close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

2 otchet drozhzhi (2)

код для вставкиСкачать
Министерство образования и науки Российской Федерации
Бийский технологический институт (филиал)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова" Кафедра Биотехнологии
Лабораторная работа №2
"Культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae
в аэробных условиях"
Выполнил студент
группы БТ-91:Кузнецова Ю.И.
Проверил
к.х.н., доцент:Ламберова М.Э.
2012
Цель работы: Культивировать дрожжи Saccharomyces cerevisiae на питательной среде: сахароза + минеральные соли. В результате культивирования в аэробных условиях определить:
- прирост биомассы дрожжей;
- убыль сахаров в питательной среде в случае их утилизации дрожжами;
- эффективность образования биомассы по субстрату.
1 Общая характеристика дрожжей
В группу дрожжей объединяются грибы, которые существуют преимущественно в виде отдельных клеток. Клетки разных видов дрожжей морфологически довольно разнообразны: круглые, яйцевидные, лимоновидные, овальные. Длина их варьируется от 2 до 20 мкм, а ширина - от 1,5 до 10 мкм. Размножаются дрожжи вегетативно и половым путем. Клетки дрожжей грамположительны. На плотных питательных средах дрожжи растут в виде врастающих в субстрат колоний, имеющих мягкую консистенцию и разнообразных по форме: выпуклых, круглых, лопастных. Колонии могут быть бесцветными или окрашенными в желтый, оранжевый, розовый цвета.
Клетки дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae округлые или овальные размером (5...7)(8...11) мкм. Размножаются многосторонним почкованием. В неблагоприятных условиях образуются аски с одной или четырьмя спорами. При созревании спор сумки - аски сохраняются. Аскоспоры имеют круглую, слегка овальную форму, гладкие. Дрожжи рода Saccharomyces активно сбраживают сахара, нитраты не ассимилируют, так как не имеют ферментов, способных восстанавливать их до ионов аммония. На поверхности агара питательного они обычно формируют гладкие, тускло блестящие, белые с желтым оттенком колонии. Дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae способны сбраживать глюкозу, сахарозу, частично раффинозу, мальтозу и декстрины. На гидролизных средах выход спирта составляет 55...57 литров из 100 кг сбраживаемых сахаров. Поэтому дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae являются одним из основных продуцентов этанола на углеводных средах.
2 Подготовка к анализу
Подготовка посуды и материалов:
Вся бактериологическая посуда должна быть перед стерилизацией тщательно вымыта и высушена. Пробирки и колбы должны быть заткнутыми ватными пробками и завернуты в бумагу. На горлышки колб следует надеть бумажные колпачки, которые обвязывают ниткой. Колбы для отбора проб должны быть заткнуты ватными пробками, снабжены бумажными колпачками. Пробки для пробирок и колб готовят из ваты, обертывают слоем марли и завязывают ниткой на свободном конце.
Чашки Петри заворачивают в бумагу. В конец пипетки, который берется в рот, вкладывают кусочек ваты и завертывают в бумагу.
Стерилизация посуды:
Подготовленную посуду стерилизуют в автоклаве при 126оС 30 минут. Если есть возможность, то подготовленную посуду можно стерилизовать сухим жаром в сушильном шкафу при 160оС в течение 1ч, считая с момента достижения этой температуры. Простерилизованную посуду вынимают из сушильного шкафа после его охлаждения ниже 60оС.
Стерильную посуду хранят в плотно закрытых шкафах или ящиках лабораторных столов.
Приготовление сред и реактивов
Приготовление стерильной воды. Дистиллированную воду разливают в колбы на 500 мл не более 1/2 в каждую, закрывают ватной пробкой, бумажным колпачком и автоклавируют при 126оС 30 минут.
Приготовление агара питательного. 2.66 г сухого агара размешивают в 70 мл дистиллированной воды, и нагревают до полного растворения агара на водяной бане. Фильтруют через марлевый фильтр и стерилизуют автоклавированием в течении 20 минут при (121±1) оС. Среду охлаждают до 45...50оС и разливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат на 48 часов при 37оС для проверки стерильности. 3 Оценка жизнеспособных клеток дрожжей в сравнении
с количеством посторонней микрофлоры
Перед началом эксперимента необходимо проверить жизнеспособность и чистоту культуры дрожжей.
Приготовление стерильных разведений клеточной суспензии
Берем 1 г дрожжей и заливаем 5 мл дистиллированной воды. В боксе, соблюдая асептические условия производим высев на чашки Петри. Для этого готовим разведения исходной суспензии. Из каждой пробы должен быть сделан засев, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При исследовании культуры дрожжей засевают в каждую из трех чашек по 1 мл.
Для посева 0,1мл и меньших объемов используют разведение. Для этого в пробирку с 9мл стерильной воды, приготовленной заранее, вносят 1мл суспензии. При этом пипетка не должна быть опущена ниже поверхности воды, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 2 мл: 1 мл переносят в чашку, что будет соответствовать посеву 0,1 мл и 1 мл в следующую пробирку с 9 мл стерильной воды. Посев 1 мл из второй пробирки будет соответствовать посеву 0,01 мл. Из второй пробирки переносим 1 мл в третью с 9 мл воды. Посев 1 мл из третьей пробирки будет соответствовать посеву 0,001 мл.
После внесения суспензии в чашки Петри ее заливают 10-12 мл остуженного до 40-45 оС питательного агара при фламбировании краев колбы, где он содержится. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых частей дна чашки, попадания среды на края и крышку чашки. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды.
После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном не более чем по 3-4 чашки вместе. Посевы выращивают при 37оС в течение 48 ч.
Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с увеличением в 2-5 раз.
Проводим микрокопирование каждого вида выросших колоний. Для этого готовим мазки, взяв по 2...3 изолированные колонии каждого вида, фиксируем их в пламени спиртовки и окрашиваем по Граму: - на фиксируемый мазок накладываем фильтровальную бумагу, пропитанную карболовым раствором генциана фиолетового, на 2...3 минуты;
- не промывая водой, на мазок наносим на 2...3 минуты раствор Люголя;
- последний, так же, не промывая водой, сливаем, мазок обрабатываем 96%-ным спиртом (30. . .40 секунд);
- хорошо промываем дистиллированной водой;
- дополнительно окрашиваем раствором фуксина (40...50 секунд).
- промываем водой, высушиваем. микроскопируем, зарисовывая и описывая результаты.
Таблица 1-Результат микрокопирования колоний
ПоказательРазведение1:101:1001:1000ПрофильвыпуклыйплоскийВрастающий в агарФормакруглаякруглаякруглаяЦветбелаябелаябелыйКрайровныйнеровныйровныйКонсистенцияВязкая, легко снимающаяся с агараВязкая, легко снимающаяся с агараВрастает в агарМикроскопирование Таблица 2-Результат подсчета колоний
Степень разведенияЧисло
колоний
на 1 чашке Петри, штЧисло клеток
в 1 мл, штЧисло клеток дрожжей
в 1 мл, штЧисло посторонних клеток
в 1 мл, штСреднее число клеток
в 1 мл, шт дрожжейпосторонних1:108787064023018,4·1041,3·1041:10016916900130003900 1:100057457400053900035000 Число жизнеспособных клеток дрожжей подсчитываем по формуле:
где N - число колоний дрожжей, шт.;
Р - выбранное разведение.
Отношение количества клеток посторонней микрофлоры к числу жизнеспособных клеток дрожжей вычисляем по формуле:
У = Х' / Х·100%,
У = (1,3·104/18,4·104)·100 = 7,01 %
где Х' - число клеток посторонней микрофлоры (определяется аналогично X).
Процент содержания посторонней микрофлоры не должен превышать 10%, тогда посевной материал можно использовать в дальнейшем процессе без дополнительной обработки.
Приготовление питательной среды
Таблица 3 - Состав синтетической питательной среды
Компоненты среды Количество К2НРО4 · ЗН2О 0,06550 г NH4Cl 0,10000 г Мg5О4 · 7Н2О 0,02000 г Рb5О4 ·7Н2О 0,00100 г СаС12 0,00075 г Вода дистиллированная 100 мл Сахароза 5 г В колбу на 250 мл вносим навески солей и 50 мл дистиллированной воды, в другую - 5 г сахара и 50 мл дистиллированной воды. Закрываем колбы ватно-марлевыми пробками и автоклавируем при температуре 112 С, давлении 0,5 атм. в течение 20 минут. Затем оба раствора стерильно сливаем вместе и, доводим рН до 4 , 10 %-ной серной кислотой.
Таким образом, приготовили питательную среду для выращивания дрожжей в аэробных условиях. 4 Культивирование дрожжей в аэробных условиях
Подготовка посевного материала
5 г прессованных дрожжей заливаем 5 мл дистиллированной воды; доводим рН до 2 концентрированной серной кислотой; выдержав 5 минут, с помощью раствора NаОН доводим рН до 4. Посев клеток на проверенную среду
В стерильных условиях помещаем эти дрожжи в приготовленную питательную среду, колбу закрываем ватно-марлевой пробкой и ставим в термостат при температуре - 35°С. Периодически колбу взвешиваем. Результаты взвешивания записываем. Кроме того проводим высев суспензии (разведений) в чашки Петри по методике описанной выше.
Таблица 4 - Изменение массы колбы в течение 5 дней
Масса колбы, г225,40225224,3223,4222 Таблица 5 - Результат микрокопирования колоний
ПоказательРазведение1:101:1001:1000ПрофильвыпуклыйплоскийвыпуклыйФормакруглаякруглаякруглаяЦветкремовыйкремовыйкремовыйКрайровныйровныйровныйКонсистенцияВязкая, легко снимающаяся с агараВязкая, легко снимающаяся с агараВязкая, легко снимающаяся с агараМикроскопирование Таблица 6 - Результат подсчета колоний
Степень разведенияЧисло
колоний
на 1 чашке Петри, штЧисло клеток
в 1 мл, штЧисло клеток дрожжей
в 1 мл, штЧисло посторонних клеток
в 1 мл, штСреднее число клеток
в 1 мл, шт дрожжейпосторонних1:1035035003000500855023001:1001051050071003400 1:100010 1000070003000 Отношение количества клеток посторонней микрофлоры к числу жизнеспособных клеток дрожжей вычисляем по формуле:
У = Х' / Х·100%,
У =(2300 /8550)*100 = 26,9 %
Оценка прироста биомассы дрожжей
Разделяем на центрифуге (10 мин, 3000 об/мин) культуральную жидкость и биомассу дрожжей, которую затем взвешиваем. По разнице веса с первоначальным определяем прирост биомассы дрожжей в процессе аэробного их выращивания. Производим высев суспензии( разведений) в чашки Петри по методике описанной выше.
Таблица 7-Определение прироста биомассы дрожжей
Масса пустой
центрифужной
пробирки, гМасса центрифужной
пробирки с биомассой
дрожжей, гМасса биомассы
дрожжей, г 10,92 12,12 1,2 10,60 11,88 1,28 10,63 11,85 1,22 10,90 12,02 1,12 Общая сумма биомасс дрожжей составляет 4,82 г.
Пересчет исходной массы дрожжей на 100 % влажность: г
Убыль биомассы составила Таблица 8 - Результат микрокопирования колоний
ПоказательРазведение1:101:1001:1000ПрофильвыпуклыйплоскийвыпуклыйФормакруглаякруглаякруглаяЦветбелыйбелыйбелыйКрайровныйровныйровныйКонсистенцияВязкая, легко снимающаяся с агараВязкая, легко снимающаяся с агараВязкая, легко снимающаяся с агараОкраска по ГрамуГ(+)Г(+)Г(+)Микроскопирование
Таблица 9 - Результат подсчета колоний
Степень разведенияЧисло
колоний
на 1 чашке Петри, штЧисло клеток
в 1 мл, штЧисло клеток дрожжей
в 1 мл, штЧисло посторонних клеток
в 1 мл, штСреднее число клеток в 1 мл, шт дрожжейпосторонних1:1070070004110289035536273901:1003703700315005500 1:100090900007100019000 Отношение количества клеток посторонней микрофлоры к числу жизнеспособных клеток дрожжей вычисляем по формуле:
У = Х' / Х·100%,
У =(27390 /35536)*100 = 77%
5 Количественное определение сахаров в питательной среде
Приготовление растворов для анализа
1) 8%-ный раствор сернокислой меди (СuSО4·5Н2О). После приготовления раствор фильтруем.
2) Щелочной раствор сегнетовой соли (С4Н4О6КNа·5Н2О).
15 г едкого натра NаОН растворяем в мерной колбе на 50 мл дистиллированной водой все время смешивая до полного растворения, сюда же добавляем 20 г сегнетовой соли, смешиваем до растворения и добавляем воду до метки. Фильтруем в склянку из темного стекла. Храним раствор в темноте.
3) Фелингова жидкость является смесью равных объемов растворов 1 и 2. Готовим непосредственно перед использованием.
4) Раствор марганцовокислого калия
0,5 г КМпО4 растворяем в 100 мл кипяченной дистиллированной воды, фильтруем в склянку из темного стекла. Через пять дней устанавливаем титр раствора.
5) Раствор сернокислого окисного железа
5 г сернокислой окисной соли железа Fе2(SО4)3 растворяем в мерной колбе на 100 мл дистиллированной водой, сюда же добавляем 11 мл концентрированной Н2SО4 (1,84 г/см3). Раствор не должен обладать восстанавливающими свойствами, поэтому к нему по каплям добавляем раствор КМпО4 до появления чуть слабо-розового оттенка. Затем объем раствора доводим до метки.
Ход анализа
В центрифужные пробирки вносим по 4 мл питательной среды. Добавляем 4 мл жидкости Фелинга и содержимое перемешиваем. Жидкость должна быть голубой. Если ее цвет стал бурым, это означает, что не хватило жидкости Фелинга и нужно взять меньше питательной среды. Пробирки ставим на 10 минут на кипящую водяную баню до выпадения красно-бурого осадка закиси меди. Затем пробирки охлаждаем в воде, содержимое их центрифугируем при 2000 об/мин в течение пяти минут. Надосадочную жидкость декантируем, и край пробирки подсушиваем фильтровальной бумагой. Следить, чтобы осадок не сливался!
Сразу после сливания жидкости к осадку добавляем 2 мл горячей дистиллированной воды, осадок встряхиваем, постукивая пальцами, но дну пробирки. Затем приливаем 5...7 мл горячей воды, обмывая ею стенки пробирки, и снова центрифугируем, а затем сливаем жидкость. Промывание водой производим 3...4 раза. После промывания осадка в пробирке немедленно приливают 2 мл горячей дистиллированной воды. К взмученному палочкой осадку приливают 3 мл раствора сернокислого оксида железа, продолжая помешивать палочкой до полного растворения осадка закиси меди (палочку оставляем в пробирке). В результате раствор в пробирке становится зеленоватым. Не вынимая палочки, раствор титруем до бледно-розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 минуты, 0,1%-ным раствором КМnО4, который готовим из 0,5%-ного раствора перед титрованием. Параллельно ставим контроль. Для этого вместо питательной среды берем 4 мл дистиллированной воды. Ход дальнейшей работы тот же, что и с питательной средой. Содержание общего количества сахаров (в %) рассчитываем по следующей формуле:
где а - количество раствора КМпО4, пошедшего на титрование питательной среды, в мл;
b - количество раствора КМпО4. пошедшего на титрование контрольной пробы, в мл;
с/5 =10;13/5=2,026 (определение описано выше);
К - коэффициент пересчета, равный 1,9;
В - масса сахара, в мг;
V - Общий объем питательной среды, в мл;
V1 - объем среды, взятый на анализ, в мл; 100 - коэффициент для пересчета в проценты.
г
г
Определение экономического коэффициента
Расчет провести по формуле, указанной при расчете экономического коэффициента при выращивании дрожжей в анаэробных условиях.
,
где Х - прирост (убыль) биомассы дрожжей;
S - убыль сахаров в процессе культивирования.
Вывод: В данной лабораторной работе было проведено культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в аэробных условиях. В результате экономический коэффициент имеет отрицательный знак, что свидетельствует о неудовлетворительном качестве дрожжей, условия культивирования были не оптимальными (по температуре). 2
Документ
Категория
Рефераты
Просмотров
82
Размер файла
73 Кб
Теги
drozhzhi, otchet
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа