close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

КОМПЛЕКСНОЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ И ФЕНИЛПРОПАНОИДОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ИВОВЫХ (SALICACEAE)

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Браславский Валерий Борисович Шифр научной специальности: 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия Шифр диссертационного совета: Д 208.085.06 Название организации: Самарский государственный медицинский университет Адрес орган

На правах рукописи
БРАСЛАВСКИЙ ВАЛЕРИЙ БОРИСОВИЧ
КОМПЛЕКСНОЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ И ФЕНИЛПРОПАНОИДОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ИВОВЫХ (SALICACEAE)
14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора фармацевтических наук
Самара - 2012
Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научный консультант: Куркин Владимир Александрович - заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, доктор фармацевтических наук, профессор
Официальные оппоненты: Кудашкина Наталья Владимировна - заведующий кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Башкирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, доктор фармацевтических наук, профессор Онучак Людмила Артемовна - заведующий кафедрой физической химии и хроматографии Федерального Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Самарский государственный университет", доктор химических наук, профессор Первушкин Сергей Васильевич - заведующий кафедрой фармацевтической технологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, доктор фармацевтических наук, профессор Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита диссертации состоится "___" __________ 2012 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171.
Автореферат разослан "___" __________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент И.К. Петрухина ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В данное время на фоне неблагоприятной экологической ситуации ведётся интенсивный целенаправленный поиск сырьевых источников флавоноидов и фенилпропаноидов для создания на их основе лекарственных препаратов, обладающих антимикробным, противовоспалительным, нейротропным и другим действием (Самылина И.А., 1994; Дубищев А.В., Кулагин О.Л., 2003; Киселёва Т.Л., 2009; Куркин В.А., 2009). Поэтому в последнее время в фармации и медицине всё большую популярность приобретают лекарственные средства и сырьё растительного и животного происхождения, содержащие в качестве ведущих групп биологически активных соединений (БАС) флавоноиды и фенилпропаноиды, которые относятся по современной классификации к фенольным соединениям (Куркин В.А., 1992; 2007). Богатым и перспективным источником флавоноидов, фенилпропаноидов являются растения рода Ива (Salix L.) и Тополь (Populus L.) семейства Ивовых (Salicaceae), а также продукт совместного труда пчёл и растений - прополис (рег. № 95/335/910, ВФС 42-1084-81) (Wollenweber E., 1987; Bankova V., 1989; Поправко С.А., Соколов И.В., 1990; Куркин В.А. и др., 1991; 2009). В связи с этим, весьма актуальным является комплексное фармакогностическое исследование сырьевых источников и физико-химическое исследование флавоноидов и фенилпропаноидов сырья представителей семейства Ивовых, а также обоснование целесообразности разработки лекарственных средств на их основе.
Ярким примером перспективности данного направления являются уже созданные отечественные препараты прополиса с выраженной антибактериальной активностью: настойка (рег. № 90/111/3, ФС 42-3736-99), "Пропосол" (рег. № 72/425/9, ФС 42-3463-97), "Пропоцеум" (рег. № 76/788/4, ФС 42-2354-92).
Научные исследования последних лет вновь подтвердили эффективность популярного в народной медицине лекарственного растительного сырья (ЛРС): почек некоторых видов рода Тополь и коры представителей рода Ива. Почки тополя чёрного (Populus nigra L.) включены в Государственный реестр лекарственных средств (ГРЛС), разрешённых к применению в медицинской практике в качестве антисептического средства (рег. № 74/684/6). Однако к началу наших исследований нормативная документация (НД) на данное сырьё отсутствовала, так как имеющийся в своё время (1932 г.) ОСТ 4286 на почки тополя чёрного утратил юридическую силу. Кроме тополя чёрного в ГРЛС имеются также гомеопатические препараты: тополь бальзамический (Populus candicans) (рег. № 95/335/899), тополь осинообразный (Populus tremuloides) (рег. № 95/335/900). Также о целесообразности внедрения в научную медицину почек тополя и коры ивы свидетельствует положительный опыт использования в зарубежных странах: почек тополя чёрного в Германии и Болгарии, а коры ивы - в Британской, Европейской и немецкой Фармакопеях. Наряду с этим введение коры ивы остролистной в отечественную медицину позволит использовать данное растение комплексно, т.к. листья ивы остролистной (Salix acutifolia Willd.) являются фармакопейным сырьём (рег. № 87/637/2; ВФС 42-1697-87) для получения лютеолин-7-глюкозида-стандарта и противовирусного препарата "Салифозид".
Кроме того, опыт отечественных (Куркин В.А., 1989) и зарубежных ученых (Thieme H., 1970; Greenaway W., 1989) свидетельствует о том, что перспективным источником получения противовоспалительных препаратов является кора осины (Populus tremula L.) и ивы прутовидной (Salix viminalis L.) - источник получения Государственного стандартного образца (ГСО) триандрина. Немаловажным фактором целесообразности расширения сырьевой базы является то обстоятельство, что почки тополя представляют собой доступное и легко воспроизводимое ЛРС, а запасы коры ивы во много раз превышают сырьевые запасы листьев растений данного рода.
Растения семейства Ивовых широко используются в народном хозяйстве, строительстве, промышленности и др. При рубке леса, заготовках древесины кора и почки являются отходами производства и на сегодняшний день практически не используются. В то же время кора, побеги, почки растений могут рассматриваться как перспективные сырьевые источники новых эффективных лекарственных средств и рационально использоваться в комплексной безотходной технологии при заготовках и рубке леса как вторичное сырье. Таким образом, представляется актуальным проведение комплексного фармакогностического исследования почек различных видов рода Тополь и коры некоторых растений рода Ива, направленного на расширение сырьевой базы и внедрение данного ЛРС в медицинскую практику. Кроме того, актуальным является физико-химическое исследование флавоноидов и фенилпропаноидов данных видов сырья, разработка подходов к современной стандартизации сырья и препаратов тополя и ивы, а также сырья прополиса.
Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящей работы является комплексное фармакогностическое и физико-химическое исследование сырья, флавоноидов и фенилпропаноидов представителей семейства Ивовых в плане экспериментально-теоретического обоснования новых подходов к стандартизации и созданию на их основе лекарственных средств.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1) комплексное морфологическое и микроскопическое исследование и выявление диагностических признаков ЛРС представителей семейства Ивовых;
2) сравнительное исследование химического состава ЛРС следующих представителей семейства Ивовых: почек тополя чёрного (Populus nigra L.), т. бальзамического (P. balsamifera L.), т. душистого (P. suaveolens Fisch.), т. лавролистного (P. laurifolia Ledeb.), т. канадского (P. deltoides Marsh.); коры осины (P. tremula L.), ивы остролистной (Salix acutifolia Willd.), ивы прутовидной (S. viminalis L.); сырья прополиса с помощью современных методов анализа;
3) выделение из ЛРС индивидуальных биологически активных соединений, идентификация, установление структуры выделенных веществ;
4) сравнительное исследование спектральных, физико-химических и фармакологических свойств флавоноидов и фенилпропаноидов представителей семейства Ивовых;
5) разработка и научное обоснование новых подходов к стандартизации сырья и препаратов тополя и сырья прополиса;
6) исследование динамики накопления биологически активных соединений - флавоноидов и фенилпропаноидов в почках тополя; 7) разработка показателей качества и объективных методик анализа для изучаемых видов ЛРС, лекарственных препаратов и ГСО пиностробина;
8) разработка нормативной и технологической документации на изучаемые виды ЛРС, стандартный образец пиностробина и лекарственные препараты;
9) научное обоснование целесообразности использования в медицинской практике сырья представителей семейства Salicaceae (роды Populus L., Salix L.) в качестве источника антимикробных и адаптогенных лекарственных средств.
Научная новизна. Впервые проведены сравнительные комплексные фармакогностические исследования ЛРС представителей семейства Salicaceae. В результате сравнительного анатомо-морфологического исследования, в том числе с использованием методов цифровой макро- и микроскопии, почек тополя бальзамического, т. дельтовидного, т. душистого, т. лавролистного и т. чёрного, а также коры ивы остролистной и ивы прутовидной, были выявлены особенности анатомо-морфологического строения, и установлены внешние и микроскопические диагностические признаки для данных видов сырья.
В сравнительном плане изучен химический состав ЛРС с использованием методов колоночной хроматографии (КХ), тонкослойной хроматографии (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Проведены сравнительные исследования физико-химических и спектральных свойств основных компонентов сырья - флавоноидов и фенилпропаноидов с использованием методов ТСХ, ВЭЖХ, УФ-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.
В результате химического изучения почек Populus suaveolens Fisch. и P. laurifolia Ledeb., с использованием жидкостной адсорбционной колоночной хроматографии, впервые выделены 3 фенилпропаноида и 15 флавоноидов - новых для этих видов, причем 7,4'-диметилкемпферол и рамназин ранее не были описаны для растений рода Populus L., пинобанксин впервые выделен из данного рода и семейства Salicaceae, а популигенин (5-гидрокси-3,7-O-диацетилфлаванон) является новым природным соединением. Впервые проведено сравнительное изучение компонентного состава 5 видов тополя, разрешённых для получения ЛРС "Тополя почки". Установлено, что особенностью подавляющего большинства известных флавоноидов почек тополя является агликоновая природа флавоноидов и отсутствие у большинства флавоноидов рода Populus L. заместителей в боковом бензольном кольце B.
Впервые детально сравнительно изучен компонентный состав почек различных видов тополя, а также гибридных и полиплоидных форм растений, произрастающих в различных регионах РФ, в результате чего были установлены критерии предварительной оценки перспективности использования вида в качестве источника сырья для получения препаратов антимикробного действия.
Из коры Salix acutifolia Willd. нами впервые выделено 9 фенольных веществ: нарингенин, прунин, изосалипурпол, катехин (флавоноиды); сирингин, триандрин (фенилпропаноиды); ацил-салигенин, саликортин и тремулацин. В результате сравнительного исследования химического состава было установлено, что доминирующими компонентами в коре ивы прутовидной являются фенилпропаноиды, а в коре ивы остролистной - флавоноиды. Впервые с использованием методов ТСХ, КХ, ВЭЖХ, УФ-, ЯМР-спектроскопии и других в сравнительном плане изучены зависимости в ряду: "химическая структура - физико-химические свойства" флавоноидов и фенилпропаноидов, выделенных из представителей семейства Salicaceae. Установлено влияние заместителей при бензольных кольцах A и B флавоноидов тополя на их растворимость в различных растворителях, на хроматографическую подвижность в условиях ТСХ, КХ, ВЭЖХ и на характер электронных спектров как исходных, так и с химическими добавками комплексообразователей.
Впервые установлены зависимости для флавоноидов тополя в ряду "химическая структура - биологическая активность", показанная на примере пиностробина и пиноцембрина. Так, свободный фенольный гидроксил флавоноидов в положении C-7 (пиноцембрин) проявляет более выраженную антимикробную активность на широкий спектр микроорганизмов по сравнению со свободным фенольным гидроксилом в положении C-5 (пиностробин и пиноцембрин). При этом пиностробин проявляет слабовыраженную, но избирательную активность в отношении грамотрицательных микроорганизмов из-за метилированного гидроксила при C-7, что повышает его сродство к липофильной мембране. Приоритет проведённых исследований защищён 2 патентами РФ на изобретение: "Способ получения настойки тополя для лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей" (Патент № 2135201) и "Способ получения лекарственной фитопленки" (Патент № 2155071).
Практическая значимость. В результате проведения комплекса научных исследований созданы объективные предпосылки для расширения ассортимента ЛРС, эффективных отечественных лекарственных фитопрепаратов представителей семейства Salicaceae, разработаны современные объективные методики стандартизации сырья и лекарственных средств с использованием ГСО. На основе полученных данных по химическому составу разработаны методологические подходы определения действующих веществ в ЛРС и препаратах с использованием методов ТСХ, ВЭЖХ, УФ-спектроскопии.
Для препаратов почек тополя и сырья прополиса разработана качественная реакция методом ТСХ с использованием ГСО пиностробина по двум ведущим флаванонам - пиностробину (Rf  0,8) и пиноцембрину (с Rs около 0,7 относительно ГСО пиностробина), имеющим диагностическое значение.
Для определения подлинности и доброкачественности ГСО пиностробина предложены методы ТСХ, ЯМР-, УФ-спектроскопии и показатели качества.
Результаты исследования химического состава различных видов, а также особенностей их внешних признаков и анатомо-морфологического строения ЛРС включены в проекты соответствующей нормативной документации (НД):
* показатели качества 5 видов ЛРС включены в ФСП 42-0329168201 "Тополя почки, "ангро", рекомендованы для включения в ФС "Ивы остролистной кора" Государственной Фармакопеи РФ XII издания (письма в Фармакопейный государственный комитет Минздравсоцразвития РФ № 126 и № 133 от 27.01.05 г., приняты 01.02.05 г. - приложения 12, 14);
* полученные в результате исследований цифровые микрофотографии препаратов коры ивы корзиночной, ивы остролистной, почек тополя предложены для включения в разделы "Внешние признаки" и "Микроскопия" соответствующих ФС, ФСП 42-0329168201 "Тополя почки "ангро"", а также в плане методологии разработки общей фармакопейной статьи (ОФС) - "Почки".
* показатели качества лекарственного средства "Тополя настойка" (ФСП 42-0329174701) и "Пиностробин-стандартный образец" (ФС 42-0073-01), * методики качественного анализа и количественного определения суммы флавоноидов и фенилпропаноидов в препаратах тополя, а также в сырье прополиса (письма в Фармакопейный государственный комитет Минздравсоцразвития РФ № 126, 127 от 27.01.05 г. и № 159 от 31.01.05 г., приняты 01.02.05 г. - приложения 12, 13, 15);
* с использованием современных методов анализа на основе сравнительного исследования физико-химических, спектральных и фармакологических свойств выявлены закономерности в ряду: "структура-свойства" флавоноидов и фенилпропаноидов сырья представителей семейства Salicaceae;
* разработаны и запатентованы способы получения лекарственных фитопрепаратов настойки тополя (патент РФ № 2135201) и лекарственной фитоплёнки "Топоплен" (патент РФ № 2155071, ТУ 9362-003-01963143-98).
На основе полученных результатов исследований разработана НД на изученные виды ЛРС, стандартные образцы веществ и лекарственные препараты (ФСП 42-0329168201 "Тополя почки, "ангро", проект ФС "Ивы остролистной кора", ФС 42-0073-01 "Пиностробин-стандартный образец", рег. № 001373/01-2002; ФСП 42-0329174701 "Тополя настойка", лабораторно-технологический регламент на получение ГСО пиностробина) (приложения 16-21). Практическая значимость результатов проведённых исследований подтверждена актами о внедрении (приложения 5-11): ЗАО "Самаралектравы" (от 16.02.12 г.), Средне-Волжский филиал ГНУ "ВИЛАР" РАСХН (от 20.02.12 г.), ГБУЗ "Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области" и на кафедрах ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (от 21.02.12 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (№ государственной регистрации 01200202298) по темам "Комплексные исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения" (№ 01200900658) и "Фармакогностическое и химико-фармацевтическое исследование лекарственных растений и фитопрепаратов" (№ 01200405620), а также Республиканских программ Минздравсоцразвития РФ "Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях" по теме "Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия" (№ 01990005277) и "Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды" (№ государственной регистрации 01990007536).
Положения, выдвигаемые на защиту:
1. Результаты сравнительного анатомо-морфологического исследования сырья представителей семейства Ивовые (почек тополя, коры ивы).
2. Результаты химического исследования почек Populus suaveolens Fisch., Populus laurifolia Ledeb., коры Salix acutifolia Willd.
3. Результаты сравнительного изучения химического состава прополиса, почек некоторых видов рода Populus L. и коры видов рода Salix L.
4. Методологические подходы к стандартизации сырья прополиса, растительного сырья и препаратов на основе видов рода Populus L.
5. Научное обоснование взаимосвязи структуры и некоторых физико-химических и фармакологических свойств флавоноидов и фенилпропаноидов представителей семейства Salicaceae;
6. Экспериментально-теоретическое обоснование целесообразности разработки лекарственных средств на основе представителей семейства Ивовых.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на международных научных конференциях: "Биологическое разнообразие. Интродукция растений" (Санкт-Петербург, 1995; 1999), "Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений" (Новосибирск, 1998), IV Съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999), "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности" (Томск, 2000), на V-XVIII Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 1998 - 2011), Всероссийских научно-практических конференциях "Экология и здоровье человека" (Самара, 1995, 1997, 1998; 2002, 2005 - 2008; 2011). Результаты диссертационного исследования обсуждались также на международных конференциях по полифенолам: Polyphenols Communications, International Conference on Polyphenols (XXI - Marrakech-Morocco, 2002; XXII - Helsinki-Finland, 2004; XXIII - Winnipeg, Manitoba, Canada, 2006; XXIV - Salamanca, 2008), а также на VI Международном Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 61 научной работе, из них 23 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2-х патентах РФ на изобретение, монографии "Ива, тополь и прополис в медицине и фармации", в лабораторном технологическом регламенте на получение ГСО пиностробина, ФСП 42-0329168201 "Тополя почки "ангро", ФСП 42-0329174701 "Тополя настойка", ФС 42-0073-01 "Пиностробин-стандартный образец".
Объём и структура работы. Диссертационная работа изложена на 310 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 80 рисунков, список литературы, включающий 286 ссылок, в том числе 66 иностранных, 24 - интернет ресурсов. Диссертация состоит из введения, 8 глав, выводов и приложений.
Во введении обосновывается актуальность темы, формулируются цель и задачи исследований, отмечены научная новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены основные положения, выносимые на защиту. Первая глава посвящена обзору литературы по современному состоянию исследований видов родов Populus L., Salix L. и прополиса, в котором обобщены и систематизированы сведения по химическому составу, фармакологическим свойствам и применению представителей сем. Salicaceae и прополиса в медицине. Кроме того, рассматриваются вопросы по проблемам стандартизации сырья представителей данного семейства и препаратов. В главах 2-8 представлены экспериментальные данные и обсуждены результаты собственных исследований. В главе 2 дана характеристика объектов и методов исследования. В главе 3 даны результаты анатомо-гистологических и морфологических исследований, диагностические признаки коры ивы прутовидной, ивы остролистной, почек тополя. Глава 4 посвящена обсуждению результатов исследования химического состава представителей семейства Salicaceae, вопросам изучения физико-химических показателей, установлению строения и идентификации выделенных веществ. В главе 5 приведены разделы сравнительного исследования компонентного состава коры видов ивы, почек тополя и сырья прополиса. В 6 главе обсуждаются проблемы стандартизации сырья и препаратов представителей семейства Salicaceae и сырья прополиса, а также предложенные методологические подходы к стандартизации ЛРС и препаратов. Глава 7 посвящена разработке и совершенствованию НД на сырьё и препараты тополя, ивы и сырьё прополиса, а также на ГСО пиностробина. Глава 8 представляет результаты исследований по научному обоснованию целесообразности создания лекарственных средств и стандартных веществ на основе сырья ивы и тополя.
В приложения вынесены акты внедрения, письма в Фармакопейный государственный комитет Минздравсоцразвития РФ, ФС, ФСП, патенты, протоколы исследований.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Характеристика объектов и методов исследования
Объектом исследования послужили образцы коры ивы прутовидной, собранные весной 1989-2001 г. до начала цветения близ р. Унга в Иркутской области, г. Близ р. Хоторосль Ярославской обл., р. Ухта Костромской обл., и экстракты, полученные из этих образцов. Также в качестве объектов исследования использовали образцы воздушно-сухого сырья коры ивы остролистной, собранные в период активного сокодвижения (апрель-май 1987-2010 гг.) в Московской, Самарской, Пензенской, Рязанской областях. Кроме того, объектами исследования служили образцы коры осины, собранные в марте-апреле 1995-2010 гг. в Самарской и Пензенской областях. Для углубленного изучения химического состава использованы почки тополя лавролистного, собранные в марте 1990-1992 гг. в Самарском ботаническом саду (СБС) и почки т. душистого (Р. suaveolens Fisch.) - с юго-западного побережья оз. Байкал весной 1992 г. Объектами исследований служили также собранные в марте 1987 - 2011 гг. почки тополя чёрного (осокорь), дикорастущего в пойме р. Волги (с. Гаврилова Поляна, Самарской обл.), почки тополя канадского, т. бальзамического, т. лавролистного, культивируемых в СБС. Кроме того, объектами для сравнительных исследований служили почки (заготовлены в апреле 1992 г.) дикорстущих видов тополя, выращенных в дендрарии Центрального Сибирского ботанического сада (ЦСБС), куда они были привлечены из разных районов России: т. черный - из поймы р. Оби, т. лавролистный - из Тувинской АССР и новых форм тополя, полученных в ЦСБС в результате межвидовой гибридизации и экспериментальной полиплоидии. В качестве объектов исследования использовались образцы прополиса, заготовленные в 1986-2010 гг в Республике Башкортостан, Республике Татарстан, а также в Московской, Самарской, Ульяновской, Пензенской, Оренбургской областях и в Краснодарском крае.
Кроме того, объектами исследования служили индивидуальные соединения (флавоноиды и фенилпропаноиды), выделенные из почек видов Populus L. и коры видов Salix L., а также лабораторные образцы галеновых препаратов: "Экстракт ивы жидкий" - из коры и "Настойка тополя" - из почек. При работе методом колоночной хроматографии в качестве сорбентов нами были использованы: силикагель L 40/100 и L 100/160 (Чехия); сефадекс LH-20 (Швеция); полиамид "Woelm"(Германия) и подготовленный полиамид.
С целью выделения индивидуальных веществ сырьё родов Populus L. и Salix L. исчерпывающе экстрагировали водным спиртом. Объединенные экстракты упаривали в вакууме до густого остатка, последовательно хроматографировали на силикагеле и полиамиде, используя различные элюентные смеси. Контроль разделения веществ осуществлялся с помощью метода ТСХ в различных системах растворителей. Индивидуальные вещества получали методом рехроматографии на колонках, где в качестве сорбента использовали полиамид и сефадекс. Для очистки веществ мы использовали метод перекристаллизации из хлороформных, спиртовых и ацетоновых растворов.
Выделенные вещества были исследованы с помощью УФ-, 1Н-ЯМР- и 13С-ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии, различных химических превращений, ТСХ, ВЭЖХ, а также непосредственного сравнения с достоверными образцами. ТСХ осуществлялась с использованием пластинок "Silufol UV 254" (Чехия), "Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ" и "Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ" (Россия) и различных систем растворителей. Детекцию веществ осуществляли просмотром хроматограмм в УФ-свете при длине волны 254 нм и 366 нм, а также после проявления 3% спиртовым раствором AlCl3 и свежеприготовленным раствором диазобензолсульфокислоты в насыщенном растворе карбоната натрия. Изучение компонентного состава почек различных видов тополя и коры ивы проводилось при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе "Милихром-4" (колонка 2х64 мм, стационарная фаза "Сепарон С-18") и "Милихром-5" (колонка 2х80 мм, стационарная обращенная фаза "Диасорб 130-С16Т"). В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и воды (в соотношениях от 10:90 до 70:30) с добавлением и без уксусной кислоты (1%) в градиентном и изократических режимах. Скорость элюирования - 100 мкл/мин. Детектирование веществ осуществляли УФ-спектрофотометрическим детектором при пяти длинах волн (270, 290, 326, 340 и 360 нм) одновременно. Полные УФ-спектры веществ снимали на спектрофотометре "Specord M 40", "Specord 40" и "Hitachi-EPS-3T" в метаноле или этаноле. Спектры 1Н-ЯМР измерены на спектрометрах "Varian HA-100D" (при 100 МГц), "Varian-Gemini-200" с рабочей частотой 200 МГц и "Bruker AM 300" (300 МГц). Спектры 13С-ЯМР измерены при 50 МГц. Величины химических сдвигов приведены в шкале . Внутренний стандарт - тетраметилсилан (=0). Масс-спектры электронного удара регистрировали на приборах "Varian СН-8", "Kratos MS-30" при энергии ионизирующих электронов 35 и 70 эВ. Температуру ионного источника варьировали от 30 до 300 0С. Анатомо-морфологические исследования осуществляли с использованием цифрового стереоскопического микроскопа "Motic DM-39С-N9GO-A" (с объективами увеличения: х20; х40, х100, х400) (Корея), а также светового цифрового микроскопа "Motic DM 111" (с объективами х40; х100; х400; х1000) (Корея).
Приготовление препаратов коры ивы для микроскопии проводили в соответствии с разделом "Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья" ГФ СССР XI издания, вып. 1, а также по общепринятой методике (Самылина И.А., Аносова О.Г., 2007). Результаты эксперимента приводятся в виде средней арифметической и её стандартной ошибки. Статистическую значимость различий параметров определяли с помощью критериев Стьюдента t (р < 0,05) и компьютерной программы Statistica 6.0. Статистическую обработку данных эксперимента (P=95 %) проводили при помощи критерия Стьюдента с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата и определением ошибки единичного определения (ГФ XI, вып. 1, стр. 199). 2. Комплексное сравнительное морфологическое и микроскопическое исследование некоторых представителей семейства Ивовые (Salicaceae)
В связи с выходом ОСТ 91500.05-00 "Стандарты качества лекарственного средства" (2000 г.) необходимо было провести современное морфологическое и микроскопическое исследование сырья представителей семейства Ивовые для формирования соответствующих разделов НД на данные виды ЛРС.
2.1. Сравнительное морфологическое и микроскопическое исследование коры ивы прутовидной и ивы остролистной В результате сравнительных исследований установлены отличительные признаки наружной поверхности для коры ивы остролистной - восковый налёт и жёлто-бурая или красно-бурая, до коричневой окраска, а у коры ивы прутовидной - коричневато-серая или тёмно-серая. Внутренняя поверхность коры ивы остролистной яркого лимонно-жёлтого цвета, а коры ивы прутовидной - от коричневато-розового до светло-бурого цвета. Были проведены гистологические исследования коры ивы прутовидной и ивы остролистной для выявления диагностических микроскопических признаков сырья с последующим включением в НД на соответствующий вид ЛРС.
Сырьё коры ивы прутовидной и остролистной на поперечном срезе включают в себя комплекс тканей, составляющих наружный слой стебля: остатки эпидермиса, перидерма, представленная пробкой; ткани первичной коры, включающие колленхиму и паренхиму; ткани вторичной коры, представленные лубяными волокнами и сердцевинными лучами в паренхиме. В пробке и паренхиме вторичной коры отмечены воздухоносные полости. Группы лубяных волокон окружены кристаллоносной обкладкой. Лубяные волокна в коре ивы остролистной расположены более рыхло, чем у коры ивы прутовидной (рис. 1 и 2).
Рис. 1. Поперечный срез коры ивы прутовидной: окраска - сернокислый анилин (х40)
Обозначения: 1 - эпидермис; 2 - пробка; 3 - колленхима; 4 - паренхима первичной коры; 5 - друзы оксалата кальция; 6 - лубяные волокна; 7 - клетки вторичной корыРис. 2. Поперечный срез коры ивы остролистной: луб, окраска - сернокислый анилин (х 100)
Обозначения: 1 - лубяные волокна; 2 - воздушная полость; 3 - друзы оксалата кальция 2.2. Морфологическое и микроскопическое исследование почек видов рода Populus L.
Изучение особенностей морфологического и анатомического строения почек 5 близкородственных видов тополя необходимо для выявления диагностических признаков и включения их в соответствующие разделы НД.
Почки тополя покрыты чешуями прилистникового происхождения. Для тополя характерно очередное расположение почек. На одной ветви располагается верхушечная (вегетативная, листовая) и боковые (генеративные) почки.
На основании проведённых исследований для включения в ОФС "Почки" выбраны такие параметры внешних признаков, как форма, длина и ширина, а также количество, форма и расположение кроющих чешуй, цвет, запах и вкус.
В результате проведённого гистологического исследования были отмечены особенности анатомического строения чешуи почек тополя на поперечном срезе: с поверхности клетки эпидермиса прямоугольной формы, с заметно утолщенными стенками, имеют пигментированный жёлто-бурый протопласт с гранулярной зернистой структурой. Наружный эпидермис чешуи почек тополя однослойный. Клетки эпидермиса на поперечном срезе имеют округлую, часто шлемовидную форму и продуцируют мощный слой кутикулы (рис. 3). В соответствии с этим для включения в ОФС "Почки" могут быть выбраны такие микроскопические признаки, как наличие с поверхности кутикулы, форма и послойное расположение клеток на поперечном срезе, наличие и описание волосков, форма и расположение кристаллических включений, форма и расположение клеток механичеких тканей.
А Б
Рис. 3. Край почечной чешуи тополя лавролистного, поперечный срез: А - край чешуи (х100); Б - край чешуи (х400)
Обозначения: 1 - кутикула; 2 - клетки наружного эпидермиса; 3 - паренхима чешуи (мезофил); 4 - разрывы паренхимы; 5 - пучки склереид; 6 - адаксиальный (внутренний) эпидермис
3. Фитохимическое исследование представителей семейства Salicaceae
3.1. Выделение флавоноидов и фенилпропаноидов рода Populus L., их физико-химические константы и характеристика
В результате химического изучения почек Populus laurifolia Ledeb. и P. suaveolens Fisch. впервые выделено 18 индивидуальных соединений, ранее не выделявшихся из этих видов, среди которых вещества 1-15 - флавоноиды, а соединения 16-18 - фенилпропаноиды. Причем 7,4'-диметилкемпферол (11) и рамназин (13) ранее не были описаны для растений рода Populus L., а пинобанксин (4) впервые выделен из данного рода и из семейства Salicaceae L. При этом флаванон популигенин (5) впервые был выделен нами из почек тополя душистого и является новым природным соединением с установленной химической структурой 5-гидрокси-3,7-O-диацетилфлаванона (табл. 1).
Таблица 1 Физико-химические показатели флавоноидов и фенилпропаноидов выделенных из почек видов рода Populus L.
№Название вещества, (источник выделения),
структурная формулаСостав, описаниеМасс-спектр (m/z,%) Тпл
(oС)max ЕtOH, (нм), 123456Флаваноны1.Пиностробин (5-гидрокси-7-метокси-флаванон) (P. laurifolia, P. suaveolens)
C16H14O4,
пластинчатые прозрачные кристаллы белого М+ 270125-128 °С
(из смеси хлороформ-гексан)max EtOH 289, 320 (пл.) нм
-1.80 (c 2,7, СН3ОН)2.Пиноцембрин (5,7-дигидрокси-флаванон) (P. laurifolia, P. suaveolens)
С15Н12О4,
кристаллы белого цветаМ+ 256185-188 °С (этанол)max EtOH 291, 325 (пл.) нмФлаванонолы3.Альпинон (3,5-дигидрокси-7-метокси-флаванон) (P. laurifolia, P. Suaveolens)
C16H14O7 игольчатые кристаллы белого цвета М+ 286176-179 °С (этанол)max EtOH 290, 325 (пл.) нм4.Пинобанксин (3,5,7-тригидрокси-флаванон). (P. laurifolia, P. suaveolens)
C15H12O5 кристаллы белого цвета M+ 272172-176 °С (этанол)max EtOH 289, 326 (пл.) нм5.Популигенин (5-гидрокси-3,7-O-диацетил-флаванон) (P. suaveolens)
С19Н16О7
кристаллы белого цветаМ+ 356°Сmax EtOH 289, 320 (пл.) нм
123456Флавоны6.Хризин (5,7-дигидроксифлавон) (P. laurifolia, P. suaveolens)
С15Н10О4 кристаллы золотисто-желтого цветаМ+ 254282-285 °Сmax EtOH 270, 335 нм7.Тектохризин (5-гидрокси-7-метоксифлавон) (P. laurifolia)
С16Н12О4
кристаллы желтого цветаМ+ 268144-147 °Сmax EtOH 271, 323 нм8.Генкванин (5,4'-дигидрокси-7-метоксифлавон) (P. laurifolia)
С16Н12О5 кристаллы желтого цветаМ+ 284285-288 °С (хлороформ-гексан)max EtOH 269, 335 нмФлавонолы9.Изальпинин (3,5-дигидрокси-7-метоксифлавон) (P. laurifolia, P. suaveolens)
С16Н12О5
кристаллы желтого цветаМ+ 284198-199 °С (хлороформ-гексан)max EtOH 267, 360 нм10.Галангин (3,5,7-тригидроскифлавон) (P. laurifolia, P. suaveolens)
С15Н10О5
кристаллы желтого цветаМ+ 270220-223 °С (хлф -этанол)max EtOH 268, 362 нм
+А1С13
275, 334, 414 нм11.3,5-дигидроски-7,4'-диметоксифлавон (P. laurifolia)
С17Н14О6 кристаллы светло-желтого цвета М+ 314171-175 °С (хлф - этанол)max EtOH 258, 366 нм
+NaOAc 258, 372 нм;
+А1С13 266, 358, 422 нм
12345612.Рамнетин (3,5,3',4'-тетрагидрокси-7-метоксифлавон) (P. laurifolia)
С16Н12О7 кристаллы ярко-желтого цвета М+ 316248-250 °С (водный спирт)max EtOH 260, 269 (пл.), 375 нм
+А1С13
296, 428 нм13.Рамназин (3,5,4'-тригидрокси-7,3'-диметоксифлавон) (P. laurifolia)
С18Н14О7 игольчатые кристаллы зеленовато-желтого цвета М+ 330242-245 °С (водный спирт)max EtOH 258, 374 нм
+А1С13
285, 422 нмХалконы14.2',6'- дигидрокси-4'-метоксихалкон (P. laurifolia, P. suaveolens)
C16H14O4 игольчатые кристаллы красно-оранжевого цвета M+ 270149-151 0С (хлороформ - метанол)max EtOH 270, 340 нм
+А1С13 310, 367 нм15.2',6'-дигидрокси-4'-метоксидигид-рохалкон (P. laurifolia)
C16H16O4 пластинчатые кристаллы желтого цветаM+ 272171-174 °С (хлороформ- гексан)max EtOH 270, 340 нмФенилпропаноиды16.Коричная кислота (P. laurifolia, P. suaveolens)
С9Н8О2 блестящие-пластинчатые кристаллыM+ 148131-133 °С (хлороформ-гексан)max EtOH 308 нм17.Кофейная кислота (P. laurifolia, P. suaveolens, P. balsamifera)
C9H8O4 кристаллы светло-желтого цветаM+ 180218-222 °С (водный ацетон)max MeОН 217, 235 (пл.), 242, 299 (пл.), 326 нм
12345618.Изопентилкофеат (2-метил-3-бутенилкофеат) (P. laurifolia, P. suaveolens)
С14Н16О4 белые кристаллы с желтоватым оттенком M+ 248117-119 °С (водный этанол)max EtOH 235, 242, 299 (пл.), 327 нм19.п-Кумаровая кислота (P. balsamifera, P. deltoides)
C9H8O3 кристаллы светло-желтого цветаM+ 164207-209 °С (этанол)max EtOH 295 (пл.), 309 нм20.Феруловая кислота (P. balsamifera, P. deltoides)
C10H10O4
белые кристаллыM+ 194168-170 °С (этанол)max EtOH 242, 290 (пл.), 333 нм21.3,4-диметоксикоричная кислота (P. balsamifera, P. deltoides)
С11Н12О4
белые кристаллыM+ 208142-145 °С (этанол)max EtOH 235, 242, 319 нм В данных исследованиях усовершенствован технологический способ получения ГСО пиностробина, в котором экстрагент 96 % этанол заменён на хлороформ, что дало увеличение выхода из сырья целевого фавоноида на 19,5 %.
При исследовании коры осины методом колоночной хроматографии было выделено доминирующее вещество коры осины - тремулоидин. Из простых фенолов коры осины в минорных количествах также был выделен тремулацин.
3.2. Выделение и характеристика флавоноидов и фенилпропаноидов рода Salix L.
В результате проведенных исследований из коры ивы остролистной с использованием колоночной хроматографии на силикагеле и полиамиде впервые выделены 14 индивидуальных веществ фенольной природы: нарингенин, прунин, салипурпозид, катехин, изосалипурпозид, 6"-кумароилизосалипурпозид, изосалипурпол (флавоноиды), триандрин, сирингин (фенилпропаноиды) (табл. 2). Кроме того, выделены простые фенолы: салициловый спирт (салигенин) и его производные - ацил-салигенин, салицин, саликортин, тремулацин. Таблица 2 Флавоноиды и фенилпропаноиды коры Salix acutifolia Willd.
№Название, химическая формулаСостав, описание Масс-спектр (m/z) Т.пл. (оС)max (нм)
(растворитель)1234561.Нарингенин (5,7,4'-тригидроскифлаванон)
С15Н12О5
Бесцветные кристаллыМ+ 272249-251 оС
(водный спирт)max MeOH 288 нм
(метанол)2.Салипурпозид (нарингенин-5-O-β-D-глюкопиранозид)
С21Н22О10 . Н2О Бесцветные кристаллы
М+ агликона 272158-161 оС
(водный этанол) max EtOH 227, 283 нм
(этанол)3.Прунин (нарингенин-7-O--D-глюкозид)
С21Н22О10 . Н2О Бесцветные кристаллы М+ агликона 272168-170
оС
(метанол)max MeOH 285 нм
(метанол)4.Изосалипурпол (4,2',4',6'-тетрагидроксихалкон)
С15Н12О5 Игольчатые кристаллы оранжевого цвета М+ 272оС
max EtOH 230, 375 нм
(этанол)5.Изосалипурпозид (2',4,4'-тригидрокси-6'-O-β-D-глюкопиранозил-халкон)
С21Н22О10
Игольчатые кристаллы оранжевого цветаМ+ агликона 272169-172
оС
(водный этанол)max EtOH 227, 315пл, 372 нм
(этанол) 6.6"-Кумароил-изосалипурпозид
С30Н28О12
Кристаллы оранжевого цвета
М+ агликона 272180-182
оС
(водный этанол)max EtOH 227, 317, 370 нм
(этанол)
1234567.(+)-Катехин (3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаван)
С15Н14О6
Белые игольчатые кристаллыМ+ 290 146-148
оС
(водный этанол)max MeOH 281 нм (метанол)
max EtOH 276 нм
(этанол)8.Сирингин (4-O--D-глюко-пиранозид 4-гидрокси-3,5-диметоксикоричного спирта). С17Н24О9 Н2О Игольчатые кристаллы белого цвета М+ агликона 210190-192
оС
(из воды)
max EtOH 221, 266 нм
(этанол) 9.Триандрин
С15Н20О7 Н2О
Игольчатые кристаллы белые М+ агликона 150178-180
оС
(из воды)max EtOH 264 нм
(этанол)Из коры ивы прутовидной были выделены фенилпропаноиды: триандрин, п-кумаровая кислота, кофейная кислота и феруловая кислота.
3.3. Изучение строения флавоноидов и фенилпропаноидов
3.3.1. Флавоноиды
Наиболее характерными флавоноидами почек тополя, имеющими диагностическое значение для видов рода Populus L., являются пиностробин (1) и пиноцембрин (2). Анализ спектральных данных (рис. 4 и 5), а также данные УФ-спектров и сопоставление физико-химических показателей позволило идентифицировать пиностробин (1) и пиноцембрин (2) как 5-гидрокси-7-метоксифлаванон и 5,7-дигидроксифлаванон соответственно (табл. 1).
Аналогичным образом проводилось установление химической структуры и идентификация других флавоноидов (3 - 15), выделенных из почек видов рода Populus L. (табл. 1), а также флавоноидов (1 - 7) выделенных из коры Salix acutifolia Willd. (табл. 2).
Рис. 4. 1Н-ЯМР-спектр пиностробина в дейтерохлороформе
Рис. 5. Масс-спектр пиностробина
3.3.2. Фенилпропаноиды Особенность фенилпропаноидного состава видов рода Populus L. и Salix L. заключается в том, что в почках тополя характерными компонентами являются производные коричных кислот (рис. 6 и 7, табл. 1 и 2), тогда как в случае коры видов Ивы диагностическое значение имеют производные коричных спиртов, в частности, триандрин (9) и сирингин (8) (табл. 2).
Аналогичным образом с флавоноидами по спектральным данным и показателям проводилась идентификация фенилпропаноидов и простых фенолов. Рис. 6. Масс-спектр кофейной кислоты
Рис. 7. 1Н-ЯМР-спектр 3,4-диметоксикоричной кислоты в ДМСО-d6
4. Сравнительное исследование УФ-спектров водно-спиртовых извлечений почек видов рода Populus L.
Сравнительное исследование УФ-спектров водно-спиртовых извлечений почек тополя черного (рис. 8) и тополя бальзамического (рис. 9) показало, что в обоих случаях имеется интенсивный основной максимум поглощения при длине волны около 290 нм (флаваноны) и "плечо" при длине волны около 326 нм (флаваноны и гидроксикоричные кислоты). Наличие максимумов поглощения в УФ-спектрах спиртового раствора пиностробина (рис. 10) и пиноцембрина (рис. 11) при длине волны 289 и 291 нм (соответственно) свидетельствует о том, что для исследуемых видов тополя в основном именно данными флавоноидами определяется характер кривой поглощения. Это подтверждается и спектральными характеристиками комплексов пиностробина и пиноцембрина с AlCl3: в УФ-спектрах наблюдается характерный для флаванонов батохромный сдвиг максимума поглощения в область 310 нм (рис. 8 - 11). Сопоставимые спектральные характеристики обнаружены и для водно-спиртовых извлечений из различных образцов сырья прополиса.
Рис. 8. УФ-спектр спиртового раствора извлечения почек тополя черного
Обозначения: 1 - исходный раствор;
2 - раствор в присутствии AlCl3Рис. 9. УФ-спектр спиртового раствора почек тополя бальзамического
Обозначения: 1 - исходный раствор; 2 - раствор в присутствии AlCl3
Рис. 10. УФ-спектр спиртового раствора ГСО пиностробина
Обозначения: 1 - исходный раствор; 2 - раствор в присутствии AlCl3
Рис. 11. УФ-спектр спиртового раствора пиноцембрина
Обозначения: 1 - исходный раствор; 2 - раствор в присутствии AlCl3
5. Сравнительное физико-химическое исследование флавоноидов и фенилпропаноидов сырья тополя и прополиса методом ВЭЖХ
Проведенное сравнительное исследование компонентного состава почек близкородственных видов тополя показало, что во всех исследованных образцах отмечается высокое содержание флавоноидов, среди которых чаще всего доминируют флаваноны (пиностробин и пиноцембрин) и флаванонолы (альпинон, пинобанксин, популигенин), определяющие характер кривой поглощения УФ-спектров изучаемых экстрактов (рис. 8 - 11) и ВЭЖХ (рис. 12-13).
Исследование компонентного состава почек тополя и прополиса проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиентном режиме элюирования (рис. 12-14). В качестве реперных веществ для идентификации пиков на хроматограммах использовали индивидуальные соединения (1-21, табл. 1).
Время удерживания определяли для каждого вещества в отдельности и в модельных смесях. Кроме того, применяли метод добавки индивидуальных веществ в исследуемые экстракты.
Количественное определение пиностробина в почках исследуемых образцов сырья проводили методом ВЭЖХ-анализа в изократическом режиме.
В результате сравнительного исследования образцов почек тополя было выявлено, что содержание пиностробина (1) выше в образцах сырья из Европейского региона РФ (от 2 до 5 %), а в образцах Сибирского региона содержание пиностробина ниже, но выше содержание его халкона (14). В экстрактах из почек тополя бальзамического и т. лавролистного преобладает пиностробин (1), а у т. чёрного и т. канадского - пиноцембрин (2). Почки т. лавролистного и т. душистого похожи по высокому содержанию альпинона (3) и пинобанксина (4). В Европейских образцах - богаче набор коричных кислот (19-21) (рис. 12).
Рис. 12. ВЭЖХ-разделение компонентов экстракта почек т. чёрного (P. nigra L.) (СБС, 1990) в режимах детектирования при 290 (сплошные линии) и 326 нм (пунктирные линии)
Обозначения: Пикам на хроматограммах соответствуют номера веществ, приведённые в табл. 1 Определено, что хроматографическое поведение (время удерживания Rt) индивидуальных веществ, тех же веществ в их модельных смесях (промежуточное поведение), а также данных веществ в составе суммарного экстракта при одинаковых тенденциях имеет видимые различия из-за физико-химических межмолекулярных взаимодействий флавоноидов и фенилпропаноидов как с хроматографическими фазами, так и между собой (табл. 3). Наибольшей хроматографической подвижностью в данных условиях обладают фенилпропаноиды - коричные кислоты. Кислоты фенилпропаноидов экстракта почек тополя бальзамического, как и в модельных смесях, выходят с колонки ВЭЖХ в порядке уменьшения их полярности (количества свободных гидроксигрупп): кофейная, п-кумаровая, феруловая, 3,4-диметоксикоричная, коричная, при этом феруловая и изоферуловая кислоты в данных условиях не делятся и выходят одним пиком.
Рис. 13. ВЭЖХ-разделение компонентов экстракта почек т. душистого (P. suaveolens Ficsh.) (№ 9/1-диплоид), (ЦСБС, 1992) в градиентном режиме, в режимах детектирования при 290 нм (сплошные линии) и 326 нм (пунктирные линии)
Обозначения: Пикам на хроматограммах соответствуют номера веществ, приведённые в табл. 1Интересно, что изопентенилкофеат (2-метил-3-бутенилкофеат) (18, табл. 1 и 3 выходит после данных кислот, даже после коричной кислоты (16), не имеющей в отличии от него свободных фенольных гидроксилов, что можно объяснить увеличением липофильности молекулы кофейной кислоты (17) (и времени удерживания на обращённофазном сорбенте) за счёт замещения кислотного гидроксила углеводородным радикалом изопентенила (табл. 1 и 3, рис. 12-14). Наиболее характерными флавоноидами, позволяющими обсуждать закономерности хроматографического поведения в сравнительном плане среди флаванонов с незамещённым кольцом B, являются пиностробин (1) и пиноцембрин (2). Аналогично среди флавонов - тектохризин (7) и хризин (6). Среди флавонолов - изальпинин (9) и галангин (10) (табл. 1 и 3). В данных случаях явно видна роль метилирования гидрокси-группы в 7 положении кольца A этих флавоноидов. Время удерживания в данных условиях хроматографирования и в данных парах флавоноидов возрастает в среднем 1,4-1,5 раза для метоксилированных производных (табл. 3). Таблица 3 Величины времени удерживания веществ в ВЭЖХ экстрактов почек рода Populus L.
Название индивидуальных веществ почек тополя в порядке выхода на хроматограмме (№ вещества в табл. 1)Время удерживания индивидуальных веществ на хроматограмме (Rt, мин)Время удерживания веществ
в суммарном экстракте на хроматограмме (Rt, мин)Populus sauveolens*Populus laurifoliaКофейная кислота (17)2,182,012,42п-Кумаровая кислота (19)2,61Феруловая кислота (20)2,923,4-диметоксикоричная (21)4,89Коричная кислота (16)7,346,708,197-метилкверцетин (12)8,468,91Изопентенилкофеат (18)14,5111,5915,08Хризин (6)15,2712,2715,36Пиноцембрин (2)15,3212,9215,97Пинобанксин (4) 16,9014,4717,44Альпинон (3) 17,0217,44Галангин (10)16,6814,4717,44Генкванин (8)16,7217,447,4'-диметилкемпферол (11)16,8017,447,3'-диметилкверцетин (13)17,5018,39Неидентифицированное в-во-16,7918,782',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкон (14)20,6717,9720,702',6'-дигидрокси-4'-метоксидигидрохалкон (15)20,9821,04Пиностробин (1)22,5719,2422,64Изальпинин (9)23,3121,0224,17Тектохризин (7)23,4521,9124,99*- образец № 25/2 - тетраплоид, градиент отличается от других ВЭЖХ.
Интересно, что почти в 2 раза уменьшается подвижность метилированного по 3'-гидроксигруппе кольца B флавонола рамназина (13) по сравнению с рамнетином (12) (табл. 1 и 3). В плане хроматографического поведения роль дигидрирования пропанового фрагмента между кольцами A и B (кольцо C) не столь велика по сравнению с метоксилированием молекулы флавоноида. Тем не менее, для метоксилированных производных эта разница заметнее: так флавон тектохризин (7) удерживается дольше флаванона пиностробина (1), а флаванон пиноцембрин (2) удерживается немногим дольше соответствующего флавона хризина (6). Метоксилированные флавоноиды с разомкнутым кольцом C ведут себя так: дигидрохалкон (15) удерживается дольше соответствующего халкона (14). Разрыв кольца C с появлением свободного гидроксила у халкона (14) заметно повышает его полярность, и он выходит с обращённой фазы заметно раньше соответствующего флаванона пиностробина (1) (табл. 1 и 3, рис. 12 и 14).
Отчётливо заметна роль фенольного гидроксила в кольце B: так тектохризин (7) выходит в данных условиях хроматографмрования более чем в 1,4 раза позже гидроксилированного по кольцу B генкванина (8). Интересно что, в отличие от фенольного гидроксила не так велика роль спиртового гидроксила: так флавонол изальпинин (9) выходит с обращённофазного сорбента колонки чуть раньше соответствующего флавона тектохризина (7) (табл. 3, рис. 12-13).
Таким образом, выявлены некоторые закономерности, позволяющие прогнозировать хроматографическое поведение флавоноидов и фенилпропаноидов по известной структуре углеродного скелета и в зависимости от наличия и расположения спиртовых и фенольных гидроксилов, а также метоксигрупп в молекулах фавоноидов и фенилпропаноидов представителей семейства Salicaceae.
Аналогичные результаты получены при ВЭЖХ компонентов почек других видов рода Populus L. Рис. 14. ВЭЖХ-разделение компонентов экстракта прополиса в режимах детектирования при 290 (сплошные линии) и 326 нм (пунктирные линии)
Обозначения пиков на ВЭЖХ с преобладанием компонента вещества: 1 и 2 - неидентифицированные вещества; 3 - кофейная кислота; 4 - феруловая; 5 - апигенин; 6 - кемпферол +коричная кислота; 7 - изопентенилкофеат; 8 - хризин; 9 - пиноцембрин; 10 - галангин; 11 - альпинон+популигенин; 12 - 2',6'-дигидрокси-4'-метоксихалкон; 13 - пиностробин; 14 - тектохризин В градиентном режиме ВЭЖХ удалось поделить экстракт прополиса на 14 основных пиков и идентифицировать вещества представителей семейства Salicaceae L. (рис. 14). Показана перспективность ВЭЖХ для стандартизации сырья прополиса. По химическому составу прополис и почки тополя близки, но у почек - более высокое содержание флавоноидов и фенилпропаноидов, и как следствие - более высокая антимикробная и противогрибковая активность.
6. Методология стандартизации сырья и препаратов растенийсемейства Salicaceae и сырья прополиса
Схожесть химического состава почек тополя и сырья прополиса учтена нами при решении проблем их стандартизации.
Для качественного анализа разработаны методики ТСХ-анализа с использованием соответствующих ГСО. В качестве стандарта при анализе коры и препаратов ивы остролистной нами рекомендовано использовать ГСО изосалипурпозида, а для ивы прутовидной - ГСО триандрина. Для количественного определения методом спектрофотометрии в качестве аналитической длины волны в УФ-спектре целесообразно использовать для ивы остролистной - 290 нм, т.к. максимум поглощения экстракта в этой области УФ-спектра обусловлен вкладом флаванонов (нарингенин и др.); а для ивы прутовидной - 270 нм - поглощение в этой области обусловливают фенилпропаноиды (триандрин и др.) и простые фенолы (салицин и др.). Для качественного и количественного изучения компонентного состава почек различных видов рода тополь и сырья прополиса был использован метод ВЭЖХ. Результаты данных исследований позволили разработать ВЭЖХ-методики стандартизации сырья прополиса и почек тополя, с использованием ГСО пиностробина. С использованием метода ТСХ проанализировано более 30 образцов прополиса, заготовленного в различных регионах РФ и показано, что во всех исследованных образцах содержится пиностробин с величиной Rf, около 0,8 (система растворителей хлороформ - этанол, 9:1). Пиностробин в данной системе растворителей наиболее подвижен и четко определяется на хроматограммах в виде пятна ярко-желтого цвета после проявления диазотированной сульфаниловой кислотой в насыщенном растворе карбоната натрия. При этом на хроматограмме обнаруживаются и другие вещества фенилпропаиоидной и флавоноидной природы с меньшими значениями Rf, которые имеют диагностическое значение в плане происхождения (или типа) прополиса, а их содержание в образцах варьирует. На основании данных исследований разработана ТСХ-методика качественного определения подлинности прополиса с использованием ГСО пиностробина.
Разработана методика спектрофотометрического определения содержания флавоноидов и фенилпропаноидов в прополисе с использованием ГСО пиностробина. Ошибка единичного определения разработанной методики с доверительной вероятностью 95 % составляла ±4,54 %. Содержание флавоноидов и фенилпропаноидов в образцах прополиса колеблется от 7,02 до 40,37 %.
Методом прямой спектрофотометрии с использованием ГСО пиностробина изучена динамика флавоноидов в почках тополя и определены оптимальные сроки заготовки сырья - период покоя, до начала весеннего роста почек.
Разработаны показатели качества и объективные методики анализа для изучаемых видов ЛРС, стандартного образца пиностробина и препаратов с учетом принципа системного подхода и унификации методик анализа с ГСО.
7. Научное обоснование целесообразности использования в медицинской практике препаратов ивы и тополя в качестве источника антимикробных, противогрибковых, адаптогенных лекарственных средств
Исследование нейротропной, адаптогенной активности препаратов проводили на кафедре фармакологии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России имени проф. А.А. Лебедева (зав. кафедрой проф. А.В. Дубищев) в соответствии с методиками, описанными в Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Под ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ОАО Издательство "Медицина", 2005. 832 с.). Антидепрессантную активность оценивали с использованием теста "Отчаяние", психостимулирующую активность препаратов выявляли с помощью теста на снотворную активность ("Тиопеталовый сон").
Эксперименты выполнены в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных". Исследования выполнены на белых беспородных мышах массой 18-25 г и белых беспородных крысах обоего пола массой тела 180-250 г. Все животные были получены из вивария ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России. Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде. Среди фенилпропаноидов, выделенных нами из коры ивы прутовидной, выраженную антидепрессантную активность проявил триандрин. Исследование ноотропной активности с использованием методики выработки условной реакции пассивного избегания (УРПИ) показало, что при введении животным настойки ивы прутовидной и триандрина стимулируется выработка у животных УРПИ и наблюдается более полное сохранение памятного следа (выраженный эффект выработки УРПИ, улучшают показатели долгосрочного запоминания). Кроме того, ярко выражено повышение ориентировочно-исследовательской реакции подопытных животных, получавших экстракт ивы корзиночной.
При применении ивы корзиночной экстракта жидкого выявлено выраженное стимулирующее влияние на ЦНС (в дозе 100 мг/кг сокращается продолжительность сна подопытных животных белых беспородных мышей и крыс обоего пола (на модели тиопенталового сна) с 71,1+14,7 мин до 39,4+14,7 мин, т.е. на 44,6%). В результате изучения нейротропной активности экстракта ивы корзиночной выявлено выраженное антигипногенное и актопротекторное действие (более выраженное повышение работоспособности - повышение длительности первого плавания по сравнению с контролем на 48,1% и выносливости - повышение длительности второго плавания на 49,6%). Для экстракта ивы остролистной получены аналогичные результаты (на 45,5% и 51,4 %). Для фенилпропаноида ивы триандрина (10 мг/кг) соответственно - 49,2% и 35,4%. Выявлено увеличение общей двигательной активности животных под влиянием эктракта коры ивы корзиночной (на 71,3%), а также фенилпропаноидов триандрина (на 61,2%) и сирингина (на 127,8%). Исследование влияния фитопрепаратов на физическую работоспособность и выносливость мышей показало, что экстракт ивы остролистной повышал физическую работоспособность животных. Для процесса адаптации животных, получавших фитопрепарат экстракт ивы остролистной, были характерны следующие особенности: уже в первый день плавания работоспособность в опытной группе была выше, чем в контрольной, оставаясь на высоком уровне в течение всего периода адаптации. Так, работоспособность белых беспородных мышей-самцов (длительность первого принудительного плавания) под влиянием экстракта ивы остролистной увеличивалась на 45,5% по сравнению с контролем: с 96,5±7,1 сек до 140,45,9 сек; несколько более выраженно увеличивалась выносливость (длительность второго плавания увеличивалась на 51,4% по сравнению с контролем: с 68,0±6,4 сек до 103,07,3 сек) относительная разность продолжительности второго и первого плавания (% к суммарной продолжительности двух плаваний) в первые дни адаптации всегда имела положительное значение и превышала уровень этого показателя в контрольных группах. В данных исследованиях обнаружено адаптогенное действие у экстракта ивы остролистной.
В результате микробиологических исследований было выявлено, что настойка почек тополя проявляет наиболее выраженную антимикробную активность в отношении стафилококка и антракоида (312-625 мкг/мл), обусловленную флавоноидами и фенилпропаноидами, аналогично прополису.
Разработаны и запатентованы способы получения настойки тополя, лекарственных фитоплёнок "Топоплен" (ТУ 9362-003-01963143-98), обладающих выраженными противовоспалительными свойствами (Патенты РФ на изобретение № 2135201 "Способ получения настойки тополя для лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей", № 2155071 "Способ получения лекарственной фитопленки" для лечения воспалительных заболеваний слизистой и кожных покровов организма).
В результате проведённых исследований показано, что лекарственные растения, содержащие флавоноиды и фенилпропаноиды, являются перспективным источником антимикробных, противовоспалительных и адаптогенных лекарственных средств.
ВЫВОДЫ
1. Проведено комплексное сравнительное анатомо-морфологическое исследование ЛРС представителей семейства Salicaceae L. (коры ивы прутовидной и ивы остролистной, почек представителей рода Тополь), в результате которого получены цифровые фотографии и выявлены диагностические признаки, для включения в современные разделы соответствующей НД. Полученные данные создают методологическую основу для разработки ОФС на ЛРС "Почки".
2. Сравнительное исследование химического состава ЛРС представителей семейства Ивовых с помощью современных методов анализа и фармакологических свойств препаратов позволило определить, что ведущими группами БАС видов рода Populus L. и Salix L. являются флавоноиды и фенилпропаноиды.
3. В результате сравнительного изучения химического состава почек тополя лавролистного и тополя душистого впервые были выделены и идентифицированы при помощи данных УФ-, ИК-, ЯМР-, масс-спектров и результатов химических превращений 3 вещества относящихся к фенилпропаноидам и 15 веществ - к флавоноидам, причем 7,4'-диметилкемпферол и рамназин - новые соединения для растений рода Populus L., пинобанксин впервые выделен из растений рода Populus L. и семейства Salicaceae, а популигенин (5-гидрокси-3,7-O-диацетилфлаванон) является новым природным соединением.
4. В результате сравнительного исследования коры ивы остролистной и ивы корзиночной выделены и идентифицированы при помощи УФ-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, а также химических превращений 17 веществ, среди которых 7 веществ относятся к флавоноидам, 5 - к фенилпропаноидам и 5 - к простым фенолам. Причём, из коры Salix acutifolia Willd. впервые выделены нарингенин, прунин, катехин, изосалипурпол, сирингин, триандрин, саликортин, тремулацин, ацил-салигенин.
5. Проведено сравнительное физико-химическое исследование флавоноидов и фенилпропаноидов сырья представителей семейства Ивовые, позволившее выявить особенности влияния заместителей и растворителя на спектральные характеристики данных БАС, а также установить, что для большинства флавоноидов почек видов рода Populus L. характерна агликоновая природа и отсутствие заместителей в бензольном кольце B.
6. В условиях обращённо-фазовой ВЭЖХ изучено хроматографическое поведение индивидуальных флавоноидов и фенилпропаноидов. Выявлено что индивидуальные вещества имеют, как правило, меньшее время удерживания, чем в модельных смесях и в составе суммарных извлечений. Установлены особенности влияния заместителей в бензольных кольцах на поведение флавоноидов и фенилпропаноидов в условиях ВЭЖХ. 7. На основе систематизации литературных данных и результатов собственных исследований показана близость химического состава почек тополя и прополиса (характер кривой поглощения УФ-спектров обусловлен в основном флаванонами), и фармакологической активности их препаратов. 8. Разработаны и научно обоснованы новые методологические подходы к стандартизации сырья и препаратов тополя и сырья прополиса, отвечающие параметрам валидации, заключающиеся в определении подлинности и качества почек тополя и прополиса по содержанию флавоноидов и фенилпропаноидов, а также двух диагностических флаванонов -пиностробина и пиноцембрина с помощью методов ТСХ, ВЭЖХ и УФ-спектрофотометрии с использованием ГСО пиностробина.
9. Результаты исследований в динамике онтогенеза представителей рода Тополь позволили выявить максимумы содержания суммы флавоноидов и фенилпропаноидов в почках тополя: осенний (перед периодом зимнего покоя растения) и весенний (до начала расхождения почечных чешуй) и рекомендовать их в качестве сроков заготовки лекарственного сырья. 10. В сравнительном плане изучены физико-химические, спектральные и фармакологические свойства БАС, субстанций и препаратов сырья растений семейства Ивовых и на этой основе разработаны методологические подходы получения лекарственных препаратов, содержащих в качестве целевых БАС флавоноиды и фенилпропаноиды на основе выявления зависимости "химическая структура - физико-химические свойства" и "химическая структура - фармакологическая активность".
11. Разработаны показатели качества и объективные методики анализа для изучаемых видов лекарственного сырья, ГСО пиностробина и лекарственных препаратов с учетом принципа системного подхода и унификации методик анализа с использованием ГСО. Усовершенствован способ получения ГСО пиностробина с повышением выхода на 19,5 % при использовании хлороформа.
12. Научно обоснована целесообразность использования видов семейства Salicaceae L., содержащих флавоноиды и фенилпропаноиды, в качестве источника антимикробных, противовоспалительных и адаптогенных лекарственных средств, на которые разработана нормативная, технологическая и патентная документация, стандартные образцы и лекарственные препараты: "Тополя почки "ангро" (ФСП 42-0329168201), "Тополя настойка" (ФСП 42-0329174701), "Пиностробин-стандартный образец" (ФС 42-0073-01), лабораторно-технологические регламенты, Патенты РФ на изобретение № 2135201, № 2155071.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Куркин, В.А. Определение флавоноидов в прополисе / В.А. Куркин, В.Б. Браславский, Г.Г. Запесочная // Фармация. - 1992. - Т. 41, № 1. - С. 35-39.
2. Куркин, В.А. Исследование экстрактов прополиса и почек тополя бальзамического методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / В.А. Куркин, В.Б. Браславский, Г.Г. Запесочная // Журнал физической химии. - 1994. - Т. 68, № 10. - С. 1816-1818.
3. Куркин, В.А. Флавоноиды почек Populus laurifolia / В.А. Куркин, М.Ф. Сенцов, Г.Г. Запесочная, В.Б. Браславский, В.О. Толкачев // Химия природных соединений. - 1994. - № 6. - С. 831-833.
4. Сенцов, М.Ф. Исследование химического состава почек Populus laurifolia Ledeb. / М.Ф.Сенцов, В.Б.Браславский, В.А.Куркин, Г.Г.Запесочная // Растительные ресурсы. - 1996. - Т.32, вып. 1-2. - С. 100-105.
5. Сенцов, М.Ф. Сравнительное исследование компонентного состава почек некоторых видов Populus L. методом ВЭЖХ / М.Ф. Сенцов, В.Б. Браславский и др. // Растительные ресурсы. - 1997. - Т. 33, вып. 2. - С. 51-56.
6. Запесочная, Г.Г. Фенольные соединения коры Salix acutifolia / Г.Г. Запесочная, В.А. Куркин, В.Б. Браславский, Н.В. Филатова // Химия природных соединенинй. - 2003. - № 4. - С. 263-266.
7. Куркин, В.А. Сравнительная актопротекторная активность фенилпропаноидов и растительных препаратов / В.А. Куркин, А.В. Дубищев, В.Н. Ежков, И.Н. Титова, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, А.В. Куркина, А.И. Бонцевич // Фармация. - 2005. - Т. 53, № 5. - С. 32-34.
8. Куркин, В.А. Влияние фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды, на физическую работоспособность животных / В.А. Куркин, А.В. Дубищев, Г.Г. Запесочная, И.Н. Титова, В.Б. Браславский и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 2006. - Т. 40, № 3. - С. 131-132.
9. Куркин, В.А. Ноотропная активность некоторых фитопрепаратов и фенилпропаноидов / В.А. Куркин, А.В. Дубищев, В.Н. Ежков, И.Н. Титова, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, А.В. Куркина, Ф.Ш. Сатдарова // Растительные ресурсы. - 2007. - Т. 43, вып. 2. - С. 76-88.
10. Браславский, В.Б. Тополь и прополис - перспективные источники лекарственных средств / В.Б. Браславский // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2007. - Т. 2. - С. 152-155.
11. Браславский, В.Б. Стандартизация сырья и препаратов тополя и прополиса / В.Б. Браславский, В.А. Куркин // Фармация. - 2009. - Т. 57, № 4. - С. 53-56.
12. Браславский, В.Б. Динамика суммарного содержания флавоноидов и фенилпропаноидов в почках Populus deltoides и P. balsamifera (Salicaceae) в осеннее-зимний и весенний периоды в условиях г. Самары / В.Б. Браславский // Растительные ресурсы. - 2009. - Т. 45, вып. 3. - С. 85-89.
13. Куркин, В.А. Создание ресурсосберегающих технологий переработки лекарственного растительного сырья / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, О.Е. Правдивцева, В.Б. Браславский и др.// Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2010. - Т. 12, № 1(3) - С. 737-740.
14. Браславский, В.Б. Перспективы использования фитопрепаратов на основе видов рода Populus L. и прополиса / В.Б. Браславский, В.А. Куркин, П.Г. Мизина // Традиционная медицина. - 2010. - № 3 (22). - С. 97-103. 15. Браславский, В.Б. Исследование электронных спектров флавоноидов тополя и прополиса / В.Б. Браславский, В.А. Куркин // Медицинский альманах. - 2011. - № 2 (15). - С. 140-144.
16. Браславский, В.Б. Растения семейства ивовых и прополис - перспективные источники фитопрепаратов / В.Б. Браславский, В.А. Куркин и др. // Традиционная медицина. - 2011. - № 5. - С 159-163.
17. Браславский, В.Б. Перспективы создания импортозамещающих лекарственных растительных препаратов / В.Б. Браславский, В.А. Куркин, Е.В. Авдеева // Традиционная медицина. - 2011. - № 5. - С. 230-232.
18. Браславский, В.Б. Рациональное использование ресурсов растений семейства ивовых и продукта пчеловодства / В.Б. Браславский, В.А. Куркин, Н.В. Браславский, И.Ф. Шаталаев // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011. - Т. 13 (39), № 1 (4). - С. 780-783. 19. Браславский, В.Б. Комплексные фармакогностические исседования растений семейства ивовых и прополиса - источников лекарственных средств / В.Б. Браславский, В.А. Куркин и др. // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011. - Т.13 (39), № 1 (8). - С. 1978-1981.
20. Панин, В.П. Модельные исследования роли оксида азота в канальцевых эффектах фитодиуретиков / В.П. Панин, А.В. Дубищев, М.И. Панина, В.Б. Браславский // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011. - Т.13 (39), № 1 (8). - С. 2026-2030. 21. Kurkin, V.A., Flavonoids of the buds of Populus laurifolia / V.A. Kurkin, M.F. Sentsov, G.G. Zapesochnaya, V.B. Braslavskii and N.O. Tolkachev // Chemistry of Natural Compounds. - 1994. - Vol. 30, No. 6. - P. 778-779.
22. Zapesochnaya, G.G. Phenolic compounds of Salix acutifolia bark / G.G. Zapesochnaya, V.A. Kurkin, V.B. Braslavsky and N.V. Filatova // Chemistry of Natural Compounds. - 2002. - Vol. 38, No. 4. - P. 314-318.
23. Kurkin, V.A. Effect of phytopreparations containing phenylpropanoids on the physical activity of animals / V.A. Kurkin, A.V. Dubishchev, G.G. Zapesochnaya, I.N. Titova and V.B. Braslavskii, et al. // Pharmaceutical Chemistry Journal. - 2006. - Vol. 40, No. 3. - P. 149-150.
24. Браславский, В.Б. Сравнительное исследование химического состава почек некоторых видов рода Populus L. при интродукции / В.Б. Браславский, М.Ф. Сенцов, В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, В.Т. Бакулин, С.А. Розно, А.В. Помогайбин // "Биологическое разнообразие. Интродукция растений": Материалы Международной научной конференции. - С.-Пб., 1995.- С. 143-144.
25. Браславский, В.Б. Растения семейства Salicaceae - перспективный источник новых лекарственных средств / В.Б. Браславский, В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, П.Г. Мизина и др. // V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тезисы докладов. - М., 1998. - С. 351.
26. Браславский, В.Б. Растения семейства Salicaceae - песпективный источник антимикробных и противовоспалительных лекарственных средств/ В.Б. Браславский, В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная и др. // Здоровый образ жизни - системный подход: Тезисы докладов V Всероссийской научно-практической конференции "Экология и здоровье человека". - Самара, 1998. - С. 113-114.
27. Браславский, В.Б. Исследования по разработке новых антимикробных лекарственных препаратов из растений рода Populus L. / В.Б. Браславский, В.А. Куркин, В.Т. Бакулин, Г.Г. Запесочная, О.Е. Правдивцева, И.П. Жданов, П.Г. Мизина // "Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений": материалы международного совещания, посвященного памяти В.Г. Минаевой. - Новосибирск: ЦСБС СО РАН, 1998. - С. 106.
28. Браславский, В.Б. Флавоноиды и фенилпропаноиды - ценные вторичные метаболиты растений рода Populus L. / В.Б. Браславский, В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная и др. // "Физиология растений - наука III тысячелетия": Международная конференция IV Съезд общества физиологов растений России: Тезисы докладов, Т. II. - М., 1999. - С. 537-538.
29. Браславский, В.Б. Перспективы использования лекарственных средств на основе интродуцированных видов рода Populus L. / В.Б. Браславский, В.А. Куркин, В.Т. Бакулин, О.Е. Правдивцева, П.Г. Мизина, И.П. Жданов // "Биологическое разнообразие. Интродукция растений": материалы второй Международной научной конференции. - С.-Пб., 1999. - С. 110-111.
30. Браславский, В.Б. Растения семейства ивовых (Salicaceae) - источник получения новых высокоэффективных отечественных лекарственных средств / В.Б. Браславский // "Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики": материалы научно-практической конференции, посвященной 35-летию фармацевтического факультета. - Курск, 2001. - С. 196-198.
31. Браславский, В.Б. Перспективы использования антибактериальных растительных средств в медицинской практике / В.Б. Браславский, О.Е. Правдивцева, А.В. Куркина и др. // X Всероссийский конгресс "Экология и здоровье человека": Тезисы докладов. - Самара, 2005. - С. 42-43.
32. Браславский, В.Б., Сравнительные исследования видов Salicaceae и прополиса - перспективных источников антимикробных и противовоспалительных лекарственных средств / В.Б. Браславский, В.А. Куркин, Н.В. Браславский и др. // XI Всероссийский конгресс "Экология и здоровье человека": Тезисы докладов. - Самара, 2006. - С. 41-45.
33. Дубищев, А.В. Антигипногенная и ноотропная активность фитопрепаратов-адаптогенов, содержащих фенилпропаноиды / А.В. Дубищев, И.Н. Титова, В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, В.Б. Браславский, Е.С. Петрова, И.Ю. Климова // "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции": материалы 58-й межрегиональной конференции по фармации и фармакологии: сборник научных трудов (Пятигорская государственная фармацевтическая академия). - Пятигорск, 2003. - С. 290 -292.
34. Егоров, В.А. Пути рационального использования новых лекарственных растений семейства Salicaceae / В.А. Егоров, В.Б. Браславский, В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, В.Т. Бакулин и др. // VI Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тезисы докладов. - М., 1999. - С. 405.
35. Запесочная, Г.Г. Флавоноиды как гепатопротекторы и антиоксиданты / Г.Г. Запесочная, В.А. Куркин, А.А. Лебедев, В.Б. Браславский, Е.В. Авдеева и др. // IX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тезисы докладов. - М., 2002. - С. 164. 36. Куркин, В.А. Проблема стандартизации прополиса / В.А. Куркин, В.Б. Браславский, Г.Г. Запесочная // "Состояние и перспективы развития фармации в Сибири и на Дальнем Востоке": Тезисы докладов научно-практической конференции, посвященной 50-летию фармацевтического факультета. - Томск, 1991. - Ч. 1. - С. 149-150. 37. Куркин, В.А. Фитохимическое исследование лекарственных растений родов родиола, тополь, ива, расторопша, одуванчик, содержащих флавоноиды/ В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, М.Ф. Сенцов, И.Б. Смольякова// "Современные аспекты изучения лекарственных растений": научные труды НИИ фармации. - М., 1995. - Т. ХХХIV. - С. 151-157.
38. Куркин, В.А. Перспективы использования растительного сырья, содержащего флавоноиды, в качестве антимикробных и противовоспалительных лекарственных средств/ В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, М.Ф. Сенцов, В.Б. Браславский, И.Б. Смольякова // "Человек и лекарство": Тезисы докладов II Российского национального конгресса. - М., 1995. - С. 238. 39. Куркин, В.А. Проблемы стандартизации сырья некоторых видов лекарственных растений, содержащих флавоноиды/ В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, М.Ф. Сенцов, В.Б. Браславский, И.Б. Смольякова, Н.С. Цыбулько // "Актуальные проблемы фармацевтической химии": Научные труды НИИ фармации. - М., 1996. - Т. XXXV. - С. 164-174. 40. Куркин, В.А. Растения семейства ивовых - перспективный источник новых антимикробных, противовоспалительных и тонизирующих лекарственных средств / В.А. Куркин, В.Б. Браславский, Г.Г. Запесочная и др. // "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности": материалы международной научной конференции. - Томск, 2000. - С. 42-43.
41. Куркин, В.А. Флавоноиды как государственные стандартные образцы и их значение для целей стандартизации сырья и препаратов / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, А.А. Лебедев, В.Н. Ежков, Г.В. Симонова, В.Б. Браславский и др. // X Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тезисы докладов. - М., 2003. - С. 728.
42. Куркин, В.А. Флавоноиды как стандартные вещества растений / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский и др. // VI симпозиум по фенольным соединениям: Тезисы докладов международной конференции. - М., 2004. - С. 101.
43. Куркин, В.А. Современные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, В.Б. Браславский и др. // II Всероссийский съезд фармацевтических работников: Материалы съезда. - М., 2005. - С. 95-96.
44. Куркин, В.А. Актуальные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский и др. // XIV Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тезисы докладов. - М., 2007. - С. 839.
45. Куркин, В.А. Подходы к стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды и фенилпропаноиды / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский и др. // XV Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тезисы докладов. - М., 2008. - С. 545-546.
46. Куркин, В.А. Актуальные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего фенольные соединения / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский и др. // Тезисы докладов XVI Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - М., 2009. - С. 690.
47. Куркин, В.А. Флавоноиды и фенилпропаноиды как биологически активные соединения лекарственных растений (пленарное сообщение) / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский и др. // Материалы конференции: "Актуальные проблемы химии природных соединений". - Ташкент, 2010. - С. 8.
48. Куркин, В.А. Перспективы создания и внедрения импортозамещающих лекарственных растительных средств / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский и др. // XVIII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": тезисы докладов. - М., 2011. - С. 507.
49. Куркин, В.А. Перспективы создания импортозамещающих нейротропных, иммуномодулирующих, антиоксидантных и гепатопротекторных фитопрепаратов / В.А. Куркин, А.В. Дубищев, Е.В. Авдеева, О.Л. Кулагин, В.Б. Браславский и др. // II Съезд натуротерапевтов России: Материалы научных трудов. - М., 2011. - С. 23-24.
50. Мизина, П.Г. Лекарственные фитопленки как экопротекторы / П.Г. Мизина, В.А. Куркин, В.Б. Браславский, Е.В. Авдеева, М.Ф. Сенцов // "Экология и здоровье человека": Тезисы докладов 2-ой Международной научно-практической конференции. - Самара, 1995. - С. 67.
51. Мизина, П.Г. Лекарственные фитопленки как профилактическое и лечебное средство / П.Г. Мизина, В.А. Куркин, Н.П. Гурина, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, В.Н. Ежков, О.И. Авдеева // "Экология и здоровье человека": Тезисы докладов IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Самара, 1997. - С. 198-199.
52. Мизина, П.Г. Исследование эффективности лекарственных пленок в модельном опыте in vivo / П.Г. Мизина, С.М. Бабкин, В.А. Куркин, В.Б. Браславский // Материалы научн. конф. "Моделирование и прогнозирование заболеваний, процессов и объектов". - Самара, 1998. - С. 73-75.
53. Патент РФ № 2135201, на изобретение "Способ получения настойки тополя для лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей" / Куркин В.А., Браславский В.Б., Запесочная Г.Г., Правдивцева О.Е., Жданов И.П., Косякин В.А., Ткаченко А.А. - А 61 К 35/78. Бюл. №3 от 27.08.1998 г. - 6 с.
54. Патент РФ № 2155071 на изобретение "Способ получения лекарственной фитопленки" / Мизина П.Г., Куркин В.А., Косарев В.В., Авдеева О.И., Авдеева Е.В., Браславский В.Б., Старостенко А.Г., Правдивцева О.Е. - А 61 К 47/34, А 61 К35/78, Бюл. № 24 от 27.08.2000 г. - 4 с.
55. ФС 42-0073-01. "Пиностробин - стандартный образец (5-Гидрокси-7-метокси-2-фенилхроман-4-он)". - М.: Фармакопейный государственный комитет МЗРФ, 2001. - 5 с. 56. ФСП 42-0329168201. "Тополя почки, "ангро"". - М., МЗРФ, 2001. - 12 с.
57. ФСП 42-0329174701. "Тополя настойка". - М., МЗРФ, 2001. - 5 с.
58. Braslavsky, V.B. The flavonoids and phenylpropanoids of Salicaceae / Braslavsky V.B., Kurkin V.A., Zapesochnaya G.G., Bakulin V.T., Zhdanov I.P., Pravdivtseva O.E. and Yunes Mustafa // XXI International Conference on Polyphenols "Polyphenols communication 2002": Abstracts. - Marrakech-Morocco, 2002. - P. 485-486.
59. Kurkin, V.A. The new possibilities in the standardization of the some medicinal plants containing the flavonoids / Kurkin V.A., Zapesochnaya G.G., Avdeeva E.V., Braslavsky V.B., Pravdivtseva O.E., et al // XXII International Conference on Polyphenols "Polyphenols communication 2004": Abstracts. - Helsinki-Finland, 2004. - P. 621-622. 60. Kurkin, V.A. Phytochemical and pharmacological investigation of medicinal plants containing flavonoids / Kurkin V.A., Dubishchev A.V., Kulagin O.L., Avdeeva E.V., Braslavsky V.B., Pravdivtseva O.E., Kurkina A.V., et al // XXIII International Conference on Polyphenols "Polyphenols communication 2006": Abstracts. - Winnipeg, Manitoba, Canada, 2006. - P. 513-514.
61. Kurkin, V.A. The new methodological approaches to the standardization of the some medicinal plants containing the flavonoids and phenylpropanoids / V.A. Kurkin, E.V. Avdeeva, V.B. Braslavsky, O.E. Pravdivtseva, A.V. Kurkina, et al. // XXIV International Conference on Polyphenols communications "Polyphenols communication 2008". - Salamanca, 2008. - P. 185-186.
2
Документ
Категория
Фармацевтические науки
Просмотров
643
Размер файла
22 566 Кб
Теги
Докторская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа