close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Voda moy otchet (2)

код для вставкиСкачать
Министерство образования и науки Российской Федерации
Бийский технологический институт (филиал)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова" Кафедра Биотехнологии
Лабораторная работа №1
"Микробиологический анализ водопроводной воды. Определение общего количества микроорганизмов в 1 мл"
Выполнил студент
группы БТ-91Кузнецова Ю.И.
Проверил
к.б.н., доцентЛамберова М.Э.
2012
Цель работы: исследование микрофлоры воды методом количественного учета и микроскопирования выросшей культуры.
1. Подготовка к анализу
1.1. Подготовка посуды и материалов.
Вся бактериологическая посуда должна быть перед стерилизацией тщательно вымыта и высушена.
Пробирки и колбы должны быть заткнутыми ватными пробками и завернуты в бумагу. На горлышки колб следует надеть бумажные колпачки, которые обвязывают ниткой. Колбы для отбора проб должны быть заткнуты ватными пробками, снабжены бумажными колпачками. Пробки для пробирок и колб готовят из ваты, обертывают слоем марли и завязывают ниткой на свободном конце.
Чашки Петри заворачивают в бумагу.
В конец пипетки, который берется в рот, вкладывают кусочек ваты и заворачивают в бумагу.
1.2. Стерилизация посуды
Подготовленную посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при С в течение 1ч, считая с момента достижения этой температуры. Простерилизованную посуду вынимают из сушильного шкафа после его охлаждения ниже 60оС.
Стерильную посуду хранят в плотно закрытых шкафах или ящиках лабораторных столов.
При отсутствии сушильного шкафа посуду стерилизуют в автоклаве при С 30 минут. 1.3. Приготовление сред и реактивов
1.3.1. Приготовление стерильной воды. Дистиллированную воду разливают в колбы на 250 мл не более 1/2 в каждую, закрывают ватной пробкой, бумажным колпачком и автоклавируют при С 30 минут.
1.3.2. Приготовление агара питательного. 2.66 г сухого агара размешивают в 70 мл дистиллированной воды, и нагреваем до полного растворения агара на водяной бане. Фильтруют через складчатый фильтр и стерилизуют автоклавированием в течении 20 минут при 121±1оС. Среду охлаждают до 45...50оС и разливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат на 48 часов при 37оС для проверки стерильности. 2. Проведение анализа
2.1. Определение общего количества бактерий в воде.
Сущность метода заключается в определении в 1 мл воды общего содержания мезофильных, мезотрофных аэробов и факультативных анаэробов, способные расти на питательном агаре данного состава при температуре 37±0,5оС в течение 24±2 ч, образуя колонии, видимые при увеличении в 2 - 5 раз.
Питательный агар расплавляют в водяной бане и охлаждают до температуры 45±5оС.
Стерильные чашки Петри раскладывают на столе и подписывают на крышке номер пробы, дату посева и объема посеянной воды.
Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При исследовании водопроводной воды засевают в каждую из трех чашек по 1 мл.
С колб с пробной водой снимают бумажные колпачки, вынимают пробки, горлышки фламбируют, после чего воду тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку.
Стерильной пипеткой отбирают соответствующие объемы воды и вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку.
Для посева 0,1 мл и меньших объемов воды используют разведение анализируемой воды. Для этого в пробирку с 9 мл стерильной воды, приготовленной заранее, вносят 1 мл анализируемой воды. При этом пипетка должна быть опущена ниже поверхности воды не более чем на 3 мм, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1 мл и переносят в чашку, что будет соответствовать посеву 0,1 мл анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов воды, этой же пипеткой переносят 1 мл содержимого первой пробирки в следующую с 9 мл стерильной воды. Посев 1 мл из второй пробирки будет соответствовать посеву 0,01 мл анализируемой воды и т. д.
После внесения воды в чашки Петри ее заливают 10-12 мл остуженного питательного агаре при фламбировании краев пробирки или бутылки, где он содержится. Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых частей дна чашки, попадания среды на края и крышку чашки. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды.
После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном не более чем по 3-4 чашки вместе. Посевы выращивают при 37±0,5оС в течение 24±2 ч. Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с увеличением в 2-5 раз или прибора для счёта колоний. Оценивают только те разведения, при посеве которых на чашке выросло от 30 до 300 колоний. При посеве 1 мл неразведенной пробы учитывают любые количества колоний, но не превышающие 300.
Далее готовят фиксированный препарат для микроскопирования выросших колоний.
2.2. Приготовление мазка.
Чашку Петри берут в левую руку таким образом, что бы была видна поверхность питательной среды с выросшей на ней культурой. В правую руку берут бактериологическую петлю и прокаливают ее в пламени горелки. Приоткрывают чашку и берут небольшое количество микробной массы. Чашку Петри закрывают, а микробную массу переносят в каплю воды на обезжиренном предметном стекле. Не следует вносить много культуры, капля должна стать немного мутной. Остаток микробной массы на петле сразу же сжигают в пламени горелки. Из капли с внесенной культурой готовят мазок, равномерно размазывая ее петлей или краем покровного стекла на площади 2-4 см2. Мазок просушивают на воздухе или слегка нагревая в струе теплового воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Нельзя перегревать мазок: клетки микроорганизмов могут деформироваться! Хороший мазок после сушки должен давать на предметном стекле еле заметный налет. 2.3. Фиксация препарата.
После высушивания приступают к фиксации препарата. Фиксация имеет цель: 1) убить микроорганизмы, 2) обеспечить их лучшее прилипание к стеклу и, тем самым, предохранить препарат от смывания, 3) сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки лучше красятся, чем живые.
Для фиксации чаще всего используется высокая температура. С этой целью захватывают предметное стекло мазком вверх пинцетом и 3 раза проводят через пламя горелки. Перед окраской препарат охлаждают!
2.4 Окраска препарата по Граму.
Для дифференциации микробных клеток, различающихся химическим составом и структурой клеточных стенок, используется сложный метод окраски по Граму.
При окраске по Граму все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные.
Неодинаковое отношение микроорганизмов к окраске по Граму связано с различиями в структуре и химическом составе клеточной стенки бактерии.
Готовят на предметных стеклах мазки. Окрашивают мазки карболовым генциановым фиолетовым. На мазки наносят краситель, выдерживают 1-2 мин, краситель сливают и, не смывая водой, мазки обрабатывают раствором Люголя (1-2 мин).
Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат 0,5-1 мин 96% этиловым спиртом.
Препарат немедленно промывают водой и окрашивают его 1-2 мин водным фуксином. Сливают краситель, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.
Микроскопируют препарат: грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный или розовый цвет фуксина.
3. Наблюдения и подсчеты.
3.1. Описание культуральных свойств.
После обнаружения роста колоний на чашках Петри проводят их описание: Таблица 1 - Описание культуральных свойств
ПризнакиРазведение 1:10Разведение 1:100Разведение 1:1000ПрофильВыпуклый, на поверхности- -ФормаОкруглые с неровным краем--ЦветБелая--КонсистенцияМягкая, легко снимается с агара--
3.2. Подсчет выросших колоний.
Подсчет проводят не открывая чашки Петри, каждую подсчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят маркером (карандашом по стеклу) на 4 или более равные части, считая число колоний в каждом секторе и их сумму.
Количество клеток в 1мл исследуемого субстрата рассчитывается по формуле:
где M - количество клеток в 1мл исследуемого субстрата;
a - среднее число колоний, выросших после посева;
V - объем суспензии взятой для посева (мл);
n - номер разведения из которого сделан посев.
Количество колоний выросших в чашке Петри при разведении 10-1 -2 . При разведении 10-2 - колоний не было. При разведении 10-3-колоний не было.
Микроскопирование объективом 90х с иммерсионным маслом: Рисунок 1 - Разведение 1:10
Вывод: В ходе данной лабораторной работы был исследован образец водопроводной воды на наличие мезофильных, мезотрофных аэробов и факультативных анаэробов, способных расти на питательном агаре. Произведен подсчет микроорганизмов в анализируемом образце равный 0,02 КОЕ/мл, что не превышает норматив ГОСТ в 100 КОЕ/мл для водопроводной воды.
Документ
Категория
Рефераты
Просмотров
50
Размер файла
37 Кб
Теги
voda, moy, otchet
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа