close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY1565

код для вставкиСкачать
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
(19)
BY (11) 1565
(13)
C1
6
(51) C 07H 19/20,
(12)
A 01N 57/16
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
АНАЛОГИ ТРИМЕРА 2', 5'-ОЛИГОАДЕНИЛОВОЙ КИСЛОТЫ,
ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ВИРУСОВ, ПОРАЖАЮЩИХ
КАРТОФЕЛЬ
(71) Заявитель: Квасюк Е.И., Михайлопуло И.А.(BY)
(72) Авторы: Квасюк Е.И., Михайлопуло И.А., Кулак
Т.И., Сентюрева С.Л., Ткаченко О.В., Зинченко
А.И., Барай В.Н., Коновалова Г.И., Ященко Н.П.
(BY)
(73) Патентообладатель: Квасюк Евгений Иванович,
Михайлопуло Игорь Александрович (BY)
(21) Номер заявки: 1993
(22) 22.06.1994
(46) 30.03.1997
(57)
Аналоги тримера 2‘, 5‘-олигоадениловой кислоты формулы:
1
HO
O
B
O
HO O
P
O
O
2 N Et 3H+
B
O
OHO O
P
Ad e
O
O
OHO OH
где один В или В1 - Ade, а другой - ТСА, обладающие активностью против вирусов, поражающих картофель.
(56)
1. Борисенко С.И., Шмыгля В.А., Шустер Г. Эффективность оздоровления картофеля методом культуры
апексов с помощью ингибиторов вирусов. // Доклады ВАСХНИЛ. - 1985. № 10. - С. 10-12.
2. Ткачук З.Ю., Артеменко В.С., Семерникова Л.И. Ингибирование вирусной инфекции 2′, 5′ - олигоаденилатом при регенерации мерисистем картофеля. // Биополимеры и клетка, 1993. Т.9. № 2. - С. 9-18 (прототип).
BY 1565 C1
Изобретение относится к области органической химии, конкретно к новым аналогам 2',5'олигоаденилатов: ди(триэтиламмониевым) солям 1-β-D-рибофуранозил)-3-карбоксамидо-1,2,4-триазолил(2'5')аденилил-(2'-5')аденозина I и аденилил(2'-5')-1-(β-D-рибофуранозил)-3-карбоксамидо-1,2,4-триазолил(2'5')аденозина II формулы:
NH 2
1
HO
O
B
O
HO O
P
O
O
O
OHO O
Ad e=
2 N Et 3H+
B
P
N
N
N
N
Ad e
O
O
CONH 2
O-
TCA=
HO OH
N
N
N
I B=Ade; B1=TCA
II B=TCA; B1=Ade
обладающим способностью ингибировать репликацию вирусов в растениях картофеля, в связи с чем
данные растения могут найти применение в сельском хозяйстве в качестве экологически безопасных средств
защиты растений, а также для получения оздоровленного от вирусов посадочного материала картофеля.
Известно использование антивирусных препаратов природного и синтетического происхождения в оздоровлении картофеля от вирусов методом культуры верхушечной ткани [1]. Суть способа заключается в том,
что срезанные верхушки ростков картофеля, зараженные вирусами X, Y, S и М, сначала стерилизуют в растворе диацида, затем отмывают водой и высаживают на питательную среду по Мурасиге-Скугу с добавкой
ингибиторов вирусов. В качестве антивирусных препаратов (АВП) используют: 1% спиртовой раствор новоиманина(5 мл/л); спиртовой раствор экстракта (1:10) зверобоя (20 мл/л); 2-тиоурацил (4 мг/л); 2,4диоксогексагидроксотриазин (ДГТ) (100 мг/л); цианогуанидин (100 мг/л) и фенилаллил-тиомочевину (100
мг/л). Затем культивируют растения в пробирках 4-6 недель при освещенности 4 тыс.люкс и 16-часовом светопериоде. Из растений выделяют экспланты размером 0,3-0,5 мм и переносят их на такую же среду , содержащую АВП. Регенеранты размножают черенкованием, а регенерацию растений осуществляют при их периодическом пересаживании на свежую питательную среду в течение 3-4 месяцев. Степень зараженности
растений определяют иммуноферментным методом. При использовании в качестве АВП 2-тиоурацила, новоиманина и экстрактов зверобоя было получено 100% растений, свободных от вируса S, и 46% - от вирусов
М и X. При использовании ДГТ и циангуанидина получено 13-15,8% растений, свободных от комплекса вирусов X, Y, S и М.
Недостатком указанных антивирусных препаратов является низкая эффективность выхода растений,
свободных от комплекса вирусов, которые присутствуют на растениях в различных соотношениях, что связано с различной специфичностью действия АВП по отношению к вирусам.
Известен [2] аденилил(2'-5')аденилил(2'-5')аденозин формулы III:
HO
O
Ad e
O
HO O
P
O
O
Ad e
O
OH
HO O
P
Ad e
O
O
III
OH
HO OH
2
BY 1565 C1
обладающий противовирусной активностью в отношении вирусов, поражающих картофель. Исследовано
влияние аденилил(2'-5')аденилил(2'-5')-аденозина в концентрации 10-7-10-4 М на вирусы М, X, S и F при регенерации растений картофеля из меристем. Из растущих почек растений вычленяли меристемы размером 0,3
мм и высаживали на питательную среду с добавкой тримера. Спустя три месяца полученные регенеранты величиной 10-15 мм черенковали и высаживали на свежую питательную среду без добавки олигоаденилата.
Растения выращивали в течение 9 месяцев, осуществляя контроль за вирусами методом иммуноферментного
анализа. Лучшие результаты были получены при использовании тримера в концентрации 10-5 М. При этом из
высажденных меристем развивалось 17,9±1,9% нормальных растений, а доля свободных от вирусов растений составила 13,3% от высажденных меристем.
Как видно из результатов, эффективность процесса оздоровления весьма низкая, сам процесс требует
длительного времени и применения относительно высоких концентраций олигоаденилата.
Задачей настоящeго изобретения является получение новых 2', 5'-олигоаденилатов, обладающих более
высокой по сравнению с известными антивирусными препаратами активностью против вирусов, поражающих картофель.
В соответствии с указанной задачей синтезированы соединения I и II, добавление которых в питательную среду при регенерации растений картофеля из меристем приводит к получению оздоровленного от вирусов посадочного материала.
Способ получения соединений I и II (см . схему) заключается в монометокситритилировании 1-(β-Dрибофуранозил)-3-карбоксамидо-1,2,4-триазола(виразола) IV [3]; селективном бензоилировании образовавшегося монометокситритильного производного V; фосфорилировании полученного при этом бензоата VI
бис-триазолидом 2-хлорфенилфосфата в пиридине с последующим добавлением в реакционную среду 2-(4нитро-фенил)этанола; селективном удалении из полученных триэфиров VII и VIII 2-хлорфенильной защитной группы или цианэтильной группы, что приводит к образованию диэфира IX и X, соответственно; конденсации диэфира IX с селективно блокированным диаденозинмонофосфатом XI [4], а диэфира Х с трибензоиладенозином XII [4], что приводит к полностью блокированному тримеру XIII и димеру XIV,
соответственно; детритилировании соединения XIV и конденсации образовавшегося селективно блокированного димера XV с диэфиром XVI [5], приводящей к полностью блокированному тримеру XVII; исчерпывающем деблокировании соединений XIII и XVII и выделении целевых тримеров I и II ионообменной хроматографией.
Схема
HO
O
TCA
TCA
M TrO
TCA
M TrO
TCA
M TrO
O
HO OH
HO OH
IV
M TrO
V
O
+
BzO O
P
O
XII
M TrO
O
TCA
BzO O
P
O
Bz
O Ad e
OR
OR
BzO O Bz
IX, R = NPE
XIV, R = ClPh
X, R = ClPh
3
OR
VII, R= NPE
VIII, R= CNE
O
-
P
OClPh
VI
TCA
O
BzO O
BzO OH
BY 1565 C1
1
O B
M TrO
XI
+
O
OR
O
O B
O
BzO O
O
BzO O
TCA
XVI
+
P
BzO O
O
HO
P
O
O
Ad e
Bz
Bz
O Ad e
O
P
OClPh
BzO O Bz
OR
BzO OBz
XIII, B=Ade
XV
Bz 1
; B =TCA; R=NPE
Bz
1
XVIII, B=TCA; B =Ade ; R=ClPh
1
O B
HO
O
HO O
O
HO
P
O
O
Bz
O
+
2NHEt 3
O B
Ad e
BzO O
P
Bz
O Ad e
O
O
_
HO O
P
O
O
O
Ad e
BzO O Bz
_
HO OH
O
HO
I, B=Ade; B 1=TCA
1
II, B=TCA; B =Ade
ONPE
XII =
Ad e
XII =
BzO OBz
Bz
M TrO
XVI =
O
Ad e
Bz
O
BzO O
P
O
_
OClPh
; NPE = NO2
ClPh =
C 2H 4
Cl
CNE = NC
C 2H 4
;
M Tr = CH 3O
;
Bz =
C
C
;
O
Пример 1. Ди(триэтиламмониевая) соль 1-(β-D-рибофуранозил)-3-карбоксамидо-1,2,4-триазолил(2'5')аденилил(2'-5')аденозина I.
К раствору 1,0 г (4,1 ммоль) виразола IV в 50 мл пиридина добавляют 1,5 г (4,9 ммоль) монометокситритила хлористого, выдерживают смесь 48 часов при комнатной температуре и упаривают досуха. Остаток обрабатывают смесью хлороформ-вода, 2:1 (150 мл). Органический слой отделяют, сушат над безводным
сульфатом натрия, упаривают до объема 5-10 мл и добавляют к раствору 200 мл гексана. Выпавший аморфный порошок отфильтровывают и сушат. Получают 1,95 г (92%) 1-(5-О-монометокситритил-β-D4
BY 1565 C1
рибофуранозил)-3-карбоксамидо-1,2,4-триазола V. УФ спектр в метаноле, λмакс, нм (lg ε): 231 (4,27). К раствору 1,8 г (3,48 ммоль) соединения V в смеси 40 мл ацетонитрила, 6,3 мл (45,45 ммоль) триэтиламина и 32
мг (0,26 ммоль) диметиламинопиридина добавляют в течение 3 часов раствор 0,55 г (4,18 ммоль) бензоилцианида в 10 мл ацетонитрила. Реакционную смесь упаривают досуха, остаток хроматографируют на колонке с силикагелем (50 см3). Продукты реакции элюируют смесью растворителей гексан-этилацетат, в градиенте концентрации этилацетата от 25 до 95 объемных %. Фракции, содержащие бензоильное производное VI,
собирают, упаривают до объема 5-10 мл и высаждают в гексан. Получают в виде аморфного порошка 1,3 г
(57%) 1-(3-О-бензоил-5-О-монометокситритил-β-D-рибофуранозил)-3-карбоксамидо-1,2,4-триазола VI. Уфспектр в метаноле λмакс, нм (lg ε):231 (4,63). Смесь 0,16 г (2,38 ммоль) 1,2,4-триазола и 0,27 г (1,19 ммоль) 2хлорфенилдихлорфосфата в 2,2 мл пиридина перемешивают 10 мин, охлаждают до 0°С и добавляют к реакционной смеси порциями раствор 0,5 г (0,81 ммоль) бензоата VI в 1,7 мл пиридина. Реакционную смесь перемешивают 3 ч, добавляют к ней 0,54 г (3,23 ммоль) 2-(4-нитрофенил)этанола и выдерживают при комнатной температуре 18 ч. Разбавляют реакционную смесь хлороформом (300 мл) и обрабатывают 0,05 М
раствором триэтиламмонийбикарбоната (ТЕАБ) (2х100 мл). Органический слой отделяют, сушат безводным
сульфатом натрия и упаривают досуха. Остаток хроматографируют на силикагеле (150 см3). Продукты
элюируют смесью растворителей хлороформ-метанол 50:1. Фракции, содержащие соединение VII, объединяют и упаривают до объема 5 мл и высаждают в 200 мл гексана. Получают в виде аморфного порошка 0,54
г (70%) триэфира VII. Уф спектр в метаноле λмакс, нм (lg ε): 230 (4,61). Обрабатывают 0,35 г (0,36 ммоль)
триэфира VII раствором 0,3 г (1,81 ммоль) 4-нитробензальдоксима в 12 мл смеси диоксан-триэтиламин-вода,
1:1:1, в течение 1 ч, добавляют 20 мл пиридина и упаривают досуха. Остаток хроматографируют на силикагеле (60 см3). Продукты элюируют смесью растворителей: хлороформ-метанол-триэтиламин, 95:4:1. Фракции, содержащие диэфир IX, собирают, упаривают досуха. Остаток растворяют в 3 мл хлороформа и высаждают в 100 мл гексана. Получают в виде аморфного порошка 0,24 г (70%) 1-(3-О-бензоил-5-Омонометокситритил-β-D-рибофуранозил)-3-карбоксамидо-1,2,4-триазол-2'-[2-(4-нитрофенил)этил]фосфата
IX. Уф спектр в метаноле λмакс, нм (lg ε): 230 (4,39), 273(4,07). К смеси 0,23 г (0,18 ммоль) димера XI и 0,14 г
(0,15 ммоль) диэфира IX в 1,7 мл пиридина добавляют 0,08 г (1,1 ммоль) тетразола и 0,17 г (0,56 ммоль)
2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорида (TPSCl), перемешивают реакционную смесь при комнатной температуре 16 ч, добавляют 75 мл хлороформа и обрабатывают ее 0,05 М раствором ТЕАБ (2х20 мл). Органический слой отделяют, сушат безводным сульфатом натрия и упаривают досуха. Остаток хроматографируют на
силикагеле (75 см3). Продукты реакции элюируют смесью растворителей хлороформ-метанол в градиенте
концентрации метанола от 0,1 до 2 объемных %. Фракции, содержащие блокированный тример XIII, объединяют, упаривают до объема 3 мл и высаждают в 100 мл гексана. Получают в виде аморфного порошка
0,19 г (61%) соединения XIII. Растворяют 190 мг (0,09 ммоль) соединения XIII в7 мл 2% раствора TsOH в
смеси хлористый метилен-метанол, 7:3, спустя 10 мин раствор разбавляют хлороформом до 100 мл и экстрагируют 0,05 М раствором ТЕАБ (2х20 мл). Органический слой отделяют, сушат безводным сульфатом натрия и упаривают досуха. Остаток растворяют в 15 мл 0,5 М растворе 1,8-диазабицикло-[5,4,0]-ундецена-7 в
пиридине и выдерживают раствор при комнатной температуре 16 ч. В реакционную смесь добавляют 7,5 мл
1 М раствора уксусной кислоты в пиридине и упаривают досуха. Остаток обрабатывают 40 мл насыщенного
при 0°С раствора аммиака в метаноле в течение 18 ч и упаривают досуха. Остаток хроматографируют на
−
ДЕАЕ-целлюлозе А-25 (НСО 3 -форма, 75 см3). Продукты элюируют раствором ТЕАБ в градиенте концентрации от 0,05 до 0,2 М. Фракции, содержащие тример I, собирают и лиофилизуют. Получают 52 мг (52%)
соединения I в виде ди(триэтиламмониевой) соли. УФ-спектр в воде, λмакс , нм (lg ε): 260 (4,43). 1Н-ЯМРспектр в D2О (внутренний стандарт t-BuОН), δ, мд: 7,06; 6,88 (2Н); 6,75 и 6,65 синглеты протонов Н-5, Н-2,
Н-8; 4,84 д (1Н, Н-1', J1’,2’=3,0 Гц); 4,73 д (1Н, H-l', J1’,2’=2,0 Гц); 4,59 д (1Н, Н-1’, J1’,2’=3,0 Гц).
Пример 2. Ди(триэтиламмониевая) соль аденилил(2'-5')-1-(β-D-рибофуранозил)-3-карбоксамидо-1,2,4триазолил(2'-5')аденозина II.
Смесь 0,12 г (1,78 ммоль) 1,2,4-триазола и 0,2 г (0,89 ммоль) 2-хлор-фенилдихлорфосфата в 1,5 мл пиридина перемешивают 10 мин, охлаждают до 0°С и добавляют к реакционной смеси порциями раствор 0,37 г
(0,60 ммоль) бензоата VI в 1,3 мл пиридина. Реакционную смесь перемешивают 2 ч, добавляют 0,16 г (2,4
ммоль) 2-цианэтанола и выдерживают при комнатной температуре 18 ч. Реакционную смесь разбавляют
хлороформом (200 мл) и обрабатывают 0,05 М раствором TEAБ (2х70 мл). Органический слой отделяют,
сушат безводным сульфатом натрия и упаривают досуха. Остаток хроматографируют на силикагеле (100
см3) и выделяют продукт, как описано в синтезе соединения VII. Получают в виде аморфного порошка 0,39 г
(76%) триэфира VIII. УФ-спектр в метаноле, λмакс , нм (lg ε):232 (4,63), 270 (4,18).
Растворяют 0,39 г (0,45 ммоль) триэфира VIII в 40 мл смеси пиридин-триэтиламин, 1:1, выдерживают 3 ч и
упаривают досуха. Остаток хроматографируют на силикагеле (50 см3) и выделяют продукты, как описано в синтезе
соединения IX. Получают в виде аморфного порошка 0,29 г (72%) 1-(3-О-бензоил-5-О-монометокситритил-β-Dрибофуранозил)-3-карбоксамидо-1,2,4-триазол-2'-(2-хлорфенил)фосфата Х. УФ-спектр в метаноле, λмакс , нм (lg
ε): 230 (4,40); 273 (4,07).
5
BY 1565 C1
Конденсируют 0,27 г (0,3 ммоль) диэфира X и 0,14 г (0,25 ммоль) трибензоиладенозина XII в 2,5 мл пиридина в присутствии 0,27 г (0,9 ммоль) TPSCl и 0,13 г (1,8 ммоль) тетразола и выделяют образовавшийся
димер XIV. Получают в виде аморфного порошка 0,27 г (80%) блокированного димера XIV, как описано в
cинтeзе тримера XIII, который детритилируют обработкой 10 мл 2% раствора TsOH в смеси хлористый метилен-метанол, 7:3. Образовавшийся димер XV со свободной 5’-гидроксильной группой выделяют хроматографией на силикагеле (70 см3), как описано при синтезе триэфира VII. Получают в виде аморфного порошка
0,2 г (90%) димера ХV, который конденсируют с 0,23 г (0,22 ммоль) диэфира XVI в 3 мл пиридина в присутствии 0,2 г (0,66 ммоль) TPSCl и 0,1 г (1,37 ммоль) тетразола. Образующийся полностью блокированный
тример XVII выделяют, как описано при получении соединения XIII. Получают в виде аморфного порошка
0,28 г (77% ) соединения XVII.
Детритилируют 0,27 г (0,13 ммоль) тримера XVII обработкой 7 мл 2% раствора TsOH в смеси хлористый
метилен-метанол, 7:3, в течение 10 мин. Разбавляют раствор хлороформом (100 мл) и обрабатывают 0,05
раствором ТЕАБ (2х50 мл). Органический слой отделяют, сушат безводным сульфатом натрия и упаривают
досуха. Добавляют к остатку 0,32 г (1,93 ммоль) 4-нитробензальдоксима в 18 мл смеси диоксантриэтиламин-вода, 1:1:1 , и выдерживают раствор при комнатной температуре 2 ч. К раствору добавляют 40
мл пиридина и упаривают смесь досуха. К остатку добавляют насыщенного при 0°С раствора аммиака в метаноле, выдерживают раствор при комнатной температуре 20 ч и упаривают досуха. Остаток хроматографи−
руют на ДЕАЕ- целлюлозе А-25 (НСО 3 -форма) (100 см3), как описано при получении соединения I. Получают в лиофилизованной форме 46 мг (31%) тримера II в виде ди(триэтиламмониевой) соли. УФ-спектр в
метаноле, λмакс, нм (lg ε): 260 (4,42). 1Н-ЯМР-спектр в D2O (внутренний стандарт t-BuOH), δ, мд: 7,06; 6,98;
6,90 (2Н) и 6,71 синглеты протонов Н-5, Н-2, Н-8; 4,87 д (1Н, Н-1', J1’,2’=6,0 Гц); 4,77 д (1Н, Н-l', J1’,2’= 5,0
Гц); 4,62 д (1Н, Н-1', J1’,2’=2,0 Гц).
Исследование биологической активности 1-(β-D-рибофуранозил)-3-карбоксамидо-1,2,4-триазолил(2'5')аденилил(2'-5')аденозина I и аденилил(2'-5')-1-(β-D-рибофуранозил)-3-карбоксамидо-1,2,4-триазолил(2'-5')аденозина II в виде ди(триэтиламмониевых) солей проводилось при получении оздоровленного от комплекса
вирусов X, Y, М, S и F посадочного материала картофеля сорта Белорусский 3. Ингибирующее действие
олигоаденилатов I и II проявлялось при добавлении их в питательную среду, используемую для оздоровления растений картофеля. Верхушки ростков из проростков клубней картофеля помещают в питательную среду по Мурасиге-Скугу в модификации НИИКХ [6] с добавкой олигоаденилатов I и II в концентрации 10-8-106
М. В течение 3-4 недель выращивают растения до образования 5-7 междуузлий. Из верхушечных и пазушных почек полученных растений выделяют экспланты размером 1-1,5 мм и переносят их на свежую питательную среду с добавкой соединений I и II в той же концентрации. Приживаемость эксплантов в этом случае составляет 100% . Через 3-4 недели получают растения, свободные от комплекса вирусов и пригодные
для последующeго черенкования. Выход оздоровленных растений составляет 69-100%. Контроль за наличием вирусов в регенерантах осуществляют методом электронной микроскопии и иммуноферментного анализа
[7]. Высокая эффективность получения свободных от вирусов растений обеспечивается антивирусными
свойствами соединений I и II, что позволяет вычленять экспланты большего размера, чем в традиционном
способе оздоровления методом термотерапии. Использование больших по размеру эксплантов способствует
их большей приживаемости.
Метод оздоровления посадочного материала картофеля термотерапией в сочетании с культурой верхушечной меристемы заключается в том, что клубни картофеля выдерживают в термостабильных камерах при
35-37°С и влажности 65-70% в течение 1-2 месяцев. Затем из образовавшихся проростков вычленяют меристемы и высаживают их в пробирки с питательной средой на минеральной основе по Мурасиге-Скугу в модификации Научно-исследовательского института картофельного хозяйства. Растения выращивают в пробирках при 23°С, влажности 70% и освещенности 5-20 тыс.люкс при 16-часовом светопериоде в течение 11,5 месяцев. Проростки величиной 3-5 мм пересаживают на свежую питательную среду для ускорения роста.
Полученные растения расчеренковывают по числу междуузлий и высаживают черенки в пробирки на такую
же питательную среду. Осуществляют отбраковку зараженных вирусом растений, а безвирусные растения
размножают черенкованием до необходимого количества. Полученные растения из пробирок пересаживают
в почву теплиц для получения клубней картофеля.
В контрольных экспериментах при использовании обычной питательной среды все полученные растения
были заражены вирусами. При использовании метода термотеpaпии выход оздоровленных от вирусов растений составлял 42,8%.
Сравнительные данные по получению различными методами оздоровленных от комплекса вирусов растений картофеля представлены в таблице.
6
BY 1565 C1
Влияние олигоаденилатов на выход оздоровленных от вирусов растений картофеля.
Вариант
Количество выде- Количество анали- Выход растений, оздоровленных от комленных эксплантов зированных расте- плекса вирусов X, Y, M, S и F
(штук)
ний (штук)
штук
%
40
20
0
0
(термотера40
21
9
42,8
Контроль
Стандарт
пия)
С добавкой олигоаденилата I
10-8 M
40
36
25
69,4
10-7 M
40
39
39
100
10-6 M
40
31
23
74,2
С добавкой олигоаденилата II
10-8 M
40
39
39
100
10-7 M
40
39
39
100
10-6 M
40
39
39
97,5
Представленные в таблице данные свидетельствуют о высокой антивирусной активности соединений I и
II в широком диапазоне концентраций: 10-8-10-6 М.
Олигоаденилаты I и II являются представителями нового поколения экологически безопасных средств
защиты растений, которые являются перспективными для их использования в современных методах получения оздоровленного от комплекса вирусов посадочного материала картофеля.
Cоставитель А.Ф. Фильченкова
Редактор В.Н. Позняк
Корректор Т.Н. Никитина
7
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
163 Кб
Теги
by1565, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа