close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Полиреактивность иммуноглобулинов молока человека как результат обмена их структурными компонентами

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Седых Сергей Евгеньевич Шифр научной специальности: 03.01.04 - биохимия Шифр диссертационного совета: Д 003.045.01 Название организации: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Адрес организации: 630090, проспе
На правах рукописи
СЕДЫХ СЕРГЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ
ПОЛИРЕАКТИВНОСТЬ
ИММУНОГЛОБУЛИНОВ МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА
КАК РЕЗУЛЬТАТ ОБМЕНА
ИХ СТРУКТУРНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ
03.01.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Новосибирск – 2012
Работа выполнена в Институте химической биологии и
фундаментальной медицины СО РАН
Научный руководитель:
д.х.н., профессор Невинский Георгий Александрович
Официальные оппоненты:
Таранин Александр Владимирович, д.б.н.
Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН,
зав. лабораторией
Попова Нэлли Александровна, к.б.н., доцент
Институт цитологии и генетики СО РАН, с.н.с.
Ведущая организация:
Институт клинической иммунологии СО РАМН
Защита состоится «
»
2012 г. в
часов
на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Институт химической
биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090
Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального
государственного бюджетного учреждении науки Институт химической
биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Автореферат разослан «
»
Учѐный секретарь диссертационного совета
к.х.н., доцент
2012 г.
Коваль В. В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Полиреактивность иммуноглобулинов является
широко известным явлением, характерным как для естественных, так и для
искусственно полученных антител. Многие моноклональные антитела при
исследовании с неродственными антигенами оказываются олиго- и даже
полиспецифичными. Описано несколько механизмов полиреактивности
иммуноглобулинов – лабильность антигенсвязывающих центров, образование димеров в случае смесей антител, полученных от тысяч доноров,
действие факторов, дестабилизирующих белки, и обмен IgG4 HLфрагментами. Получение биспецифичных моноклональных терапевтических
иммуноглобулинов является актуальной задачей молекулярной иммунологии. Полиреактивность также описана и для искусственно полученного
мультикаталитического антитела, гидролизующего ДНК, РНК и казеин.
Полиреактивность природных абзимов к настоящему времени изучена
недостаточно. Молоко человека представляет собой уникальный источник
каталитически активных антител (абзимов), которые гидролизуют
разнообразные субстраты и обладают уникальными синтетическими
активностями.
Целью настоящей работы было изучение природы полифункциональности
иммуноглобулинов классов G и A молока человека. Для достижения данной
цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Исследовать каталитические активности IgG и sIgA молока человека,
обладающих различным сродством к ДНК, АТР, казеину, липидам молока, а
также различной гидрофобностью, в гидролизе ДНК, олигосахаридов, АТР,
фосфорилировании казеина и прочно связанных с иммуноглобулинами
липидов и олигосахаридов.
2. Выяснить, присутствуют ли в молоке человека каталитически активные
IgG и sIgA, содержащие не только легкие цепи одного типа (лямбда или
каппа), но и химерные иммуноглобулины (Ig), содержащие одновременно
легкие цепи двух типов. Выяснить возможность обмена HL-фрагментами
(половинами молекул) среди подклассов IgG (IgG1–IgG4).
1
3. Исследовать in vitro возможность обмена HL-фрагментами или другими
структурными компонентами между различными молекулами IgG, а также
между молекулами sIgA молока человека.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые
показана каталитическая полифункциональность Ig молока человека,
обладающих высоким сродством к ДНК, АТР, казеину и липидам молока,
активных гидролизе ДНК, АТР, олигосахаридов, фосфорилировании казеина,
липидов и олигосахаридов. Впервые показано, что в молоке человека
существуют химерные АТ, содержащие одновременно легкие цепи типа
каппа (κ) и лямбда (λ), причем такие IgG представлены всеми подклассами
(IgG1–IgG4). Показано, что в присутствии плазмы молока, лишенной АТ и
восстановленного глютатиона (GSH) IgG молока обмениваются HLфрагментами, a sIgA HL- и/или (HL)2-компонентами, но не свободными
легкими (L) или тяжелыми (H) цепями.
и апробация работы. По материалам диссертации
опубликовано 4 печатные работы. Результаты были представлены на
конференциях – «Студент и научно-технический прогресс» (НГУ,
Новосибирск, 2007, 2008, 2010), XII Всероссийская медико-биологическая
конференция «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (СанктПетербург, 2009), «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск,
2009), «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2010).
Публикации
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения,
выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 116
страницах, содержит 31 рисунок, 1 таблицу. Библиография включает 290
литературных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Выделение иммуноглобулинов. Препараты иммуноглобулинов класса А
и G были выделены из молока здоровых по медицинским показаниям
доноров на сорбентах protein A- и protein G-Sepharose (в отличие от
антигенов белки A и G специфически взаимодействуют с Fс фрагментами Ig).
После нанесения антител (АТ) для разрушения неспецифических комплексов
2
колонку промывали 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, содержащим 0,2 % Тритон Х-100
и 0,3 NaCl. Затем колонку промывали TBS и элюировали АТ 0,1 М Gly-HCl
pH 2,6. Далее АТ были дополнительно очищены ионообменной
хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрацией на Superdex 200
(для разрушения неспецифических комплексов АТ перед гель-фильтрацией
инкубировали с 2 М МgCl2). Ранее было показано, что выделение АТ с
помощью использованной методики приводит к получению препаратов, не
содержащих примесей каких-либо канонических белков или ферментов
(Kanyshkova et al., 1997; Odinsova et al., 2005, 2011), что подтверждено в
настоящем исследовании. Выделенные препараты АТ были гомогенны по
данным SDS-электрофореза в полиакриламидном геле при окраске серебром
и иммуноблоттинге. С помощью тестирования ДНКазной активности in situ в
геле, содержащем сополимеризованную ДНК, а также анализа других
активностей, соответствующих фрагментам геля после SDS-электрофореза
было показано, что все исследованные активности являются собственным
свойством IgG и sIgA.
2. Разделение иммуноглобулинов на аффинных сорбентах. Ранее было
показано, что реакции гидролиза ДНК, АТР, олигосахаридов, а также
фосфорилирования казеина и прочно связанных с АТ липидов и
олигосахаридов катализируют не только интактные IgG и sIgA молока
человека, но также изолированные легкие цепи или, по крайней мере, их
изолированные HL-фрагменты (диссертац. работы: Кит, Ю. Я., 1996;
Канышкова Т. Г., 1999; Семенов, Д. В., 1998; Каратаева, Н. А., 2007). Кроме
того в этих работах было показано, что способностью связываться с
субстратом и каталитической активностью обладают Fab и/или Fab2 IgG и
sIgA. Эти данные свидетельствуют о том, что основную роль в
комплексообразовании и катализе играют активные центры таких абзимов,
сформированные их вариабельными участками легких и тяжелых цепей. При
этом активный центр почти всегда расположен на легкой цепи (в случае sIgA
с АТРазной активностью на стыке Н- и L-цепей), а тяжелая цепь в большей
степени важна для увеличения сродства АТ к субстрату. Таким образом,
очевидно, что связывание абзимов с различными аффинными сорбентами
обусловлено взаимодействием иммобилизованных субстратов с активными
центрами вариабельных участков АТ.
3
IgG и sIgA последовательно разделяли аффинной хроматографией на
сорбентах, содержащих иммобилизованные ДНК, аналог АТР, казеин и
липиды. Фракцию антител, обладающих сродством к ДНК-целлюлозе,
наносили на АТР-сефарозу (рис. 1А). Затем фракцию, обладающую высоким
сродством к ДНК и АТР (рис. 1Б), наносили на казеин-сефарозу, а фракцию,
обладающую высоким сродством к этим трем лигандам (рис. 1В) наносили
на сорбент, содержащий липиды молока. Далее в работе анализировали
каталитические активности фракций IgG и sIgA, отличающихся по сродству к
ДНК, АТР, казеину и липидам молока.
Рис. 1. Профили последовательных аффинных хроматографий IgG. А – хроматография на ДНК-целлюлозе. Б – хроматография IgG, обладающих высоким сродством к
ДНК-целлюлозе, на АТР-сефарозе. В – хроматография IgG, обладающих высоким
сродством к ДНК-целлюлозе и АТР-сефарозе, на казеин-сефарозе. Г – хроматография
IgG, обладающих высоким сродством к трем предыдущим на сорбенте, содержащем
липиды.
– помечены фракции, обладающие высоким сродством к аффинному
сорбенту, элюированные 3 М NaCl и 3 М MgCl2; (▬) – оптическая плотность (А280).
3. Анализ каталитических активностей абзимов. Каталитическая
полиреактивность. При последовательной хроматографии IgG на ДНК-
целлюлозе, АТР-, казеин-сефарозе и сорбенте, содержащем липиды, не
удалось получить фракции АТ, обладающие только одной из шести
исследованных активностей. Все полученные фракции, отличающиеся
сродством к аффинным сорбентам, обладали всеми исследованными
4
каталитическими активностями (гидролиз ДНК, АТР, олигосахарида,
фосфорилирование казеина, липидов и олигосахаридов молока человека,
прочно связанных с антителами). Следует отметить, что высокие уровни
активностей проявляли фракции, обладающие высоким сродством ко всем
аффинным сорбентам, элюированные в условиях разрушения прочных
иммунных комплексов (3 М NaCl, 3M MgCl2) (рис. 2–рис. 4).
Рис. 2. Профили относительных каталитических активностей IgG, последовательно
разделенных на ДНК-целлюлозе (А), АТР-сефарозе (Б), казеин-сефарозе (В), липидсорбенте (Г). (▬) – оптическая плотность (А280), УА – относительная удельная
активность, (▲) – гидролиз плазмидной ДНК, (■) – фосфорилирование липидов, (■) –
фосфорилирование казеина.
sIgA молока также последовательно разделяли по сродству к ДНК, АТР,
казеину и липидам, были получены фракции антител, обладающие высоким и
низким сродством к сорбентам. Высоким сродством к ДНК-, АТР-, казеин- и
липид-сорбенту обладали соответственно 52%, 21%, 12%, 4% от общего
количества АТ, нанесенных на первый сорбент – ДНК-целлюлозу. Во всех
случаях фракции, обладающие высоким сродством к любому из этих
сорбентов (элюция 3М NaCl и MgCl2) проявляли все исследованные
каталитические активности (рис. 3).
5
Рис. 3. Профили относительных каталитических активностей sIgA, последовательно
разделенных на ДНК-целлюлозе (А), АТР-сефарозе (Б), казеин-сефарозе (В) и липидсорбенте (Г). (▬) – оптическая плотность (А280), УА – относительная удельная
активность, (▲) – гидролиз плазмидной ДНК, (■) – фосфорилирование липидов (■) –
фосфорилирование казеина.
В другой серии экспериментов АТ выделяли из эквимолярной смеси АТ
молока пяти доноров и затем независимо наносили на ДНК-целлюлозу и
АТР-сефарозу (рис. 4). Анализировали каталитические активности
полученных фракций: антитела, обладающие высоким сродством к ДНК,
гидролизовали не только ДНК, но и другие субстраты (рис. 4А, Б). АТ,
обладающие высоким сродством к АТР, также катализировали все изученные
реакции (рис. 4В, Г). Подобные результаты получены и при
последовательном разделении иммуноглобулинов по гидрофобности на
фенил-сефарозе, а затем на ДНК целлюлозе.
Известно, что канонические ферменты и моноклональные АТ могут
взаимодействовать с неспецифическими лигандами, но обычно сродство к
специфическим лигандам на 1–3 порядка выше, чем к неспецифическим.
Слабое неспецифическое взаимодействие ферментов (и некоторых
моноклональных АТ) с чужеродными лигандами является достаточно
широко распространенным явлением, однако в литературе пока нет данных о
ДНКазах (или о других ферментах), способных с заметной эффективностью
катализировать превращение чужеродных субстратов.
6
Рис. 4 . Профили относительных каталитических активностей IgG (А, В) и sIgA (Б,
Г), разделенных аффинной хроматографией на ДНК-целлюлозе (А, Б) и АТР-сефарозе
(В, Г). (▬) – оптическая плотность (А280), (– –) – концентрация NaCl, УА – относительная
удельная активность, (▲) – гидролиз плазмидной ДНК, (♦) – гидролиз олигосахарида, (●)
– гидролиз АТР, (■) – фосфорилирование липидов, (□) – фосфорилирование
олигосахаридов.
Исходя из современных представлений о моновалентности АТ и данных о
более низком сродстве АТ к чужеродным лигандам, а также катализе
ферментами только одной реакции, следовало ожидать, что для каждого из
использованных аффинных сорбентов фракции, элюируемые в условиях
разрушения прочных иммунных комплексов (3М NaCl и MgCl2), будут
содержать АТ только к одному – конкретному иммобилизованному антигену
и катализировать только одну из реакций. Однако получить фракции,
катализирующие только одну реакцию не удалось; все фракции, элюированные с сорбентов при последовательных хроматографиях в условиях
разрушения прочных иммунных комплексов обладали шестью каталитическими активностями: гидролиз ДНК, АТР, олигосахаридов, а также
фосфорилирование казеина, липидов и олигосахаридов.
Полученные результаты невозможно объяснить на основе классических
представлений о природе полиспецифичности моновалентных АТ. Согласно
литературным данным, полиспецифичность связывания может быть
обусловлена конформационной лабильностью антигенсвязывающего центра
(Notkins, A. L., 2004). Кроме того, разные антигены могут быть связаны
7
разными участками одного антигенсвязывающего центра (Edwards, B. D. et
al., 2003). Нельзя исключить возможность некоторых «особых» молекул АТ
связывать с сопоставимым сродством специфический антиген и один (или
даже два) неспецифических антигена. Возможно, высокое сродство
некоторых IgG и sIgA молока ко всем использованным аффинным сорбентам
обусловлено именно этими механизмами полиреактивности связывания.
Однако данные механизмы полиспецифичности не могут объяснить, каким
образом в активном центре каталитически полиреактивного монофункционального антитела могут появиться нескольких наборов аминокислотных
остатков, катализирующих шесть различных химических реакций, которые в
случае канонических ферментов соответствуют шести разным ферментам.
Одним из возможных объяснений полученных результатов может быть
то, что некоторые фракции АТ действительно взаимодействуют с высоким
сродством со специфическим и неспецифическими сорбентами за счет
полиреактивности связывания. В то же время некоторые фракции АТ,
обладающие высоким сродством к различным аффинным сорбентам и
проявляющие каталитические активности в отношении шести неродственных
субстратов, могут быть биспецифичными – содержать одновременно два
разных антигенсвязывающих каталитических центра – один со сродством к
одному из субстратов, а другой – ко второму субстрату. Образование
биспецифичных АТ может происходить в результате обмена HLфрагментами между молекулами различных АТ, что может привести к
образованию большого числа самых разных вариантов химерных
иммуноглобулинов. Таким образом, в работе впервые показана
каталитическая полиреактивность АТ молока человека, которая может быть
следствием наличия в составе одной молекулы IgG и sIgA как минимум двух
разных антигенсвязывающих центров.
4. Иммуноглобулины, содержащие легкие цепи различных типов.
Известно, что все классы иммуноглобулинов содержат легкие цепи только
двух типов (κ и λ). Иммуноглобулины класса G и А молока человека сначала
разделяли на сорбентах (в условиях недостатка сорбента), содержащих АТ
против легких цепей – анти-κ-L- и анти-λ-L-сефарозе (рис. 5А и В). Затем
фракцию АТ со сродством к анти-κ-L-сефарозе подвергали хроматографии
анти-λ-L-сефарозе, а IgG со сродством к анти-λ-L-сефарозе- хроматографии
анти-κ-L-сефарозе (рис. 5Б и Г). В обоих случаях повторная хроматография
8
приводила к получению фракции химерных κλ-IgG, имеющих сродство к
обоим сорбентам (рис. 5Б и Г). При повторной хроматографии чистых
препаратов κ-IgG и λ-IgG (после удаления химерных κλ-IgG) соответственно
на анти-κ-L-сефарозе и анти-λ-L-сефарозе достоверно определяемых
количеств АТ, элюируемых кислым буфером не обнаружено (рис. 6А, Б). В
то же время, химерные IgG элюировались кислым буфером как с анти-λ-L-,
так и анти-κ-L-сефарозы (рис. 6В, Г). Эти данные свидетельствовали в пользу
обмена HL-фрагментами между κ-IgG и λ-IgG.
Рис. 5. Профили аффинных хроматографий IgG (А, Б) и sIgA (В, Г) на сорбентах,
содержащих иммобилизованные антитела против легких цепей разных типов. А, В –
хроматография на анти-κ-L-сефарозе. Б, Г – хроматография на анти-λ-L-сефарозе
антител, обладающих сродством к анти-κ-L-сефарозе (пики 2, 4). (▬) – оптическая
плотность (А280).
Чтобы исключить такой обмен в процессе выделения АТ из молока
смешивали κ-IgG и λ-IgG (лишенные химерных κλ-IgG) и после инкубации
(24 ч) смеси провели выделение АТ согласно стандартной методике.
Полученные препараты IgG были использованы для выделения κ- и λ-IgG на
9
анти-λ-L-сефарозе и анти-κ-L-сефарозе соответственно. При последующей
рехроматографии очищенных κ- и λ-IgG соответственно на анти-κ-Lсефарозе и анти-λ-L-сефарозе химерных κλ-IgG, элюируемых кислым
буфером обнаружено не было. Аналогичный результат был получен в случае
такого же анализа смеси чистых κ- и λ-sIgA. Это свидетельствовало, как об
отсутствии заметного обмена в процессе стандартного выделения IgG и sIgA,
так и о связывании в использованных условиях c анти-κ-L-сефарозой только
κ-Ig, а c анти-λ-L-сефарозoй – только λ-Ig. Отсутствие в препаратах λ-Ig (и
κ-Ig) заметных примесей κ-Ig (и λ-Ig) или химерных κλ-Ig было также
показано с помощью вестерн-блот.
Рис. 6. Профили аффинных хроматографий λ-IgG (А), κ-IgG (Б) и κλ-Ig (В, Г) на
анти-κ-L-сефарозе (А, В) и анти-λ-L-сефарозе (Б, Г). (▬) – оптическая плотность (А280).
Отношение относительных каталитических активностей в катализе пяти
различных реакций было различным для IgG и sIgA, содержащих легкие цепи
только κ- или λ-типа, а также κλ-Ig (рис. 7).
10
Рис. 7. Относительные активности АТ, содержащих легкие цепи разных типов: уу –
гидролиз плазмидной ДНК, уу – гидролиз олигосахарида, уу – гидролиз АТР, уу –
фосфорилирование липидов, уу – фосфорилирование олигосахаридов.
5. Иммуноферментный анализ (ИФА). Препараты κ-, λ- и κλ-(IgG и sIgA)
анализировали с помощью прямого и сэндвич-ИФА, используя конъюгаты
моноклональных антител анти-L-κ и анти-L-λ с пероксидазой хрена (HRP).
При прямом анализе κ-IgG давали положительный ответ только на анти-L-κHRP конъюгаты, а λ-IgG – только на анти-L-λ-HRP. Химерные κλ-IgG давали
положительный ответ при использовании обоих конъюгатов (рис. 8А, Б).
Аналогичные результаты были получены и в случае κ-, λ- и κλ-sIgA (рис.
8В, Г).
При сэндвич-ИФА в лунку планшета сначала вносили первичные
антитела против легких цепей, затем анализируемые иммуноглобулины, а
затем различные конъюгаты. В комбинациях анти-L-λ-первичные АТ и
конъюгаты анти-L-κ-HRP, а также анти-L-κ-первичные АТ и конъюгаты
анти-L-λ-HRP положительный ответ давали только химерные κλ-IgG. В
комбинациях, когда и первичные АТ и конъюгаты были анти-L-κ или анти-Lλ, положительный ответ давали соответственно только κ-IgG и λ-IgG (рис. 9).
Положительный ответ в случае соответствующих комбинаций первичных
антител и конъюгатов наблюдается при концентрации порядка 0,5 мкг/мл АТ
и он отсутствует в контрольных экспериментах при использовании АТ в
концентрации 40 мкг/мл (рис. 7). Следовательно, если κ-АТ и содержат
примесь λ-АТ и наоборот, то количество примеси составляет менее 1%.
На основании данных, полученных при хроматографии АТ на анти-L-κили анти-L-λ-сефарозе и ИФА было оценено относительное содержание κ-, λ11
и κλ-Ig в суммарных препаратах IgG и sIgA антител (средние значения для
АТ из молока пяти доноров): 33 ± 5% κ-IgG, 13 ± 5% λ-IgG и 54 ± 10% κλIgG; 48±7% κ-sIgA, 35±5% λ-sIgA и 17±4 % κλ-sIgA.
Рис. 8. Прямой ИФА препаратов IgG (А, Б) и sIgA (В, Г), содержащих легкие цепи
типа λ (■), типа κ (▲), типа κ и типа λ (▬▬). Конъюгаты против легких цепей κ (А, В) и λ
(Б, Г). ▬ ▬ – контроль.
Рис. 9. Сэндвич-ИФА IgG, содержащих легкие цепи различных типов. А – первичные
антитела анти-λ, конъюгат – анти-κ. Б – первичные антитела – анти-κ, конъюгат – анти-λ.
■ – IgG, содержащие легкие цепи типа λ, ▲ – IgG, содержащие легкие цепи типа κ,
▬▬ – IgG, содержащие легкие цепи типа κ и типа λ, ▬ ▬ – контроль.
12
В литературе описан обмен НL-фрагментами, который in vivo и in vtiro
приводит к биспецифичности только IgG4. C помощью прямого ИФА было
оценено относительное содержание IgG четырех подклассов (IgG1–IgG4).
Согласно полученным данным химерные κλ-IgG содержали HL-фрагменты
всех четырех подклассов, причем распределение по подклассам примерно
соответствовало распределению четырех подклассов тяжелых цепей в крови
человека (рис. 10).
Рис. 10. Относительное содержание подклассов IgG в препаратах, содержащих
легкие цепи разных типов при помощи прямого ИФА. уу – IgG1, уу – IgG2, уу – IgG3, уу –
IgG4.
Таким образом, в работе впервые показано, что препараты IgG и sIgA
молока человека, представлены антителами, содержащими в своем составе
легкие цепи типа κ, λ, а также κλ-Ig, при этом κλ-IgG представлены всеми
подклассами.
6.
Обмен
иммуноглобулинов
молока
человека
HL-фрагментами.
В работах, посвященных обмену IgG4, иммуноглобулины обменивались HLфрагментами in vitro в присутствии восстановленного глютатиона и лизата
клеток крови (Kolfschoten et al., Science, 2007). В настоящей работе проведен
анализ обмена различными структурными компонентами IgG и sIgA человека
(эквимолярные смеси АТ от пяти доноров) in vitro в различных условиях.
Сначала были получены фракции немодифицированных АТ,
отличающиеся по сродству к ДНК-целлюлозе, а затем фракции АТ, модифицированных радиоактивным фосфором и флюоресцеинизотиоцианатом
(FITC) с помощью аффинной хроматографии на ДНК-целлюлозе (рис. 11).
Фракции, отличающиеся по сродству к ДНК, элюировали ступенчатым
13
градиентом NaCl. В случае sIgA-FITC также была использована 8 М
мочевина.
Рис. 11. Профили аффинных хроматографий IgG (А, Б) и sIgA (В),
модифицированных FITC (А, В) и 32Р (Б) на ДНК-целлюлозе. ▬▬ – профиль
хроматографии модифицированных Ig (А280), ▬▬ – профиль хроматографии
немодифицированных AT (А280), – относительная радиоактивность (флюоресценция).
Немодифицированные IgG (или sIgA) инкубировали с соответствующими
модифицированными АТ в различных условиях, затем смеси диализовали
против буфера, содержащего окисленный глутатион и подвергали
хроматографии на ДНК-целлюлозе. После инкубации немодифицированных
IgG, элюированных с ДНК-целлюлозы 0,15 M NaCl (0,15М-IgG), с [32P]IgG,
элюированными 0,6 M NaCl (0,6М-IgG) в присутствии только TBS, а также
этого буфера, содержащего только GSH или плазму молока, лишенную
жиров, липидов и АТ, образования меченых АТ с низким сродством к
сорбенту не происходило (рис. 12), также не наблюдали образования АТ с
более высоким сродством при инкубации 0,15M-[32P]IgG с 0,6M-IgG.
После инкубации 0,15M-IgG и 0,6M-[32P]IgG (рис. 13Г) или 0,15M[ P]IgG и 0,6M-IgG (рис. 13В) в присутствии одновременно плазмы молока и
GSH, примерно 31 ± 2% и 41 ± 3% общей 32P-метки переходило в пик
исходно нерадиоактивного IgG. Аналогичные результаты были получены
32
14
после инкубации в указанных условиях интакного IgG с IgG-FITC. Только
при одновременном присутствии плазмы и GSH в зависимости от
использованных комбинаций АТ наблюдалось изменение сродства к ДНКцеллюлозе 25–60 % IgG-FITC (рис. 13А, Б).
Рис. 12 Профили аффинных хроматографий на ДНК-целлюлозе смесей
немодифицированных и модифицированных IgG с помощью 32Р после инкубации в
различных условиях. А – смесь содержала 0,6М-[32P]IgG (рис. 11Б), 0,15М-IgG, GSH и не
содержала плазмы молока. Б – смесь содержала 0,6М-[32P]IgG (рис. 11Б), 0,15М-IgG,
плазму молока, но не содержала GSH. ▬▬ – профиль оптической плотности при
повторной хроматографии на ДНК-целлюлозе,
– относительная радиоактивность
(cpm).
Как и в случае IgG, обмен структурными компонентами между sIgA –
sIgA-FITC в присутствии TBS, а также буфера содержащего только GSH или
плазму молока не наблюдали (рис. 14Б). После инкубации 0,6M-sIgA с sIgAFITC, элюированными 8 М мочевиной, в присутствии плазмы и GSH
примерно 14 ± 3% флюоресцентной метки перешло во фракции sIgA,
элюированные 0,6, 1,5 и 3 M NaCl (рис. 14А). При смешивании 0,15M-sIgA и
0,6M-sIgA-FITC примерно 16±4% флюоресцентной метки было обнаружено в
пике АТ, элюированных 0,15 M NaCl.
Таким образом, переход радиоактивной (флюоресцентной) метки при
хроматографии реакционных смесей на ДНК-целлюлозе во фракции с
большим (или меньшим) сродством только после инкубации при
одновременном присутствии GSH и плазмы молока указывает в пользу
возможности обмена структурными компонентами IgG и sIgA
непосредственно в молоке, которое также содержит восстанавливающие
соединения.
15
Рис. 13. Профили аффинных хроматографий на ДНК-целлюлозе смесей
немодифицированных и модифицированных IgG с помощью FITC (А, Б) или 32Р (В, Г)
(рис. 11Б) после их инкубации в присутствии одновременно GSH и плазмы молока. А –
смесь содержала 0,15М-IgG-FITC и 0,5М-IgG. Б – 0,5М-IgG-FITC и 1,5М-IgG. ▬▬ –
профиль оптической плотности (А280),
– относительная флюоресценция (ОФ). В –
смесь содержала 0,15М-[32P]IgG и 0,6М-IgG. Г – 0,6-М-[32P]IgG и 0,15М-IgG.
–
относительная радиоактивность (cpm).
Рис. 14. Профили аффинных хроматографий на ДНК-целлюлозе смесей 0.6M-sIgA и
8M-мочевина-FITC-sIgA после инкубации в присутствии одновременно GSH и плазмы
молока (А) и только плазмы молока (Б); ▬▬ – профиль оптической плотности,
–
относительная флюоресценция (ОФ).
16
Чтобы выяснить, могут ли АТ обмениваться свободными легкими или
тяжелыми цепями, модифицированные свободные легкие и тяжелые цепи
смешивали с немечеными интактными IgG в присутствии плазмы молока и,
GSH. Перехода флюоресцентной метки в область интактного IgG (150 кДа)
не происходило (рис. 15).
Рис. 15. Электрофоретический анализ
продуктов обмена IgG со свободными
тяжелыми и легкими цепями, мечеными
FITC. 1, 2 – легкие и тяжелые цепи,
меченые FITC, 3 – IgG, 4 – маркеры
молекулярной массы, 5, 6 – смесь IgG и
легких (тяжелых) цепей, меченых FITC в
присутствии GSH и плазмы молока.
Таким образом, АТ молока человека могут обмениваться только HLфрагментами, что приводит к образованию химерных κλ-Ig, а также молекул
АТ, содержащих самые разные варианты комбинаций из HL-фрагментов к
различным антигенам. Это обуславливает высокое сродство IgG к ДНК, АТР,
казеину, липидам и гидрофобным сорбентам и катализ такими антителами
всех исследованных химических реакций. Однако in vitro обмен sIgA в
присутствии GSH и плазмы молока примерно в 1,5–3 раза менее эффективен,
чем для IgG. Кроме того, суммарные препараты соответствующих АТ
содержат меньше κλ-sIgA (17±4 %), чем κλ-IgG (54 ± 10%) Это может быть
связано с тем, что секреторный компонент и J-цепь молекул sIgA затрудняют
in vitro и in vivo такой обмен между κ- и λ-sIgA.
Согласно данным последовательных аффинных хроматографий на
нескольких сорбентах относительное количество иммуноглобулинов (и их
каталитических активностей в исследуемых реакциях) с высоким сродством к
различным сорбентам для IgG и sIgA в определенной степени сопоставимо.
Как и IgG, IgA крови существуют в виде мономеров – (HL)2-молекул.
Секреторные IgA поступают в молоко в виде тетрамеров (HL)4JS, в которых
IgG связаны с J-цепью и секреторным компонентом. Нельзя исключить, что
при прохождении через эпителиальные клетки молочной железы соединение
двух IgA в sIgA может иметь в той или иной степени случайный характер. В
17
случае реализации этого механизма и последующего обмена HL- или (HL)2фрагментами уже непосредственно в молоке, не исключена возможность
образования (HL)4JS молекул, содержащих HL-фрагменты против трех или
даже четырех различных антигенов.
Согласно данным работы (Kolfschoten et al, Science, 2007), обмен HLфрагментами в присутствии природных компонентов крови, GSH или других
агентов, восстанавливающих дисульфидные связи (DTT, меркаптоэтанола) в
случае IgG4 может катализировать протеиндисульфидизомераза и/или
неонатальный Fc-рецептор (FcRn). Поскольку интенсивный обмен
фрагментами в настоящем исследовании происходит только при
одновременном присутствии GSH и молочной плазмы, следует полагать, что
молоко человека содержит белки и/или ферменты (возможно их комплексы),
катализирующие
обмен
HL-компонентами
после
образования
восстановленных форм АТ. Не исключено, что, как и в случае IgG4, такой
обмен могут катализировать протеиндисульфидизомераза и/или FcRn. В тоже
время возможно, что молоко содержит какие-то другие ферменты или
факторы, катализирующие такой обмен.
Совокупность полученных данных свидетельствует о возможной
реализации для IgG и sIgA молока человека классических механизмов
полиреактивности
связывания,
обусловленных
конформационной
лабильностью антигенсвязывающих центров и потенциальной возможностью
связывания разных антигенов в пределах одного центра. В то же время,
возможен еще один механизм реализации полиреактивности связывания и
продемонстрированной в работе каталитической полифункциональности
абзимов, которые возникают в результате обмена структурными
компонентами между молекулами как IgG, так и sIgA, с образованием самых
разных вариантов химерных антител.
ВЫВОДЫ
1. Впервые показана каталитическая полифункциональность IgG и sIgA
молока человека. Анализ сродства и каталитической активности IgG и sIgA,
проведенный с помощью последовательных аффинных хроматографий на
ДНК-целлюлозе, АТР-, казеин- и фенил-сефарозе, а также липид-сорбенте,
показал, что фракции с высоким сродством к каждому из предыдущих
сорбентов распределяются по всему профилю каждой из последующих
18
хроматографий. При этом фракции, элюируемые с каждого из сорбентов в
условиях разрушения прочных иммунных комплексов, обладают шестью
каталитическими активностями: гидролиз ДНК, АТР и олигосахаридов, а
также
в фосфорилирование
казеина
и
прочно связанных с
иммуноглобулинами липидов и олигосахаридов.
2. В молоке человека, наряду с IgG и sIgA с легкой цепью только типа
лямбда или каппа, обнаружены химерные иммуноглобулины, содержащие
одновременно легкие цепи типа лямбда и каппа. Химерные IgG представлены
всеми подклассами: 74,0 ± 7,0% IgG1, 16,0 ± 1,5% IgG2, 5,0 ± 0,4% IgG3 и
5,0 ± 0,5% IgG4.
3. Показано, что IgG молока человека in vitro при одновременном
присутствии восстановленного глютатиона и молочной плазмы, лишенной
антител, обмениваются HL-фрагментами, но не легкими или тяжелыми
цепями. В этих условиях sIgA также подвергаются обмену, который может
быть отнесен как к HL-, так и (HL)2-фрагментам этих антител. Такой обмен
приводит к формированию би- и полифункциональных АТ, которые могут
проявлять полиреактивность в связывании антигенов и полиспецифичность в
катализе химических реакций.
Основные результаты диссертации опубликованы в работах:
1. Седых, С. Е., Бунева, В. Н., Невинский, Г. А. Каталитическая
полиспецифичность IgG молока лактирующих женщин // Иммунопатология,
аллергология, инфектология. – 2008. – №. 3. – С. 22-32.
2. Седых, С. Е., Бунева, В. Н., Невинский, Г. А. Каталитическая
полиспецифичность sIgA абзимов из молока лактирующих женщин //
Российский иммунологический журнал. – 2009. – Т. 3. – С. 147-157.
3. Тарасенко, К. Л., Седых, С. Е., Бунева, В. Н., Невинский, Г. А.
Каталитическая полиреактивность абзимов молока человека // Вестник НГУ.
Серия: Биология, клиническая медицина. – 2011. – Т. 9. – С. 30-36.
4. Sedykh, S. E., Buneva, V. N., Nevinsky, G. A. Human milk IgGs contain
various combinations of different antigen-binding sites resulting in multiple
variants of their bispecificity // PLoS ONE. – 2012. – V. 7. – e42942.
19
Документ
Категория
Биологические науки
Просмотров
56
Размер файла
2 149 Кб
Теги
кандидатская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа