кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии ГБОУ ВПО Тверской государственной медицинской академии, № госрегистрации 01.2.006.06352.
Получены 2 патента РФ на изобретение: № 2235324 от 25 августа 2004 г.: "Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс диагностике дисбактериоза кишечника" и № 2400174 от 27 сентября 2010 г.: "Способ местного лечения воспалительных заболеваний пародонта"; поданы 2 заявки на изобретение: "Штамм бактерий Lactobacillus plantarum 36к ВКПМ В-11154, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам" № 2012105262 от 16.02.2012 и "Штамм бактерий Lactobacillus rhamnosus 38к ВКПМ В-11155, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам" №2012105265 от 16.02.2012.
В государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора депонировано 19 штаммов и 2 штамма лактобацилл депонировано во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Эти штаммы можно использовать для создания перспективных пробиотических препаратов, обладающих широким спектром антимикробной активности и адаптированных к организму человека.
Внедрение в практику
Поданы две заявки о выдачи патента РФ на изобретение в Федеральную службу по интеллектуальной собственности ФГБУ Федерального института промышленной собственности:
1. Штамм бактерий Lactobacillus plantarum 36к ВКПМ В-11154, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Регистрационный номер заявки - 2012105262 от 16.02.2012.
2. Штамм бактерий Lactobacillus rhamnosus 38к ВКПМ В-11155, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Регистрационный номер заявки - 2012105265 от 16.02.2012.
Получены 2 патента РФ на изобретение:
1. № 2235324 от 25 августа 2004 г.: "Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс диагностике дисбактериоза кишечника";
2. № 2400174 Бюл.№ 27, 27.09 2010 г.: "Способ местного лечения воспалительных заболеваний пародонта".
В государственную коллекцию микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора депонировано 19 штаммов.
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии, а также в работе бактериологической лаборатории НИЦ ГБОУ ВПО Тверской ГМА Минздравсоцразвития России. Получен акт о внедрении материалов диссертации в учебный процесс и научную работу кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Новосибирского государственного медицинского университета Минздравсоцразвития России.
Апробация работы Результаты исследования доложены: на международной конференции "Физиология и патология иммунной системы" и IV Международной конференции по иммунотерапии, посвященных 100-летию присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии и 25-летию Всесоюзного научного общества иммунологов, 2009 г. в виде стендового доклада; на V съезде Общества биотехнологов России и Всероссийском совещании работников биотехнологической отрасли промышленности, Москва 2-4 декабря, 2008г. в виде стендового доклада; на XV Международная конференция челюстно-лицевых хирургов и стоматологов "Новые технологии в стоматологии" 17-19 мая 2010г. г. Санкт-Петербург, в виде устного доклада; на межрегиональной научно-практической конференции "Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта", Тверь, 8 апреля, 2011 г. в виде устного доклада; на межрегиональной научно-практической конференция "Актуальные вопросы рефлюкс-эзофагита и язвенной болезни", 20 апреля 2012 г., Тверь, в виде устного доклада.
Положения, выносимые на защиту 1. Выделенные и идентифицированные штаммы лактобацилл из различных биотопов пищеварительного тракта здоровых людей обладают выраженным адаптационным потенциалом.
2. Выделенные штаммы лактобацилл не оказывают взаимного антагонистического воздействия, не подавляют метаболизма и размножения бифидобактерий, а также практически не влияют на рост нормофлоры ЖКТ.
3. Выделенные штаммы лактобацилл проявляют выраженную антагонистическую активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ, а также вакцинным полиовирусным штаммам Сэбина 1, 2 и 3 типов.
4. Механизм пробиотического действия выделенных штаммов лактобацилл связан с продукцией молочной кислоты и полипептидных фракций, обладающих избирательным антагонистическим действием по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам.
5. Выявлена антагонистическая активность лактобацилл в отношении сальмонелл в эксперименте на животных и показана положительная динамика регенерации пораженных органов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 03.02.03 - "микробиология". Результаты проведённого исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта микробиологии.
Личный вклад
Весь материал диссертации собран, обработан и проанализирован лично автором. Вклад автора является определяющим и в обсуждении результатов исследования в научных публикациях и докладах.
Публикации Основное содержание работы отражено в 53 научных публикациях: в 21 статье, в том числе, в 17 статьях, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4-х глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы из 397 наименований, в том числе, 270 зарубежных и 127 отечественных работ. Диссертация изложена на 412 страницах основного текста, содержит 134 рисунка, 149 таблиц, 1 схему и 5 приложений.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования служило содержимое зубодесневых карманов, зубной налет, соскоб со слизистой оболочки щек, языка, биоптаты слизистой оболочки пищевода, желудка, 12 п. кишки, фекалии 600 здоровых людей разных возрастных групп и больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ (1-я группа - дети в возрасте до 8 лет, 2-я группа - дети от 10 до 14 лет, 3-я группа - от 20 до 35 лет, 4-я группа - старше 80 лет; мужчин - 240, женщин - 360). Все здоровые люди на момент обследования были клинически здоровы, не имели в анамнезе инфекционных и соматических заболеваний ЖКТ.
Настоящая работа является одномоментным поперечным исследованием. У всех лиц получено информированное согласие на сбор материала.
Критерием включения для практически здоровых лиц является отсутствие: острых заболеваний, очагов гнойно-воспалительных инфекций, сахарного диабета, онкопатологии, первичного и вторичного иммунодефицита; у лиц с хроническими заболеваниями старше 50 лет отсутствие обострений и стадии функциональных нарушений.
Критерием включения для лиц с патологией ЖКТ является наличие: ГЭРБ с явлениями эзофагита, хронического активного гастрита, дуоденита, язвенной болезни желудка и 12 п. кишки; диагнозы верифицированы эндоскопическим и гистологическим исследованием.
Количество выделенных клинических штаммов микроорганизмов составило: Lactobacillus spp. - 203, Micrococcus spp. - 9, Bacteroides spp. - 14, Enterococcus spp. - 6, Streptococcus spp. - 25, Staphylococcus spp. - 33, Sarcina spp. - 8, Lactococcus spp. -2, Corynebacterium spp. - 5, Neisseria spp. - 6, Veillonella spp. - 6, Actinomyces spp. - 34, Escherichia spp. -8, Serratia spp. -3, Gemella spp. -2, Eubacterium spp. -13, Bifidobacterium spp. -21, Clostridium spp. - 5, Propionibacterium spp. - 2, H. pylori - 6, Bacillus spp. - 13, Klebsiella spp. - 2, Proteus spp. - 18, Candida spp. - 46, Cryptococcus spp. - 2, Pseudomonas spp. - 18, Salmonella spp. - 5, Shigella spp. - 3, Enterobacter spp. - 5, Campylobacter spp. - 4, Citrobacter spp. - 3, Acinetobacter spp. - 3, Moraxella spp. - 2, Leptotrichia spp. - 2, Fusobacterium spp. - 4, Prevotella spp. - 4, Peptostreptococcus spp. - 5, Peptococcus spp. - 4.
Индикаторные культуры: производственные штаммы L. plantarum 8RA-3 и B. subtilis 534 из международных коллекций Государственного музея нормальной микрофлоры человека ФГУН им. Г. Н. Габричевского; C. albicans ATCC 885-653, S. typhimurium 415, S. sonnei I фазы 941 из коллекции музейных культур НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН г. Москва; E. coli ATCC 25922, S. aureus 209, P. aeruginosa ATCC 9027, B. catenulatum 20103, B. breve 20213, B. bifidum 20239, B. bifidum LBA-3, B. bifidum 791, B. pseudocatenulatum 2, B. longum B379M, B. longum 2C, L. acidophilus (helveticus ТШ) NK1 и L. amylovorus БТ-24/88 из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л. А. Тарасевича, а также полиовирусные штаммы Сэбина 1, 2 и 3 типов, полученные в НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН.
Питательные среды, условия роста и хранение культур микроорганизмов. Для комплексного изучения аэробной и анаэробной микрофлоры посевы производили на отечественные, и на импортные питательные среды, включающие: желточно-солевой агар (г. Оболенск), МакКонки агар (BBL(r)), Колумбиа агар (BBL(r), "Himedia"), Эритрит агар (ФГУП НПО "Микроген", Москва), Sabouraud Dextrose Agar (BBL(r)), MRS Agar (BBL(r)), Schaedler Agar (BBL(r)) с кровью, Muller-Hinton II агар (BBL(r)), хромогенные питательные среды ("Himedia"). Посевы культивировали в аэробных, анаэробных и микроаэрофильных условиях с использованием микроанаэростатов (BBL) и газогенераторных пакетов Gas Pack Plus (BBL) в течение 24-72 часов при температуре 37о С. Культуры длительно хранили в криопробирках на ТСБ (TSB: Difco Laboratories, Detroit, Mich.) с 15% глицерина в морозильной камере при температуре -20° С.
Диски с антибиотиками. В работе использованы диски с антибиотиками производства "Himedia" Laboratories Pvt., Индия.
Тест-системы, рекомендованные Роспотребнадзором для идентификации микроорганизмов: Enterotube II, Oxi/Ferm Tube II и Mycotube (BBL), а также api(r) 20 STREP, api(r) 20 A, api(r) Staph, api(r) CAMPY, api(r) 50 CH, api(r) Coryne и api(r) NH (bioMérieux Vitek, Inc.).
Для определения противовирусной активности суспензий и супернатантов бульонных культур лактобацилл использовали полиовирусные штаммы Сэбина 1, 2 и 3 типов, полученные в НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН.
Для определения антагонистической активности лактобацилл в эксперименте in vivo использованы 30 половозрелых белых лабораторных крыс самцов линии Вистар массой тела 180 г. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755). Все животные содержались при сходных условиях в отношении температуры, влажности и освещения, а также рациона питания (комбикорм ПК-120-1, Россия). На проведение экспериментов было получено разрешение этического комитета ГБОУ ВПО Тверской ГМА Минздравсоцразвития России (протокол от 30.05.2011 г.).
Методы исследований
Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств микроорганизмов, выделенных из разных биотопов пищеварительного тракта, проводили на базе бактериологической лаборатории НИЦ Тверской ГМА по общепринятым методикам, а также используя новые методы исследования (Бондаренко В. М., 2004).
Генетическую идентификацию лактобацилл проводили по стандартному методу с использованием нуклеотидной последовательности гена 16S РНК на базе Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (г. Москва). Для исследования генов, ответственных за продукцию бактериоцинов, у выделенных штаммов лактобацилл использована ПЦР и специфические праймеры для генов L. plantarum (для генов пребактериоцинов plnEF, plnJ, plNC8, а также для гена plnN, предположительно являющегося пребактериоцином) и L. rhamnosus (генов пребактериоцинов LGG_02380 и LGG_02400).
Первичное изучение антагонизма у лактобацилл проводили (Блинкова Л. П., 2003) с помощью метода перпендикулярных штрихов по отношению к индикаторным культурам условно-патогенных и патогенных микроорганизмов: Candida albicans ATCC 885-653, Salmonella typhimurium 415, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtilis 534 из коллекции музейных культур НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН г. Москва; Escherichia coli 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus 209 из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л. А. Тарасевича. Антагонистическую способность лактобацилл (продукция бактериоцинов) определяли методом двухслойного агара или отсроченного антагонизма (Блинкова Л. П., 1986, Баженов Л. Г., 1997). Антимикробную активность супернатантов лактобацилл, содержащих бактериоциноподобные вещества, изучали методом диффузии в агар и путем определения оптической плотности.
Активность кислотообразования у лактобацилл определяли титрометрическим методом (Лянная А. М., Гончарова Г. И., 1975). Адгезивную активность лактобацилл определяли, пользуясь средним показателем адгезии (СПА) по методу Брилис В. И.(1986) на эритроцитах человека О (I) группы Rh+. Аутоагрегация и поверхностная гидрофобность лактобацилл определялась методом A. Andreu et al. (1995). Способность лактобацилл к коаггрегации определялась методом G. Reid et al. (1990). Тестирование лактобацилл на способность формировать биопленки проводили в стерильных пластиковых чашках Петри со стеклышками по методике, описанной Романовой Ю. М., 2006. Биосовместимость исследуемых лактобацилл между собой и бифидобактериями определялась методом совместного культивирования на плотной питательной среде (Глушанова Н. А., 1999).
Отношение лактобацилл к антибиотикам и химиопрепаратам определялась методом диффузии в агар на среде Muller-Hinton 2 в соответствие с методиками, рекомендованными фирмой "Himedia" (www.himedialabs.ru).
Ферменты патогенности микроорганизмов (лецитиназную, казеинолитическую, уреазную, желатиназную, нуклеазную, каталазную, гемолитическую, антилизоцимную активности), а также цитотоксичность определяли по стандартным методикам (Мавзютов А. Р., 2007; Агапова О. В., 1999; Червинец В. М., 2002; Никитин В. М., 1986).
Определение экзометаболитов лактобацилл осуществляли хромато-масс-спектрометрическим методом на системе "Dionex UltiMate3000- API 2000" (Лебедев А. Т., 2003; Vicki H. W., 2005). Анализ фракций, пептидов лактобацилл, изолированных хромато-масс-спектрометрическим методом, проводился методом капиллярного зонного электрофореза на системе "КАПЕЛЬ-105" (Комарова Н. В., 2006).
Для определения активности штаммов лактобацлл в отношении вирусов проведена реакция нейтрализации в перевиваемой линии ткани Hep-2 (Cincinnati) эпидермальной карциномы человека, с использованием штаммов полиовирусов Сэбина 1, 2 и 3 типов, полученных в НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН.
Для определения антагонистической активности лактобацилл в эксперименте in vivo животные были разделены на три группы: две экспериментальные (№ 1 и № 2) и одна контрольная группы по 10 крыс в каждой группе. Животным экспериментальной группы № 1ежедневно в одно и то же время 3 раза в день per os в течение 7 дней вводили Salmonella typhimurium в количестве 2 мл 108 КОЕ/мл. Животным экспериментальной группы № 2 ежедневно в одно и то же время 3 раза в день per os в течение 2-х дней вводили Salmonella typhimurium в количестве 2 мл 108 КОЕ/мл, а затем с 3-го дня в течение 5 дней вводили через рот суспензию лактобацилл, Lactobacillus plantarum 38к, по 1 мл 108 КОЕ/мл (ОСМ по McFarland). Животным контрольной группы никаких препаратов не вводили, они находились на обычном рационе питания. Микробиологическое исследование фекалий белых крыс всех 3-х групп проводилось на вторые, пятые и седьмые сутки. Анализ состава и качества микрофлоры проводился стандартными бактериологическими методами. Крыс выводили из эксперимента на восьмые сутки передозировкой диэтилового эфира с соблюдением принципов эвтаназии (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755). Забирали кусочки подвздошной кишки, печени, поджелудочной железы и надпочечника. Кусочки органов фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина. После заливки в парафин готовили срезы толщиной 5-7 мк, которые окрашивали гематоксилином и эозином.
Данные экспериментов обрабатывались с помощью прикладной программы "STATISTICA" (Stat Soft Russia) и "Excel". Сравнение групп микроорганизмов проводилось методом параметрической статистики по критерию Шапиро-Уилка и непараметрическими методами с использованием дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I. АДАПТАЦИОННЫЙ И ПРОБИОТИЧЕСИКЙ ПОТЕНЦИАЛ ЛАКТОБАЦИЛЛ
1. Выделение и идентификация лактобацилл
Для отбора антагонистически активных культур изучено 203 штамма лактобацилл, выделенных из полости рта, желудка и толстого кишечника здоровых людей 3-х возрастных групп (1-я группа - дети в возрасте до 8 лет, 2-я группа - дети от 10 до 14 лет, 3-я группа - от 25 до 35 лет; мужчин - 240, женщин - 360). Изучались культуральные, морфологические, тинкториальные, биохимические свойства, факторы патогенности, антагонистическая активность, геном и чувствительность к антимикробным химиотерапевтическим препаратам.
При исследовании этих штаммов лактобацилл на наличие каталазной активности, микробных протеаз (казеиназа и желатиназа), нуклеазной активности (ДНК-аза и РНК-аза), гемолитической, антилизоцимной и лецитиназной активности выявлено отсутствие указанных фенотипических признаков, ассоциированных с синтезом ферментов агрессии.
Оказалось, что лактобациллы проявляют чувствительность в 100% к тетрациклину, 93,4% - к гентамицину, эритромицину, рифампицину и меропенему, 86,2% - к линезолиду, стрептомицину и ампициллину, 75,4% - к фурадонину, левомицетину и доксициклину, 66,9% - к бензилпенициллину, 33,9% - к ципрофлоксацину, 14,3% - к ванкомицину, 6,4% - к левофлоксацину. К раствору Люголя оказались чувствительны 100% исследуемых лактобацилл, к метиленовой сини - 60,1 %, к 0,5% раствору диоксидина - 30,5%, к хитозану - 15,3%. К раствору димексида все штаммы лактобацилл показали 100% резистентность.
Установлено, что резистентность к антибиотикам генотипически связана с островками патогенности микроорганизмов (Бондаренко В. М., 2011). Высокая чувствительность выделенных нами лактобацилл к вышеперечисленным антибиотикам и химиопрепаратам свидетельствует об отсутствии генов антибиотикорезистентности у данных штаммов. Таким образом, исследуемые лактобациллы являются безопасными в применении, т. к. они не могут участвовать в формировании лекарственной устойчивости у нормальной микрофлоры ЖКТ.
В результате определения антагонистической активности штаммов лактобацилл методом перпендикулярных штрихов отобрано 20 антагонистически активных лактобацилл, проявивших антагонизм ко всем индикаторным культурам условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Штаммы не подвергались генно-инженерным воздействиям.
В результате биохимической идентификации с помощью тест системы api(r) 50 CH (bio Mérieux) и программного обеспечения API WEB по 50 параметрам выявлено, что из 10 изолятов лактобацилл, выделенных из полости рта, 2 принадлежат к виду L. fermentum, 3 - к L. plantarum, 5 - к L. rhamnosus; из 4-х изолятов лактобацилл, выделенных из желудка, 2 принадлежат к виду L. plantarum, 2 - к L. rhamnosus; из 6 изолятов лактобацилл, выделенных из кишечника, 4 принадлежат к виду L. plantarum, 2 - к L. rhamnosus.
В результате генетической идентификации по гену 16S РНК выявлено, что из 10 изолятов лактобацилл, выделенных из полости рта, 5 принадлежат к виду L. fermentum, 4 - к L. rhamnosus, 1 - к L. plantarum,; из 4-х изолятов лактобацилл, выделенных из желудка, 3 принадлежат к виду к L. rhamnosus, 1 - к L. plantarum,; из 6 изолятов лактобацилл, выделенных из кишечника, 3 принадлежат к виду L. plantarum, 2 - к L. rhamnosus и 1 - к L. casei.
Анализ данных, полученных после биохимической и генетической идентификации лактобацилл, показал, что в 70% случаях, подтверждена видовая принадлежность, определенная по биохимическим тестам (табл. 1). В 30%, генетическое исследование изменило их видовую принадлежность: L. plantarum 11 зв. на L. fermentum 11 зв., L. rhamnosus 291 на L. fermentum 291, L. paracasei 50 зв. на L. rhamnosus 50 зв., L. fermentum 1 ж. на L. plantarum 1 ж., L. fermentum 2 ж. на L. rhamnosus 2 ж., L. plantarum 17 к. на L. casei 17 к.
Таблица 1
Идентификация лактобацилл
№БиотопРезультаты биохимической идентификации по тест-системе api 50 CH "bio Mérieux"Результаты генетической идентификации, основанные на исследовании гена 16S РНК1.
Полость ртаL.fermentum 2пр.L.fermentum 2пр.2.L.fermentum 11 д.ст.L.fermentum 11 д.ст.3.L.plantarum 11 зв.L.fermentum 11 зв.4.L.fermentum 39 зв.L.fermentum 39 зв.5.L. rhamnosus 291L.fermentum 2916.L.plantarum 106 зв.L.plantarum 106 зв.7.L.rhamnosus 7 д.ст.L.rhamnosus 7 д.ст.8.L.rhamnosus 24 д. ст.L.rhamnosus 24 д. ст.9.L. paracasei 50 зв.L.rhamnosus 50 зв.10.L.rhamnosus 72 зв.L.rhamnosus 72 зв.11.
ЖелудокL. fermentum 1 ж.L.plantarum 1 ж.12.L. fermentum 2 ж.L. rhamnosus 2 ж.13.L.rhamnosus 3 ж.L.rhamnosus 3 ж.14.L.rhamnosus 4 ж.L.rhamnosus 4 ж.15.
КишечникL.plantarum 46 к.L.plantarum 46 к.16.L.plantarum 36 ст.L.plantarum 36 ст.17.L.rhamnosus 38 к.L.rhamnosus 38 к.18.L. plantarum 17 к.L.casei 17 к.19.L.rhamnosus 32 к.L.rhamnosus 32 к.20.L. plantarum К9 LL. plantarum К9 L Из полости рта (табл. 2) выделены 2 антагонистически активных штамма лактобацилл, L. rhamnosus и L. fermentum, от здоровых детей в возрасте до 8 лет; 2 штамма, L. rhamnosus и L. fermentum, от здоровых детей в возрасте от 10 до 14 лет; 6 штаммов, L. plantarum, L. rhamnosus и L. fermentum, от здоровых людей в возрасте от 20 до 35 лет. Из желудка выделены 4 антагонистически активных штамма лактобацилл, L. rhamnosus и L. plantarum, от здоровых людей в возрасте от 20 до 35 лет. Таблица 2
Видовой состав индигенных штаммов лактобацилл четырех возрастных групп, выделенных из полости рта, желудка, и кишечника здоровых людей
Вид микроорганизмаКоличество штаммовПолость ртаЖелудокКишечникI
группаII группаIII группаI группаII группаIII группаI группаII группаIII группаL. plantarum 1112L. rhamnosus 112311L. fermentum113L. casei1 Из кишечника выделены 3 антагонистически активных штамма лактобацилл, L. plantarum, L. rhamnosus и L. casei, от здоровых детей в возрасте от 10 до 14 лет; 3 штамма, L. plantarum и L. rhamnosus, от здоровых людей в возрасте от 20 до 35 лет.
2. Адгезивная способность лактобацилл
При исследовании адгезивной способности 20 антагонистически активных штаммов лактобацилл (рис. 1), выделенных из полости рта, желудка и кишечника здоровых людей выявлено, что высокой адгезивной способностью обладают 7 оральных штаммов лактобацилл (L. fermentum 11 д.ст., L. fermentum 11 зв., L. fermentum 291, L. plantarum 106 зв., L. rhamnosus 50 зв., L. rhamnosus 7 д.ст. и L. rhamnosus 24 д. ст.) и 3 кишечных штамма (L. rhamnosus 38 к., L. rhamnosus 32 к. и L. plantarum К9 L). СПА лактобацилл полости рта колебался от 3,44 до 6,08 и в среднем составил 3,8±0,99. СПА лактобацилл желудка колебался от 2,48 до 3,24 и в среднем составил 3,0±0,32. СПА лактобацилл кишечника колебался от 2,12 до 4,52 и в среднем составил 3,87±1,02. Таким образом, лактобациллы имели среднее значение адгезивности.
Рис. 1 Адгезия лактобацилл на эритроцитах человека 0 (I) группы Rh+
3. Способность лактобацилл к аутоагрегации Исследование аутоагрегации лактобацилл (рис. 2) показало, что антагонистически активные штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта, обладали средней (5 штаммов: L. fermentum 2пр., L. fermentum 291, L. plantarum 106 зв., L. rhamnosus 50 зв. и L. rhamnosus 72 зв.) и высокой аутоагрегацией (5 штаммов: L. fermentum 11 д.ст., L. fermentum 11 зв., L. fermentum 39 зв., L. rhamnosus 7 д.ст. и L. rhamnosus 24 д. ст.). Все лактобациллы, выделенные из желудка, обладали средней способностью к аутоагрегации. Из 6 штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника, только 1 обладал высокой аутоагрегацией (L. rhamnosus 38 к.), остальные - средней. Таким образом, лактобациллы, выделенные из полости рта имели более высокие показатели аутоагрегации, чем лактобациллы желудка и кишечника.
Рис. 2 Аутоагрегация лактобацилл (увеличение 1х1000)
4. Поверхностная гидрофобность лактобацилл
Определение поверхностной гидрофобности лактобацилл показало, что, антагонистически активные штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта, обладали средней (L. fermentum 291, L. plantarum 106 зв., L. rhamnosus 50 зв. и L. rhamnosus 72 зв.) и высокой поверхностной гидрофобностью (L. fermentum 2пр., L. fermentum 11 д.ст., L. fermentum 11 зв., L. fermentum 39 зв., L. rhamnosus 7 д.ст. и L. rhamnosus 24 д. ст.). Только один штамм лактобацилл (L. rhamnosus 2 ж.), выделенный из желудка, обладал высокой поверхностной гидрофобностью, остальные - средней. Из 6 штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника, четыре обладали высокой поверхностной гидрофобностью (L. plantarum 46 к., L. plantarum 36 ст., L. casei 17 к., L. rhamnosus 32 к.), а два, L. rhamnosus 38 к. и L. plantarum К9 L- средней. Установлено, что лактобациллы, выделенные из полости рта и кишечника, в основном обладали более высокой поверхностной гидрофобностью, чем лактобациллы желудка.
5. Способность лактобацилл к коагрегации
Все лактобациллы, выделенные из полости рта, L. fermentum 291, L. plantarum 106 зв., L. rhamnosus 50 зв. и L. rhamnosus 72 зв., L. fermentum 2пр., L. fermentum 11 д.ст., L. fermentum 11 зв., L. fermentum 39 зв., L. rhamnosus 7 д.ст. и L. rhamnosus 24 д. ст., образовывали коагрегаты с двумя из 8 индикаторных штаммов, B. subtilis 537 и B. subtilis 6633. Только 60% штаммов лактобацилл полости рта образовывали коагрегаты с C. albicans 531 и P. aeruginosa АТСС 9027. Половина исследуемых штаммов коагрегировала с S. aureus 209 и E. coli АТСС 25922 (рис. 3). Оставшиеся 30% штаммов лактобацилл полости рта коагрегировали с S. flexneri 26 и S. typhimurium 11.
Все лактобациллы, выделенные из желудка, L. plantarum 1ж., L. rhamnosus 2 ж., L. rhamnosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж., образовывали коагрегаты с 5 штаммами микроорганизмов, S. aureus 209, E. coli АТСС 25922, C. albicans 531, B. subtilis 537 и B. subtilis 6633. Половина штаммов лактобацилл желудка, L. rhamnosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж., коагрегировали с 3 патогенными микроорганизмами, P. aeruginosa АТСС 9027, S. flexneri 26 и S. typhimurium 11.
Все лактобациллы, выделенные из кишечника, L. plantarum 46 к., L. plantarum 36 ст., L. casei 17 к., L. rhamnosus 32 к., L. rhamnosus 38 к. и L. plantarum К9 L, образовывали коагрегаты с двумя индикаторными штаммами, B. subtilis 537 и B. subtilis 6633. Только 50% штаммов лактобацилл кишечника коагрегировали с 3 микроорганизмами, S. aureus 209, E. coli АТСС 25922, C. albicans 531. Ни один из штаммов, выделенный из кишечника, не коагрегировал с P. aeruginosa АТСС 9027, S. flexneri 26 и S. typhimurium 11.
Рис. 3 Коагрегация между штаммами Lactobacillus and E. coli (увеличение 1х1000)
Выявлено, что в составе агрегатов лактобациллы могут более эффективно проявлять свои антагонистические свойства в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов ЖКТ.
6. Способность лактобацилл к формированию биопленок
При тестировании лактобацилл на способность формировать биопленки обнаружены интенсивно окрашенные спиртовым раствором кристалл виолета биопленки на дне пластиковых чашек Петри и на покровных стеклах (рис. 4).
Рис. 4. Биопленки на пластиковой чашке Петри и стекле in vitro
Подсушенные чашки Петри со стеклами фотографировали цифровой фотокамерой программно-аппаратного комплекса Диаморф Цито. Выявлено, что лактобациллы располагаются скоплениями, тесно прилегающими друг к другу (рис. 5).
Рис. 5. Биопленка из лактобацилл на пластиковой чашке Петри (увеличение 1х1000)
Определение оптической плотности (ОП) суспензии клеток лактобацилл показало, что ОП лактобацилл, выделенных из полости рта, образовавших биопленку на пластиковой чашке Петри, на порядок выше (от 0,037 до 0,225), чем на стекле (от 0 до 0,076). У всех лактобацилл, выделенных из желудка, оптическая плотность клеток на пластиковой чашке колебалась от 0,124 до 0,191 и значительно превышала ОП на стекле (ОП на стекле - от 0,033 до 0,063). У лактобацилл, выделенных из кишечника, сформировавших биопленку на пластиковой чашке Петри оптическая плотность клеток на пластиковой чашке (от 0,144 до 0,449) превышала оптическую плотность на стекле (от 0 до 0,056). Установлено, что оптические плотности лактобацилл, выделенные из различных биотопов, формирующих биопленку на пластиковой чашке Петри, значительно превышают оптические плотности лактобацилл на стекле.
7. Способность лактобацилл к кислотообразованию
Исследована активность кислотообразования у 20 штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта, желудка и кишечника здоровых людей, которая характеризовались разной степенью продукции кислоты в зависимости от присутствия глюкозы в качестве питательного субстрата.
При этом четыре штамма лактобацилл, L. fermentum 11 зв., L. rhamnosus 24 д. ст., L. rhamnosus 7 д.ст. и L. fermentum 11 д.ст., выделенные из полости рта, характеризовались постепенным увеличением продукции кислоты, как в присутствии глюкозы, так и без нее, причем кислотопродуцирующая способность 2-х из них, L. fermentum 11 зв., L. rhamnosus 24 д. ст., имела большую тенденцию к нарастанию под действием глюкозы к концу 3 суток (102° Т и 78° Т соответственно). Другие три штамма, L. rhamnosus 72 зв., L. fermentum 291 и L. fermentum 39 зв., характеризовались постепенным в течение 2-х суток увеличением образования кислоты с последующим ее снижением на 3-и сутки, как в присутствии, так и в отсутствии глюкозы. У 2-х штаммов, L. rhamnosus 50 зв. и L. fermentum 2пр., только присутствие в питательном субстрате глюкозы стимулировало в течение 3-х суток кислотопродукцию. Только один штамм, L. plantarum 106 зв., характеризовался постепенным увеличением продукции кислоты в течение 3-х суток без добавления глюкозы, а присутствие глюкозы привело к снижению кислотопродуцирующей способности к 3-м суткам. Четыре штамма лактобацилл, L. plantarum 1 ж. и L. rhamnosus 2 ж. L. rhamnosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж., выделенные из желудка, характеризовались постепенным увеличением продукции кислоты, как в присутствии глюкозы, так и без нее, причем кислотопродуцирующая способность 2-х из них, L. rhamnosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж., имела большую тенденцию к нарастанию под действием глюкозы к 3 суткам (102° Т и 90° Т соответственно). Два штамма лактобацилл, L. plantarum 36 ст. и L. rhamnosus 38 к., выделенные из кишечника, характеризовались постепенным увеличением продукции кислоты, как в присутствии глюкозы, так и без нее. У 3-х штаммов, L. plantarum 46 к., L. casei 17 к. и L. plantarum К9 L, только присутствие в питательном субстрате глюкозы стимулировало в течение 3-х суток кислотопродукцию. Только один штамм, L. rhamnosus 32 к., характеризовался постепенным увеличением продукции кислоты в течение 2-х и 3-х суток без добавления глюкозы, а присутствие глюкозы привело к продукции кислоты только на 3-и сутки. Наибольшей кислотопродуцирующей способностью обладали 2 оральных штамма лактобацилл (L. fermentum 11 зв., L. rhamnosus 24 д. ст.), 2 желудочных (L. rhamnosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж.) и 1 кишечный штамм (L. casei 17 к.).
Лактобациллы характеризовались разной степенью продукции кислоты в зависимости от присутствия глюкозы в качестве питательного субстрата. В течение трех суток происходило закисление среды культивирования, к первым суткам кислотность колебалась от 2 до 52° Т (в среднем - 24,05° Т), ко 2 суткам: от 14 до 60° Т (в среднем - 37,75° Т) и к 3 суткам: от 26 до 54°Т (в среднем - 43,5°Т). После добавлении в среду глюкозы наблюдалось закисление среды к концу первых суток (кислотность - от 2 до 48° Т, в среднем - 25,6° Т), ко вторым суткам кислотность (кислотность- от 25 до 92° Т, в среднем - 44,95° Т) и к третьим суткам (кислотность - от 12 до 102° Т, в среднем 51,4° Т). Таким образом, присутствие глюкозы незначительно стимулировало продукцию молочной кислоты лактобациллами (p<0,05).
8. Способность лактобацилл к синтезу бактериоцинов
При жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии культуральной среды у двух штаммов лактобацилл Lactobacillus acidophilus (helveticus ТШ) NK1 и Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 выявлены 3 полипептидные фракции с Mr соответственно 228,3 Da, 347,3 Da, 351,6 Da. Определение антагонистической активности полипептидных фракций методом диффузии в агар показало практическое отсутствие антагонистической активности по отношению к грамположительным, грамотрицательным бактериям и грибам рода Candida. По-видимому, это связано с небольшим количеством полипептидов, наносимых на газон исследуемых тестовых культур.
При использовании метода высаливания с последующим диализом полипептидов из супернатанта бульонных культур лактобацилл выявлено, что полипептиды ведут себя неоднозначно в отношении индикаторных культур микроорганизмов Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6633, E. coli ATCC 25922, Shigella sonnei III № 1908, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhimurium 5715, Candida albicans ATCC 885-653.
Полипептиды Lactobacillus acidophilus (helveticus ТШ) NK1 подавляют рост и размножение только B. subtilis, замедляют в 2 раза размножение S. aureus и S. typhimurium, в 1,5 раза E. coli, S. sonnei и C. albicans и практически не оказывали влияния на рост и размножение P. aeruginosa. В то же время сам супернатант суточной бульонной культуры подавлял рост и размножение всех индикаторных микроорганизмов.
Полипептиды L. amylovorus БТ-24/88 замедляют в 2 раза рост и размножение S. aureus, C. albicans, в 1,5 раза B. subtilis и практически не оказывали влияния на рост и размножение E. coli, P. aeruginosa, S. sonnei и S. typhimurium. Супернатант L. amylovorus БТ-24/88 тормозил рост и размножение индикаторных культур E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, S. typhimurium, C. albicans, и в 4 раза задерживал рост и размножение S. sonnei, в 1,5 раза B. subtilis.
Установлено, что полипептидные фракции лактобацилл обладают выраженным избирательным антагонистическим действием по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, по сравнению с супернатантами бульонных культур лактобацилл.
8. Генотипическая способность лактобацилл к синтезу бактериоцинов
Исследованы гены, кодирующие синтез бактериоцинов у лактобацилл, выделенных из полости рта и кишечника и проявляющих выраженную антагонистическую активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ. Использованы специфические праймеры для генов L. plantarum (для генов пребактериоцинов plnEF, plnJ, plNC8, а также для гена plnN, предположительно являющегося пребактериоцином) и L. rhamnosus (генов пребактериоцинов LGG_02380 и LGG_02400). Проверено наличие 6-ти генов (табл. 3), синтезирующих предшественники бактериоцинов, у штаммов L. plantarum, L. rhamnosus, L. fermentum. Показано, что все проверенные 6 генов являются видоспецифичными. По наличию (отсутствию) проверенных генов 6 исследованных штаммов L. rhamnosus идентичны. Проверенные штаммы L. plantarum и L. rhamnosus подразделяются на две группы. Штаммы L. plantarum и L. rhamnosus, проявляющие выраженную и слабую бактериоцинпродуцирующую активность, не различаются по наличию проверенных генов предшественников бактериоцинов. Наличие генов бактериоциногенности не всегда проявляется фенотипически. Скорее всего, существуют определенные факторы, предрасполагающие экспрессию генов бактериоциногенности. Таким образом, наличие выявленных генов не имеет прямую зависимость с синтезом бактериоцинов.
Таблица 3
Наличие генов бактериоцинов в штаммах лактобацилл по данным ПЦР-анализа
Вид и штамм лактобациллБактериоцинпродуцирующая активностьНаличие генов пребактериоциновplNC8plnNplnEFplnJLGG_
02380LGG_
02400L.fermentum 2прт+------L.fermentum 11дст+------L.fermentum 11зв+------L.fermentum 39зв+------L.fermentum 291ч+(-)------L.plantarum 106зв+(-)-+++--L.plantarum 46к+-+++--L.plantarum 36ст+(-)--+---L.rhamnosus 7дст+----++L.rhamnosus 24дст+----++L.rhamnosus 50зв+----++L.rhamnosus 72зв+(-)----++L.rhamnosus 38к+----++L.rhamnosus 32к+----+++ лактобациллы проявляют высокую бактериоцинпродуцирующую активность
+(-) лактобациллы проявляют слабую бактериоцинпродуцирующую активность
10. Антагонистическая активность лактобацилл в эксперименте на животных
Для изучения антагонистической активности лактобацилл in vivo проведено заражение 2-х экспериментальных групп белых крыс штаммом Salmonella typhimurium, с последующим введением второй экспериментальной группе животных суспензии лактобацилл, Lactobacillus plantarum 38к. При гистологическом исследовании у крыс экспериментальной группы № 1 в подвздошной кишке (рис. 7А) определялись отек, выраженное полнокровие, мелкие петехиальные кровоизлияния в слизистой оболочке, уменьшение ширины щёточной каёмки цилиндрических клеток, гипертрофия и гиперплазия слизеобразующих бокаловидных клеток, уменьшение числа межэпителиальных лимфоцитов, выраженная лимфогистиоцитарная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки, с наличием в инфильтрате полинуклеарных лейкоцитов и небольшого количества плазмоцитов. В мышечной оболочке подвздошной кишки выявлялись незначительный отек и умеренное полнокровие. Отмеченные в тонкой кишке изменения характерны для морфологической картины острого инфекционного энтерита, при котором имеет место нарушения процессов гидролизации полисахаридов до моносахаридов, расщепления белков до аминокислот, расщепления жиров с образованием хиломикронов и мицелл и всасывания продуктов расщепления цилиндрическими клетками ворсинок слизистой оболочки подвздошной кишки, на что указывает уменьшение ширины их щёточной каёмки.
В свою очередь сальмонеллы приводят к развитию во внутренних органах вторичных реактивных изменений. В печени отмечались паренхиматозная белковая вакуольная дистрофия гепатоцитов (рис. 6А), отек, выраженное полнокровие центральных вен и кровеносных синусоидов (рис. 6В), увеличение в портальных трактах количества лимфоцитов.
В поджелудочной железе выявлялись отек, умеренное полнокровие, атрофия и склероз одних островков Лангерганса и компенсаторная гипертрофия других рядом расположенных. Железистые клетки ацинусов имели зернистую эозинофильную цитоплазму.
В надпочечниках отмечались отек коркового и мозгового слоев, выраженное полнокровие мозгового слоя. В клетках коркового слоя преимущественно в пучковой зоне имела место их делипидизация т. е. клетки теряли липиды, а цитоплазма их становилась оптически пустой.
У крыс экспериментальной группы № 2 после курса применения лактобацилл в подвздошной кишке отмечалось положительные изменения на течение острого инфекционного энтерита, которое характеризовалось уменьшением выраженности воспалительных изменений в подвздошной кишке (рис. 7Б), в составе воспалительного инфильтрата не определялись полиморфноядерные лейкоциты, количество межэпителиальных лимфоцитов увеличивалось, щёточная каёмка цилиндрических клеток становилась шире, бокаловидные клетки были небольших размеров, а число их уменьшалось и достигало контрольных значений. Во внутренних органах (в печени, поджелудочной железе, надпочечниках) выраженность реактивных изменений уменьшалась (рис. 6 Б и Г), а морфологическое строение внутренних органов восстанавливалось и было почти таким же, как в контрольной группе.
Рис. 6. Печеночные дольки. Окраска гемотоксилином и эозином (увеличение х200) А) у крыс экспериментальной группы № 1 выраженная вакуольная дистрофия гепатоцитов
Б) у крыс экспериментальной группы № 2 слабо выраженная вакуолизация гепатоцитов на периферифии печеночной дольки
В) у крыс экспериментальной группы № 1 отек и выраженное полнокровие центральных вен и синусоидов печеночных долек
Г) у крыс экспериментальной группы № 2 уменьшение отека и полнокровия печеночных долек Рис. 7. Слизистая оболочка подвздошной кишки. Окраска гемотоксилином и эозином (увеличение х200)
А) у крыс экспериментальной группы № 1 в собственной пластинке слизистой оболочки отмечается отек и выраженное полнокровие с единичными петехиальными кровоизлияниями
Б) у крыс экспериментальной группы № 2 в собственной пластинке слизистой оболочки имеет место уменьшение выраженности отека и полнокровия, петехиальные кровоизлияния не выявлены
Таким образом, у крыс экспериментальной группы № 1 в подвздошной кишке развивался острый инфекционный энтерит, а в печени, поджелудочной железе и надпочечниках - вторичные реактивные изменения. Под влиянием лактобацилл, L. plantarum 38к, у крыс экспериментальной группы № 2 наблюдалось выраженное уменьшение воспалительных изменений в подвздошной кишке и восстановление морфологической картины во внутренних органах.
Микробиологическое исследование фекалий белых крыс показало следующие результаты.
Микрофлора фекалий контрольной группы на 2 сутки эксперимента представлена в основном бактериями семейства Enterobacteriaceae в концентрации 6 lg КОЕ/мл и грибами рода Candida в концентрации 5,7 lg КОЕ/мл. На 5 сутки концентрация этих же микроорганизмов возросла: бактерии семейства Enterobacteriaceae в концентрации 6,5 lg КОЕ/мл и грибами рода Candida в концентрации 6 lg КОЕ/мл. На 7 сутки выделялись бактерии рода Lactobacillus (6,8 lg КОЕ/мл), рода Bacillus (6,5 lg КОЕ/мл), а концентрация бактерий семейства Enterobacteriaceae снизилась до 5,9 lg КОЕ/мл. Сальмонеллы в контрольной группе выявлены не были.
Микрофлора фекалий экспериментальной группы № 1 (рис. 8) на 2 сутки после заражения сальмонеллами в основном представлена бактериями рода Lactobacillus (6,5 lg КОЕ/мл), семейства Enterobacteriaceae (6 lg КОЕ/мл), рода Bacillus (5,7 lg КОЕ/мл) и грибами рода Candida в концентрации 5,7 lg КОЕ/мл. Бактерии рода Salmonella выявлены в концентрации 5,5 lg КОЕ/мл.
На 5 сутки после заражения сальмонеллами микрофлора фекалий (рис. 8) в основном представлена бактериями рода Bacillus (концентрация увеличилась с 5,7 до 6,7 lg КОЕ/мл), а также бактериями рода Lactobacillus (концентрация уменьшилась с 6,5 до 5,7 lg КОЕ/мл) и грибами рода Candida в концентрации 5,8 lg КОЕ/мл. Концентрация сальмонелл увеличилась с 5,5 до 5,7 lg КОЕ/мл.
На 7 сутки после заражения сальмонеллами микрофлора фекалий (рис. 8) в основном представлена бактериями рода Bacillus (6 lg КОЕ/мл), грибами рода Candida в концентрации 5,9 lg КОЕ/мл. Концентрация лактобацилл к 10 суткам уменьшилась с 6,5 до 5 lg КОЕ/мл, бактерий семейства Enterobacteriaceae от 6 до 5,5 lg КОЕ/мл. Концентрация сальмонелл увеличилась с 5,5 до 5,9 lg КОЕ/мл.
Рис. 8. Микрофлора фекалий крыс экспериментальной группы № 1
Микрофлора фекалий экспериментальной группы № 2 (рис. 9) на 2 сутки после заражения сальмонеллами в основном представлена бактериями семейства Enterobacteriaceae (6 lg КОЕ/мл), бактериями рода Bacillus (5,7 lg КОЕ/мл) и грибами рода Candida в концентрации 5,7 lg КОЕ/мл. Бактерии рода Salmonella выявлены в концентрации 5,3 lg КОЕ/мл.
На 5 сутки после заражения сальмонеллами и получения подкормки лактобактериями микрофлора фекалий (рис. 9) в основном представлена бактериями рода Lactobacillus (концентрация увеличилась с 0 до 7 lg КОЕ/мл), семейства Enterobacteriaceae (концентрация увеличилась со 6 до 6,7 lg КОЕ/мл), рода Bacillus (концентрация увеличилась с 5.7 до 6,5 lg КОЕ/мл), а также и грибами рода Candida в концентрации 5,7 lg КОЕ/мл. Концентрация сальмонелл уменьшилась с 5,3 до 4,95 lg КОЕ/мл.
Рис. 9. Микрофлора фекалий крыс экспериментальной группы № 2
На 7 сутки после заражения сальмонеллами и получения подкормки лактобактериями микрофлора фекалий (рис. 9) в основном представлена бактериями рода Bacillus (6,3 lg КОЕ/мл). Наблюдается уменьшение концентрации лактобацилл с 7 до 5,7 lg КОЕ/мл., бактерий семейства Enterobacteriaceae с 6,7 до 5,5 lg КОЕ/мл, грибов рода Candida с 5,7 до 5 lg КОЕ/мл. Сальмонеллы к 7 дню эксперимента не выявлены.
Пероральное введение лактобацилл крысам, контаминированным сальмонеллами, позволяет достоверно (p<0.05) сократить сроки элиминации возбудителя и уменьшить морфологическую картину воспаления во внутренних органах в среднем на 2 суток.
II. СИМБИОЗ ЛАКТОБАЦИЛЛ С МИКРОБИОТОЙ ЧЕЛОВЕКА
1. Симбиоз лактобацилл с представителями нормофлоры человека
Симбиоз выделенных лактобацилл с представителями нормофлоры пищеварительного тракта изучался методом отсроченного антагонизма. Из полости рта, желудка и кишечника выделено и идентифицировано до вида 357 штаммов нормальной микрофлоры (75% выделено от здоровых людей, 15% - от больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ).
Выявлено, что 4 из 10 штаммов лактобацилл, выделенные из полости рта здоровых людей, проявили преимущественно низкую и среднюю антагонистическую активность по отношению к нормофлоре ЖКТ, в основном ингибируя Staphylococcus spp. и Streptococcus agalactiae. Штамм L. fermentum 11 зв. незначительно подавляет следующих представителей грамположительной нормофлоры: Staphylococcus spp., Micrococcus spp., Streptococcus agalactiae, Corynebacterium xerosis и Sarcina spp.; штамм L. fermentum 11 д.ст. - Streptococcus agalactiae и Staphylococcus spp.; L. rhamnosus 24 д. ст. (рис. 10) - Actinomyces spp., Lactococcus lactis, Corynebacterium xerosis, и Propionibacterium propionicus; L. rhamnosus 7 д.ст. - Clostridium spp., Peptostreptococcus asaccharolyticus, Streptococcus agalactiae и Eubacterium spp.
Рис. 10. Зоны подавления роста грамположительной нормофлоры ЖКТ под действием L. rhamnosus 24 д.ст.
Выделенный штамм L. fermentum 11 зв. слабо подавляет рост следующих представителей грамотрицательной нормофлоры: Escherichia coli и Leptotrichia buccalis; штамм L. fermentum 11 д.ст. - Neisseria mucosa; L. rhamnosus 24 д. ст. (рис. 11) - Leptotrichia buccalis; L. rhamnosus 7 д.ст. - Veillonella parvula и Neisseria mucosa.
Рис. 11. Зоны подавления роста грамотрицательной нормофлоры ЖКТ под действием L. rhamnosus 24 д.ст.
При определении влияния штамма L. rhamnosus 24 д. ст. (табл. 4), выделенного из полости рта здоровых людей, на представителей грамположительной и грамотрицательной нормофлоры ЖКТ, использованы непараметрические элементы статистики, т. к. результаты не соответствовали "нормальности" по критерию Шапиро-Уилка. Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса выявил значимое отличие средних рангов 5 родов представителей грамположительной и 2-х родов грамотрицательной нормофлоры по их диаметру задержки роста под влиянием L. rhamnosus 24 д. ст.
Таблица 4
Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса
L. rhamnosus 24 д. ст.Род; ранг (R)Род; ранг (R)Уровень значимостиActinomyces spp. R: 75,25Eubacterium spp. R: 20,50,000003Actinomyces spp. R: 75,25Peptostreptococcus asaccharolyticus R: 20,50,005640Actinomyces spp. R: 75,25Clostridium spp. R: 20,50,005640Actinomyces spp. R: 75,25Enterococcus spp. R: 20,50,001664Neisseria mucosa R: 29Bacteroides spp. R: 120,025777 Для 5 родов представителей грамположительной и 2-х родов грамотрицательной нормофлоры рассчитаны параметры описательной статистики (табл. 5).
Таблица 5 Описательная статистика L. rhamnosus 24 д. ст.
ПараметрыActinomyces spp.Eubacterium spp.Peptostreptococcus asaccharolyticusClostridium spp.Enterococcus spp.Neisseria mucosaBacteroides spp.N набл.1813556614Среднее1200009,166670Доверительный интервал среднего -95,000%10,324,13740Доверительный интервал среднего +95,000%13,6814,19593Медиана12,5000010,50Минимум0000000Максимум160000130Нижняя квартиль11000090Верхняя квартиль130000120Стандартное отклонение3,37800004,7923550Стандартная ошибка0,79600001,9564710Асимметрия-2,76-1,82196Стандартная ошибка асимметрии0,5360,845154Эксцесс10,0293,57779Стандартная ошибка эксцесса1,0381,740777 Статистический анализ выявил достоверное антагонистическое воздействие штамма L. rhamnosus 24 д. ст. на представителей 5 родов грамположительной и 2 родов грамотрицательной нормофлоры.
Прочие штаммы лактобацилл, L. fermentum 2пр., L. fermentum 39 зв., L. fermentum 291, L. plantarum 106 зв., L. rhamnosus 50 зв., L. rhamnosus 72 зв., не оказывали подавляющего воздействия на нормофлору человека.
Отмечено, что низкой степенью антагонизма по отношению к нормофлоре ЖКТ обладали два штамма, L. rhamnosus 2 ж. и L. rhamnosus 3 ж. выделенные из желудка здоровых людей. Штамм L. rhamnosus 2 ж. незначительно подавляет следующих представителей грамположительной нормофлоры: Streptococcus agalactiae, Lactococcus lactis и Staphylococcus spp.; штамм L. rhamnosus 3 ж. - Streptococcus agalactiae, Micrococcus spp. и Sarcina spp. Штаммы L. rhamnosus 2 ж. и L. rhamnosus 3 ж. не подавляют рост ни одного представителя грамотрицательной нормофлоры ЖКТ.
Показано, что все 10 штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника здоровых людей, проявили в основном среднюю антагонистическую активность по отношению к нормофлоре ЖКТ. Штамм L. casei 17 к. подавляет рост следующих представителей грамположительной нормофлоры: Staphylococcus spp., Clostridium spp. и Peptostreptococcus asaccharolyticus; штамм L. plantarum 46 к. - Clostridium spp., Peptostreptococcus asaccharolyticus, Actinomyces spp. и Staphylococcus spp.; штамм L. rhamnosus 32 к. - Eubacterium spp., Clostridium spp. и Actinomyces spp.; штамм L. rhamnosus 38 к. - Clostridium spp. и Peptostreptococcus asaccharolyticus; штамм L. plantarum 36 ст. - Clostridium spp., Peptostreptococcus asaccharolyticus и Actinomyces spp.; штамм L. plantarum К9 L - Clostridium spp. и Peptostreptococcus asaccharolyticus. Штамм L. casei 17 к. подавляет рост следующих представителей грамотрицательной нормофлоры: Leptotrichia buccalis и Veillonella parvula; штамм L. plantarum 46 к. - Veillonella parvula и Escherichia coli; штамм L. rhamnosus 32 к. - Veillonella parvula.
Установлено, что выделенные штаммы лактобацилл различных биотопов в основном не оказывали антагонистического влияния на нормофлору ЖКТ. Лактобациллы, выделенные из полости рта не подавляли роста 78% представителей нормофлоры; лактобациллы, выделенные из желудка - 92% нормофлоры; лактобациллы, выделенные из кишечника - 43% нормофлоры.
Непараметрические элементы статистики выявили достоверное антагонистическое воздействие различных штаммов лактобацилл.
Симбиоз исследуемых лактобацилл между собой и бифидобактериями определялся методом совместного культивирования на плотной питательной среде.
Рис. 12. Биосовместимость лактобацилл между собой и бифидобактериями
Установлено, что выделенные лактобациллы не оказывают антагонистического действия как на лактобациллы, так и бифидобактерии (рис. 12), о чём свидетельствует отсутствие зоны задержки роста культур при их совместном культивировании на плотной питательной среде.
2. Симбиоз лактобацилл с представителями условно-патогенной и патогенной микрофлоры пищеварительного тракта человека
Из полости рта, желудка и кишечника выделено и идентифицировано 197 штаммов условно-патогенной и патогенной микрофлоры (9% - от здоровых людей, 91% - от больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ).
Симбиоз выделенных лактобацилл с представителями условно-патогенной и патогенной микрофлоры пищеварительного тракта изучался методом отсроченного антагонизма.
Выявлено, что все 10 штаммов лактобацилл, выделенные из полости рта здоровых людей, проявили в основном высокую и реже низкую и среднюю антагонистическую активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ. Штамм L. fermentum 11 зв. (рис. 13) проявляет высокую антагонистическую активность по отношению к следующим представителям условно-патогенной и патогенной грамположительной микрофлоры: Staphylococcus spp. и Peptococcus niger; штамм L. rhamnosus 24 д.ст. - Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и Bacillus spp.; штамм L. rhamnosus 7 д.ст. - Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.; штамм L. rhamnosus 50 зв. - Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.; штамм L. fermentum 11 д.ст. - Staphylococcus spp. и Streptococcus spp., Peptococcus niger., Bacillus spp. и Actinomyces israelii; штамм L. fermentum 39 зв. - Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.; штамм L. fermentum 2пр. - Staphylococcus spp.; штамм L. fermentum 291 - Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.; штамм L. plantarum 106 зв. - Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.; штамм L. rhamnosus 72 зв. - Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.
Рис. 13. Зоны задержки роста грамположительной условно-патогенной и патогенной микрофлоры ЖКТ под действием L. fermentum 11зв.
Выделенный штамм L. fermentum 11 зв. (рис. 14) проявляет высокую антагонистическую активность по отношению к следующим представителям условно-патогенной и патогенной грамотрицательной микрофлоры: Proteus spp., Pseudomonas spp. и Shigella sonnei; штамм L. rhamnosus 24 д.ст. - Pseudomonas spp., Shigella sonnei, Enterobacter cloacae, Klebsiella spp. и Salmonella typhimurium; штамм L. rhamnosus 7 д.ст. - Citrobacter fruendii, Shigella sonnei, Serratia spp., Enterobacter cloacae, Klebsiella spp., Salmonella typhimurium и Pseudomonas spp.; штамм L. rhamnosus 50 зв. - Salmonella typhimurium, Pseudomonas spp., Shigella sonnei, Klebsiella spp., Fusobacterium nucleatum spp. и Prevotella spp.; штамм L. fermentum 11 д.ст. - Pseudomonas spp., Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Klebsiella spp., Proteus spp.и Enterobacter cloacae; штамм L. fermentum 39 зв. - Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Proteus spp., Klebsiella spp., Citrobacter fruendii, Pseudomonas spp., Fusobacterium nucleatum spp. и Enterobacter cloacae; штамм L. fermentum 2пр. - Pseudomonas spp., Shigella sonnei, Klebsiella spp. и Salmonella typhimurium; штамм L. fermentum 291 - Shigella sonnei, Klebsiella spp., Salmonella typhimurium и Pseudomonas spp.; штамм L. plantarum 106 зв. - Shigella sonnei, Klebsiella spp., Pseudomonas spp. и Salmonella typhimurium; штамм L. rhamnosus 72 зв. - Salmonella typhimurium, Klebsiella spp., Shigella sonnei и Pseudomonas spp.
Рис. 14. Зоны подавления роста грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры ЖКТ под действием L. fermentum 11зв.
В результате изучения влияния штамма L. fermentum 11 зв. (табл. 6), выделенного из полости рта здорового человека, на представителей грамположительной условно-патогенной и патогенной микрофлоры ЖКТ, использованы непараметрические элементы статистики, т. к. результаты не соответствовали "нормальности" по критерию Шапиро-Уилка. Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса выявил значимые отличия средних рангов исследуемых 2-х родов представителей грамположительной микрофлоры по их диаметру задержки роста под влиянием L. fermentum 11 зв.
Таблица 6 Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса
L. fermentum 11 зв.Род; ранг (R)Род; ранг (R)Уровень значимостиStaphylococcus spp. R: 46,575Actinomyces israelii R: 26,4690,028086 Для этих 2-х родов представителей грамположительной условно-патогенной и патогенной микрофлоры рассчитаны параметры описательной статистики (табл. 7).
Таблица 7
Описательная статистика L. fermentum 11 зв.
ПараметрыStaphylococcus spp.Actinomyces israeliiN набл.2016Среднее2421,06250Доверительный интервал среднего -95,000%22,9156219,62649Доверительный интервал среднего +95,000%25,0843822,49851Медиана2421Минимум2014Максимум2825Нижняя квартиль2220Верхняя квартиль2623Стандартное отклонение2,3169852,694903Стандартная ошибка0,5180940,673726Асимметрия0-1,03329Стандартная ошибка асимметрии0,5121030,564308Эксцесс-0,636601,98998Стандартная ошибка эксцесса0,9923841,090774 При определении влияния штамма L. fermentum 11 зв. (табл. 8), выделенного из полости рта здорового человека, на представителей грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры ЖКТ, использованы непараметрические элементы статистики, т. к. результаты не соответствовали "нормальности" по критерию Шапиро-Уилка. Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса выявил значимые отличия средних рангов 7 исследуемых родов представителей грамотрицательной микрофлоры по их диаметру задержки роста под влиянием L. fermentum 11 зв.
Таблица 8
Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса
L. fermentum 11 зв.Род; ранг (R)Род; ранг (R)Уровень значимостиPseudomonas spp. R: 68,611Proteus spp. R: 25,6670,000003Pseudomonas spp. R: 68,611Acinetobacter lwoffii R: 10,50,005524Pseudomonas spp. R: 68,611Helicobacter pylori R: 10,50,00001Pseudomonas spp. R: 68,611Campylobacter upsaliensis R: 10,50,000552Pseudomonas spp. R: 68,611Enterobacter cloacae R: 26,30,028762Salmonella typhimurium R: 60,9Helicobacter pylori R: 10,50,031056 Для этих 7-и родов представителей грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры рассчитаны параметры описательной статистики (табл. 9).
Таблица 9 Описательная статистика L. fermentum 11 зв.
ПараметрыPseudomonas spp.Proteus spp.Acinetobacter lwoffiiHelicobacter pyloriCampylobacter upsaliensisEnterobacter cloacaeSalmonella typhimuriumN набл.181836455Среднее28,56,833337,426,4Доверительный интервал среднего -95,000%27,327544,601232,0883524,14441Доверительный интервал среднего +95,000%29,672469,0654412,7116528,65559Медиана289927Минимум2424Максимум32121128Нижняя квартиль27825Верхняя квартиль3010928Стандартное отклонение2,3577164,4885484,2778501,816590Стандартная ошибка0,5557191,0579611,9131130,812404Асимметрия-0,28781-0,87351-1,86371-0,56716Стандартная ошибка асимметрии0,5362780,5362780,9128710,912871Эксцесс-0,59022-1,024073,86903-2,23140Стандартная ошибка эксцесса1,0377951,03779522 Статистический анализ выявил достоверное антагонистическое воздействие штамма L. fermentum 11 зв. на представителей 2-х родов только грамположительной и 7-и грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры.
Выявлено, что штаммы L. plantarum 1 ж., L. rhamnosus 2 ж., L. rhamnosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж., проявляют среднюю степень антагонистической активности в отношении следующих представителей грамположительной условно-патогенной и патогенной микрофлоры: Streptococcus spp., Bacillus spp. и Staphylococcus spp. Все штаммы, выделенные из желудка, показали низкую и среднюю степень активности по отношению к грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ. Штаммы L. plantarum 1 ж. и L. rhamnosus 4 ж., в большей степени подавляют рост следующих представителей грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры: Shigella sonnei и Salmonella typhimurium; L. rhamnosus 2 ж. и L. rhamnosus 3 ж., - Shigella sonnei, Salmonella typhimurium и Pseudomonas spp.
Установлено, что все 6 штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника здоровых людей, проявили высокую антагонистическую активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ. Штаммы L. casei 17 к., L. plantarum 46 к., L. plantarum 36 ст., L. rhamnosus 38 к., L. rhamnosus 32 к., L. plantarum К9 L оказывают высокую степень антагонизма в отношении грамположительных условно-патогенных и патогенных Staphylococcus spp. и Streptococcus spp. Штамм L. casei 17 к. подавляет рост следующих представителей грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры (рис. 15) - Pseudomonas spp., Prevotella spp., Klebsiella spp., Enterobacter cloacae, Citrobacter fruendii, Fusobacterium nucleatum spp., Shigella sonnei и Proteus spp.; штамм L. plantarum 46 к. - Pseudomonas spp., Prevotella spp., Klebsiella spp., Enterobacter cloacae, Citrobacter fruendii, Fusobacterium nucleatum spp., Shigella sonnei и Salmonella typhimurium; штаммы L. plantarum 36 ст., L. rhamnosus 38 к., L. rhamnosus 32 к. и L. plantarum К9 L ингибируют рост Pseudomonas spp., Shigella sonnei, Salmonella typhimurium и Klebsiella spp.
Рис. 15. Антагонистическая активность лактобацилл, выделенных из полости рта и кишечника по отношению к Pseudomonas aeruginosa
Непараметрические элементы статистики выявили достоверное антагонистическое воздействие различных штаммов лактобацилл.
В исследованиях A. Mansour, 2011, отмечено фунгистатическое действие лактобацилл. Показано, что L. acidophilus и L. plantarum проявили антимикробную активность по отношению к C. аlbicans. Наши данные свидетельствуют (рис. 16), что средней антагонистическою активностью по отношению к грибам рода Candida обладают штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта: L. fermentum 11 зв., L. rhamnosus 7 д.ст., L. fermentum 2пр., L. fermentum 11 д.ст. и L. rhamnosus 50 зв., штаммы, выделенные из кишечника: L. rhamnosus 32 к., L. casei 17 к. и L. plantarum 46 к.
Рис. 16. Антагонистическая активность лактобацилл, выделенных из полости рта и кишечника, по отношению к грибам рода Candida и Criptococcus
Прочие штаммы обладали низкой степенью антагонистической активности по отношению к дрожжевым грибам рода Candida. Средней антагонистической активностью по отношению к грибам рода Cryptococcus обладают штаммы лактобацилл: L. fermentum 11 д.ст., выделенный из полости рта, L. plantarum 46 к и L. casei 17 к., выделенные из кишечника. Остальные штаммы не обладали антагонистической активности по отношению к грибам рода Cryptococcus.
Для определения антагонистической активности штаммов лактобацлл, выделенных из полости рта, желудка и кишечника, в отношении вирусов проведена реакция нейтрализации в перевиваемой культуре клеток Hep-2 (Cincinnati), эпидермальной карциномы человека, с использованием полиовирусных штаммов Сэбина 1, 2 и 3 типов.
Установлено влияние суспензии и супернатантов бульонных культур лактобацилл на вирус полиомиелита. Выделенные из полости рта семь (70%) суспензий бульонных культур штаммов лактобацилл, L. fermentum 11 зв., L. fermentum 39 зв., L. fermentum 11 д.ст., L. fermentum 2 п.р., L. rhamnosus 50 зв., L.rhamnosus 72 зв. и L.plantarum 106 зв., полностью нейтрализовали все 3 типа полиовирусных штаммов Сэбина. L. rhamnosus 7 д.с. и L. fermentum 291 (20%) нейтрализовали два типа полиовируса и L. rhamnosus 24 д.с. (10%) - один тип вируса (рис. 17). Супернатанты бульонных культур L. fermentum 2 пр., L. rhamnosus 50 зв., L. rhamnosus 7 д.с., L. rhamnosus 72 зв., L. plantarum 106 зв., и L. fermentum 29, выделенных из полости рта, показали отсутствие нейтрализации всех 3-х типов вируса; супернатанты трех штаммов, L. fermentum 11 зв., L. rhamnosus 24 д.с. и L. fermentum 39 зв., нейтрализовали два типа полиовируса и L. fermentum 11 д.с. - один тип полиовируса.
Рис. 17. Нейтрализация полиовируса Сэбина I типа штаммом L. rhamnosus 24 д.ст. (ЦПД отсутствует).
Выявлено, что как суспензии, так и супернатанты бульонных культур лактобацилл, выделенных из желудка, не оказывали подавляющего воздействия на все типы полиовируса Сэбина.
После инкубирования суспензии бульонной культуры лактобацилл кишечника с полиовирусами обнаружено, что один из шести штаммов лактобацилл, L. plantarum 46к (16,7%), полностью нейтрализовал все 3 вакцинных типа полиовируса Сэбина. Три штамма, L. rhamnosus 32к, L. rhamnosus 38к и L. rhamnosus K9L (50%), нейтрализовали два типа полиовируса, и два штамма, L. casei 17к и L. plantarum 36к (33,3%) нейтрализовали один тип полиовируса.
При использовании супернатанта бульонных культур лактобацилл наблюдали полную нейтрализацию одного типа полиовируса двумя штаммами, выделенными из кишечника, L. casei 17к и L. plantarum 36к (33,3%); четыре штамма, L. rhamnosus 32к (рис.18), L. plantarum 46к, L. rhamnosus 38к и L. rhamnosus K9L, нейтрализовали два типа вируса (66,7%).
Рис. 18. Отсутствие нейтрализации полиовируса Сэбина III типа штаммом L. rhamnosus 32к (ЦПД)
Таким образом, показано, что суспезии бульонных культур лактобацилл, выделенных из полости рта, оказывают высокую противовирусную активность по сравнению с супернатантом данных штаммов. Как суспензии, так супернатанты бульонных культур лактобацилл желудка не проявили активность по отношению к полиовирусу. Выявлена средняя и низкая противовирусная активность суспензий и супернатантов культур лактобацилл, выделенных из кишечника. Выводы
1. Из полости рта, желудка и кишечника выделено и идентифицировано до вида 357 штаммов нормальной микрофлоры (75% выделено от здоровых людей, 15% - от больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ) и 197 штаммов условно-патогенной и патогенной микрофлоры (9% - от здоровых людей, 91% - от больных).
2. Оральные, желудочные и кишечные штаммы лактобацилл, выделенные от здоровых людей разных возрастных групп не имеют факторов патогенности и чувствительны в 100% к тетрациклину, 93,4% - к гентамицину, эритромицину, рифампицину и меропенему, 86,2% - к линезолиду, стрептомицину и ампициллину, 75,4% - к фурадонину, левомицетину и доксициклину, 66,9% - к бензилпенициллину, 33,9% - к ципрофлоксацину, 14,3% - к ванкомицину, 6,4% - к левофлоксацину.
3. Из 203 штаммов лактобацилл, выделенных от здоровых людей, высокой антагонистической активностью обладают только 10%. Высокоантагонистические 20 штаммов лактобацилл различных биотопов в основном не оказывают антагонистического влияния на нормофлору ЖКТ. 40% оральных штаммов лактобацилл проявляют низкую и среднюю антагонистическую активность по отношению к 22% нормофлоры ЖКТ, 50% желудочных штаммов лактобацилл обладают низкой активностью по отношению к 8% нормофлоры, все кишечные штаммы лактобацилл проявляют среднюю антагонистическую активность по отношению к 57% нормофлоры ЖКТ.
4. Высокой и средней антагонистической активностью отличаются все штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта и кишечника здоровых людей, по отношению к 92% и 86% соответственно условно-патогенной и патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, по сравнению со штаммами, выделенными из желудка, проявляющими низкую активность по отношению к 64% микрофлоры. 50% оральных и кишечных штаммов лактобацилл обладают средней антагонистическою активностью по отношению к грибам рода Candida. Лактобациллы, выделенные из желудка, не проявляют антимикотическую активность.
5. Оральные штаммы лактобацилл обладают высоким и средним подавляющим действием на штаммы полиовирусов Сэбина, по сравнению со средней и низкой активностью кишечных штаммов. Лактобациллы, выделенные из желудка, не проявили противовирусную активность.
6. Высокоантагонистические штаммы лактобацилл не оказывают взаимного антагонистического воздействия на L. fermentum, L. plantarum, L. rhamnosus и L. casei, не подавляют метаболизма и размножения бифидобактерий (B. catenulatum, B. pseudocatenulatum, B. breve, B. bifidum, B. longum).
7. Высокоантагонистические штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта, желудка и кишечника, имеют среднее значение адгезивности и характеризуются постепенным нарастанием продукции кислоты, причем добавление глюкозы в питательную среду способствует увеличению их кислотообразующей способности в несколько раз.
8. Оральные штаммы лактобацилл отличаются более высокими показателями аутоагрегации, чем лактобациллы желудка и кишечника. Оральные и кишечные штаммы лактобацилл обладают более высокой поверхностной гидрофобностью, чем лактобациллы желудка. В составе коагрегатов оральные, желудочные, кишечные штаммы лактобацилл более эффективно проявляют свои антагонистические свойства в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Лактобациллы трех биотопов образуют биопленку in vitro, причем оптические плотности лактобацилл, формирующих биопленку на пластиковой чашке, значительно превышают оптические плотности лактобацилл на стекле.
9. Полипептидные фракции Lactobacillus acidophilus (helveticus ТШ) NK1 с молекулярной массой 228,3 Da, 347,3 Da, 351,6 Da обладают более выраженным избирательным антагонистическим действием по отношению к индикаторным штаммам условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, чем супернатант бульонной культуры Lactobacillus acidophilus (helveticus ТШ) NK1.
10. Штаммы L. plantarum и L. rhamnosus несут шесть генов (plnEF, plnJ, plNC8, plnN, LGG_02380 и LGG_02400), детерминирующих синтез предшественников бактериоцинов, но их наличие не имеет прямой зависимости с синтезом бактериоцинов.
11. Пероральное введение лактобацилл крысам, контаминированным сальмонеллами, позволяет достоверно (p<0.05) сократить сроки элиминации возбудителя и уменьшить выраженность морфологической картины воспаления во внутренних органах в среднем на 2 суток.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Выделенные из полости рта, желудка и кишечника здоровых людей антагонистически активные штаммы лактобацилл, обладающие разным набором свойств, характеризующих адаптационный и пробиотический потенциал, могут быть использованы в качестве препаратов пробиотиков.
2. Выделенные лактобациллы из определенного биотопа должны быть использованы для восстановления нормальной микрофлоры того же отдела пищеварительного тракта.
3. Антагонистическая активность лактобацилл проявляется за счет комплексного воздействия адаптационного и пробиотического потенциала не только в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, но и кишечных вирусов.
4. Депонированные в государственную коллекцию микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора 19 штаммов лактобацилл и 2 штамма лактобацилл во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) могут быть использованы при конструировании новых отечественных препаратов-пробиотиков.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Гаврилова О.А. Микроэкология слизистой оболочки полости рта у школьников / В.М. Червинец, Д.В. Лебедев, Ю.В. Червинец// Мат. Всероссийской научной конференции с международным участием "Социально-медицинские аспекты экологического состояния Центрального экономического района России". Тверь.- 2007.-С.289-291.
2. Пиекалнитс И.Я. Особенности микрофлоры полости рта у больных с генерализованным периодонтитом средней тяжести /О.А. Гаврилова, В.М. Червинец, Д.В. Лебедев, Ю.В. Червинец// Мат. Всероссийской научной конференции с международным участием "Социально-медицинские аспекты экологического состояния Центрального экономического района России". Тверь.-2007.-С.499-500.
3. Червинец В.М. Бактериоцинпродуцирующие штаммы лактобацилл, перспективные для разработки новых пробиотических препаратов / Ю.В. Червинец, Н.А. Шабанова, В.М. Бондаренко // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва.-2007.-Т.2.-С.314-315.
4. Червинец В.М. Патогенетические основы использования пробиотиков в лечении дисбактериоза желудочно-кишечного тракта / С.Н. Базлов, В.В. Чернин, Ю.В. Червинец // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Научно-практический журнал.-2007.-№1-2.-С.М118, 414.
5. Червинец В.М. Скрининг непатогенных антагонистически активных штаммов Enterococcus faecium /В.М. Бондаренко, А.М. Самоукина, Ю.В. Червинец // ЖМЭИ.-2007.- №1.-C.57-61.
6. Червинец Ю.В. Бактериоцин-секретирующие штаммы лактобацилл: кандидаты для новых пробиотических препаратов / В.М. Червинец, Н.А. Шабанова, В.М. Бондаренко / Клиническое питание. Научно-практический журнал.-2007.- №1-2.-С. А72-А73.
7. Гаврилова О.А. Микробный пейзаж полости рта у здоровых подростков и больных хроническим гастродуоденитом / Ю.В. Червинец, В.М. Бондаренко В.М. Червинец, А.М. Самоукина, Д.В. Лебедев// ЖМЭИ.- 2008.- №6.- С.59-63. 8. Давыдов Б.Н. Колонизация микроорганизмами съемных пластинчатых протезов из различных материалов у детей /Т.М.Бакерникова, В.М.Червинец, Ю.В.Червинец// Стоматология детского возраста и профилактика.-2008.-№4.- том.7,4(27).-С.57-60 9. Михайлова Е.С. Микрофлора желудочно-кишечного тракта у больных хроническим холециститом /В.М. Червинец, Ю.В. Червинец, А.П. Барашков, Е.В. Секарева// ЖМЭИ.- 2008.- №4.- С.103-105.
10. Самоукина А.М. Микрофлора полости рта детей 7-11 лет / Ю.В. Червинец, Д.В. Лебедев, О.А. Гаврилова // Вестник Российской Академии медицинских наук № 6, 2008, приложение, Тез. докладов V Конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины".-2008-С.385-386.
11. Червинец В.М. Дисбиозы желудочно- кишечного тракта у больных пожилого возраста с хроническим бескаменным холециститом и желчно-каменной болезнью / Ю.В. Червинец, Е.С. Михайлова, В.Ф. Виноградов, Л.Е. Смирнова, А.И. Сидоров// Вестник Санкт-Петербургской Государственной Медицинской Академии им. И.И Мечникова. "Терапевтические проблемы пожилого человека" Материалы российской научно-практической конференции. Санкт-Петербург.-2008.-№3/1(28).-С.158-163.
12. Червинец В.М. Применение хитозана для коррекции микробиоценоза влагалища при бактериальном вагинозе и вагинальном канидозе. /И.И. Стольникова, Ю.В. Червинец// Международная конференция "Физиология и патология иммунной системы" и IV Международная конференция по иммунотерапии, посвященные 100-летию присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии и 25-летию Всесоюзного научного общества иммунологов. Аллергология и иммунология.-2008.-Том 9.-№3.-С.309.
13. Червинец Ю.В. Антагонистическая активность пробиотических штаммов для заквасок прямого внесения. Тезисы V съезда Общества биотехнологов России и Всероссийского совещания работников биотехнологической отрасли промышленности. Москва.- 2008.-С.353-357.
14. Червинец Ю.В. Особенности микробного пейзажа полости рта у школьников с гастродуоденитами /А.М. Самоукина, О.А. Гаврилова// Вестник Российской Академии медицинских наук № 6, 2008, приложение, Тез. докладов V Конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины".- 2008.-С.466.
15. Гаврилова О.А. Возрастные изменения микробиоценоза смешанной слюны и налета с поверхности зубов при декомпенсированном течении кариозного процесса /Ю.В.Червинец// Институт стоматологии-2009.-№1(42).-С.80-81.
16. Гаврилова О.А. Мониторинг чувствительности к антибиотикам микрофлоры полости рта у практически здоровых детей и больных хроническим гастродуоденитом /Б.Н. Давыдов, Ю.В.Червинец, В.М.Червинец //Стоматология.- 2009.-№,6.-том 88.-С.62-65.
17. Гаврилова О.А. Содержимое зубодесневого желобка у дошкольников: физические и микробиологические характеристики / Ю.В.Червинец // Стоматология детского возраста и профилактика.-2009.-№2.- С.66-68.
18. Михайлова Е.С. Способность к формированию биопленок у микроорганизмов, выделенных из верхних отделов ЖКТ больных хроническим холециститом и ЖКБ / Ю.В. Червинец, В.М. Червинец, О.А. Гаврилова, А.М. Самоукина // Тезисы конференции: Актуальные вопросы науки и образования V общероссийской научной конференции. Журнал "Успехи современного естествознания".- Москва.- 2009.-№ 7.-С.76.
19. Михайлова Е.С. Чувствительность условно-патогенной микрофлоры, выделенной из верхних отделов ЖКТ у больных хроническим холециститом и ЖКБ к пробиотическим штаммам лактобактерий / Ю.В. Червинец, В.М. Червинец, О.А. Гаврилова, А.М. Самоукина// Тезисы конференции: Актуальные вопросы науки и образования V общероссийской научной конференции. Журнал "Успехи современного естествознания".- Москва.- 2009.-№ 7.-С.77.
20. Червинец В.М. Антимикробная активность Lactobacillus helveticus / Ю.В. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 6-й объединенной научной сессии и 2-го Международного конгресса по пробиотикам "Санкт-Петербург - Пробиотики-2009".- 2009.-№ 4.-С.44-45.
21. Червинец В.М. Влияние низкомолекулярных углеводов Valeriana officinalis на микрофлору кишечника при эрозивно-язвенных поражениях гастродуоденальной зоны / Е.В. Ожимкова, Ю.В. Червинец, Л.Е. Смирнова, В.Ф. Виноградов, А.И. Сидоров, Е.М. Короткова, В.П. Молчанов // Вестник Санкт-Петербургской Государственной Медицинской Академии им. И.И Мечникова. -2009.- №2/1 (31).-С.100-104.
22. Червинец В.М. Микробиоценозы эзофагогастродуоденальной зоны и дуоденальный рефлюкс у больных желчнокаменной болезнью /Е.С. Михайлова, Г.С. Джулай, М.А. Львова, Ю.В. Червинец// Материалы IX съезда Научного общества гастроэнтерологов России, II совместной школы последипломного образования AGA и НОГР, XXXV сессии ЦНИИГ. Приложение № 1 к журналу. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- Москва.- 2009.-№ 2, 2009.-С.165-166.
23. Червинец В.М. Микрофлора полости рта детей 7-11 лет / О.А. Гаврилова, Ю.В. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, Д.В. Лебедев// Тезисы конференции: Современные проблемы науки и образования IV общероссийской научной конференции. Журнал "Успехи современного естествознания".- Москва.-2009.- № 2.-С.73-74.
24. Червинец В.М. Особенности микробиоценозов эзофагогастродуоденальной зоны у больных хроническим бескаменным холециститом и желчнокаменной болезнью /Е.С. Михайлова, Г.С. Джулай, Ю.В. Червинец, А.М. Самоукина // Материалы IX съезда Научного общества гастроэнтерологов России, II совместной школы последипломного образования AGA и НОГР, XXXV сессии ЦНИИГ. Приложение № 1 к журналу. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- Москва.- 2009.-№ 2, 2009.-С.164-165.
25. Червинец Ю.В. Антагонистическая активность пробиотических штаммов / В.М. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова// Тезисы конференции: Современные проблемы науки и образования IV общероссийской научной конференции, г.Москва, Журнал "Успехи современного естествознания" .- Москва.-2009.-№ 2.-С.73.
26. Червинец Ю.В. Колонизационная и патогенетическая способность микрофлоры пародонтального кармана больных с воспалением пародонта /Д.В. Лебедев, В.М. Червинец, О.А. Гаврилова, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова// Тезисы конференции: Актуальные вопросы науки и образования V общероссийской научной конференции. Журнал "Успехи современного естествознания".- Москва.- 2009.-№ 7.-С.111.
27. Червинец Ю.В. Способность лактобацилл, выделенных из полости рта здоровых людей, к формированию биопленок / В.М. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, В.М. Бондаренко // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 6-й объединенной научной сессии и 2-го Международного конгресса по пробиотикам "Санкт-Петербург - Пробиотики-2009".-2009.-№ 4.-С.45.
28. Ботина С.Г. Генетическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта здоровых людей / Ю.В. Червинец, К.М. Климина, Н.В. Коробан, В.М. Червинец, О.А. Гаврилова, Д.В. Лебедев, А.Ю. Миронов// Клиническая лабораторная диагностика.- 2010.-№11.- С.43-46.
29. Пиекалнитс И.Я. Пути совершенствования консервативного лечения генерализованного пародонтита /Г.Л. Саввиди, О.А. Гаврилова, В.М. Червинец, Ю.В. Червинец// XV Международная конференция челюстно-лицевых хирургов и стоматологов "Новые технологии в стоматологии".- Санкт-Петербург.- 2010.-МАПО, кафедра челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии.
30. Самоукина А.М. Мониторинг свойств, ассоциированных с персистенцией представителей нормальной и условно-патогенной микрофлоры ЭГДС, у лиц с патологией ЖКТ / Ю.В. Червинец, Е.С. Михайлова, В.М. Червинец, Е.А. Беляева// Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 7-ой объединенной научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии. СПбГМА им. И.И. Мечникова.- Санкт-Петербург.- 2010.-№ 4.- 2010 г.-С.34. 31. Смирнова Л.Е. Влияние различных видов терапии на течение язвенной болезни, сочетающейся с артериальной гипертонией / В.Ф. Виноградов, Ю.В. Червинец, А.В.Смирнов // XII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" Сборник материалов конгресса. Тезисы докладов.- Москва.- 2010.- С.252-253.
32. Червинец Ю.В. Антивирусная активность пробиотических штаммов лактобацилл /В.М. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, Л.А. Владимирова// Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 7-ой объединенной научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии СПбГМА им. И.И. Мечникова.- Санкт-Петербург.- 2010.-№ 4.- 2010 г.-С.48.
33. Червинец Ю.В. Способность индигенных лактобацилл полости рта человека к формированию биопленок /А.М. Самоукина, В.М. Червинец, Е.С.Михайлова, Д.В. Лебедев, В.М. Бондаренко// ЖМЭИ.- 2010.-№6.-С.80-83.
34. Гаврилова О.А. Структурные особенности микробного биоценоза полости рта практически здоровых детей /Ю.В. Червинец, Е.Н.Федотова, А.С. Хохлова// Маэстро стоматологии.- Москва.-2011.-№43.-С.60-63
35. Лебедев Д.В. Микробиоценозы полости рта у больных генерализованным пародонтитом и их коррекция / В.М. Червинец, А.Ю. Миронов, Ю.В. Червинец // Стоматолог.- 2011.-№ 12.-С.23-29.
36. Смирнова Т.И. Исследование влияния нового лиганда и слабого постоянного магнитного поля на пекарские дрожжи / Я.М. Халяпина, В.М. Никольский, А.Н. Маслов, Ю.В. Червинец // Известия высших учебных заведений. Серия: "Химия и химическая технология", Иваново.-2011.-том 54.- вып. 6.-С.82-86. 37. Червинец В.М. Антибактериальная активность наноструктуированного серебряного геля / Ю.В. Червинец, М.М. Овчинников, А.М. Самоукина, М.Б. Петрова, Е.А. Харитонова, В.М. Брянцева, В.М. Бондаренко // ЖМЭИ.- 2011.- №4.-С.88-92.
38. Червинец В.М. Клинический эффект хитозана при терапии бактериального вагиноза / Ю.В. Червинец, В.М. Бондаренко, И.И. Стольникова, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, А.И. Албулов // ЖМЭИ.- 2011.- № 5.- С.76-79.
39. Червинец В.М. Мониторинг чувствительности к противомикробным препаратам микроорганизмов, выделенных от больных хроническим фарингитом, хроническим тонзиллитом и фарингомикозом /Ю.В. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, М.А. Куцоля, Е.А. Беляева// Научно-практические технологии диагностики и лечения в современной медицине. Материалы межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 75-летию кафедры оториноларингологии с курсом детской отоларингологии ТГМА, Тверь, 24 марта 2011г.- С.114-118.
40. Червинец Ю.В. Активность пробиотических штаммов лактобацилл в отношении полиовирусов / В.М. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, Л.А. Владимирова// Современные наукоемкие технологии.-2011.-№1.-С.65-66.
41. Червинец Ю.В. Генетическая паспортизация и изучение способности к формированию биопленок лактобациллами, выделенными из полости рта здоровых людей // С.Г. Ботина, А.А. Глазова, Н.В. Коробан, В.М. Червинец, А.М. Самоукина, О.А. Гаврилова, Д.В. Лебедев, А.Ю. Миронов // Клиническая лабораторная диагностика.- 2011.- №2.-С. 44-46.
42. Червинец Ю.В. Индигенные пробиотические штаммы лактобацилл полости рта человека / В.М. Червинец, А.Ю. Миронов, С.Г. Ботина, Е.Ю. Гагарина, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова // "Врач, провизор, пациент".-2011.-№1.-С.М19.
43. Червинец Ю.В. Микробиоценоз кишечника детей в возрасте 8-10 лет / В.М. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, Е.А. Беляева// Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии.-2011.-№ 4.-С. М 41.
44. Червинец Ю.В. Микрофлора полости рта и её чувствительность к антибиотикам у здоровых и больных гастродуоденитом детей / А. Ю. Миронов, В. М.Червинец // Стоматолог. - 2011. - № 10. -С. 41-45.
45. Червинец Ю.В. Симбиоз лактобацилл полости рта с микробиотой человека /В.М. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, Е.А. Беляева// Национальные приоритеты России. Специальный выпуск: "Современные аспекты природной очаговости болезней". Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию ФБУН "Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых болезней" Роспотребнадзора, Омск.-2011.- № 2(5).-С.203-204.
46. Червинец Ю.В. Симбиоз лактобацилл кишечника с микробиотой человека / В.М. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, Е.А. Беляева// Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии.-2011 г.-№4.- С.М 41.
47. Базлов С.Н. Применение пробиотиков - Споробактерина и Нормофлорина Л и Б - в лечении рецидива язвенной болезни, ассоциированной с дисбактериозом гастродуоденальной зоны /Ю.В.Червинец// XXXVIII сессия ЦНИИ Гастроэнтерологии XII съезд Научного общества гастроэнтерологов России. Клиническая и прикладная гастроэнтерология. Тезисы докладов.- Москва.-1-2 марта 2012 .-С.10.
48. Самоукина А.М. Молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза /В.М. Червинец, Ю.В. Червинец, Е.С. Михайлова // "Актуальные проблемы туберкулеза и оздоровительного питания" Материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 130-летию доклада Р.Коха о возбудителе туберкулеза. Тверь.- 23 марта 2012 г.-С.14-15.
49. Червинец В.М. Дисбактериоз кишечника и иммунный статус у детей с заболеваниями ЖКТ и верхних дыхательных путей / Ю.В. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, Е.А. Беляева // XXXVIII сессия ЦНИИ Гастроэнтерологии XII съезд Научного общества гастроэнтерологов России. Клиническая и прикладная гастроэнтерология. Тезисы докладов.-2012 г.-С.113.
50. Червинец В.М. Формирование биопленок антагонистическими штаммами лактобацилл полости рта / Ю.В. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, О.А. Гаврилова // Стоматология.- 2012.-том 91.- С.16-19.
51. Червинец Ю.В. Индигенные лактобациллы полости рта человека - кандидаты в пробиотические штаммы / В.М. Червинец, А.Ю. Миронов, С.Г. Ботина, Е.Ю. Гагарина, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова // Курский научно-практический вестник "Человек и здоровье".- 2012.- № 1.- С.131-137. 52. Червинец Ю. В. Микрофлора зубодесневого желобка у детей дошкольного возраста. / А. Ю. Миронов // Стоматолог. - 2012. - № 2. - С. 57-59. 53. Червинец Ю.В. Способность антагонистически активных штаммов лактобацилл формировать биопленки /В.М. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, Е.С. Беляева// Материалы X съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. "Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации", Москва, 12-13 апреля 2012г. - Том 2 "Инфекция и иммунитет".- № 1-2.- С.340-341.
48
Документ
Категория
Медицинские науки
Просмотров
229
Размер файла
18 547 Кб
Теги
Докторская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа