close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Отчет 1 правка

код для вставкиСкачать
Санкт-Петербургский Государственный Политехнический Университет
Институт: ИФНиТ Руководитель: Касацкий П.С. Отчёт по лабораторной работе "Основы хроматографии и электрофореза тРНК"
Выполнили студенты группы 33417 Толичева Ольга
Пивоваров Вячеслав
Трескова Дарья
Санкт-Петербург
2013
Цель работы: Электрофорез и хроматографический анализ препаратов тРНК.
Ход работы:
1. Хроматография.
Для анализа препаратов индивидуальных деацилированных тРНК
tRNALys, С1 = 1,7 un/ml
tRNAPhe,С2 = 290 un/ml
tRNATyr, С3 = 105 un/ml
применяли разделение методом HPLC на обратнофазной колонке LiСhrospher wf 300 RP-18. Для нанесения использовали 0,5-1 ед. А260 тРНК в зависимости от типа препарата.
Каждый образец наносили на колонку, уравновешенную буфером А (20mM NH4Ac, pH 5,0; 10 mM MgCl2; 400 mM NaCl, 5% EtOH) и элюировали линейным градиентом этанола (5% →15%) (см. рис. 2) со скоростью элюции v = 0,5мл/мин. Объем градиента V = 40 мл. Оптическую плотность А260 элюента измеряли проточным спектрофотометром (см. рис. 1).
Образцы для хроматографии. Наносим по 1 ед. индивидуальных тРНК в HPLC buf x1(см. табл.1).
tRNALys: (1 ед)/(1 мл)= (1 ед tRNA^Lys )/(588 µл )+ (H_2 0)/(212 µл)+ (HPLC buf ×5)/(200 µл)
tRNAPhe: (1 ед)/(1 мл)= (1 ед tRNA^Phe )/(3,45 µл )+ (H_2 0)/(796,55 µл)+ (HPLC buf ×5)/(200 µл)
tRNATyr: (1 ед)/(1 мл)= (1 ед tRNA^Tyr )/(9,52 µл )+ (H_2 0)/(790,48 µл)+ (HPLC buf ×5)/(200 µл)
Соли HPLC 1х HPLC 5х NaCl 400 mM 2 M MgCl2 10 mM 50 mM NH4Ac 20mM 100 mMТабл. 1. Буферы для хроматографии.
Чтобы увидеть, как расположены пики тРНК друг относительно друга, готовим смесь тРНК из расчета примерно одинаковой оптической плотности А260 образцов на хроматографии (см. рис. 3). Элюируем в тех же условиях, что и индивидуальные образцы.
Т.е. наносим на колонку: tRNAMixed: (0,25 ед tRNA^Lys )/(30 µл )+ (1 ед tRNA^Phe )/(3,45 µл )+ (0,5 ед tRNA^Tyr )/(4,76 µл )+ (H_2 0)/(761,8 µл)+ (HPLC buf ×5)/(200 µл)
2. Спиртовое осаждение суммарной тРНК.
Осаждение суммарной тРНК (С0 = 520un/ml) а) Делаем три разведения суммарной тРНК:
С1 = С0*(110µл)/(4000µл) = 14,3 un/ml;
С2 = С0*(95µл)/(4000µл) = 12,35 un/ml;
С3 = С0*(80µл)/(4000µл) = 10,4 un/ml;
Измерили концентрацию каждой пробы на спектрофотометре:
С_1^изм = 0, 278 ед/мл*(3060µл)/(60µл) = 14,18 un/ml;
С_2^изм = 0, 236 ед/мл*(3060µл)/(60µл) = 12,04 un/ml;
С_3^изм = 0, 072 ед/мл*(3020µл)/(20µл) = 10,87 un/ml;
б) Осаждение тРНК.
V(тРНК) + 0,1V(СН3СООК, рН = 5.0) + 2,2V(С2Н5ОН t = 4ºC) инкубируем при -20ºС. Центрифугируем 4000 об/мин при 4 ºС 30 мин., осадок ресуспензируем в 5 мл воды. Измеряем оптическую плотность А260. По ней высчитываем осажденное количество тРНК с учетом затрат на первичную спектрофотометрию (см. табл. 2).
№ образца тРНКожидаем единиц осадить (по стоковой конц-и)ожидаем единиц осадить (по измеренн. конц-и)осадили единиц156,34255,8658,4248,90647,4249,044341,39243,262644,42Табл. 2. Сравнение количества осажденной тРНК с ожидаемым. 3. Вертикальный электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях.
а) Гель и буферы для фореза. ТВЕ 10х 1 л
Tris107,82 гBoric Acid55 гEDTA 0,5 M pH 8,840 мл APS 10% 100 ml = 10 g APS + Н2О (до 100 мл)
40% АА mix 19:1 100 ml = 38 g AA + 2 g bis-AA + Н2О (до 100 мл)
Urea Page 10 мл Н2О6 млTBE 1 мл AA-mix3 мл AA-mix 40%Urea4,2 г Acrylamid 10 ml
Urea Page10 млTEMED 100%10 µлAPS 10%50 µл Буфер для нанесения образцов 10 мл
Формамид 80%8 млTBE1 млБромфенол 0,1%50 мгКсиленцианол 0,1 %50 мгН2О1 мл40 минут проводим префорез при 200 В.
б) Образцы для фореза.
Для фениаланиновой и тирозиновой тРНК готовим предразведение по 2 µл тРНК до 5u⁄ml в 116 µл воды для фенилаланиновой и в 42 µл воды для тирозиновой тРНК. тРНК(mix): 2,4 µл тРНКLys + 1,7 µл тРНКPhe и тРНКTyr (предразведенной).
В эппендорфах прогреваем при +100ºC 2 минуты: а) 14 µл буфера для нанесения + 5 µл тРНКPhe (предразв.)
б) 14 µл буфера для нанесения + 5 µл тРНКTyr (предразв.)
в) 14 µл буфера для нанесения + 7,4 µл тРНКLys
г) 14 µл буфера для нанесения + 5,8 µл тРНКMix
в) Наносим образцы на дорожки в следующем порядке (слева направо): 1. тРНКPhe - дрожжевая, контрольная, 0,025 ед
2. тРНКLys 0,025 ед
3. тРНКTyr 0,025 ед
4. тРНКPhе E. coli 0,025 ед
5. тРНК(mix): 0,0083 ед тРНКLys + 0,0083 ед тРНКPhe + 0,0083 ед тРНКTyr = 0,0249 ед тРНКMix
Проводим форез: 10 минут на 100 В, 50 минут на 200 В.
г) Обработка результатов фореза.
Фиксируем гель в 10% ЛУКе, красим раствором метилленового синего, промываем, фотографируем результат (см. рисунок ниже). Рис. 4. Электрофорез тРНК в ПААГ. Дорожки (слева направо): 1. тРНКPhe дрожжевая 0,025 ед, 2. тРНКLys 0,025 ед, 3. тРНКTyr 0,025 ед, 4. тРНКPhе E. coli 0,025 ед, 5. тРНК(mix): 0,0083 ед тРНКLys + 0,0083 ед тРНКPhe + 0,0083 ед тРНКTyr = 0,0249 ед тРНКMix
Вывод.
В данной работе мы познакомились с основными методами разделения тРНК. Хроматография в нашем случае позволяет оценить состав исследуемого вещества, его чистоту. В нашем случае аминокислоты разделялись по своей гидрофобности (раньше всего из колонки выходили наиболее гидрофильные тРНК). По измерениям проточного спектрофотометра видно, что образец фенилаланиновой тРНК недостаточно очищен от других нуклеиновых кислот и, возможно, этанола. Необычно, что при элюировании смеси тРНК крайние пики вышли с опозданием на 5 минут. Скорее всего, это связано примесью спирта в образце тРНКPhe. На электрофорезе хорошо видно, что все тРНК практически одинаковы по своему размеру - расхождение достаточно невелико, но есть, что говорит нам о варьировании размеров тРНК различных аминокислот. Так же можно заметить преобладание остатков других нуклеиновых кислот в образце тРНКPhe. Очевидно, что проводить препаративный форез тРНК нельзя.
Документ
Категория
Рефераты
Просмотров
22
Размер файла
800 Кб
Теги
правка, отчет
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа